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des la conversion de en L-phénylalanine au moyen de nylalanne nera-
Les proclement les stades (a) de propager en dérobiose un micro-organisme producteur de phenylalanin ammonialyase (dite ci-après PAL) dans un milieu nutritif
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@4 F aqueux :
PAL, (b) de mettre les cellules du micro-organisme producteur de PAL obtenues an (a), soit sous forme de bouillon de culture complet, soit sous forme de cellules qui en ont été isolées, ou de mettre l'enzyme isolée en contact avec des ions ammonium et des ions trans-cinnamate et de laisser la réaction progresser dans des conditions impostes de température et de pH jusqu'à ce que la conversion en L-phénylalanine soit sensiblement achevée et (c) de separer et recueillir la L-phénylalanine hors du mélange de reaction.
Le procédé ci-dessus est dd-crit, par exemple dans le brevet anglais nO 1. 489. 468 (19 octobre 1977).
Un inconvenient de l'application de ce rrocédé à 1a production industrielle est l'instabilité relative du PAL et son inhibition par le substrat qui est l'acide trans-cinnamique. Pour favoriser la production de la L- phényla1nìne et contrecarrer les effets de l'inhibition par le substrat, le brevet anglais précité décrit un procédé dans lequel on utilise de grandes masses de cellules contenant du PAL et une concentration d'ions
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ammonium en excès.
Yamada, S. et al. (Appl. and Environ.
Microbiol., 42, 773-778 (1981)) production de la phénylalanine à partir de l'acide transcinnamique au moyen de cellules de Rhodotorula glutinis contenant du PAL. Ils ont envisage que l'absence d'application pratique antérieure de ne procédé était attribuable à la faible activité et à l'instabilité du PAL microbien. Yamada et al. ont observé que la Lisoleucine a un effet stabilisant sur le PAL et augmente la durée d'activité utile de l'enzyme. Ces auteurs ont observé, en outre, l'effet inhibiteur du substrat en notant qu'aux concentrations pratques on acide trans-cinnamique (150 mM), la vitesse de conver-
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sion en L-phénylalanine est réduite à la moitié du maximum.
Malgré les améliorations décrites ci-dessus,
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le procedé au PAL n'a, de la Deman- deresse, pas été applique 3 la fabrication industrielle de la L-phénylalanine. L'instabilité et la faible activité de l'enzyme constituent un inconvénient persistant de ce procédé.
La presente invention a pour objet un procédé
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perfectionné de production de la phénylalanine ammonialyase suivant lequel on cultive un micro-organi9e producteur de PAL dans des conditions d'aérobiose favorisant la croissance, on amène par induction le micro-organisme à produire du PAL dans les conditions de la production du PAL, puis cn expose le milieu contenant le PAL à des conJitions sensiblement statiques anaérobies.
La Demanderesse a en effet decouvert qu'une diminution de l'aeration et de l'agitation du milieu de fermentation après l'induction du PAL améliore la stabilité'et prolonge l'activité de l'enzymc.
La demande de brevet EUA 547. 158 du 31 octobre 1983 et la demande de brevet européen n* 84307523. 5 du 30 octobre 1984 indiquent que la phénylalanine ammonialyase est sensible à la degradation en presence d'oxygène et SOUR l'influence de l'agitation mécanique. Ces demandes de brevets précisent des lors que la stabilité et la vie utile de l'enzyme peuvent être améliorées- si la reaction de bioconversion est exécutée dans des conditions sensiblement statiques anaerobies.
Suivant la présente invention, le procédé due fermentation pour produire le PAL a été perfectionné par maintien du milieu de fermentation dans des conditions sensiblement statiques anaérobies apres l'induction du PAL. Les mécanisrnes exacts par lesquels ces
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conditions améliorent pas 6te 'elles réduisent les effets chirniques etmecahiquesdel'oxy- lastabilitedel'enzymen'ontgène et de l'agitation, l'hypothèse avancée est que ces conditionsréduisentaussilesactvitésmétaboliques des cellules avec une baisse concomitante de la dégra-
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dation nzyme.
L'établissement de proteolytique de l'statiques anaerobies dano le milieu de fermentation apres l'induction du PAL peut améliorer notablement l'efficacité et le rendement d'ensemble d'un procédé pour produire la L-phénylalanine au moyen de cette enzyme. Il existe habituellement un délai entre 1a, production PAL et l'utilisation de l'enzyme pour produire la N-phénylalanine. Ce délai peut résulter de la collecte des cellules ou des techniques de conservation. Des pertes sensibles d'enzyme peut avoir lieu au cours de cette durée.
Les conditions anaérobie8 peuvent être établies par différents moyens, par exemple par barbotage d'un gaz inerte (comme l'azote), par diminution ou. suppression de l'agitation et par limitation du volume d'air au-dessus de la surface du milieu contenant les cellules. Deux ou plusieurs de ces techniques peuvent être combinées avec avantage.
Les conditions statiques sont établies par une diminution de l'agitation jusqu'au minimum suffisant pour entretenir une homogénéité sensible. Une certaine agitation est, en général, souhaitable pcur empêcher une sédimentation des solides ou des composants de
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réaction liens aux solides.
Tout micro-organisme producteur de PAL peut outre utilisé dans le procédé de l'invention. Les microorganismes préférés sont notamment des souchcs productrices de PAL de bactéries du genre Streptomyces et des
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levures des genres Rhodotorula, Rhodosporidium et Sporobolomyces. Ces micro-organismes sont décrits, par exemple, dans la demande dss brevet E. U. A. 547. 129 du 31 octobre 1983 et la demande de brevet européen n* 64307477. 4 du 30 octobre 1984. Les micro-organismes specialement preferes sont les souches de Rhodotorula rubra et Rhodosporidium toruloides décrites dans l'exemple 1 de ces mémoires et reprises ci-apres.
Ces souches ont été déposées à l'united States Department of. Agriculture, Agricultural Research Collection, Northern Regional Research Cet ce, Peoria, Illinois le 8 septembre 1983.
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NO u : atricu1eRhodotorula rubra souche GX3242 NRRL Y-15596 Rhodotorula rubra souche GX3243 NRRL Y-15597 Rhodosporidium toruloides souche GX 3248 NRRL Y-15598 Rhodosporidium toruloides souche GX 3249 NRRL Y-15599
Le" micro-organismes producteurs de PAL utilises dans le procédé de la présente invention ont besoin d'oxygène pour leur croissance et. par conséquent, les cellules sont initialement cultivées en conditions d'aérobiose favorisant la croissance. En general, les techniques habituelles sont appliquées à la culture des cellules.
Les cellules sont inoculées dans un milieu nutritif contenant des sources assimilables de carbone et d'azote et des vitamines, minéraux et autres facteurs de croissance essentiels. Des sources appropriées de carbone sont notamment différents hydrates de carbone raffines ou bruts, comme le glucose, le saccharose, la melasse, les amidons, les céréales, etc. Une source de carbone préferée est le glucose.
Des sources d'azote sont notamment les sels inorganiques d'ammonium, comme le phorphate d'ammonium, le sulfate d'ammonium, l'acétate d'ammonium, le citrate d'ammonium, le nitrate d'ammonium, etc., et des sub-
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stance" organiques azotées comme la farine de soya, les infusions de viande, les aminoacides, la liqueur de macération de maîe, les hydrolysats de protéines, la peptone, les extraits de levure, etc. Une source d'azote préférée pour le procédé de l'invention eat l'extrait de levure et cet élément nutritif peut, avec avantage, être combine avec du phosphate de diammonium qui apporte simultanément de l'azote et du phosphore.
Les vitamines, mineraux et autres facteurs de croissance peuvent être apportés par les sources le carbone et d'azote (par exemple au moyen de l'extrait de levure) ou être apportés séparément. Ces constituants peuvent varier avec la nature du micro-orgenisme utilisé en particulier. Normalement, des o) go-éléments tels que le zinc, le manganèse, le fer, le cobalt et le calcium peuvent être apportés sous forme de sels inorganiques en quantités favorisant la croissance. Ces minéraux peuvent, par exemple, être apportés dans de l'eau, par exemple de l'eau de distribution ou de l'eau de mer, etc. Les milieux nutritifs du type décrit sont classiques et peuvent varier beaucoup en constitution.
Après la multiplication des cellules jusqu'a la densitf de c lLules souhaitce dans des conditions aérobies, elles peuvent être amendes par induction à produire le PAL dans des conditions d'aerobiose pour la production du PAL. L'induction du PAL est généralement assurée par addition de petites quantites d'un compose qui agit comme substrat pour le PAL. La L-phénylalanine est un bon inducteur du PAL et un certain ncmbre d'analogues de la phénylalanine induisent aussi la synthèse de cette enzyme. Par exemple, la D, Lphénylalanine, la L-tyrosine et la D, L-tyrosine conviennent à cette fin. De plus, il a été découvert que différentes sources d'azote brut peuvent être utilisées pour induire le PAL.
De telles sources d'azote brut
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sont notamment les protcines hydrolysées qui contiennent des quantités sensibies de N-phénylalanine ou de L-tyrosin6. Les hydrolysats de caséine ou de sang peuvent eire utilises avec avantage conune sources d'azote brut pour induire la synthese du PAL.
L'inducteur de PAL est ajoute aux cellules en quantité induisant le PAL, qui s'échelonne généralement d'environ 0, 1 a 10 g par litre de milieu de fermentation. De préférence, .. nducteur de PAL est utilise! en une concentration d'environ 4 à 8 g par litre du milieu de fermentation. Pendant cette opération, les conditions de température et de pH, l'aération et l'agitation induioant le PAL sont entretenues. La temperature et le pH sont généralement maintenus entre les limites physiologiquement compatibles pendant l'induction du PAL.
Des temperatures quelque le réduites, par exemple d'environ 15*C a environ 25'C, sont préférées parce qu'à ces températures plus basses, la stabilité de l'enzyme est meilleure et que la vitesse de consommation de l'inducteur de PAL est diminuée. Un pH préféré pour l'induction du PAL s'éche- lonne d'environ 5,5 à environ 7, 5, où des concentrations relativement élevées en PAL sont atteintes.
Si les cellules utilisées sont sensibles à la repression catabolique de la synthèse du PAL, il faut utiliser, avant l'induction, des moyens pour raréfier ou supprimer les catabolites ou leurs précurseurs hors du milieu. Cela peut être réalisé par séparation des cellules hors du milieu, par lavage des cellules et par mise en suspension des cellules dans du milieu exempt de catabolites. En variante, los cellules peuvent être laissées en croissance jusqu'a ce que les elements. nutritifs soient sensiblement épuisés avant que l'jnduction du PAL soit commencée.
Les cellules sont cultivées avec avantage dans
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les conditions de l'induction du PAL jusqu'à ce que l'activite de PAL atteigne au moins environ 0,5 et de preference au moins environ 2 unites par ml. Il a été observé que dans ces conditions, l'activité de PAL augmente jusqu'a un certain point, puis commence à diminuer. Le PAL obtenu suivant ces procédés peut être utilisé pour produire la phénylalanine ci partir du l'pacifie trans-cinnamique et de l'ammoniac.
Apres l'induction du PAL et l'accumulation de l'activité de PAL jusqu'à la valour souhaitée, les conditionssensiblementstatiquesanaérobiessont 4tablies dans le milieu de fermentation. En général, ces conditions sont établies par arrêt de l'aération et de l'agitation et par barbotage d'un gaz inerte tel que l'azote dans le milieu. Normalement, dans un système de réaction à marche discontinue, les cellules sont récoltées par centrifugation et transfErees dans un biréacteur. Dans un tel cas, les conditions sens- blement statiques anaérobies sont également entreiss n'. es aspres la récolte.
Comme indiqué précédemment, la phénylalanine ammonia-lyase s'est révélée très sensible à la degra- dation en présence d'oxygene et sous l'influence de l'agitation. Alors que l'agitation dans les réacteurs classiques (par exemple les cuves de fermentation profondes) est exécutée avec une puissance d'environ 0, 5 à 1 watt par litre, l'agitation des melanges de fermentation conformes à l'invention est avantageusement assurée avec une puissance moyenne inferieure à environ 400 et de preference inferieure à environ 100 milliwatts par litre.
Des puissances plus elevees, par exemple jusqu'a environ 5 watts par litre, sont applicables aussi, mais dans ce cas l'agitation est intermittente, par exemple 30 secondes d'agitation à des intervalles de 2 heures.
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La nature de l'agitation semble influencer aussi la stabilité de l'enzyme. Un mélange sous faible cisaillement est préféré. Une telle agitation est
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avantageuaeinent par injeotion jaz in gaz. que l'azote dans le mélange de r4action.
De plus, des agitateurs m4caniques us pour une agitation s - > euvent ;-tre utilisg-s avant-ageusGtnent assureeaussi. En général, l'agitation est juste suffisante pour entretenir l'homogénéité sensible du mélange.
La phénylalanine ammonia-lyase produite par le procédé de l'invention est utilisée pour catalyser la conversion de l'acide trans-cinnamique et de l'ammoniac en L-phénylalanine. Cette conversion est exécutée par mise en contact de 1'enzyme, sous forme de cellules entières, sous forme d'enzyme isolée ou sous forme immobiliste, avec une solution du snbstrat dans les conditions de la production de la phénylalanine. Un procédé particulièrement préféré pour condoire cette réaction de conversion est décri t dans la demande de brevet EUA 547. 258 du 31 octobre 1983 et la demande de brevet européen nO 84307523. 5 du 30 octobre 1984.
La bioréaction est poursuivie jusqu'à accumu- lation de quantits sensibles de L-phénylalanine dans le melange de reaction. En général, l'isolement est comment lorsque la concentration en : "-phénylalanine
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atteint environ 30 c atteint environ de preference environ 45 à 50 g par litre. La L-phénylalanine peut être isolée du melange de réaction de toute manière appropriée. Par exemple, les solides peuvent être séparés par filtration ou centrifugation pour laisser subsister une solution clarifiée dont la L-phénylalanine puut être précipitée par ajustement du pH au int isoelec- trique de la L-phenylalanine. à savoir environ 5, 5.
L'invention est davantage illustrée sans être limitée par les exemples suivants.
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EXEMPLE
Le présent exemple decrit nn procede de fermentation pour produire de la phénylalanine ammonilyase conformément à la présents invention. On cultive Rhodotorula rubra, souche NRRL Y-15597 a 30 C aur de la gélose au malt inclinée. Le milieu gélosé contient 1% d'extrait de malt (Difco) et 1, 5% de gélose (Difco) et a un pH de 6, 0.
On introduit dans un flacon à secouer de 250 ml, 25 ml d'un milieu d'ensemencement d'un pH de 6, 0 qui contient 1% p/v d'extrait de levure et 7% v/v de sirop de mals riche en fructose (stériln sepa- rément). On inocule le milieu an moyen d'un prélèvement à la boucle de la culture inclinée et on le met à incuber pendant 24 heures à 30 C sur un secoueur rotatif.
On introduit 550 ml du milieu d'ensemencement décrit ci-dessus dans un flacon à secouer de 4 litres muni de chicanes. On inocule le milieu en transférant l'ensemble des 25 ml du premier flacon à secouer. On met le flacon à secouer de 4 litres a incuber pendant 24 heures à 30 C sur un secoueur rotatif jusqu' ce que la densite optique A 560 nm soit au moins 40.
On verse tout le contenu du flacon i secouer de 4 litres dans un fermenteur de 14 litres contenant 9, 5 litres du milieu d'ensemencement décrit precé- demment. Après 14 heures d'incubation sous aeration et agitation à 30 C, la densité cptique à 560 rm est d'au moins 40 dans le fermenteur.
On utilise le contenu du fermenteur ensuite pour inoculer un grand fermenteur de 250 litres contenant 136 litres du milieu de production. Le milieu de production a la constitution suivante : Sirop de mats riche en fructose 15 g/litre Extrait de levure 4, 5 g/litre
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Phosphate de dianmonium 1, 9 q/litre L-phénylalanine8,5g/litre Silicone antimouasea 100 ppm
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le est à peu pres de i50 litres après l'inocu- volumelation. on ajuste à 6,0 le pil dans le grand fermenteur par des additions d'ammoniaque aqueuse ? 29% ou d'acide sulfurique 10%. On agite ce milieu et on l'aère à
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raison de 1 volume tient la temperature ä 30oC.
Lorsque la densité optique 20 dans le grand on ajoute-lu de mals riche en fructose en quantité conduisant ä une concentration de 15 g par litre. Lorsque la densit optique 560 nm atteint 30, on ajoute de l'extrait de levure en quantité conduisant à une concentration de 9 g par litre. Apres tout. es les additions, le volume final est d'environ 165 litres.
Après environ 20 heures, l'activité de PAL dans le milieu de fermentation atteint une valeur de crete de 2140 unites oar litre. A ce moment, on arrête l'admission d'air, de meme que l'agitateur et on désaère la culture an moyen d'azote. On maintient le milieu de fermentation dans ces conditions ju & qu'au moment ou on récolte les cellules en faisant passer la uulture par une centrifugeuse à bol et disque.
EXEMPLE lb.-
On exécute la produetion de la L-phénylalanine & partir de l'acide cinnamique et de l'ammoniaque dans un bioréacteur au moyen de cellules entiares de hodotorula rubra ayant une haute activite enzymatique de PAL obtenues comme dans l'exempie la. On ajoute a 390 litres d'eau, 11, 2 kg d'acide trans-cinnamique, puis 470 litres d'ammoniaque aqueuse à 29%. Après la dissolution de l'acide cinnamique, on ajuste le pH de la solution A 10, 6 par addition de 31 kg de dioxyde de
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carbone. On désaère la solution par barbotage d'azote pendant 5 minutes. On ajoute 5,06 kg (en poids sec) de
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cellules de Rhodotorula la solution du e- & -on laisse 1 p-. ndant et se poursuivre 130 heures.
On ajoute périodiquement des Supplements de rubra asubstrat dans le bioréacteur sous la forme d'une solution concentrée de cinnamate l'ammonium, Après chaque addition, on melange brièvement le contenu du biréacteur par barbotage d'azote. On maintint la
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température dans le bioreacteur à 29*C pendant lespremières 17 heures de réaction, puis on la fait baisser graduellement jusqu'à 13 C à 130 heures.
Après 130 heures d'incubation, la solution de substrat contient 42, 7 g par litre de L-phénylalanine et 6 ; 4 g par litre d'acide trans-@nnamique. on sépare lee cellules de la solution de sub3trat au moyen d'une centrifugeuse à bol et disque.
On filtre le liquide surnageant centrifugé et on en chasse l'ammoniac et le carbonate d'ammonium par evaporation. Les cristaux de L-phénylalanine précipitent lors du refroidissement. On recueille les cristaux de L-phénylalanine dans une centrifugeuse à panier, on les rince à l'eau froide et on les sèche. On collecte ainsi 22 kg de L-phenylalanine.
EXEMPLE 2.-
Le present exemple décrit une experience démontrant l'induction de la production du PAL d l'aide d'une source d'azote brut. La source d'azote utilisee pour l'experience est une caséine hydrolysée vendue par la Société Sheffield Chemical, Memphis, Tennessee, E. U. A., sous la marque N-Z Amine. On compare l'efficacite de cette source d'azote brut à celle la phénylalanine pour induire la production du PAL.
On cultive la souche de Rhodotorula rubra décrite dans l'exemple 1 dans 10 litres du milieu de
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fertMentationcontenantdela:;pepton; (30 g par ;.''.''.''. '-'. ''.' litre) et tffrentes uantités ration mats ine e la L-phnylalanine..
On ient d'anmonaque * sulfurique à 10\., On al% en quantite 0, et on l'agite l'aided'un mücanique.'Les l'experience sont rassembles resultats brut peut remplacer la L-ph4nylalanine comme-inducteur de PAL.
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''. . '..'TABLEAU ''', ."'.. TABLEA
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<tb>
<tb> de <SEP> ; <SEP> Milieu <SEP> de <SEP> Activité <SEP> de <SEP> Concentration
<tb> fermentation <SEP> crête <SEP> du <SEP> PAL <SEP> finale
<tb> en <SEP>
<tb> celluLiqueur <SEP> Caséine <SEP> Concentra- <SEP> Activité <SEP> Poids
<tb> de <SEP> macé- <SEP> hydro- <SEP> tion <SEP> en <SEP> de <SEP> PAL <SEP> sec <SEP> de
<tb> ration <SEP> lysée <SEP> cellules <SEP> ## <SEP> cellules
<tb> de <SEP> maïs <SEP> g/1 <SEP> # <SEP> g/1
<tb> g/1 <SEP> g/1
<tb> 0 <SEP> 15 <SEP> 8,8 <SEP> 49,0 <SEP> 9,6
<tb> 2 <SEP> 15 <SEP> 8,8 <SEP> 56 <SEP> 10,0
<tb> 4 <SEP> 15 <SEP> 9,5 <SEP> 52 <SEP> 10,2
<tb> 10 <SEP> 15 <SEP> 9,2 <SEP> 57 <SEP> 10,6
<tb> L-Ph'eriylL-',
<tb> alanine <SEP> g/1
<tb> 0 <SEP> 1,5 <SEP> 7,0 <SEP> 49 <SEP> 7,7
<tb> 2 <SEP> 1,5 <SEP> 7,2 <SEP> 65 <SEP> 7,6
<tb> 4 <SEP> 1,5 <SEP> 7,9 <SEP> 46 <SEP> 7,
4
<tb> 10 <SEP> 1,5 <SEP> 7,9 <SEP> 53 <SEP> 8,6
<tb>
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* poids sec de ** par 9 de poids sec
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conversion of to L-phenylalanine using nylalanne nera-
Proclement stages (a) to propagate a microorganism producing phenylalanin ammonialyase (hereinafter PAL) in a nutrient medium
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@ 4 F aqueous:
PAL, (b) to put the cells of the PAL producer microorganism obtained in (a), either in the form of a complete culture broth, or in the form of cells which have been isolated therefrom, or to put the isolated enzyme into contact with ammonium ions and trans-cinnamate ions and allow the reaction to proceed under transient conditions of temperature and pH until the conversion to L-phenylalanine is substantially complete and (c) to separate and collect the L -phenylalanine out of the reaction mixture.
The above process is described, for example, in English Patent No. 1,489,468 (October 19, 1977).
A disadvantage of the application of this process to industrial production is the relative instability of PAL and its inhibition by the substrate which is trans-cinnamic acid. To promote the production of L-phenylamine and counteract the effects of inhibition by the substrate, the aforementioned English patent describes a process in which large masses of cells containing PAL and a concentration of ions are used.
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excess ammonium.
Yamada, S. et al. (Appl. And Environ.
Microbiol., 42, 773-778 (1981)) production of phenylalanine from transcinnamic acid using Rhodotorula glutinis cells containing PAL. They considered that the lack of prior practical application of a process was due to the low activity and instability of microbial PAL. Yamada et al. observed that Lisoleucine has a stabilizing effect on PAL and increases the useful life of the enzyme. These authors observed, in addition, the inhibitory effect of the substrate, noting that at the practicable concentrations of trans-cinnamic acid (150 mM), the rate of conversion
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L-phenylalanine is reduced to half the maximum.
Despite the improvements described above,
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the PAL process has not been applied to the industrial manufacture of L-phenylalanine by the Applicants. Instability and low activity of the enzyme is a persistent drawback of this process.
The subject of the present invention is a process
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improved production of phenylalanine ammonialyase according to which a PAL-producing micro-organism is cultivated under aerobic conditions promoting growth, the micro-organism is induced to produce PAL under the conditions of PAL production, then The medium containing the PAL is exposed to substantially static anaerobic conditions.
The Applicant has in fact discovered that a reduction in the aeration and the agitation of the fermentation medium after the induction of PAL improves the stability and prolongs the activity of the enzyme.
The patent application EUA 547. 158 of October 31, 1983 and the European patent application No. 84307523. 5 of October 30, 1984 indicate that phenylalanine ammonialyase is sensitive to degradation in the presence of oxygen and SOUR the influence of mechanical agitation. These patent applications therefore state that the stability and the useful life of the enzyme can be improved if the bioconversion reaction is carried out under substantially static anaerobic conditions.
According to the present invention, the fermentation process for producing the PAL has been improved by maintaining the fermentation medium under substantially static anaerobic conditions after the induction of the PAL. The exact mechanisms by which these
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conditions do not improve if they reduce the chemical and mechanical effects of the oxygen-stabilability of the enzyme and agitation, the hypothesis put forward is that these conditions also reduce the metabolic activities of the cells with a concomitant decrease in degra-
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nzyme donation.
Establishing proteolytics of the anaerobic statics in the fermentation medium after induction of PAL can significantly improve the overall efficiency and yield of a process for producing L-phenylalanine using this enzyme. There is usually a delay between 1a, PAL production, and the use of the enzyme to produce N-phenylalanine. This delay may result from the collection of cells or from conservation techniques. Significant loss of enzyme may occur during this time.
The anaerobic conditions8 can be established by various means, for example by bubbling an inert gas (such as nitrogen), by decreasing or. suppression of agitation and by limiting the volume of air above the surface of the medium containing the cells. Two or more of these techniques can be combined with advantage.
The static conditions are established by reducing the agitation to the minimum sufficient to maintain substantial homogeneity. Some agitation is generally desirable to prevent sedimentation of solids or components
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reaction links to solids.
Any PAL-producing microorganism can also be used in the process of the invention. The preferred microorganisms are in particular PAL-producing strains of bacteria of the genus Streptomyces and
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yeasts of the genera Rhodotorula, Rhodosporidium and Sporobolomyces. These microorganisms are described, for example, in the patent application EUA 547. 129 of October 31, 1983 and the European patent application No. 64307477. 4 of October 30, 1984. The microorganisms especially preferred are the strains of Rhodotorula rubra and Rhodosporidium toruloides described in Example 1 of these memoirs and repeated below.
These strains have been deposited with the United States Department of. Agriculture, Agricultural Research Collection, Northern Regional Research Ce ce, Peoria, Illinois September 8, 1983.
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NO u: atricu1eRhodotorula rubra strain GX3242 NRRL Y-15596 Rhodotorula rubra strain GX3243 NRRL Y-15597 Rhodosporidium toruloides strain GX 3248 NRRL Y-15598 Rhodosporidium toruloides strain GX 3249 NRRL Y-15599
The "PAL-producing microorganisms used in the process of the present invention require oxygen for their growth and, therefore, the cells are initially cultured under aerobic growth-promoting conditions. In general, the usual techniques are applied to cell culture.
The cells are inoculated into a nutritious medium containing assimilable sources of carbon and nitrogen and vitamins, minerals and other essential growth factors. Suitable sources of carbon include various refined or crude carbohydrates, such as glucose, sucrose, molasses, starches, cereals, etc. A preferred carbon source is glucose.
Sources of nitrogen include inorganic ammonium salts, such as ammonium phorphate, ammonium sulfate, ammonium acetate, ammonium citrate, ammonium nitrate, etc., and sub-
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organic nitrogenous stance such as soy flour, meat infusions, amino acids, corn maceration liquor, protein hydrolysates, peptone, yeast extracts, etc. A preferred nitrogen source for the the invention is yeast extract and this nutritive element can, with advantage, be combined with diammonium phosphate which simultaneously supplies nitrogen and phosphorus.
Vitamins, minerals and other growth factors can be supplied by carbon and nitrogen sources (for example by means of yeast extract) or can be supplied separately. These constituents can vary with the nature of the micro-organism used in particular. Normally o) go-elements such as zinc, manganese, iron, cobalt and calcium can be provided in the form of inorganic salts in growth promoting amounts. These minerals can, for example, be brought into water, for example tap water or sea water, etc. Nutrient media of the type described are conventional and can vary greatly in constitution.
After the cells have multiplied to the desired density of cells under aerobic conditions, they can be amended by induction to produce PAL under aerobic conditions for the production of PAL. PAL induction is usually achieved by adding small amounts of a compound that acts as a substrate for PAL. L-phenylalanine is a good inducer of PAL and a number of phenylalanine analogs also induce the synthesis of this enzyme. For example, D, Lphenylalanine, L-tyrosine and D, L-tyrosine are suitable for this purpose. In addition, it has been discovered that different sources of crude nitrogen can be used to induce PAL.
Such sources of raw nitrogen
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are notably hydrolyzed protcins which contain sensitized amounts of N-phenylalanine or L-tyrosin6. Casein or blood hydrolysates can be used with advantage as sources of crude nitrogen to induce the synthesis of PAL.
The PAL inducer is added to the cells in a PAL-inducing amount, which generally ranges from about 0.1 to 10 g per liter of fermentation medium. Preferably, .. PAL driver is used! in a concentration of about 4 to 8 g per liter of the fermentation medium. During this operation, the temperature and pH conditions, the aeration and the agitation inducing the PAL are maintained. The temperature and pH are generally kept between physiologically compatible limits during induction of PAL.
Reduced temperatures, for example from about 15 ° C to about 25 ° C, are preferred because at these lower temperatures the stability of the enzyme is better and the rate of consumption of the inductor PAL is decreased. A preferred pH for the induction of PAL ranges from about 5.5 to about 7.5, where relatively high concentrations of PAL are reached.
If the cells used are sensitive to the catabolic repression of PAL synthesis, means must be used, before induction, to rarefy or suppress catabolites or their precursors outside the medium. This can be accomplished by separating the cells from the medium, washing the cells, and suspending the cells in catabolite-free medium. Alternatively, the cells can be left growing until the elements. nutrients are substantially depleted before induction of PAL is started.
The cells are cultivated with advantage in
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the conditions for the induction of PAL until the activity of PAL reaches at least about 0.5 and preferably at least about 2 units per ml. It has been observed that under these conditions the activity of PAL increases to a certain extent and then begins to decrease. The PAL obtained by these methods can be used to produce the phenylalanine ci from the trans-cinnamic acid and from ammonia.
After the induction of PAL and the accumulation of PAL activity up to the desired value, the appreciably static anaerobic conditions are established in the fermentation medium. In general, these conditions are established by stopping the aeration and stirring and by bubbling an inert gas such as nitrogen into the medium. Normally, in a batch reaction system, the cells are harvested by centrifugation and transferred to a twin-engine. In such a case, the substantially static anaerobic conditions are also entered. es aspres the harvest.
As previously indicated, phenylalanine ammonia lyase has been shown to be very sensitive to degradation in the presence of oxygen and under the influence of agitation. While the stirring in conventional reactors (for example deep fermentation tanks) is carried out with a power of about 0.5 to 1 watt per liter, the stirring of the fermentation mixtures according to the invention is advantageously ensured with an average power of less than about 400 and preferably less than about 100 milliwatts per liter.
Higher powers, for example up to about 5 watts per liter, are also applicable, but in this case the stirring is intermittent, for example 30 seconds of stirring at intervals of 2 hours.
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The nature of the agitation also seems to influence the stability of the enzyme. Mixing under low shear is preferred. Such agitation is
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advantageous by injeotion jaz in gaz. than nitrogen in the reaction mixture.
In addition, mechanical stirrers used for stirring must be used beforehand. In general, the stirring is just sufficient to maintain the substantial homogeneity of the mixture.
The phenylalanine ammonia lyase produced by the process of the invention is used to catalyze the conversion of trans-cinnamic acid and ammonia to L-phenylalanine. This conversion is carried out by bringing the enzyme into contact, in the form of whole cells, in the form of an isolated enzyme or in the immobilist form, with a solution of the substrate under the conditions of production of phenylalanine. A particularly preferred method for carrying out this conversion reaction is described in the patent application EUA 547. 258 of October 31, 1983 and the European patent application No. 84307523.5 of October 30, 1984.
Bioreaction is continued until sensitive amounts of L-phenylalanine accumulate in the reaction mixture. In general, isolation is how when the concentration of: "-phenylalanine
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reaches approximately 30 c preferably reaches approximately 45 to 50 g per liter. L-phenylalanine can be isolated from the reaction mixture in any suitable way. For example, the solids can be separated by filtration or centrifugation to leave a clarified solution in which L-phenylalanine can be precipitated by adjusting the pH to the isoelectric int of L-phenylalanine. namely about 5, 5.
The invention is further illustrated without being limited by the following examples.
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EXAMPLE
The present example describes a fermentation process for producing phenylalanine ammonilyase in accordance with the present invention. Rhodotorula rubra, strain NRRL Y-15597 is cultivated at 30 ° C. from inclined malt agar. The agar medium contains 1% malt extract (Difco) and 1.5% agar (Difco) and has a pH of 6.0.
25 ml of a seeding medium with a pH of 6.0, which contains 1% w / v yeast extract and 7% v / v mal syrup, are introduced into a 250 ml shaking flask. rich in fructose (sterile separately). The medium is inoculated by means of a sample from the loop of the inclined culture and it is incubated for 24 hours at 30 ° C. on a rotary shaker.
550 ml of the seeding medium described above are introduced into a 4 liter shaking flask fitted with baffles. The medium is inoculated by transferring all of the 25 ml from the first bottle to be shaken. The 4 liter shaking flask is incubated for 24 hours at 30 ° C. on a rotary shaker until the optical density at 560 nm is at least 40.
The entire contents of the 4-liter shake bottle are poured into a 14-liter fermenter containing 9.5 liters of the seed medium described above. After 14 hours of incubation with aeration and shaking at 30 ° C., the cptic density at 560 rm is at least 40 in the fermenter.
The contents of the fermenter are then used to inoculate a large 250 liter fermenter containing 136 liters of the production medium. The production medium has the following constitution: Mats syrup rich in fructose 15 g / liter Yeast extract 4, 5 g / liter
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Dianmonium phosphate 1.9 q / liter L-phenylalanine 8.5 g / liter Silicone anti-mud 100 ppm
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the is about 150 liters after the inocu- volumelation. the pil is adjusted to 6.0 in the large fermenter by additions of aqueous ammonia? 29% or 10% sulfuric acid. We stir this medium and air it to
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1 volume holds the temperature at 30oC.
When the optical density 20 in large is added amount of fructose rich in quantity leading to a concentration of 15 g per liter. When the optical density 560 nm reaches 30, yeast extract is added in an amount leading to a concentration of 9 g per liter. After all. es additions, the final volume is about 165 liters.
After approximately 20 hours, PAL activity in the fermentation medium reaches a peak value of 2140 units per liter. At this time, the air intake is stopped, as is the agitator and the culture is deaerated using nitrogen. The fermentation medium is maintained under these conditions until the cells are harvested by passing the culture through a bowl and disc centrifuge.
EXAMPLE lb.-
The production of L-phenylalanine is carried out from cinnamic acid and ammonia in a bioreactor using whole hodotorula rubra cells having a high enzymatic activity of PAL obtained as in example 1. To 390 liters of water, 11.2 kg of trans-cinnamic acid are added, followed by 470 liters of 29% aqueous ammonia. After the dissolution of the cinnamic acid, the pH of the solution A 10.6 is adjusted by the addition of 31 kg of dioxide
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carbon. The solution is deaerated by bubbling nitrogen through for 5 minutes. 5.06 kg (dry weight) of
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Rhodotorula cells the solution of e- & -on leaves 1 p-. ndant and continue for 130 hours.
Supplements of rubra asubstrate are periodically added to the bioreactor in the form of a concentrated solution of ammonium cinnamate. After each addition, the contents of the twin-jet are briefly mixed by bubbling nitrogen. We maintained the
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temperature in the bioreactor at 29 ° C during the first 17 hours of reaction, then it is gradually lowered to 13 C at 130 hours.
After 130 hours of incubation, the substrate solution contains 42.7 g per liter of L-phenylalanine and 6; 4 g per liter of transnamic acid. the cells are separated from the substrate solution by means of a disc and bowl centrifuge.
The centrifuged supernatant is filtered and the ammonia and ammonium carbonate are removed by evaporation. L-phenylalanine crystals precipitate upon cooling. The L-phenylalanine crystals are collected in a basket centrifuge, rinsed with cold water and dried. 22 kg of L-phenylalanine are thus collected.
EXAMPLE 2.-
This example describes an experiment demonstrating the induction of PAL production using a source of raw nitrogen. The nitrogen source used for the experiment is a hydrolyzed casein sold by the Sheffield Chemical Company, Memphis, Tennessee, E.U.A., under the brand name N-Z Amine. The effectiveness of this raw nitrogen source is compared to that of phenylalanine to induce the production of PAL.
The strain of Rhodotorula rubra described in Example 1 is cultivated in 10 liters of the medium.
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fertMentationincluding:; pepton; (30 g per;. ''. ''. ''. '-'. ''. 'Liter) and various amounts ration matte ine e L-phnylalanine ..
We have an ammonia * sulfuric at 10 \., We have 0% in quantity 0, and stirred with the help of a mechanical. 'The experience is combined raw results can replace L-ph4nylalanine as inducer PAL.
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'' . '..' TABLE '' ',. "' .. TABLEA
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<tb>
<tb> of <SEP>; <SEP> Medium <SEP> of <SEP> Activity <SEP> of <SEP> Concentration
<tb> fermentation <SEP> peak <SEP> of final <SEP> PAL <SEP>
<tb> in <SEP>
<tb> celluLiqueur <SEP> Casein <SEP> Concentra- <SEP> Activity <SEP> Weight
<tb> of <SEP> maceration <SEP> hydro- <SEP> tion <SEP> in <SEP> of <SEP> PAL <SEP> sec <SEP> of
<tb> ration <SEP> lysed <SEP> cells <SEP> ## <SEP> cells
<tb> of <SEP> corn <SEP> g / 1 <SEP> # <SEP> g / 1
<tb> g / 1 <SEP> g / 1
<tb> 0 <SEP> 15 <SEP> 8.8 <SEP> 49.0 <SEP> 9.6
<tb> 2 <SEP> 15 <SEP> 8.8 <SEP> 56 <SEP> 10.0
<tb> 4 <SEP> 15 <SEP> 9.5 <SEP> 52 <SEP> 10.2
<tb> 10 <SEP> 15 <SEP> 9.2 <SEP> 57 <SEP> 10.6
<tb> L-Ph'eriylL- ',
<tb> alanine <SEP> g / 1
<tb> 0 <SEP> 1.5 <SEP> 7.0 <SEP> 49 <SEP> 7.7
<tb> 2 <SEP> 1.5 <SEP> 7.2 <SEP> 65 <SEP> 7.6
<tb> 4 <SEP> 1.5 <SEP> 7.9 <SEP> 46 <SEP> 7,
4
<tb> 10 <SEP> 1.5 <SEP> 7.9 <SEP> 53 <SEP> 8.6
<tb>
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* dry weight of ** by 9 of dry weight