DE2336765A1 - Verfahren zur herstellung von mutterkornalkaloiden, vorzugsweise von ergokryptin und ergokornin, durch fermentation - Google Patents

Description

VERFAHREN ZOR HERSTELLUNG VON MUiTTERKOIlNAIiKALOIDSN, VORZUGBWEtSfi

FERMENTATION

VORZUGBWEtSfi VON EHGOKHYPiIN UND ERGQKORNIN DURCH

Die Erfindung bezieht "sich auf ein Verfahren zur Herstellung von Mutterkornalkaloide^ hauptsächlich von Ergo-"^fyjptin und Ergokornin durch Ferment ation*

Nach den ersten, eher prinzipiell bedeutungsvollen Versuchen zur saprophytischen Alkaloidproduktion gelang es als erstes, dass Grundgerüst der klassischen Mutterkornalkaloide bildende Lysergsäureamid auf dem Wege der Fermentation in auch für industrielle Zwecke geeigneter Weise her-

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zustellen (Britische Patentschriften Nr. 883 229 und 1 041 246). Die Ausarbeitung der Verfahren wurde von zwei Umständen entscheidend beeinflußt: Der Lysergsäureamid produzierende, auf Gräsern gefundene Olaviceps paspali versus
fügt im Gegensatz zu de«\Roggen stammenden Claviceps-Stämmen über außerordentlich günstige Züchtungseigenschaften, und zweitens ist das Produkt Lysergsäureamid wasserlöslich und reichert sich daher während des Prozesses, nachdem ee von der Pilzzelle in den Nährboden abgeschieden wurde, in der Flüssigkeit an.

Auf Grund der bei den ^Lysergsäureamid-Verfahren gesammelten Erfahrungen war das erste Fermentationsverfahren zur Herstellung eines Nutzalkaloidjfs ein Verfahren but Herstellung des ebenfalls wasserlöslichen Ergometrins (Britische Patentschrift Nr, 1 071 846). Der in diesem Verfahren verwendete Stamm ist ein weiterer Vertreter des erwähnten Olaviceps paspali. Wenig später wurde zur fermentativen Gewinnung des Ergometrins ein in größerem HaBe anwendbares,\ entsprechendes Alkaloidniveau gewährleistendes Verfahren ausgearbeitet» bei dem bereits der natürliche, charakteristische Stamm der freilandmutterkorn-Alkaloide, der Eoggensohmarotzer Olavicepe purpurea Verwendung fand "!Schweizerische Patentschrift Hr.

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Die Mutterkämalkaloid-Jermentationen, die den Stamm

Olaviceps purpurea verwenden und auf die Herstellung der in Waseer schlecht löslichen Alkaloide vom Peptid-Typus, wie zum Beispiel die Glieder der Ergotoxingruppe oder des Brgotamins gerichtet sind, zeigen Jedoch entgegen zahlreichen Literaturangaben auch heute noch Unsicherheiten-in

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der Reproduzierbarkeit, Die aus drei Aminosäuren bestehende cyclische Seitenkette der Alkaloide vom Peptid-Typ · " macht den Vorgang der Biosynthese kompliziert. Außerdem häuferi sich die in Wasser schlecht löslichen Alkaloide in den Zellen an, was sowohl für die Bildung des Alkaloide^ wie auch vom ßtandpunkt seiner Abtrennung aus der Fermentflüssigkeit nachteilig ist.

Die Biosynthese der Alkaloide vom Peptid-Typ wird günstig beeinflußt, wenn der Kultur während des ganzen Fermentationsvorganges ausreichend Stickstoff zur Verfügung steht. Zu diesem Zwecke wird gemäß früheren Verfahren eine gut verwertbare Aminosäure (DBP Nr. 1 007 94-9) oder eine komplexe Stickstoffquelle natürlichen Ursprungs, zum Beispiel Hefeextrakt, Pepton, Gemüse extrakt. (DBP Nr, 1 120 128), meistens in einer Menge von 1 %_t zum Nährboden gegeben.

Die Verwendung dieser Stoffe birgt die Gefahr in sich, daß durch sie gleichzeitig das Wachstum des Pilzes beschleunigt wird} eine schnellwüchsige Kultur ist jedoch wenig oder gar nicht zur Bildung solcher ßtoffwechselprodukte wie des Mutterkornalkaloide¹ β im Stande. I¹Ur diese Stoffwechseiprodukte ist ganz allgemein charakteristisch, daß sie beim sogenannten sekundären Stoffwechsel, also bei gehemmtem, verlangsamtem Stoffwechsel gebildet werden.

Bei der Isolierung der in den Pilzzellen angereicherten Alkaloide vom Peptid-Typ wird zwangsläufig auch ein Teil des Lipoid- und Pigment gehalt es. der Zellen extrahiert. Diese Stoffe zeigen ein den Alkaloiden ähnliches.Lösungs- und Verteilungsverhalten, wodurch die Reinigung der Alkaloide außerordentlich erschwert wird. Auf die Verminderung

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der bei der Fermentation gebildeten Pigmentmenge wird bei ölen bekannten Verfahren nicht hingewiesen. Im Gegenteil: Die zur Gewährleistung des sekundären Stoffwechsels notwendige Wachstumshemmung wird bei den meisten Verfahren durch den niedrigen Phosphorgehalt des Nfihrmediums (0,25 g Kaliumdihydrogenphosphat/Liter) erreicht. Diese geringe Phosphormenge wird innerhalb weniger Tage aufgebraucht» das Wachsttun verlangsamt sich, aber gleichzeitig beginnt infolge des Phosphormangels eine starke Pigmentbildung (z. B. österreichische Patentschrift Nr. 259 770).

Ziel der Erfindung ist zwecks Beseitigung obiger Mangel die Isolierung eines Claviceps-purpurea-Stämmes, der zur fermentativen -froduktion von Alkaloiden des Peptid-Typs im Stande ist, anorganische Stickstoffquellen gut verwertet, auch auf Nährboden mit erhöhtem Phosphorgehalt Alkaloid produziert,*- und dessen Alkaloidbildung so schnell vor sich geht, daß das Alkaloidniveau der Kultur sieh am bis 7· ^^aS d-^em" erreichbaren Maximum annähert·

Zur Isolierung eines solchen Stammes wird in folgender Weise vorgegangen: Der Stamm Olaviceps purpurea wird aus einem Sklerosium mit hohem Alkaloidgehalt gezüchtet· In Zyklen, die aus drei Impfschritten bestehen, wird mittels Selektion die dem Zweck entsprechende Variante fortlaufend angereichert. In den einzelnen Impfzyklen wird mit der von einem festen, Nährboden abgenommenen Kolonie eine Impfkultur in flüssigem Nährmedium gezüchtet, aus dieser durch Weiterimpfen eine alkaloidproduzierende Flüssigkultur hergestellt und deren Material erneut auf festen Nährboden aufgebracht.

Jedem Nahrmedium wird Ammoniumnitrat zugesetzt, 3 09885/U3 5

und zwar der sinkenden Empfindlichkeit des Pilzee entsprechend in steigender Menge von 1,0 bis 10,0 g/Diter» Dem flüssigen Nährmeditim der alkaloidproduzierenden Kultur werden pro Liter 0,5 g Kaliumdihydrogenphosphat zugesetzt. Gleichzeitig wird das Nährmedium durch Zusatz von 20 g Natriumchlorid pro Liter ergänzt (Schweizerische Patentschrift N_r, 501 ?28).

Von dem festen Nährboden werden die scharf umgrenzten, kegelförmig herausragenden , keine Konidien bildenden Kolonien ausgesucht* Von den alkaloidproduzierenden flüssigen Kulturen werden jene auf festes Nährmedium zurückgeimpft, die am 6. und 7· Tag das höchste Alkaloidniveau erreicht haben und innerhalb des Alkaloidniveaus die größte ^enge an Alkaloiden vom Peptid-Typ enthalten; Die zur Alkaloidbildung notwendige Wachstumshemmung wird bei gesteigerter Phosphorkonzentration durch den Zusatz des Natriumchlorids erreicht·

Mit dem kurz umrissenen Verfahren wurd© ein Btamm isoliert t der eine zur Bildung iron Brgokryptin und lörgokornin befähigte Variante von Olaviceps purpurea darstellt* und über die gewünschten vorteilhaften Eigenschaften verfügt.

Der gezüchtete Stamm wurde unter der Nummber 88/1972 ,Un ft α Wicke w. . "

bejS\iandeainstitut für Gesundheitswesen (OKI - Orszägos Közegoszsogügyi Intäzet) deponiert. Zur Identifizierung des Stammes werden die folgenden morphologischen und biochemischen Gharakteristika angegeben!

MorpHöl€?gie der Kolonie auf Nährboden SO 101 nach. 30-tägiger Inkubation:

Scharf umgrenzte. erhabene, in Badialrichtung ge-

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runzelte Siedlung von 25-30 mm. Oberfläche samtig, Farbe ■weifl, in der Mitte hell sandfarben, an der Unterseite der Kolonie bräunlich. Die Kolonie ist von der Oberfläche des Agar schwer entfernbar, ihre Konsistenz iat hart. Bei mikroskopischer Untersuchung zeigt sich, daß die Hauptmenge der Zellen, aus denen die Kolonie besteht, gequollen, kurz, und stark gekörnt ist.

Zusammensetzung des Nährmediums 80 101; Saccharose 100,0 g

Zitronensäure 10,0 g

Natriumchlorid 10,0 g

Ammoniumnitrat 1,0 g

Kaiiumdihydrogenphosphat 0,3 g

.Magnesiumsulfat 0,3 g

Ammoniumhydroxyd bis pH 5»2 ffaseragar 20,0 g

Wasser ad 1000 ml.

Morphologie der flüssigen Kultur in Nährmedium SB 203 nach sechstägiger Inkubation:

Das Wachstum ist hell sandfarben und kleinflookig. Bei mikroskopischer Untersuchung erweisen sich die Zellen der Kultur ale 4-5 /U starke, stark lichtbrechende, eeptierte, gerade und sich selten verzweigende Hyphen, Die älteren Zellen sind gequollen und stark gekörnt·

Zusammensetzung des NÖhrmediums SB 203: Saccharose ¹⁰⁰*° β

Bernsteinsäure 10,0 g

Natriumchlorid 20,0 g

Ammoniumnitrat 3>° g

Kaliumdihydrogenphosphat °»5 g

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Magnesiumsulfat 0,25 6

Ammbniujnhydrbxyd bis pH 5^2 Wasser ad 1000 ml

WachBtum und Alkaloidproduktiön des Stammes an dem Sahrmedium SB 203

m__ Trockengehalt des Alkaloidgehalt Spezifischer ⁶ Myceliums in in Gammä/inl Alkalöidge-· g/100 ml hält in

0	0|3
1	0,7
2	1,22
3	1,68
	2,18
5	2,65
6	2,82

0	0
60	8*6
105	8,6
220	13,0
448	20,6
83^	31,5
858	30.4

Wirkiing von Ammoniumnitrat auf die ilketloidproduktion des Stammest

^Anteil der Alkftloide vom Peptid-Syp

am 7. Tag, >

66 71 69 61

64

Wirkung des Zusatzes von organischem Stickstoff auf die Alkaloidproduktion des Stammes; Die zugesetzte Menge der einzelnen Stickstoffquellen betragt 3,0 g/Idter.

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Ammoniumnit rät	Alkaloidgehalt am 7- Tag Gamma/ml
O	IO72
2,0	1482
3,0	I53O
6,0	1121
10,0	IO36
15,0	981

Substanz Alkaloidgehalt am 7. Tag

(Gamma/ml)

Asparagin	945
Pepton	402
Kasein ..	"" 730
Maiequellwasser	595
Ammoniumnitrat (Kontrolle)	1042

Die Bestimmung des Alkaloidgehaltes wurde nach der Extraktion mit einem Gemisch aus Chloroform und Ißopropa- nol im Verhältnis 4:1 durch Schicht Chromatographie dee extrahierten Alkaloid/s an Aluminiumoxyd durchgeführt. Die einzelnen Komponenten wurden herausgelöst und durch Vergleich mit einem identischen Standard ihre M_enge auf Grund der UV-Absorption festgestellt. Die in der Tabelle angegebene Alkaloidmenge ist die Summe der ^engen der einzelnen Komponenten.

Die von.dem Stamm produzierte Alkaloidmenge verteilt sich wie folgt auf die einzelnen Alkaloidarten: Ergokryptinin 5 #

Ergökorninin 4 %

Ergokryptin 30 %

Ergokornin 28 %

Ergosin . 5 %

Ergometrinin & *

Ergometrin ²^ %

übrige wasserlösliche Alkaloide 2 %· Auf Grund der obigen ausführlichen Angaben kann der Stamm ölaviceps purpurea 88/1972 zusammenfassend wie folgt charakterisiert werden:

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_ 9 —

Es handelt sich um einen ohne mutagene Behandlung hergestellten, zur eaprophytischen Alkaloidproduktion geeigneten Stamnu Die Gegenwart von 0,1-1,0 % Ammoniumnitrat im NMhrmedium behindert weder das Wachstum noch die Alkaloidproduktion des Stammes, sondern beeinflußt sie in vorteilhafter Weise. Am Mhrmedium ist bei der Alkaloidproduktion die Produktion des für Clavicepe purpurea charakteristischen dunkellila ("figments nicht wahrnehmbar· Die Alkaloidproduktion erreicht am 6. bis 7· Tag ihr Maximum» Die -Menge des sich bildenden Myceliums bleibt bis zum ?· Tag unter 3»5 %, wodurch die spezifische Alkaloidproduktion, auf den Trockengehalt bezogen.den Wert von 30 mg/g erreicht· 60-70 % der produzierten Alkaloide werden von den zwei Komponenten der Ergotoxingruppe beziehungsweise von deren Isomeren zu praktisch gleichen Teilen gebildet·

Das den Gegenstand der Erfindung bildende Verfahren zur Herstellung von Mutterkornalkaloide^ hauptsächlich von Ergokryptin und Ergokornin, mit Hilfe des Stammes Ölaviceps purpurea durch belüftete Fermentation an einem Saccharose und anorganischen Stickstoff sowie andere, an sich bekannte Zusatzstoffe enthaltenden flüssigen Nahrmedium kann dadurch gekennzeichnet werden, daß als Mikroorganismus die beim Ungarischen Landesinstitut für Gesundheitswesen unter der Hummer OKI 88/1972 deponierte Variante des Stammes ölaviceps purpurea verwendet wird.

Der Stamm ist infolge seiner Eigenschaften fü* die herstellung der Alkaloide Ergokryptin und Ergokornin geeignet. Das diesen Stamm verwendende Verfahren, welches mit an sich bekannten Nährmedien und in an sich bekannter Weise . durchgeführt wird, ist gegenüber den früheren Fermentations-

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- ίο -

▼erfahren zur Gewinnung von Ergotoxin in mehr als einer Hinsicht vorteilhaft·

^üie Vorteile sind im einzelnen folgende»

1) Der ohne mutagene Behandlung hergestellt· Stan* verfügt über eine größere Stabilität alB die Mutantenstäiune, daher ist das diesen Stamm verwendende Verfahren gut reproduzierbar·

2) Durch die Verwendung von Ammoniumnitrat an Stelle der organischen Stickstoffquellen wird die Heproduzierbarkeit ebenfalls verbessert und außerdem der Nährboden billiger·

3) Im Vergleich zu den früheren Fermentationsverfahren zur Gewinnung von Alkaloiden des ^eptid-Typs, bei denen die iermentationszeit 8-12 Tage beträgt, iBt das erfindungsgemaße Verfahren mit 5-7 Tagen Permentationszeit günstiger«

4) Durch die verminderte Pigmentbildung und die geringe Myceliummenge ist die hergestellte Fermentflüssigkeit zur Isolierung der Alkaloide geeigneter·

5) In der hergestellten Permentflüssigkeit ist die Verteilung der Alkaloide günstig· Von den drei Gliedern der Ergotoxin-Gruppe entstehen zwei in identischer Menge. Diese können gemeinsam isoliert und durch Zusatz von Ergokristin zu einem kompletten, die Komponenten in identischen Mengen enthaltenden Ergotoxinpräparat vervollständigt werden.

6) Das bedeutendste Nebenalkaloid, das Ergometrin, sondert sich infolge seiner Wasserlöslichkeit im Laufe der Aufarbeitung einfach ab und kann gesondert isoliert

werden.

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Dae erf indungsgemäße Verfahren wird an Hand der f ol~ >genden Beispiele näher erläutert ι
• Beispiel 1

Eine typieche Kolonie des unter der Hummer BB/1972 beim OKI (Ungarisches Landes inet it ut für Gesundheitswesen) deponierten Stammes wird von dem festen NMhrmedium BO abgenommen und in 10 ml sterilem Wasser auependiert· Mit der Suspension werden 100 ml Nährmedium B20, die sich, in einem 500 ml-Erlenmeyerkolben befinden, geimpft· Das Nährmedium S2G hat folgende Zusammensetzung!

Saccharose 200,0 g

Zitronensäure 15|O g

Kaliumdihydrogenphosphat 0,5 B Magnesiumsulfat 0,3 g

Ammoniumhydroxyd bis pH 512
Wasser ad 1000 ml.

Die Kultur wird bei 24 ⁰O 6 Tage lang geschüttelt,

>Vfew

dann\10 ml entnommen und damit in einem 500 ml-Erlenmeyerkolben 100 ml Nährmedium BB 1O1 geimpft. Die Zusammensetzung dieses Nährmediums ist folgendeι

Baccharose 100,0 ;g

Bernsteinsäure 10,Og

Calciumnitrat 1»0 g

Ammoniumnitrat 1»0 g

Kaliumdihydrogenphosphat °»5 B

Hagnesiumsulfat 0»3 g

Natriumchlorid 10,0 g Ammoniumhydroxyd bis pH 5, 5
Wasser ad 1000,0 g

Bei einer Temperatur von 24 ⁰C wird auf dem ßchüt-3 O 9 8 8 5 / U 3 5

- 12 teltisch 7 Tage lang weitergezüchtet.

Der Trockengehalt der Kultur beträgt 3,42 %.

100 ml der Kultur werden mit einem Gemisch von Chloroform und Isopropjlalkohol im Verhältnis 4-:1 extrahiert. 10 ml des Extraktes werden eingedampft» der Rückstand in 1 ml eines Gemisches von Chloroform und Methanol im Verhältnis 1:1 aufgenommen und an einer trockenen Aluminiumoxydschicht chromatographiert. Die Alkaloidflecke werden in UV-Licht angezeichnet, mit 1 % Weinsäure enthaltendem, 50 %-igem Methanol ausgewaschen und die in ihnen enthaltene Alkaloidmenge durch die UV-Absorption bestimmt.

Die Summe der erhaltenen Alkaloidwerte beträgt 1687 Gamma/ml, die ^Menge an Ergokornin und Ergökryptin 1187 Gamma/ml.

Aus Jeder der erhaltenen Kulturen können das Ergokryptin und das Ergokornin in kristalliner Form isoliert werden*

Beispiel 2

Bei Verwendung des gleichen Stammes und des gleichen festen Nährbodens wie in Beispiel Λ wird eine 30 Tage alte _y zusammenhängende Myceliumschicht von ungefähr 150 cm Ober-. ,-.., fläche von der Agarschicht abgenommen und in 100 ml Wasser suspendiert und homogenisiert.

Mit je 20 ml der Suspension werden 2 χ 200 ml Nahe· boden SC 100 geimpft. Der Nährboden SC 100 befindet sich in Erlenmeyerkolben von 750 ml Inhalt und hat folgende Zusammens et zung:

Saccharose 100,0 g

Zitronensäure 10,0 g

Magnesiumsulfat 0,3 g

K<i] i'.)Tnd i h.ydrofrenphofiphat 0,^c;> χ

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ORIGINAL INSPECTED

Natriumchlorid 10,0 g

Ammoniumhydroxyd TdIs pH 5,2 Wasser ad 1000 ml.

Die Kultur wird auf dem Schüttelt lach, bei 24 6 Tage lang weitergezüchtet, danaclr\in einem ^Laboratoriumf ermentor von 10 Liter Eauminhalt 6 Liter Nährmedium SB mit 400 ml der Kultur e-eimpft. Die Zusammensetzung des Nährmediums SB 103 ist folgende:

Saccharose ' 100,0 g

Bernsteinsäure 10,0 g

Natriumchlorid 10,0 g

Ammoniumnitrat . 3,0 g

Calciumnitrat 1,0 g

Kaliumdihydrogenphosphat 0,5 g Magnesiumsulfat 0,3 g

Ammoniumhydroxyd bis pH 5» 6 Wasser ad 1000 ml.

Die ffermentflüssigkeit wird bei 25 ⁰O mit einer Htihrgeschwindigkeit von 240 Umdrehungea pro Minute gerührt und unter Zuführung von Luft in einer Menge von 0,5 Idter/titer und Minute 5 Tage lang fermentiert· Die erhaltene tfermentflüsBigkeit hat einen Trockengehalt von 3_f14 %_t die Summe der nach der im Beispiel 1 beschriebenen Methode bestimmten Alkaloidmengen beträgt 1046 Gamma/ml. Davon sind 310 Gamma/ml Ergometrin, 636 Gamma/ml Ergokornin und Ä kryptin.

Die Fermentflüssigkeit wird auf die im Beispiel 1 beschriebene Weise aufgearbeitet.

Beispiel 3

Der im Beispiel 1 verwendete Stamm wird auf den

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festen Nährboden SB 010 aufgebracht und durch 30-tägi_ge Inkubation eine Myceliumschicht gezüchtet. Der Nährboden hat folgende Zusammensetzung:

Saccharose 100 0 g

Bernsteinsäure 10 0 g

•Ammoniumnitrat 10,0 g

Calciumnitrat 1|O g

Kaliumdihydrogenphosphat 0,25 g Magnesiumsulfat 0,25 g

■Ammoniumhydroxyd bis pH 5,2 Wasser ad 1000 ml.

Die Kultur wird von der Oberfläche des Agar abge nommen und auf die im Beispiel 2 beschriebene Weise auf Nährmedium SB 100 eine Impfkultür bereitet. Am 6. Tage werden mit je 400 ml der Geschüttelten Kultur je 6 Liter sterilisiertes Nährmedium SB 1O1 in 10 Liter i \ssenden Fermentoren geimpft und unter den im Beispiel 2 angege benen Bedingungen 5 Tage lang weitergezüchtet· Von den Kulturen werden 18 Liter in einer Impfkanne vereinigt und damit in einem halbtechnisehen, 300 Liter fassenden Fermentor 200 Liter des flüssigen Nährmediums SC 1O1 geimpft. Das Nährmedium enthält keinen Faseragar, seine übrige Zusammensetzung entspricht der in der Beschreibung angegebenen· Die Fermentflüssigkeit wird mit einer Bührge-Bchwindigkeit von 300 Umdrehungen pro Minute gerührt und "bei 25 ⁰C unter Einleiten von 9 Kubikmeter Luft pro Stunde 6 Tage lang fermentiert. Von der 55· bis 60. Stunde an wird der pH-Wert der Kultur durch Zugabe von Ammoniumhydroxyd bei einem Wert von 4,5 gehalten.

Am sechsten Tae der Fermentation beträgt der " 885/U35

Trockengehalt der Ferment flüssigkeit 5*4-2 % und ihr Gesamtalkaloidgehalt 124-6 Gamma/ml. Davon sind 202 Gamma/ml Ergometrin, 646 Gamma/ml Ergokryptin und Ergokörnin.

Die Fermentflüssigkeit wird nach der im Beispiel 1 beschriebenen Weise aufgearbeitet.

3 O 9 8 8 5 /■

Claims (1)

1. - 16 PATENTANSPRUCH

   Verfahren zur Herstellung von Mutterkornalkaloide^ n eiere

   von Ergokryptin und Ergokornin, unter Verwendung eines Stammes Gläviceps purpurea durch belüftete Fermentation an einem anorganischen Stickstoff und andere, an sich bekannte Zusatzstoffe enthaltenden flüssigen Nährmedium, dadurch gekennzeichnet', daß als Mikroorganismus äes· unter der Nummer 88/1972 beim Ungarischen Landesinstitut für Gesundheitswesen deponierte Olaviceps-purpurea-Variante verwendet wird.

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