DE1795356B2

DE1795356B2 - Verfahren zur Herstellung von Inosin und y-Guanosinmono-.di-undtriphosphorsäure auf fermentativem Wege

Info

Publication number: DE1795356B2
Application number: DE1795356A
Authority: DE
Inventors: Shigeo Tokio Abe; Akira Furuya; Ryo Okachi
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1967-09-27
Filing date: 1968-09-18
Publication date: 1974-09-05
Also published as: DE1795356A1; FR1582375A; DE1795356C3; GB1209711A; US3616212A

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Inosin und S'-Guanosinmono-, -di- und -triphosphorsäure auf fermentativem Wege durch Züchten eines Mikroorganismus und anschließende Isolierung der genannten Produkte aus dem Kulturmedium.

Inosin, ein Hypoxanthinribosid, findet sich im Fleisch sowie in Fleischextrakten und in Zuckerrüben. Inosin hat ebenso wie die 5'-Guanylsäurenukleotide 5'-Guanosinmono-, -di- und -triphosphorsäure eine weit verbreitete Verwendung in der Biochemie gefunden. Inosin kann beispielsweise aus Adenosin durch chemische Desaminierung mit Nitrit oder durch enzymatische Desaminierung hergestellt werden (vgl. die deutsche Auslegeschrift I 134 995 und »Hoppe-Seyler's Z. für physiologische Chemie«, 324 [1961], S. 163 bis 168). Inosin kann auch auf fermentativem Wege durch Züchten von Mikroorganismen der Gattu.ig Bazillus substilis in üblichen Nährmedien, die einfache Purine als Zusatz enthalten, hergestellt werden (vgl. die französischen Patentschriften 1 321 318 und 1 461 183). Das 5'-Guanosinmonophosphat (GMP) kann durch enzymatische Hydrolyse von Hefenukleinsäure (vgl. französische Patentschrift 1 369 382), durch Phosphorylierung von Guanosin (vgl. französische Patentschrift 1 369 079) oder durch Züchten von Mikroorganismen (vgl. französische Patentschrift I 372 054) hergestellt werden. Auch ist die Herstellung von 5'-Guanosindiphosphat (GDP) und von 5'-Guanosintriphosphat (GTP) durch Züchten von Mikroorganismen in Gegenwart von 5'-Guanylsäure oder in Gegenwart von Guanin bekannt (vgl. französische Patentschriften I 343 794 und I 440 633).

Demgegenüber ist es nach dem erfindungsgemäßen Verfahren möglich, auf fermentativem Wege gleichzeitig Inosin, das in großem Umfange als Medikament verwendet wird, und S'-Guanosinmono-, -di- und -triphosphorsäure, die wichtige Nahrungsmittelzusätze darstellen, im Rahmen eines einzigen, technisch einfachen Verfahrens dadurch herzustellen, daß man die Stämme Brevibacterium ammoniagenes ATCC 21264 oder Corynebacterium glutamicum ATCC 21266 in einem Nährmedium, das pro ml S,0 bis 30,0 mg S'-Xanthylsäure enthalt, züchtet und die genannten Produkte aus dem Kulturmedium isoliert.

Die in dem erfindungsgemäßen Verfahren als Ausgangsmaterial eingesetzte 5'-XanthyIsäure kann in erheblichen Mengen großtechnisch auf fermentativem Wege hergestellt werden (vgl. die britische Patentschrift I 170 970) und ist daher leicht zugänglich. Nach diesem Verfahren können die bisher als technisch wertlos verworfenen Abfallmelassen in S'-Xanthylsäure überführt werden, aus der ihrerseits nach dem erfindungsgeraäßen Verfahren Inosin und die Guanylsäurenukleotide hergestellt werden können.

Bei den erfindungsgemäß verwendeten Miikroorganismenstämraen Brevibacterium ammoniagenes ATCC 21264 und Corynebacterium glutamicum ATCC 21266 handelt es sich um Mutanten, die durch Behandlung von Stämmen der gleichen Art mit üblichen niiutagenen Mitteln erhalten worden sind. Sie sina dadurch charakterisiert, daß sie für ihr Wachstum Adenin. Adenosin oder Adenylsäure benötigen und außerdem wird das Wachstum durch Purinverbindungen beschleunigt.

Man kann jedes synthetische Kulturmedium oder jedes natürliche Kulturmedium für di··; Züchtung verwenden, sofern es die für das Wachstum der eingesetzten Mikroorganismen erforderlichen Nährstoffe enthält. Derartige Nährstoffe sind bekannt. Beispielsweise seien eine Kohlenstoffquelle, eine Stickütoffquelle und anorganische Verbindungen erwähnt. Diese Materialien werden von den erfindungsgemäß eingesetzten Mikroorganismen in den entsprechenden Mengen verbraucht.

Beispiele für Kohlenstoffquellen, die in dem wäßrigen Nährmedium eingesetzt werden können, sind Kohlehydrate, wie beispielsweise Glukose, Fruktose, Maltose, Rohrzucker, Stärke, Stärkehydrolysate und Abfallmelassen. Es kann auch jede andere geeignete Kohlenstoffquelle verwendet werden, beispielsweise Glyzerin, Mannit, Sorbit, organische Säuren, wie beispielsweise Essigsäure, Milchsäure, Glutaminsäure od. dgl. Diese Substanzen können entweder einzeln oder in Mischungen aus zwie oder mehreren Substanzen verwendet werden.

Als Stickstoffquelle kommen verschiedene Arten von organischen oder anorganischen Salzen oder Verbindungen in Frage, beispielsweise Harnstoff, Ammoniak oder Ammoniumsalze, z. B. Ammoniumchlorid. Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat und Ammoniumphosphat. Außerdem kann man natürliche Substanzen, die Stickstoff enthalten, verwenden, z. B. Maisquellwasser, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Fischmehl, Pepton, Fleischbrühe, Caseinhydrolysate, lösliche Fischbestandteile, Reiskleieextrakt und Casaminosäure. Diese Substanzen können ebenfalls entweder allein oder in Kombination aus zwei oder mehreren Substanzen eingesetzt werden.

Anorganische Verbindungen, welche dem Kulturmedium zugesetzt werden können, sind beispielsweise Magnesiumsulfat, Natriumphosphat, Kaliiumdihydrogenphosphat, Kaliummonohydrogenphosphat, Eisen^ sulfat, Manganchlorid, Calciumchlorid, Natriumchlorid und Zinksulfat, wobei Mangan(ll)-ionen im Überschuß die erfindungsgemäße Umwandlung von S'-Xanthylsäure in die angegebenen S'-Guanylsäurenuklcotide verhindern. Dieser unerwünschte Effekt kann jedoch durch Zusatz eines grenzflächenaktiven Mittels wieder aufgehoben werden.

Darüber hinaus muß das Nährmedium neben den vorstehend angegebenen Adeninverbmdungen bestimmte weitere wesentliche Nährstoffe enthalten, wie Biotin oder Pantothenat.

In manchen Fällen ist es vorteilhaft, ein grenzflächenaktives Mittel dem Kulturmedium zuzugeben. Beispielsweise kann der inhibierende Effekt von Mn⁸*- Jonen auf die Umwandlung der 5'-Xanthylsäure in die 5'-Guanylsäurenukleotide nach dem erfindungsgemäßen Verfahren dadurch aufgehoben werden, daß man dem Kulturmedium ein grenzflächenaktives Mittel zusetzt, so daß das erfindungsgemäße Verfahren auch mit einem Mn²*-Ionen enthaltenden Nährmedium durchgeführt werden kann (vgl. das weiter unten folgende Beispiel 2). Grenzflächenaktive Mittel, weiche verwendet werden können, können entweder anionisch, kationisch oder nicht-ionisch sein. Derartige Mittel sind bekannt. Sie bestehen im allgemeinen aus den Natriumsalzen höhermolekularer Alkylsulfate oder -sulfonate, Polyoxyäthylenglykolderivaten, höheren Fettsäuren mil 12 bis 20 Kohlenstoffatomen, beispielsweise Laurinsäure, Myristinsäure, Palmitinsäure, Stearinsäure, ölsäure oder organischen Estern höherer Fettsäuren, wie beispielsweise Sorbitanmonooleat.

Die 5'-XanthyIsäure kann dem Medium zu dem Zeitpunkt zugesetzt werden, zu welchem der Mikroorganismus überimpft wird, sie kann aber auch dann zugegeben werden, wenn das Wachsen des Mikroorganismus stattgefunden hat. Die Menge an 5'-Xanthylsäure, weiche Jem Medium zugesetzt wird, schwankt zwischen 5,0 und 30,0 mg/ml. Reine 5'-Xanthylsäure selbst oder D'-Xamfiy!säure enthaltende Substanzen sowie Kulturbrü5ien welche 5'-Xanthylsäure enthalten (hergestellt durch Fermentation, vgl. britische Patentschrift I 170 970), können als Additive für das Medium verwendet werden, sofern die jeweilige Form der eingesetzten 5'-Xanthylsäure nicht in nachteiliger Weise das Wachsen der Mikroorganismen, die Anreicherung von Inosin oder die Umwand- 4" lung in 5'-Guanylsäurenukleotide beeinflußt.

Die Gärung wird unter aeroben Bedingungen durchgeführt, beispielsweise durch aerobes Schütteln der Kultur oder durch Lüften und Rühren einer Submerskultur bei einer Temperatur von 20 bis 40 C und bei einem pH-Wert von 5 bis 9. Der pH-Wert des Mediums kann unter Verwendung von Chlorwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Harnstoff, wäßrigem Ammoniak, Natriurnhydroxyd oder Kaliumhydroxyd während der Züchtung in entsprechender Weise eingestellt werden. Nach 2- bis 6tägigem Züchten unter diesen Bedingungen werden große Mengen an 5'-Guanosinmono-, -di- und -triphosphorsäure zusammen mit Inosin in der Kulturbrühe und den Mikroorganismenzellen angereichert. Nach Beeudigung des Züchtens können die angereicherten Produkte als einzelne Substanzen oder als Mischung nach üblichen Methoden abgetrennt werden, beispielsweise durch Behandlung mit einem lonenaustauscherharz, durch Ausfällen mit Metallsalzen, durch Adsorption, Extraktion oder Chromatographie.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung. Sofern nicht anders angegeben, beziehen sich die Prozentangaben auf das Gewicht pro Liter Wasser.

⁶5 Beispiel I

Brevibacterium ammoniagenes ATCC 21264, erhal ten aus Brevibacterium ammoniagenes ATCC 6872 durch Bestrahlung mit UV-Licht, wurde als Impfstamm verwendet. Er erfordert for sein Wachstum Adenin. Die Mutante wurde unter aerobem Schütteln bei 30'C 24 Stunden lang in einem Kulturmedium (pH 7,2) gezüchtet, das 2% Glukose, 1% Pepton, \% Hefeextrakt und 0,3",, Natriumchlorid enthielt. Auf diese Weise wurde eine Impfkultur erhalten.

20 ml-Portionen des nachstehend beschriebenen Impfmediums wurden in konische Kolben mit einem Fassungsvermögen von 250 ml gegossen wid bei 120° C 10 Minuten lang unter erhöhtem Druck sterilisiert.

Ein Nährmedium der folgenden Zusammensetzung wurde hergestellt:

10	/0	Glukose
0,6	°/	Harnstoff
1,0	/0	K₂HPO₄
1,0	°/ /O	KH₂PO₁
1,0	O/ /O	MgSO₁ · 7 H„O
0,01	^a/ /0	CaCI₂ · 2 H₂O
30	*v-gß*	Biotin
20	mg/1	Adenin
	mg/1	Vitamin B,
10	mg/1	Calciumpanthothenat
1.0	0/	Fleischextrakt

Der pH-Wert»Jes Nährmediums wurde durch Verwendung einer verdünnten Natriumhydroxydlösung vor der Sterilisierung auf 7,8 eingestellt.

Vor dem Überirnpfen der Impfkultur in das Nährmedium wurde 5'-Xanthylsäure (80%ige Reinheit) in einer solchen Menge zugesetzt, die ausreichte, um eine Konzentration von 20 mg/ml zu ergeben. Die Impfkultur wurde in das Nährmedium in einer Menge von IO Volumprozent, bezogen auf die Menge des Nährmediums, überimpft.

Das Züchten wurde dann unter aerobem Schütteln der Kultur bei 30 C durchgeführt. Nach 72stündigem Züchten wurde der pH-Wert der Flüssigkeit unter Verwendung von verdünntem Ammoniakwasser auf 7,5 eingestellt. Die Fermentation war nach 120stündigem Züchten beendet.

Nach Beendigung der Fermentation hatten sich 13 mg/ml Inosin, 3,4 mg/ml 5'-GMP, 2,8 mg/ml 5'-GDP und 7,7 mg/ml 5'-GDP in der Kulturbrühe angereichert. Zusätzlich wurde die Anreicherung von kleinen Mengen an Guanosin, Guanin bzw. Hypoxanthin beobachtet. Eine kleine Menge an restlicher 5 -Xanthylsäure verblieb in dem Medium.

Beispiel 2

Brevibacterium ammoniagenes ATCC 21264 wurde als Impfmikroorganismus verwendet. Der Impfstamm wurde in der gleichen Weise wie in Beispiel I zur Erzielung einer Impfkultur gezüchtet.

Das verwendete Nährmedium hatte die folgende Zusammensetzung:

13 %

0,6 % 0,5 % 0,5 %
0,5 % 0,01 %
10 mg/1
I mg/1 5 mg/1

verzuckerte Stärke-Flüssigkeit

(berechnet als Glukose)

Harnstoff

KH₂PO₄

K₂HPO₄

MgSO₄

CaCI₂ ·

FeSO₄ ·

ZnSO₄

MnCl₂

7 H₂O 2 H₂O 7 H₂O 7 H₂O 4 H₂O

1 791 356

5 mg/1 Vitamin j

IQ mg/1 ^alciumpantnothenat

30 mg/1 Adenin

30 μβ/l Biotin

1,0 % Casaminasäure

Die Impfkulturbrühe wurde in einer Menge von 10 Volumprozent in das Nährmedium überimpft. Das Züchten wurde anschließend unter aerobem Schütteln der Kultur bei 35° C 72 Stunden lang durchgeführt, Zu diesem Zeitpunkt wurde eine gleiche Menge, 5'-XanthyIsäure enthaltende Nährflüssigkeit (die 30 mg/ml 5'-Xanthylsäure enthielt) der Kulturbrühe zugesetzt. Zusätzlich wurden 3,0 mg/m! Polyoxyäthylenstearylamin (ein grenzflächenaktives Mittel) der Flüssigkeit zugesetzt. Das Züchten wurde anschließend weitere 48 Stunden lang durchgeführt. Während des Züchtens wurde eine Ammoniumsulfatlösung in einer solchen Menge zugesetzt, daß eine Endkonzentratton von 0,5 % erreicht wurde. Anschließend wurde der pH-Wert unter Verwendung von verdünntem Natriumhydroxyd auf 7.8 eingestellt.

Nach Beendigung der Fermentation hatten sich 6,8 mg/ml lnosin, 7,4 mg/ml 5'-GMP und 3.4 mg/ml 5'-GTP in der Flüssigkeit angereichert. Darüber hinaus wurde die Anreicherung von kleinen Mengen 5'-GDP, Guanin bzw. Guanosin festgestellt. Nur eine kleine Menge an restlicher 5'-Xanthylsäure verblieb in der Kulturbrühe.

Beispiel 3

Corynebacterium glutamicum ATCC 21266, ein Mutantenstamm, der durch Behandlung von Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 mit Nitrosoguanidin erhalten worden war, wurde als Impfstamm verwendet. Das charakteristische Merkmal diese» Stammes besteht darin, daß sein Wachstum durch S Adenin. Guanin oder Hypoxanthin stark beschleunigt wird.

Es wurde ein Nährmedium der folgenden Zusammensetzung verwendet:

13,0% Glukose 1,0% KH₂PO₄

1,0% K₈HPO₁ 1,0% MgSO₄- 7 HjO 1,5% NH₁CI 0,5% Hefeextrakt 3,0% CaCO₃

Das CaCO₃ wurde nach der Sterilisierung zugesetzt. Der pH-Wert des Mediums betrug 7,3.

Die Impfkultur wurde in das Nährmedium in einer Menge von IO Volumprozent überimpft. Darüber hinaus wurden 20 mg/ml 5'-Xanthylsäure dem Medium zu dem Zeitpunkt der U^kirimpfung zugesetzt. Die anderen Bedingungen entsprachen den Bedingungen, wie sie in Beispiel I beschrieben worden sind. *5 Das Züchten wurde unter aerobem Schütteln 120 Stunden lang durchgeführt. Während des Züchtens wurde zur Linsteilung des pH-Wertes eine 20%ige Harnstofflösung verwendet.

Als Ergebnis der Fermentation wurden 9,7 mg/ml

lnosin, 6~4 mg/ml 5'-GMP, 4,2 mg/ml 5'-GDP bzw.

3.8 mg/ml 5'-GTP in der Kulturbrühe beobachtet.

Zusätzlich fand man eine kleine Menge an restlicher

5'-Xanthylsäure in der Flüssigkeit.

Claims

I 795 Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung von Inosin und S'-Guanosinmono*. -di- und -triphosphorsäure auf fermentativem Wege durch Züchten eines Mikroorganismus und anschließende Isolierung der genannten Produkte aus dem Kulturmedium, d adurch gekennzeichnet, daß als Mikroorganismus Brevibacterium aramoniagenes ATCC to 21264 oder Corynebacterium glutamicum ATCC 21266 verwendet wird und die Züchtung in einem Nährmedium durchgeführt wird, das pro ml 5,0 bis 30,0 mg 5'-Xanthylsäure enthält.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Nährmedium außerdem ein grenzflächenaktives Mittel enthält.