FR2491495A1 - Procede pour la production d'amino-acides par fermentation aerobie - Google Patents

Abstract

A.PROCEDE POUR LA PRODUCTION D'AMINO-ACIDES PAR FERMENTATION AEROBIE. B.IL CONSISTE PLUS PRECISEMENT EN LA CULTURE AEROBIE D'UN MICROORGANISME PRODUISANT L'AMINO-ACIDE, POSSEDANT L'APTITUDE A ASSIMILER L'ACIDE LACTIQUE, EN PRESENCE D'AU MOINS UN MICROORGANISME D'ACIDE LACTIQUE DANS UN MILIEU NUTRITIF AQUEUX CONTENANT AU MOINS UN HYDRATE DE CARBONE, QUI EST ASSIMILABLE PAR LE MICROORGANISME D'ACIDE LACTIQUE MAIS NON ASSIMILABLE OU PEU ASSIMILABLE PAR LE MICROORGANISME PRODUISANT L'AMINO-ACIDE, COMME PRINCIPALE SOURCE DE CARBONE, L'ACCUMULATION D'UN AMINO-ACIDE DANS LE BOUILLON DE CULTURE RESULTANT, ET LA RECUPERATION DE L'AMINO-ACIDE DU BOUILLON DE CULTURE. C.PRODUCTION D'AMINO-ACIDES A PARTIR DE DECHETS, NOTAMMENT LE PETIT LAIT.

Description

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La présente invention concerne un procédé de production par fer-

mentation d'amino-acides. Plus particulièrement, la présente invention concer-

ne un procédé dans lequel un microorganisme produisant un amino-acide et capa-

ble d'assimiler l'acide lactique est cultivé en aérobie en présence d'au moins un microorganisme de l'acide lactique dans un milieu nutritif aqueux contenant au moins un hydrate de carbone assimilable par le microorganisme de l'acide

lactique mais non assimilable ou peu assimilable par le microorganisme produi-

sant l'amino-acide; on récupère un amino-acide accumulé du bouillon de culture.

Un autre objet de la présente invention est de fournir un procé-

dé avantageux du point de vue industriel pour la production d'aminoacides im-

portants pour la nutrition humaine et animale en utilisant des sources de car-

bone peu chères ou les substances organiques dans les déchets de l'agriculture

ou de l'élevage qui jusqu'à présent n'ont pas été-effectivement utilisés.

Un autre objet de la présente invention est de réduire la pollu-

tion de l'environnement due aux déchets de l'agriculture et de l'élevage.

Le caractère limité des ressources naturelles a été récemment reconnu et leur utilisation effective est devenue un sujet courant, mais cette utilisation effective des ressources est encore dans son enfance.Par exemple, il ressort d'une étude de la FAO que sur 74 millions de tonnes de petit lait produit dans le monde en 1973, seule la moitié de cette quantité a été utilisée principalement comme aliment dans l'élevage et le reste jeté. Ceci signifie que plus de 2 millions de tonnes de lactose et plus de 300 mille tonnes de

protéines précieuses ont été gaspillées dans l'année à cause du petit lait re-

jeté des fabriques de fromages ou de caséine qui contient environ 5% de lacto-

se et environ 1% de protéines. Cette situation non seulement provoque la perte de ressources naturelles mais encore crée un sérieux problème de conduite du point de vue de la pollution; ainsi, on a eu un besoin fortement ressenti de meilleurs procédés pour l'utilisation du petit lait. Les efforts continus de l'industrie laitière sur la dernière décade n'ont malheureusement pas apporté de réponse satisfaisante à ce problème. Une des voies d'approche très explorée a été l'utilisation de la fermentation du petit lait. Par exemple, la conversion des parties solides du petit lait en une masse de-cellules de levure comestible a été tentée en utilisant une souche de levure capable d'assimiler le lactose

( Brevet U.S. 3 818 109). Cependant, l'utilisation extensive du petit lait com-

me produit de départ pour la fermentation n'a pas été couronnée de succès.

Ceci est certainement attribuable à la présence limitée des mi-

croorganismes capables d'assimiler le lactose contenu dans le petit lait.

L'aptitude à assimiler les sources de carbone telles que les hy-

drates de carbone est une caractéristique importante pour la taxinomie ou l'i-

dentification des microorganismes. Il est très difficile ou impossible d'accor-

der la faculté d'assimilation aux microorganismes ou d'accroître la faculté dhssimilation des microorganismes par les techniques de mutation artificielles classiques. Par conséquent, dans le procédé par fermentation connu pour la

production d'amino-acides, o une souche unique d'un microorganisme est utili-

sée (méthode de mono-culture), les produits de départ utilisables sont limités à ceux qui peuvent être effectivement assimilés ou métabolisés par la souche adoptée et la productivité est régie par ces propriétés génétiques fondamentales

possédées par la souche qui peut difficilement être améliorée par mutation ar-

tificielle. Par ailleurs, les techniques d'engineering génétique sont récemment devenues prométeuses en tant que technique pour la création de souches mutantes

des microorganismes; néammoins, l'adaptation de la technique à une echelle in-

dustrielle nécessite encore la résolution de nombreux problèmes tels que la

confirmation de la stabilité et la sureté des souches recombinées.

Selon le procédé de la présente invention, les amino-acides peu-

vent &tre produits par fermentation, en utilisant des sources de carbone non assimilables ou faiblement assimilables par les microorganismes produisant

l'amino-acide, en cultivant les microorganismes produisant l'amino-acide en pré-

sence des microorganismes de l'acide lactique utilisés depuis fort longtemps dans la production de nourriture et de boisson; ainsi, la présente invention

permet l'utilisation extensive des produits de départ selon l'aptitude d'assi-

milation des microorganismes de l'acide lactique employés. En d'autres termes,

la présente invention a atteint pratiquement le même objectif que celui qui pour-

rait etre atteint par l'engineering génétique, à savoir que la présente inven-

tion a rendue possible de pratiquement conférer les propriétés génétiques des

microorganismes de l'acide lactique aux microorganismes produisant de l'amino-

acide par une technique simple et sure.

On possède quelques documents sur une méthode de culture mixte; David E.F. Harrison considère l'étendueet les possibilités d'application de la culture mixte à la fermentation industrielle ( Adv. Appl. Microbiol., Vol. 24, p 129 (1978)). Sur la production des amino-acides par les populations mixtes

de microorganismes, M. Suzuki et S. Yamatodani rapportent que l'acide Lgluta-

mique est produit en grande quantité par la culture mixte d'Escherichia coli (E)et dine souche de Corynebacterium (A); ils montrent comme mécanisme, que l K cétoglutarate est accumulé par la souche E et qu'à son tour l'%K-cétoglutarate

est aminé par la souche A pour produire le L-glutamate. Dans ce procédé, la sou-

che E doit tre capable de produire l'x-cétoglutarate, un précurseur de l'aci-

de glutamique, ceci différant substantiellement de la présente invention ( M.

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Suzuki et S. Yamatodani; Annual Meat. Agr. Chem. Soc. Jpn., Abst., p.l64 (1967).

On connait également un procédé pour produire la L-lysine dans lequel on cul-

tive en mélangeun microorganisme assimilant les hydrocarbures appartenant au

genre Arthrobacter ou Brevibacterium et un microorganisme produisant la Lly-

sine appartenant au genre Corynebacterium, dans un milieu nutritif contenant

un hydrocarbure comme principale source de carbone ( Brevet E.A. 3 655 510).

On connait également une méthode dans laquelle on obtient des protéines de cel-

lule unique, en cultivant en mélange une levure appartenant au genre Saccha-

romyces ou Candida et un microorganisme produisant l'acide lactique appartenant

au genre Lactobacillus ( Brev. U.S. 3 818 109, All. Offen. 2 403 306, All.

Offen. 2 500 323).

Ainsi, malgré les tentatives faites pour produire une variété de produits de fermentation par culture mixte, une production industriellement

avantageuse d'amino-acides par une culture mixte d'un microorganisme d'acide lac-

tique et d'un microorganisme produisant un amino-acide reste inconnue.

Par ailleurs, on sait déjà qu'un amino-acide est accumulé dans un milieu nutritif par la culture aérobie d'un microorganisme produisant un aminoacide dans un milieu nutritif contenant l'acide lactique comme principale

source de carbone.( par exemple, V. N. Shaposhnikov et V. S. Isaeva, Mikrobio-

logia Vol 36,p 31 (1967), K. Seto et T. Harada, T. Ferment. Technol., Vol 47, p 558 (1969)). Cependant, on a rarement utilisé l'acide lactique comme produit de départ pour la production industrielle d'amino-acides car l'extraction et

la purification de l'acide lactique à partir d'un bouillon de culture de fer-

mentation d'acide lactique sont difficiles et un acide lactique obtenu par syn-

thèse est coAuteux. On conçoit une fermentation à deux étapes dans laquelle la

fermentation de l'acide lactique et la fermentation de l'amino-acide sont com-

binées en série, mais cette méthode nécessite une substance alcaline, telle que le carbonate de calcium ou l'ammoniaque, comme réactif de neutralisation, et elle prend du temps car le taux de production de l'acide lactique diminue du fait de l'inhibition de la fermentation due au produit, l'acide lactique, accumulé en des concentrations élevées. En outre, la deuxième étape de cette

méthode nécessite l'addition d'une substance de caractère acide pour la régu-

lation d'une augmentation à un pH correspondant à la consommation de l'acide lactique. Cependant, dans le procédé de la présente invention, onsuppose

que l'acide lactique produit par les microorganismes d'acide lactique est aus-

sitôt utilisé par les microorganismes produisant l'amino-acide; il en résulte que l'hydrate de carbone de départ peut être transformé en aminoacides en une opération en une étape; ainsi, on peut réaliser une production par fermentation

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efficace des amino-acides, et en même temps, on peut diminuer la quantité de réactif de neutralisation et faciliter l'extraction et la purification des

amino-acides du bouillon de culture résultant.

La présente invention consiste en un procédé pour produire un amino-acide qui comprend,la culture aérobie d'un microorganisme produisant un aminoacide qui est capable d'assimiler l'acide lactique en présence d'au

moins un microorganisme d'acide lactique dans un milieu nutritif aqueux conte-

nant, comme source principale de carbone, au moins un hydrate de carbone qui est assimilable par le'microorganisme d'acide lactique mais non assimilable ou peu assimilable par le microorganisme produisant l'aminoacide, l'accumulation d'un amino-acide dans le bouillon de culture résultant, et la récupération de

l'amino-acide du bouillon de culture. -

Des amino-acides produits par le procédé de la présente invention

sont, par exemple, les suivants: L-lysine, L-valine, L-thréonine, acide Lgluta-

mique, L-isoleucine, L-leucine, DL-alanine, L-phénylalanine, L-tyrosine, L-

tryptophane, L-arginine, L-histidine, L-sérine, L-glycine, et acide Lasparti-

que. Bien qu'on n'ait pas encore clarifié le mécanisme du procédé de la présente invention, on conçoit un mécanisme o des métabolites contenant l'acide lactique comme ingrédient principal sont produits à partir d'un hydrate

de carbone grâce à un microorganisme d'acide lactique puis assimilés par un mi-

croorganisme produisant l'amino-acide pour être transformés en un aminoacide.

En d'autres termes, on conçoit un système dans lequel le premier microorganis-

me - un microorganisme d'acide lactique (L) - a pour mission la glycolyse d'un hydrate de carbone et le second microorganisme - un microorganisme produisant l'amino-acide (A) - a pour mission la production d'amino-acide à partir de ces métabolites, contenant l'acide lactique comme ingrédient principal, et qui sont

produits par le premier microorganisme. Puisqu'il y a sans aucun doute oxyda-

tion de l'acide lactique au cours du passage principal dans lequel est impliqué la lactate desydrogénase (LDH), des amino-acides sont certainement produits par

cet enzyme via l'acide pyruvique qui est situé au centre d'un passage métaboli-

que des microorganismes généraux comme indiqué ci-dessous.

Microorganisme (L) hydrate de carbone - %Lactate (LDH) - - Microorganisme (A) (Pyruvate) w L-amino-acide

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Mécanisme hypothétique pour la production de L-amino-acide à partir d'un hydrate de carbone dans la présente invention Une caractéristique distinctive de la présente invention provient

du fait que la simple combinaison des deux systèmes de microorganismes non seu-

lement utilise convenablement des caractéristiques des deux microorganismes mais également produit vraisemblablement un synergisme inconnu; c'est pourquoi, on peut attendre des effets avantageux du point de vue industriel qui n'existent pas

avec une mono-culture.

Les avantages de la présente invention seront expliqués ci-après.

D'abord, des substances inorganiques qui étaient inutilisables comme produit de départ pour la fermentation à cause de leur non assimilabilité ou leur faible assimilabilité par des microorganismes produisant l'aminoacide,

sont devenues utilisables comme produit de départ pour la fermentation d'amino-

acide. Par exemple, on peut utiliser le petit lait du fromage ou de la caséine

évacué des usines comme produit de départ convenable dans le procédé de la pré-

sente invention. Il va sans dire qu'il est très avantageux du point de vue in-

dustriel qu'on puisse utiliser des produits de départ non onéreux comme produits

de départ disponibles.

Deuxièmement, la présente invention contribue à réduire la pollu-

tion de l'environnement car les substances organiques contenues dans le petit lait, les déchets liquides ou les rejets des usines d'amidon sont transformées en amino-acides et cellules microbiennes par leur utilisation comme produit de départ pour la fermentation; il en résulte que les composants de DBO qui sont à l'origine de la pollution, sont fortement réduits au cours des procédés pour

récupérer des amino-acides.

Troisièmement, la productivité de fermentation est éminemment améliorée si on la compare avec les méthodes de mono-culture. Quand on emploie un microorganisme produisant de l'amino-acide qui possède une grande capacité d'assimiler l'acide lactique,le taux de consommation d'un hydrate de carbone

comme substrat, taux qui est souvent proportionnel au taux de formation du pro-

duit, dépend de l'activité d'un microorganisme d'acide lactique, c'est à dire eju taux de fermentation de l'acide lactique. Dans un système de culture mixte

salon la présente invention, l'acide lactique produit et accumulé par les mi-

d acide lactique

croorganisn;Vést rapidement utilisé par des microorganismes produisant l'ami-

no-acide, avec pour résultat qu'il se produit vraisemblablement le même effet

que pour la fermentation de dialyse, o on accélère la fermentation par élimi-

nation des produits à travers une membrane; en conséquence, l'activité élevée

des microorganismes d'acide lactique est maintenue. On présume qu'il est éga-

lement possible que le taux élevé de la fermentation d'acide lactique soit main-

tenu par un effet de synergie inconnu tel qu'un effet d'accélération du à la

décomposition du peroxyde d'hydrogène, qui est de nature à provoquer l'inhibi-

tion du métabolisme, par catalase qui manque dans les microorganismes d'acide

lactique mais est fournie par les microorganismes produisant l'aminoacide.

Quand on utilise des microorganismes d'acide lactique d'homofermentation, qui produisent seulement l'acide lactique à partir des hydrates de carbone, cela contribue probablement à la productivité élevée et le taux de conversion de l'hydrate de carbone en acide lactique atteind 90 100% ce qui conduit à une

perte réduite de la source de carbone.

La demanderesse a observé que la fermentationd'acide lactique,

bien que s'effectuant généralement dans des conditions anaérobie, peut effec-

tivement se dérouler dans le procédé selon la présente invention, même dans des conditions aérobiesgénéralement requises pour la fermentation de l'amino-acide;

cette découverte soutient les spéculations précédentes.

Quatrièmement, l'avantage de la présente invention réside dans la

résistance à la contamination par les microorganismes étrangers. La revue de Da-

vid E.F. Harrison, mentionnée ci-dessus,cite la résistance à la contamination par des microorganismes étrangers comme un avantage de la culture mixte.Dans le procédé de la présente invention qui emploie des microorganismes de l'acide lactique, outre le mécanisme expliqué par l'auteur, il y a certainement des substances antimicrobiennes ( par exemple, nisin par Streptococcus lactis et diplococcin par Streptococcus cremoris, etc.) qui sont impliquées dans des effets de réduction de la contamination par des microorganismes étrangers.La prévention de la contamination par des microorganismes étrangers est l'un des

problèmes les plus importants posé par la fermentation industrielle.

Les microorganismes produisant l'amino-acide, qui ont la faculté d'assimiler l'acide lactique, utilisés dans la présente invention sont un des

membres appartenant à un des genres choisi dans le groupe comprenant Alkalige-

nus, Acinetobacter, Arthrobacter, Bacillus, Brevibacterium, Corynebacterium,

Flavobacterium, Micrococcus, Microbacterium, Nocardia, Proteus, Serratia, Can-

dida, Saccharomyces, Sporoboromyces et Schizosaccharomyces.

La faculté des microorganismes produisant l'amino-acide à assimi-

ler l'acide lactique peut être vérifiée et comparée en cultivant en aérobie un

microorganisme de test dans un milieu minimum contenant l'acide lactique ( L-

ou DL-lactate) comme source de carbone unique et en observant la croissance du microorganisme. Il est également possible d'isoler des souches possédant une excellente faculté d'assimiler l'acide lactique de la nature par une culture

d'enrichissement utilisant un milieu minimum contenant l'acide lactique (O,5,2%).

Des exemples représentatifs des souches utilisées dans le procé-

dé de la présente invention comme microorganismes produisant l'acide lactique sont les suivants: Alkaligenes faecalis Alkaligenes marshallii Acinetobacter sp-38-15 Acinetobacter calcoaceticus Arthrobacter paraffineus Arthrobacter citreus Arthrobacter sp-18 Bacillus circulans Bacillus megatherium Bacillus subtilis Brevibacterium ammoniagenes Brevibacterium acetylicum Brevibacterium thiogenitalis Brevibacterium flavum Brevibacterium lactofermentum Corynebacterium hydrocarboâlastum Corynebacterium acetoacidophilum Corynebacterium glutamicum Flavobacterium lutescens Micrococcus luteus Micrococcus roseus Microbacterium ammoniafilm Nocardia alkanoglutinosa Nocardia erythropolis Nocardia lyena Proteus morganii

IFO-3160

ATCC-21030

FERM-P-2187

IFO-12552

ATCC-15591

ATCC-17775

FERM-P-1481

IFO-3329

IFO-3970

XAM-1071

ATCC-19350

IAM-1790

IFO-12400

ATCC-13826

ATCC-13869

ATCC-15960

ATCC-13870

ATCC-13032

IFO-3085

IFO-3333

IF0-3764

ATCC-15354

ATCC-31220

IAM-12122

ATCC-21338

I.FO-3848

Serratia marcescens IFO-3054 Serratia plymuthium IFO-3055 Saccharomyces oviformis IAM-4325 Saccharomyces cerevisiae IFO-0971 Candida humicola IFO1577 Candida lypolitica IFO-0746 Sporoboromyces roseus IFO-1037 Schizosaccharomyces pombé_ IFO-6170 (Note) IAM: Institut de microbiologie appliquée, Univ. de Tokyo, 1-chome, Yayoi, Bunkyo-ku, Tokyo, Japon IFO: Institut pour la fermentation, Osaka, Juso, Nishinomachi, Higashiyodogawaku, Osaka, Japon FERM-P: Institut de recherche de fermentation, Agence de technologie et de Science Industrielle, Ministère de l'industrie et du commerce, Chiba-city, Japon Ces souches possedent la faculté d'assimiler l'acide lactique,

mais l'intensité de l'assimilabilité varie suivant les différentes souches.

I1 est également possible d'induire ou d'accrottre l'assimilabilité par la cul-

ture aérobie d'un microorganisme produisant l'amino-acide dans un milieu conte-

nant 0,2, -4% en poids/volume d'acide lactique (lactate de calcium ou de sodium).

On sait que, parmi les lactate déhydrogénases qui régissent certainement l'éta-

pe de limitation de taux de l'utilisation de lactate, la L(+)-lactate déhydro-

génase peut être induite par culture aérobie d'un microorganisme en présence d'un lactate ( Ellen I. Carvie; Microbiological Review, Vol.44(1) , p 106- 139 (1980)). La mutation artificielle peut également accroitre l'assimilabilité de

l'acide lactique.

Parmi les microorganismes énumérés ci-dessus à titre d'exemples, on peut obtenir des souches possédant une productivité élevée en amino-acide par les traitements de mutation classiques tels que ceux utilisants des agents mutagènes chimiques, par exemple, la N-méthyl-N'-nitro-N- nitrosoguanidine (NTG), ou une radiation, par exemple, les rayons ultra- violets ou les rayons X, suivis par l'isolation des souches mutantes selon des procédés connus ( K. Nakayama et coll., J. Gen. Appl. Microbiol. , Vol. 7, p41 (1961); Koichi Yamada, Biotechnol.

and Bioeng., Vol. 19, p 1563 (1977)).

249 1 495

Des souches produisant la L-lysine sont, par exemple, les sui-

vantes:

auxotrophes exigeant l'homosérine (ou la thréonine plus la méthio-

nine ( Brev. U.S. 2 979 439, Brev. Brit. 1 200 587): auxotrophes exigeant n'im-

porte lequel des amino-acides suivants: thréonine, isoleucine, valine, méthio- nine, leucine, alanine, arginine, histidine, phénylalanine, cystine, cystéine

( Brev. Français 1 486 235, Brev. Français 1 58 154, Brev.U . 3 527 672, Brev.

Brit. 1 184 530, Brev. Brit. 1 118 719); mutants dérivés d'un auxotrophe néces-

sitant l'homosérine ( Brev. U. S 3 524 797, Brev. Brit. 1 186 988, Brev. Belge

753 394); mutants résistants aux analogues de la L-lysine tels que S-(2amino-

éthyl)-L-cystéine (S-AEC) (Brev.U.. 3 707 441; K. Sano et I. Shiio: J. Gen.

Appl. Microbiol., Vol. 16, p 373 (1970); E. Takenouchi et coll., Agr. Biol.

Chem., Vol 41,615 (1977); Brev. U.S. 4 123 329); mutants sensibles à la thréoni-

ne ou à la méthionine ( Brev. Français 1 200 353; I. Shiio et R. Miyajima, J. Gen. Appl. Microbiol., Vol. 15, 267 (1969))

Des souches produiqant la L-valine sont, par exemple, les sui-

vantes:

auxotrophes nécessitant (1) isoleucine, (2) leucine, (3) thréo-

nine, (4) homosérine, ou thréonine plus méthionine, ou (5) arginine (R. Ishii et coll., J. Gen. Appl. Microbiol., Vol 13, p 217 (1967); Brev.U S. 3 700 556); mutants résistants à l'V-amino- butyrate ou à la 2thiazolealanine( M. Kisumi, J. Bacteriol. Vol. 106, p493 (1971); Brev. Jap. deux. publication N 44877/ 1973 et N 68794/1973)

Des souches produisant la L-thréonine sont, par exemple, les sul-

vantes: auxotrophes nécessitant un ou plusieurs des amino-acides suivants: méthione, isoleucine, lysine, acide diaminopimélique ( Brev. français 1 489 910; Brev. Brit. 1190 687; Brev. Français 1 591 232; Brev. Ouest All. 1 817 666);

mutants résistant aux analogues de la L-thréonine tels que l'acide damino-

p-hydroxyvalérique (AHV) ( Brev. U.S. 3 582 471) Des souches produisant l'acide L-glutamique sont, outre celles énumérées ci-dessus comme exemples, les suivantes:

mutants nécessitant le glycérol ( Y. Nakano et coll., Agr. Biol.

Chem., Vol 34, 1875 (1970); mutants nécessitants l'acide oléique( Okazaki et coll., Agr. biol. chem.,Vol. 31, p 1314 (1967))

Des souches produisant la L-isoleucine sont, par exemple, les sui-

vantes:

mutants résistant aux analogues de L-isoleucine,; -AHV, acide "-

aminobutyrique ou hydroxamate d'isoleucine

24 91495

Des souches produisant la L-leucine sont, par exemple, les sui-

vantes:

auxotrophes nécessitant la L-isoleucine ou l'K-aminobutyrate (R.

Ishii et coll., J.GEn. Appl. Microbiol., Vol 13,p217 (1967); F. Yoshinaga et coll.

ibid., Vol.13,p25 (1967); mutants résistant à la 2-thiazolealanine (T. Tsuchida

et coll., Agr. Biol. Chem., Vol 38, 1907 (1974) ou analogues de la leucine (R.A.

Calvo et J.M. Calvo, Science, Vol 156, 1107 (1967))

Des souches produisant la L-tyrosine sont, par exemple, les sui-

vantes:

auxotrophes nécessitant la L-phénylalanine ( K. Nakayama et coll.

J. Agr. Chem. Soc. Jpn., Vol 35, p142 (1961)); mutants résistant à 5méthyl-

tryptophane ( I. Shiio et coll., Agr. Biol. Chem., Vol 36,p2315 (1973)) Des souches produisant le L-tryptophane sont, par exemple, les suivantes:

mutants résistant au 5-méthyltryptophane ( Brev. Jap. second.

publications 18 828/1973 et 39517/1978); auxotrophes nécessitant la Ltyrosine et la L-phénylalanine (H. Hagino et coll., Agr. Biol. Chem., VOL. 39,p343( 1975)) L'addition d'acide anthranilique ou d'indole, un précurseur de

la biosynthèse du L-tryptophane, au milieu de fermentation au cours de la cul-

ture est efficace pour améliorer le rendement en ce qui concerne la production

de L-tryptophane.

Des souches produisant la L-phénylalanine sont, par exemple, les suivantes: auxotrophes nécessitait la L-tyrosine (Brev. U.S. 3 759 790);

mutants résistant à la p-fluorophénylalanine ( S. Sugimoto et coll., Agr. Biol.

Chem., VOl 37, p 2327)1973))

Des souches produisant la L-arginine sont, par exemple, les sui-

vantes:

mutants résistant à l'hydroxamate d'arginine ou à la 2-thiazole-

alanine ( M. Kizumi et coll., Appl. Microbiol., Vol 22, p 987 (1971); K. Naka-

yama et H. Yoshida, Agr. Biol. Chem., Vol. 36, pl675)1972); K. Kubota et coll.

J. Gen. Appl. Microbiol., Vol 19, p339 (1973)) Les microorganismes de l'acide lactique utilisés dans le procédé de la présente invention comprennent des bactéries qui sont souvent appelées

collectivement "bactéries de l'acide lactique" et des microorganismes apparte-

nant au genre Rhizopus qui sont une sorte de champignons; ils appartiennent, par exemple au genre Lactobacillus, Sreptococcus, leuconostoc, Pediococcus,

Tetracoccus, Bacillus, et Rhizopus.

* Des exemples représentatifs des microorganismes de l'acide lactique

249 1 495

sont les suivants: Lactobacillus bulgaricus Lactobacillus casei Lactobacillus acidophilus Lactobacillus japonicus Lactobacillus thermophilus Lactobacillus plantarum Lactobacillus delbrueckii Lactobacillus pentosus Streptococcus cremoris Streptococcus thermophilus Streptococcus lactis Leuconostoc dextranicum Pediococcus acidilactici Pediococcus pentosaceus Pediococcus soyae Tetracoccus soyae Bacillus coagulans Bacillus laevolactici Rhizopus oryzae

IFO-3533

IFO-12004

IFO-3532

IAM-10068

IFO-3863

IFO-12006

IFO-3534

IFO-4758

IFO-3427

IFO-3535

IFO-12007

IFO-3347

IFO-3884

IFO-3891

IFO-12172

ATCC-21787

IFO-3887

ATCC-23492

IFO-4706

Dans le procédé de la présente invention, on peut employer les

microorganismes de l'acide lactique seul ou en combinaison d'au moins deux.

Par exemple, on sait qu'il existe une symbiose entre Lactobacillus bulgaricus et Sreptococcus thermophilus, et donc la combinaison est également efficace dans

le procédé de la présente invention. On classifie les microorganismes de l'aci-

de lactique en deux groupes, à savoir, les microorganismes d'homofermentation qui produisent seulement de l'acide lactique à partir des hydrates de carbone

et les microorganismes d'hétérofermentation qui produisent du dioxyde de car-

bone, un acetate, et/ou de l'éthanol à partir des hydrates de carbone; dans le

procédé de la présente invention, on préfère les microorganismes d'homofermenta-

tion.Quand on utilise des microorganismes d'hétérofermentation dans la présen-

te invention, il est probable qu'un acétate et l'éthanol qui sont produits, sont également utilisés par des microorganismes produisant l'amino-acide en plus de l'acide lactique produit; cependant, dans ce cas,le dioxyde de carbone, qui est un des métabolites, représente une perte en source de carbone.

On peut également employer dans le procédé de la présente inven-

tion, ces souches résistant aux antibiotiques ou des analogues d'aminoacide qui sont obtenus en soumettant les microorganismes d'acide lactique précédents à des traitements mutagènes. Par exemple, dans la production de L-lysine selon le procédé de la présente invention, on peut employer ces souches résistant à

S-AEC, un analogue de L-lysine, qui est obtenu par traitement mutagène des mi-

croorganismes d'acide lactique employés pour la production de L-lysine. Comme microorganismes d'acide lactique employés pour la production de Lthréonine,

on peut utiliser des souches (souches résistantes) capable de crottre en pré-

sence de S-AEC et de L-thréonine ou des souches résistant à X-AHV, un analogue

de L-thréonine. La production effective d'acide L-glutamique est rendue possi-

ble par l'emploi des microorganismes d'acide lactique résistant aux antibioti-

ques, tels que les pénicillines, ou aux drogues qui sont ajoutées au milieu de culture. Un homme de l'art peut facilement produire ces souches résistant aux

drogues.

Quand on emploie un microorganisme d'acide lactique tel qu'il pro-

duit une substance antimicrobienne, comme Sreptococcus lactis et Sreptococcus cremoris, on emploie de préférence en combinaison un microorganisme produisant - - l'amino-acide résistant à la substance antimicrobienne. Pour obtenir la souche mutante résistante produisant l'amino-acide, on soumet une

souche produisant l'amino-acide aux traitements mutagènes classiques et on ré-

cupère une souche qui peut croitre dans un milieu ( liquide ou solide) conte-

nant un bouillon de culture du microorganisme d'acide lactique produisant une

substance antimicrobienne ( on utilise le bouillon de culture du microorganis-

me d'acide lactique tel quel, car sa stérilisation par chauffage peut rendre inactive la substance antimicrobienne); cette méthode peut être avantageuse dans

la mesure o la contamination par des microorganismes étrangers est prévenue.

Le procédé de la présente invention, procédé de production par

fermentation d'amino-acides, sera expliqué en détails par la suite.

On va d'abord décrire les procédures pour les cultures par ense-

mencement. On inocule une ou plusieurs souches des microorganismes d'acide

lactique dans un milieu nutritif pour la fermentation d'acide lactique conte-

nant un sucre tel que glucose, fructose, sucrose, lactose, etc.; ou des méla-

249 1 495

sses, du petit lait, ou des hydrolysats d'amidon contenant ces sucres; avec une source d'azote organique tel que l'extrait de levure, la liqueur de macération

de mals ( C.S.L.), etune peptone et on cultive à 25655'C. Par exemple, on uti-

lise comme milieu convenable un milieu nutritif contenant l'extrait de levure et/ou C.S.L. en addition au petit lait du fromage ou de la casèine. On effec- tue généralement une culture anaérobie telle qu'une culture stationaire, mais

on peut également adopter une culture aérobie. On utilise le bouillon de cul-

ture ainsi obtenu comme première culture d'ensemensement.

Il est également possible d'utiliser les cellules microbiennes obtenues par la fermentation d'acide lactique après leur immobilisation sur ou

dans un matériau de support tel que des réactifs induisant le gel, par exem-

ple, la carragénine, l'arginate de calcium, et la polyacrylamide. L'ensemble des cellules immobilisées peut être ré-utilisé après collecte par filtration

à l'achèvement de la fermentation.

D'autre part, on prépare la culture d'ensemencement des souches produisant l'amino-acide comme seconde culture d'ensemencement, de la manière suivante: Bien qu'on puisse aussi utiliser le milieu nutritif classique

comme milieu de culture pour cultiver des microorganismes, la culture d'ensemen-

sement obtenue par culture aérobie d'un microorganisme produisant l'aminoacide dans un milieu nutritif contenant 0,2V5% ( P/V) d'acide lactique ( L ou DL)

ou de son sel, permet la production efficace d'amino-acides.

Comme milieu nutritif pour la préparation de la seconde culture

d'ensemencement, on peut également utiliser de façon convenable un milieu nu-

tritif préparé en ajustant un bouillon de culture, obtenu par fermentation (généralement anaérobie) des microorganismes d'acide lactique qui doivent être utilisés pour la fermentation d'amino-acide, pour atteindre une concentration

d'acide lactique de 0,2Nj5% (de préférence 0,5ov2%) P/V, et ensuite en complé-

tant avec des sources de carbone telles que des hydrates de carbone et des al-

cools, des sels minéraux, des sources d'azote organique ou minéral et ainsi de

suite. Le pH au cours de la culture est de 5,5 08,0.

On inocule les deux sortes de culture d'ensemencement ainsi ob-

tenues dans un milieu de fermentation pour production d'amino-acides.

Le rapport entre les quantités des cultures d'ensemensement qui doivent être inoculées, bien qu'il ne soit pas particulièrement limité, se situe généralement de 10 ( volume) pour les microorganismes produisant l'aminoacide

à O,lÀjlO ( volume) pour les inicroorganismes d'acide lactique. Quand un micro-

organisme produisant l'aîii:c-acide possède une relativement faible aptitude à assimiler l'acide lactique, la quantité du microorganisme d'acide lactique à inoculer doit être faible afin d'équilibrer la production d'acide lactique et

l'assimilation d'acide lactique entre elles, et ceci pour une progression effi-

cace de la fermentation de l'amino-acide. Par exemple, lorsque la quantité du microorganisme d'acide lactique inoculée est trop importante, la fermentation de l'acide lactique se déroule si rapidement que la production d'acide lacti-

que et le taux d'assimilation se déséquilibre; il en résulte que la fermenta-

tion conduit à une production d'acide lactique et donc que la production d'a-

mino-acide chute.

On inocule généralement les deux types de cultures d'ensemence-

ment en même temps, mais il est aussi possible de différer l'inoculation de l'une des deux. Par exemple, on inocule un microorganisme d'acide lactique dans

le milieu après avoir précultivé en aérobie,un microorganisme produisant l'a-

mino-acide pendant une période donnée ( par ex., 2,v2O heures), dans un milieu nutritif contenant de petites quantités ( par ex., 0,5tv2,0 g/dl) de sources de

carbone supplémentaires,assimilables par le microorganisme produisant l'amino-

acide, en plus de la source de carbone principale. La faculté d'un microorga-

nisme produisant l'amino-acide à assimiler l'acide lactique peut être induite

pour une fermentation stable en effectuant la préculture dans un milieu nutri-

tif contenant 0,2W1,0 g/dl d'acide lactique de même que la source de carbone

supplémentaire. Des exemples de source de carbone supplémentaire sont des su-

cres tels que glucose et fructose, et des alcools tel que l'éthanol.

Il est également possible d'employer ensemble le microorganisme

d'acide lactique et le microorganisme produisant l'amino-acide, en combinai-

son dans l'étape de la culture d'ensemensement. Pour citer un exemple, on ino-

cule et on fait la culture aérobie des deux types de microorganismes dans un milieu nutritif aqueux contenant 2AJ5% P/V d'un hydrate de carbone, qui doit

être utilisé comme principale source de carbone dans la production d'amino-

acide. Les conditions de fermentation dans ce cas sont semblables à celles de 'La production d'amino-acide décrites ci-après. On inocule le bouillon de culture contenant les deux types de microorganismes ainsi obtenu, dans un

milieu de culture pour la production d'amino-acide.

L'hydrate de carbone utilisé comme principale source de carbone dans le procédé de la présente invention est un de ceux qui est assimilable par le microorganisme d'acide lactique mais non assimilable ou peu assimilable par le microorganisme produisant l'amino-acide et comprend: glucose, fructose,

sucrose, mélasses, hydrolysats d'amidon, hydrolysats de cellulose, hydrol, lac-

tose, hydrolysats de lactose, jus de fruits, petit lait de caséine, petit lait

du fromage, petit lait du soja, dextrine et amidon.

Les petits laits précédents comprennent le petit lait acide, le

petit lait doux, le petit lait déprotéinisé (perméat-UF) (on utilise une mem-

brane d'ultrafiltration pour la déprotéinisation), et petit lait déminéralisé.

On peut utiliser deux ou plusieurs hydrates de -carbone mentionnés

ci-dessus en combinaison dans le procédé de la présente invention.

Il est nécessaire de sélectionnerle type de microorganisme d'a- cide lactique en fonction du type d'hydrate de carbone choisi. Par exemple,

Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus caséi, Sreptococcus cremoris, et Srep-

tococcus thermophilus conviennent pour le lactose ou les petits laits; Lacto-

bacillus delbrueckii et Sreptococcus thermophilus conviennent pour les mélasses; Lactobacillus thermophilus, Lactobacillus japonicus et Rhyzopus oryzae sont

tous capables de produire de l'acide lactique à partir d'amidon ou de dextrine.

Quand on utilise l'amidon ou la dextrine comme source de carbone, on peut réaliser efficacement la production par fermentation des amino-acides

en ajoutant une amylase au milieu nutritif aqueux et en utilisant de préféren-

ce un microorganisme d'acide lactique possédant une activité d'amylase. On peut

obtenir une amylase d'emploi convenable, par exemple, en dissolvant une amy-

lase disponible dans le commerce dans de l'eau et ensuite en filtrant la solu-

tion à travers une membrane possédant une taille de pore inférieure à 0, 5t

telle qu'un filtre Millipore.

Des sources d'azote dans le milieu nutritif comprennent l'ammo-

niaque, le gaz ammoniac, l'urée et des sels d'ammonium organiques ou minéraux tels que le chlorure d'ammonium, le sulfate d'ammonium, le phosphate d'ammonium,

l'acétate d'ammonium, et le lactate d'ammonium.

Des substances minérales dans le milieu nutritif comprennent des sels de sodium, de potassium, de manganèse, de magnésium, de calcium, de cobalt,

de nickel, de zinc, de cuivre, et de fer avec les acides chlorhydrique, sul-

furique et phosphorique.

Au milieu nutritif aqueux on ajoute, outre les éléments nutritifs

tels que des vitamines et des amino-acides requis pour la croissance des micro-

organismes produisant l'amino-acide, extraits de levure, peptone, hydrolysats de caséine, hydrolysats de protéine du soja, liqueur de macération de mals (CSL),

petit lait,ou hydrolysats du petit lait, qui contiennent des vitamines, des a-

mino-acides, ou des substances se rapportant à l'acide nucléique, et ceci dans

le but d'accélérer le developpement de l'acide lactique.

Pour la production d'acide glutamique à partir des mélasses ou du petit lait, l'addition de produits chimiques tels que des pénicillines et des agents tensio-actifs au milieu nutritif aqueux, améliore le rendement du produit ( Brev. U.S. 3 080 297; K. Takami et coll., Agr. Biol. Chem., Vol 27, p 858 -1968-). On ajoute les produits chimiques au cours d'une période de 4 &'24 heures

249 1 495

après le début de la culture.Dans ce cas, il est préférable d'employer comme microorganisme d'acide lactique, un de ceux qui sont résistants aux produits chimiques ajoutés. Les concentrations et les méthodes pour l'addition des

éléments nutritifs et des produits chimiques sont semblables à celles de la cul-

ture habituelle simple des microorganismes produisant l'amino-acide; cependant, on doit déterminer leur quantité ortimale dans des conditions de culture mixte

puisque le métabolisme des microorganismes d'acide lactique peut avoir une in-

fluence sur eux.

On effectue la culture dans des conditions aérobies d'une cultu-

re avec secousse ou avec aération par agitation,etc.

Au cours de la culture, on ajuste de préférence le pH à 4,5 -'/7,5, plus particulièrement 5,5 e7,0. On peut utiliser comme réactif de neutralisation l'ammoniaque, le carbonate de calcium, l'urée et ainsi de suite. On effectue

la culture à une température de 250C "550C.

La différence entre le taux de production d'acide lactique et le

taux de consommation d'acide lactique, est déterminée en concentration accu-

mulée d'acide lactique; celle ci doit être de préférence controlée afin de ne pas dépasser 1,5% ( poids/vol), et encore mieux 1,0% ( poids/vol); en d'autres

termes, il est important de minimiser la quantité accumulée d'acide lactique.

Quand on utilise un microorganisme produisant l'amino-acidepossédant une gran-

de aptitude à assimiler l'acide lactique, on constate que la concentration

dacide lactique se maintient à une valeur d'un ordre négligeable même sans con-

trole spécial.On effectue le controle de la concentration d'acide lactique en réglant la température de la culture" le pH du milieu de culture, le taux

dapport d'oxygène au milieu de culture par mesure-de la concentration acide lac-

tique dans le milieu ( par exemple, on utilise pour la mesure le lactate déshy-

drogénase). Par exemple, une élévation de la valeur du pH d'un domaine légère-

ment acide à une faible alcalinité diminue le taux de fermentation d'acide lac-

tique et, en conséquence, la concentration en acide lactique; en outre, une

augmentation en apport d'oxygène diminue la concentration en acide lactique.

A la fin de la culture, on chauffe le bouillon de culture résul-

tant à une température de 75 -100C; le traitement à la chaleur coagule les

protéines coagulant à la chaleur et facilite la séparation des cellules micro-

biennes. On élimine les cellules microbiennes et les protéines coagulant à la

chaleur etc. par filtration ou centrifugation.

On détermine la présence d'amino-acide dans le bouillon par des méthodes de dosage microbiologique ou des méthodes calorimétriques basées sur

une réaction à la ninhydrine.

On peut isoler un amino-acide selon les procédures ordinaires,

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à partir du filtrat ou de la solution surnageaate.

Afin de mieux illustrer la présente invention, mais non de la li-

miter, on donnera les exemples suivants.

EXEMPLE 1

Lactobacillus bulgaricus ( IFO-3533) et Sreptococcus thermophi- lus ( IFO3535) sont chacun inoculsà partir de cultures dans un milieu agar dans 10 ml d'un milieu ( Milieu A) possédant la composition suivante: Milieu A ( pour la culture d'ensemencement) g/1 Glucose 10 Peptone 12,8 Extraits de levure 7,5

KH2PO4 5,0

MgSO4 7H20 0,8 NaCl 5,0 MnC12. 4H20 0,14 FeSO4.7H20 0,04 Na2CO3 1,25 Tween 80 0,2 pH 6,8 ( après stérilisation à 120 C pendant 15 min.) Les deux inocula sont chacun mis en incubation à 37 C pendant heures. On ajoute trois millilitres de chacun des inocula à 100 ml du second milieu ( Milieu B) possédant la composition suivante: Milieu B (pour la culture d'ensemencement) g/l Petit lait de fromage(com.lactose) 30

KH2PO4 1

Extraits de levure 6 MgSO4.7H20 0,5 CaCO 30 pH 6,5 ( après stérilisation à 120 C pendant 15 min.) La culture stationnaire pour la fermentation d'acide lactique

se fait à 37 C pendant 24 heures. On utilise la culture résultante comme ino-

culum (semence A) pour une culture mixte avec des microorganismes produisant l'amino-acide répertoriés dans le tableau I. Les microorganismes produisant l'amino-acide sont introduits,

chacun d'un plan agar dans 5 ml d'un milieu ( Milieu C) possédant la composi-

tion suivante: Milieu C ( pour culture d'ensemencement) g/l Glucose 10 Peptone 10 Extrait de viande 5 NaCl 5 Lactate 3'5 pH 7,0 (après stérilisation à 120 C pendant 15 minutes) * Un bouillon de culture obtenu en cultivant Sc. thermophilus plus L. bulgaricus dans un milieu ( Milieu B, lactose 40AJ50 g/l) à 37 C,pendant

72 heures est utilisé comme source d'acide lactique.

On réalise l'agitation aérobie à 30 C pendant 20 heures. On in-

troduit ensuite un millilitre de la culture résultante dans 20 ml d'un milieu de fermentation (D) possédant la composition suivante: Milieu D ( pour la fermentation) g/l Petit lait du fromage(com. lactose) 50 Glucose 10

KH2PO4 0,5

K2HPO4 0,5

MgSO4.7H20 0,5 FeSO4.7H20 0,02 MnSO4.4H20 0,01

ZnSO 7H20 0,01.

4 2

(NH4)2S04 25

CaC03 ( stérilisé séparément) 50 pH initial de 6,7 pour des souches de bactéries 6,0 pour des souches de levure On effectue la fermentation en cultivant à 30 C avec agitation aérobie pendant 16 heures, puis on introduit 3% en volume de l'inoculum des

microorganismes d'acide lactique ( semence A) dans le milieu de fermentation.

On continue la fermentation avec agitation aérobie à 30 C pen-

dant bO60 heures. On ajuste le pH du milieu à 4,5&v 6,5 pour des souches de levure

et à 5,0 "/7,0 pour des souches de bactéries, avec une solution de soude caus-

tique ou d'acide chlorhydrique au cours de la culture. Une fois la culture

terminée, on chauffe le bouillon de culture résultant à 95 C pendant 5 minutes.

Cette procédure donne des cellules microbiennes et des précipités tels que des protéines coagulant à la chaleur, facilement éliminables par centrifugation ou filtration. w Tableau I Fermentation d'amino-acides utilisant le petit lait ra e Assimilabilité* culture mixte Monoculture Microorganise lcide lactiquelactose Crois.descel"e Amino acides rois.des cell** Amino acides Alkaligenes faecalis L-Lys 250mg/Q IFO-3160 + - 75g/ L-Val 200 1t5g/ moins de 7,5g/SL200 1,5 g/i lOO10 mg/Z L-Ileu 400 Acinetobacter 38-15 L-Lys 4500 moins de FERM-p.2188 S L-Val 300 ng1ig. OOmg/ (résistant S-AEC) + L-Ileu 200 L-Leu 100 I.... Arthrobacter No.18 LLys 1200 moins de FERM-P-1481 + - 8g/ L-Val 200 ngg. loomg/ (ésistant à la thréonine L-Ileu 500 Bacillus circulans + + 7/ L-Lys 350 3/ moins de IFO-3329 - g lOOmg/Q Bacillus subtilis L-Lys 150 1 5g/Q moins de IAM-1071 + - 65/ L-Glu 500 100 lOOmg/Q DL-Ala 400 L-Val 200 Brevibacterium L-Lys 200 moins de, alkanolyticum + - 12g/Q L-Glu 2500 neglig lOOmg/Q IFO-12922 L-Val 300 Brevibacterium L-Glu 1500 25 L-Glu 300mg/Q flavum + - L-Lys 450 g L-Val 150 " AT'C'=-13826 L-Val 600 lOg/Q DL-Ala 300 L-Leu 200 L-Ileu 150 Glycine 200 F% oD lo %O 1-- b0 a o ui -n3 o Assimilabiiité* culture mixte Monoculture Microorganism e acide-fa-ctiquq,Lactose rois.des cellP Amino acides rois.des cell** amino-acides Brevibacterium L-Glu 500mg/Q lactofermentum + - DL-Ala 2500 ATCC-21420 5/ L-Val 800 2o L-Glu 200 (Tyrosine-auxotrophe) L-Ileu 300 g/ DL-Ala 300 L-Phe 500 L-Lys 700 Corynebacterium L-Glu 1500 moins de

lig/9 néglig.

hydrocarboclastum + - g/ L-Lys 150 neglig lOOmg/Q

ATCC-15592

Corynebacterium DL-Ala 500 acetoacidophilum + 8g/ -Val 200 l15g/y moins de + 8g/ZL-Val 200 100mg/z ATCC-13870 L-Ileu 150 Flavobacterium L-Lys 250 2 moins de lutescens + - 7g/Q l0oomg/z

IFO-3085

_ o Micrococcus roseus L-Lys 200 moins de IF0-3768 + - 9g/Q L-Val 200 1 5g/z 100mg/Q L-Ileu 300 Nocardia erythropolis + 12 / L-Glu 2500 moins de IAM-12122 L-Lys 150 neglig lOOmg/ Serratia plymuthicum 1L-Lys 150 log/ú 3pog/k moins de IF0--3055 DL-Ala 400 00/loorng/ Proteus morganii L-Lys 250 2utoins de IF0-3848 + Ig/L-Val 200 g/ lOOmg/Q Saccharomyces DL-Ala 500 moins de cerevisiae + 85g/ L-Glu 500 3g/ OOmg/ + 8/5g/ZL-Glu 500 ogz IFO-0971 L-Asp 300 \n o Microorganisms Saccharomyces oviformis

IAM-4325

U1 + o T r Assimilabilit * Monoculture c ulture mixte ôia. descel'i. Amino acic' DL-Ala 12g/Q L-Glu L-Val 2500mg/Q o ros.des cell * 315g/Q s_l Amino acidms moins de lOOmg/Q Sporoboromyces roseus + lg/ DL-Ala 1500 moins de IF0-1037 _gQ L-Glu 500 35g/ lOOmg/Q Candida humicola DL-Ala 500 8/ L-Glu 800mg/Q IF0-1577 + 1g/ L-Glu 1500 L-Asp 300 + 15g/g L-Val 200 L-Asp 500 Schizosaccharomyces +_ 8/ DL-Ala 500 moins de pombe+ - 8g L-Glu 1500 3g 100mg/Q

IF0-6170

* Note 1 Assimilabilité +: assimilable, +: faiblement assimilable, -: non assimilable * *Note 2 Croissance des cellules Une croissance du poids des précipités ( poids sec) dans le bouillon après dissolution du carbonate de calcium par addition d'acide chlorhydrique,est

considérée comme une indication de la croissance des cellules.

Note 3 Abréviation Lys: Glu: Ala: des amino-acides: Lysine, Val: Valine, Ileu: Isoleucine Glutamate, Leu: Leucine, Phe: Phénylalanine, Alanine, Asp: acide aspartique Assimilabilit * acide lactiqte Lactose M1 t-. LIA o vi Gn Monoculture

EXEMPLE 2

Brevibacterium flav-um ( ATCC-13326), Corynebacterium glutamicum

(ATCC-13032), Micrococcus lysodeikticus (IAM-3333), Micrococcus roseus (IFO-

3768), Brevibacterium lactofermentum (ATCC-13869), Brevibacterium linens (IFO-

12142), et Microbacterium ammoniafilm (ATCC-15354) sont tous cultivés de la

même manière que dans l'exemple 1, si ce n'est qu'on ajoute 4U;E. par milli-

litre de sel de potassium de pénicilline G 16 heures après le début de la cul-

ture, en même temps que des microorganismes d'acide lactique utilisés dans l'exemple 1, et qu'on ajuste le pH du milieu à 6,0 V7,O. Il est confirmé que les bactéries d'acide lactique utilisées sont résistantes à 5 U I./ml de pénicilline

G dans les présentes conditions de culture.On indique les quantités d'acide L-

glutamique accumulées dans le bouilon de culture après 3 jours de culture dans

le tableau 2.

Tableau 2 Microorganismes Acide L-glutamique accumulé g/l Brevibacterium flavum 18,0

ATCC-13326

Corynebacterium glutamicum 17,0

ATCC-13032

Micrococcus roseus 8X5

IFO-3768

Brevibacterium lactofermentum 15,0

ATCC-13869

Brevibacterium linens 610

IFO-12142

Microbacterium ammoniafilm 14 0

ATCC-15354

Micrococcus lysodeikticus 570

IAM-3333

EXEMPLE 3

On laisse incuber une souche produisant la L-lysine, Brevibacte-

rium flavum (ATCC-13326,nécessitant l'homosérine) dérivé par mutation de la souche mère, Brev. flavum (ATCC-13826), avec agitation aérobie dans 30 ml

d'un milieu ( Milieu C dans l'exe.ple 1) à 30 C pendant 24 heures.

On inocule trois millilitres du bouillon de culture résultant et

* 0,5 ml d'un inoculum d'une bactérie d'acide lactique ( semence A dans l'exem-

ple 1), dans 27 ml d'un milieu de fermentation( Milieu E) possédant la composi-

tion suivante: Milieu E ( pour fermentation)g/l Petit lait de fromage(comme lactose) 80 Glucose 20

KH2PO4 0,5

K2HPO4 0,5

MgSO4.7H20 0,5 FeS04.7H20 0,02 ZnSO4.7H20 0,01 MnSO4. 7H20 0,01

(NH 4)2SO4 35

C.S.L. 7,5

CaCO3 50 L-homosérine 0,2 On ajuste le pH à 6,7 après stérilisation à 120 C pendant 15 min.

On effectue la culture mixte de la même manière que dans l'exem-

ple 1. Après 72 heures de culture, la concentration de L-lysine dans le bouillon de culture résultant est de 24,5 g/1 ( comme chlorhydrate). On trouve aussi

dans le bouillon de culture cinq grammes de L-valine.

EXEMPLE 4

On effectue la culture mixte en utilisant, comme microorganisme

produisant l'amino-acide, Corynebacterium acetoacidophilum (ATCC-21476, néces-

sitant l'homoserine), et Corynebacterium glutamicum (ATCC-13287, nécessitant l'homoserine), de la même manière que dans l'exemple 3. Après trois jours de

culture, la quantité de L-lysine produite est de 22,0 et 12,0 g/l, respective-

ment.

249 1 495

EXEMPLE 5

On effectue la culture mixte en utilisant Brevibacterium lacto-

fermentum ( FERM-P-1945, résistant à 2-thiazolealanine) comme microorganisme produisant l'amino-acide,de la même manière que dans l'exemple 3., si ce n'est qu'on supprime L-homosérine dans le milieu E. Apres 4 jours de culture, la quan-

tité de L-valine produite est de 12 g/l. Par ailleurs, dans le cas d'une mono-

culture utilisant la même souche comme microorganisme produisant l'aminoacide,

la quantité de L-valine produite est de 1,5 g/l.

EXEMPLE 6

EXEMPLE 6 respectiveent On effectue la culture mixte en utilisant, comme microorganisme

produisant la L-thréonine un mutant nécessitant L-isoleucine (ATCC-19560) dé-

rivé de Corynebactertum hydrocarboclastum (ATCC-15592) et un mutant résistant à

un analogue de l-thréonine(ATCC-21269) dérivé de Brevibacterium flavum (ATCC-

13826), de la même manière que dans l'exemple 1, mais en utilisant Streptococ-

cus cremoris (IFO-3427) comme microorganisme d'acide lactique à la place de

Sc. thermophilus et on ajoute 100 mg/l de L-isoleucine au milieu de fermenta-

tion. La L-thréonine produite après trois jours de culture est respectivement de

1,2 g/1 et de 3,2 g/l.

EXEMPLE 7

On utilise comme souche produisant la L-lysine, Nocardia alkano-

glutinosa N 223-59,(ATCC-31220, Résistant à S-AEC). On obtient la souche par un traitement mutationnel à partir d'une souche assimilant les hydrocarbures

isolée du sol ( Brevet U.S, 4 123 329). La souche peut utiliser de l'hydrocar-

bure, de l'acide lactique, de l'acide pyruvique ou de l'acide acétique mais non du lactose ou du sucrose comme seule source de carbone. L'assimilabilité du glucose est faible. On inocule la souche d'un agar dans 50 ml d'un milieu ( Milieu E) possédant la composition suivante: Milieu E ( pour culture d'ensemensement) g/l Fructose ----------------------- 15 Peptone ------------------------- 5

2 4

KH 2PO0 -------------------------

MgSO4 --2----------------------- 15 FeSO422 24 ------------_______ 1 MnSO 4H20--------------------- o ZnSO4-7H20------------------ 001 * Acide lactique -------------------- 6 r. 7 pH ------------------------------ 67 On utilise le même bouillon de culture que dans le milieu C

dans l'exemple 1.

On effectue la culture avec agitation aérobie à 30'C pendant 24 heures. Par ailleurs, on prépare un inoculum de Lactobacillus bulgaricus en utilisant les mêmes milieux de culture A et B de la même manière que dans

l'exemple 1.

On inocule un millilitre de chaque inoculum dans un milieu de fer-

mentation ( Milieu F) possédant la composition suivante:

2 4 9 1495

Milieu F (pour fermentation)

15 minutes.

Glucose -------------------------

KH2PO 4------- 05

K2HPO4 ------------- 015

MgSO4. 7H20 ------------- -- 05 NaC ---------------------------- 1 FeSO47H20 ----- à____ 0102 MnSO4-4H20 à-------- - 0010 ZnSO4'7H20 ---______0 f01

(NH4)2SO4 35

Peptone ------------------------- 5 CaCO3 --------------------------On ajuste le pH à 6,7'v6,8 après stérilisation

On effectue la culture mixte avec agitation aérobie à 300C pen-

dant 4 jours.

Dans une expérience de controle, on inocule seulement un inocu-

lum de Nocardia alkanoglutinosa ATCC-31220 dans le milieu F, et on effectue une

mono-culture à 33 C avec agitation pendant 4 jours.

On obtient des quantités accumulées de L-lysine de 14,8 g/l et

de 2,1 g/l respectivement,avec la culture mixte et la mono-culture.

EXEMPLE 8

On effectue la culture mixte en utilisant diverses souches de

microorganismes d'acide lactiquede la même manière que dans l'exemple 7.

Les résultats sont indiqués dans le tableau 2.

à 120 C pendant

Tableau 2

EXEMPLE 9

Lactobacillus delbrueckii (IFO-3534) et Sreptococcus thermophi- lus (IFO-3535) sont chacun inoculés dans un milieu (Milieu A) et les

inocula sont chacun mis à incuber à 37 C pendant 20 heures. On ajoute trois millilitres

de chaque inoculum à 100 ml d'un milieu de culture contenant 2,5 g/dl de mé-

lasses de canne ( comme sucre), 0,1 g/dl de KH2P04, 0,05 g/dl de MgSO4. 7H20,

0,5 g/dl d'extrait de levure, 0,5 g/dl de peptone, et 3 g/dl de CaC03, et po-

ssédant un pH initial de 6,8. On effectue la culture à 37 C pendant 24 heures.

Par ailleurs, on prépare un inoculum d'une souche produisant la

L-lysine, Nocardia alkanoglutinosa (FERM-P-6046) selon une procédure de l'exem-

ple 7.

On inocule deux millilitres de l'inoculum ainsi obtenu et 0,5 ml de l'inoculum des bactéries d'acide lactique décrit ci-dessus, dans 28 ml d'un S uches L-lysine HCZ (Monoculture) 2;2 g/ú ( culture mixte) Lactobacillus acidophilus IFO-3532 14r2 Lactobacillus casei IFO-12004 10, 5 Lactobacillus thermophilus IFO-3863 815 Lactobacillus delbrueckii IFO3534 4,1 Lactobacillus plantarum IFO-12006 811 Streptococcus cremoris IFO3427 1415 Streptococcus thermophilus IFO-3535 14,1 Leuconostoc dextranicum IFO-3347 4,l Leuconostoc mesenteroides IFO-3426 3>5 Bacillus coagulans IFO-3887 315 Pediococcus soyae IFO-12172 8]0 Pediococcus pentosaseus IFO-3891 4;5 Rhizopus oryzae IFO-4706 7;5 g491495

24 9 1 4 9 5

milieu de fermentation contenant 8 g/dl de mélasses de canne (comme sucre) , 2 g/dl de petit lait de fromage (comme lactose), 0,05 g/dl de K 2HPO4, 0,05 g/dl de K 42P04, 0,05 g/dl de MgSO4.7H20, 1,0 g/dl de C.S.L., 0,2 g/dld'hydrolysats de caséine, 3,5 g/dl de (NH4)2S04, et 5,0 g/dl de CaCO3 et possédant un pH initial de 6,â. On effectue la culture mixte avec agitation aérobie à 34 35 C

pendant 94 heures. La quantité de L-lysine produite est de 26,5 g/l (sous for-

me de chlorhydrate).

EXEMPLE tO

On inocule Lactobacillus bulgaricus IFO-3533 et Sreptococcus thermophilus IFO-3535 (rapport d'inoculation: 1:1) dans 100 ml du milieu A et on cultive à 37 C toute la nuit. On recueille les cellules microbiennes par

centrifugation, on les lave avec de l'eau salée stériliséeet on les met en sus-

pension dans 10 ml d'eau saline stérilisée. On mélange la suspension de cellu-

les avec 20 ml d'une solution stérilisée de 3 g/dl d'alginate de sodium (réac-

tif induisant le gel).

On verse ensuite la suspension par gouttes dans une solution à 2% en poids par volume de CaC12. On lave les perles formées avec une solution

saline stérilisée.

On inocule deux millilitres d'un inoculum de Nocardia alkanoglu-

tinosa 223-59 obtenu par la même procédure que celle décrite dans l'exemple 7, dans 30 ml d'un milieu de fermentation (Milieu D) contenant du petit lait de

fromage et du glucose.

On place environ 20 gouttelettes des perles obtenues ci-dessus, o les cellules des microorganismes d'acide lactique ont été immobilisées,de

façon aseptique dans le milieu de fermentation.

On effectue la culture mixte à 33 C pendant 70 heures. On main-

tient le pH du milieu de cultureà 6,O 6,8 au cours de la culture. La quanti-

té de L-lysine produiteaprès trois jours de culture est de 8,5 g/l ( sous for-

me de chlorhydrate).

EXEMPLE 11

On réalise la production de L-lysine à partir d'un perméat de petit lait dans un flacon de fermentation de 2-1. L'échantillon de petit lait est un produit obtenu par ultrafiltrationde petit lait de fromage( l'échantillon

séché contient 84% de lactose et 9% de cendres).

On prépare par la même procédure que dans l'exemple 7, un ino-

culumde Nocardia alkanoglutinosa (FERM-P-6064).Cinquante millilitres de l'ino-

culum, avec 30 ml de l'inoculum de L,bulgaricus plusSc. thermophilus ( semence A dans l'exemple 1), sont inoculés dans 1 000 ml d'un milieu de fermentation

24 9 1495

2E de composition suivante: 10 g/dl (conmmne lactose) de perméation du petit lait de fromage, 0,4 g/dl d'alcool éthylique, 0,05 g/dl de K2HP04, 0,05 g/dl de KH2P04, 0,05 g/dl de MgSO4.7H20, 0,5 g/dl de C.S.L., 0,5 g/dl de peptone, 0,2 g/dl d'

hydrolysats de caséine, 1,75 g/dl de (NH4)2S04, avec un pH initial de 6,8.

On effectue la culture mixte avec agitation ( 1000 t.p.m.) et aération (1, 0 V.V.M.). On maintient le pH du milieu à 6,6zv6,8 pendant 24 heures

à partir du debut de la culture avec de l'acide sulfurique et on l'ajuste en-

suite à 6,0.J6,2 avec de l'ammoniaque. Au cours de la culture, la teneur d'acide lactique dans le milieu de culture est déterminée par une méthode enzymatique

utilisant le lactate déshydrogénase.

Au stade initial de la culture, la concentration d'acide L-lac-

tique augmente jusqu'à 0,5 g/dl ( 12 heures de culture) puis diminue rapidement jusqu'à moins de 0,1 g/dl. La quantité de L-lysine produite après 50 heures de

culture est de 30,5 g/l ( sous forme de chlorhydrate).

On chauffe le bouillon de culture à 95eC pendant 15 minutespour

avoir 21 g de cellules séchées à partir d'l litre de bouillon de culture.

On sépare et purifie la L-lysine du filtrat par une méthode

conventionnelleutilisant une résine échangeur d'ion pour obtenir 11,5 g de chlor-

hydrate de L-lysine à partir de 500 ml du filtrat.

EXEMPLE 12

Deux millilitres d'un inoculum de Nocardia alkanoglutinosa (FERM

P-6064) préparé par la même procédure que dans l'exemple 7 et 0,5 ml d'un ino-

culum de L. bulgaricus plus Sc. thermophilus (semence A) décrit dans l'exemple 1, sont inoculés dans un milieu contenant 10 g/dl d'amidon soluble, 3,5 g/dl de (NH4)2S04, 0,05 g/dl de KH2P04, 0,05 g/dl de K2HP04, 0,05 g/dl de MgS04.7H20, 2 mg/dl de FeSO4.7H20, 1 mg/dl de MnSO4.4H20, 1 mg/dl de ZnSO4.7H20, 0,3 g/dl d'hydrolysats de caséine, 0,4 g/dl de peptone, et 5 g/dl de CaCO3 et possédant

un pH initial de 6,8.

Avant le départ de la culture, on ajoute aseptiquement au milieu de fermentation 5 unités par gramme d'amidon de glucoamylase ( une unité: la quantité qui fournit 10 mg de glucose par réaction à 40 qpH 4,5, pendant 30 minutes).On utilise un filtrat de glucoamylase ( avec une membrane filtre - filtre

Millipore; dimension de pore 0,22r-).

On effectue la culture mixte avec agitation aérobie à 35 C pendant 90 heures. La quantité de L-lysine produite est de 25,0 g/l ( sous forme de chlorhydrate).

2 4 91495

3o

Claims (13)

REVENDICATIONS

1-Procédé pour produire un amino-acide caractérisé en ce qu'il comprend la

culture aérobie d'un microorganisme produisant l'amino-acide, possédant l'ap-

titude à assimiler l'acide lactique, en présence d'au moins un microorganisme d'acide lactique dans un milieu nutritif aqueux contenant au moins un hydrate de carbone, qui est assimilable par le microorganisme d'acide lactique mais non assimilable ou peu assimilable par le microorganisme produisant l'amino-acide, comme principale source de carbone, l'accumulation d'un amino-acide dans le bouillon de culture résultant, et la récupération de l'amino-acide du bouillon

de culture.

0 2- Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'aminoacide-est un memibre choisi dans le groupe constitué par: L-lysine, Lvaline, L-thréonine,: acide L-glutamique, L-isoleucine, L-leucine, DLalanine, L-phénylalanine, L-tyrosine, L-tryptophane, L-arginine, Lhistidine, L-sérine, L-glycine, et

acide L-aspartique.

3- Procédé selon la revendication lou 2, caractérié en ce que le microorganisme produisant l'amino-acide est un membre appartenant à un genre choisi dans le groupe constitué par: Alkaligenus, Acinetobacter, Arthrobacter, Bacillus, Brevibacterium, Corynebacterium, Flavobacterium, Micrococcus, Microbacterium,

Nocardia, Proteus, Serratia, Candida, Saccharomyces, Sporoboromyces et Schizo-

saccharomyces.

4- Procédé selon la revendication 3 caractérisé en ce que le microorganisme produisant l'amino-acide est un membre choisi dans le groupe constitué par les espèces Alkaligenes faecalis, Alkaligenes marshallii, Acinetobacter sp-38-15, Acinetobacter calcoaceticus, Arthrobacter paraffineus, Arthrobacter citreus,

Arthrobacter sp-18, Bacillus circulans, Bacillus megatherium, Bacillus subti-

lis, Brevibacterium ammoniagenes, Brevibacterium acetylicum, Brevibacterium

thiogenitalis, Brevibacterium flavum, Brevibacterium lactofermentum, Corynebac-

terium hydrocarboclastum, Corynebacterium acetoacidophilum, Corynebacterium glutamicum, Flavobacterium lutescens, Micrococcus luteus, Micrococcus roseus, Microbacterium ammoniafilm, Nocardia alkanoglutinosa, Nocardia erythropolis,

Nocardia lyena, Proteus morganii, Serratia marcescens, Serratia plymuthi-

cum, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces oviformis, Candida humicola,

Candida lypolitica, Sporoboromyces roseus, Schizosaccharomyces pombe.

- Procédé selon l'une des revendicatios 1 à 4,caractérié en ce que le microorganisme

d'acide lactique est un membre appartenant au genre choisi dans le groupe cons-

titué par Lactobacillus, Sreptococcus, Leuconostoc, Pediococcus, Tetracoccus,

Bacillus et Rhizopus.

6- Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que le microorganisme

249 1 495

d'acide lactique est un membre choisi dans le groupe constitué par les espèces Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus casei, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus japonicus, Lactobacillus thermophilus, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus pentosus, Sreptococcus cremoris, Sreptococcus thermophtlus, Streptococcus lactis, Leuconostoc dextranicum,

Pediococcus acidilactici, Pediococcus pentosaceus, Pediococcus soyae, Tetra-

coccus soyae, Bacillus coagulans, Bacillus laevolactici et Rhizopus oryzae.

7- Procédé selon la revendication 1, 5 ou 6, caractérisé en ce que le micro-

organisme d'acide lactique est constitué de cellules vivantes immobilisées

dans ou sur un matériau de support.

8- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1, 5 ou 6 caractérisé en

ce que le microorganisme d'acide lactique est une souche mutante résistant

aux antibiotiques ou aux analogues amino-acides.

9- Procédé selon i'une des revendications 1 à 8,caractérisé en ce que l'hydrate de car-

bone est un membre choisi dans le groupe constitué par: glucose, fructose, su-

crose, mélasses, hydrolysats d'amidon, hydrolysats de cellulose, hydrol, lac-

tose, hydrolysats de lactose, jus de fruits, petit lait de caséine, petit lait

de fromage, petit lait de soja, dextrine et amidon.

- Procédé selon l'une des revendicaticns 1 à 9,caractérisé en ce qu'on inocule, une

culture d'ensemencement obtenue en cultivant le microorganisme produisant l'a-

mino-acide dans un milieu nutritif aqueux contenant de l'acide lactique, son

sel, ou un bouillon de culture du microorganisme d'acide lactique, dans le mi-

lieu nutritif aqueux pour la production d'amino-acide.

11- Procédé selon l'une des revendications 1 à 9, caractéris en ce qu'on effectue la cul-

ture en inoculant le microorganisme produisant l'amino-acide dans le milieu nutritif aqueux pour la production d'amino-acide contenant l'acide lactique,

et qu'on poursuit en précultivant le microorganisme avant l'inoculation du mi-

croorganisme d'acide lactique dans le milieu nutritif aqueux.

12- Procédé selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce qu'on inocule, une

culture d'ensemencement obtenue en cultivant en aérobie à la fois le microor-

ganisme produisant l'amino-acide et le microorganisme d'acide lactique dans un milieu nutritif aqueux contenant l'hydrate de carbone, dans le milieu nutritif

aqueux pour la production d'amino-acide.

13- Procédé selon la revendication 1 ou 12, caractérisé en ce qu'on controle la concentration d'acide lactique accumulé dans le milieu de culture au cours de la culture, afin qu'elle se situe dans une plage non supérieure à 1,5% en poids/volume. 14- Procédé selon la revendication 13 caractérisé en ce qu'on effectue le controle de la concentration d'acide lactique en réglant la température de 3.2 culture, le pH du milieu de culture, le taux d'apport d'oxygène vers le milieu

de culture, ou une de leur combinaison.

- Procédé selon l'une des revwndicatios l a 114,caractérié en ce qu'on effectue la cul-

ture à un pH de 4,5 #7,5.

16- Procédé selon l'une des revendications 1 à 15, caractérisé en ce qu'on effectue la cul-

ture à une température de 25.v55'C.

17- Procédé selon l'une des revendications 1 à 16, caractéris en ce qu'on ajoute au milieu

nutritif aqueux l'amylase et l'hydrate de carbone est l'amidon ou la dextrine.

18- Procédé selon l'une des revendications 1 et 9 à 17, caractérisé en ce que le microorganismne

d'acide lactique est un de ceux qui produit une substance antimicrobienne, et le microorganisme produisant l'amino-acide est une souche mutante résistant

à la substance antimicrobienne.