DE3132786A1

DE3132786A1 - Antibiotikum sf-2103a und verfahren zu dessen herstellung

Info

Publication number: DE3132786A1
Application number: DE19813132786
Authority: DE
Inventors: Norio Yokohama Kanagawa Ezaki; Tatsuo Isehara Kanagawa Ito; Michio Tokyo Kojima; Tomizo Yokohama Kanagawa Niwa; Masaji Tokyo Sezaki; Takashi Yokohama Kanagawa Shomura
Original assignee: Meiji Seika Kaisha Ltd
Current assignee: Meiji Seika Kaisha Ltd
Priority date: 1980-08-19
Filing date: 1981-08-19
Publication date: 1982-05-13
Also published as: CA1163220A; NL8103854A; NL190197C; ES8301277A1; KR840001256B1; IT1209889B; FR2488895A1; DE3132786C2; KR830006426A; GB2087382A; IT8149120A0; CH650785A5; US4404218A; ES504813A0; GB2087382B; FR2488895B1; NL190197B

Description

HOFFMANN · ΕΓΓΙ,.Ε Λ PARTNER

PAT E N TAN AV ALT IC

DR. ING. E. HOFFMANN (1930-1976) . D I P L.-l N G. W. EITL E · D R. R E R. N AT. K. H O F I=MAN N · Dl PL.-1 N G. W. LEH N

DIPL.-ING. K.FOCHSLE · DR. RER. NAT. B. HANSEN ARABELIASTRASSE A ■ D-8000 MO NCH EN 81 ■ TELE FON (089) 911087 . TELtX 05-2961? (PATH E)

35 385 o/wa

mm tZ —

MEIJI SEIKA. KAISHA LTD., TOKYO / JAPAN

Antibiotikum SF-21O3A und Verfahren zu dessen Herstel-

Die Erfindung betrifft eine neue antibiotische Substanz SF-21O3A und deren Salze, sowie ein Verfahren zu deren Herstellung.

IO Es ist bekannt,, dass verschiedene Mikroorganismen beim Kultivieren in einem Nährmedium, enthaltend assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen, antibiotische Substanzen erzeugen können. Es besteht jedoch ein ständiger Bedarf an neuen und brauchbaren antibiotischen Sub-

stanzen»

Aufgrund von intensiven Untersuchungen, neue und

brauchbare Antibiotika mit antibakterieHer Aktivität gegen verschiedene gram-positive und gram-negative Baktierien, einschliessend solchen Bakterien, die gegenüber den bekannten Antibiotika resistent sind, zu finden, wurde nun gefunden, dass ein neues Antibiotikum, das nachfolgend als SF-21O3A bezeichnet wird, erhalten werden kann, indem man .einen Stamm vom Genus Streptomyces in einem Nährmedium kultiviert.

Das Antibiotikum SF-21O3A wurde isoliert und die physikalischen und chemischen Eigenschaften und die biochemischen Eigenschaften wurden bestätigt.

Die Erfindung betrifft somit ein neues Antibiotikum SF-21O3A der Formel .

HO₃SO 20 " COOH

und dessen Salze, sowie ein Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums SF-21O3A und dessen Salze.

Fig. 1.bis 3 sind Ultraviolettabsorptionsspektren,

Infrarötabsorptionsspektren bzw. kernmagnetische Resonanzspektren der antibiotischen Substanz SF-21O3A (Natriumsalz).

Ein Beispiel für Stämme, welche SF.-21O3A bilden, ist der Actinomyces SF-2103-Stamm, der aus Erde isoliert

mm *7 »

wurde, die in Katsuura, Wakayama Prefecture, Japan, gesammelt wurde.

4 g der Erde wurden in 40 ml sterilisiertem Wasser in 5 einem 100 ml Erlenmeyer-Kolben suspendiert, 10 Minuten geschüttelt und dann 15 Minuten stehen gelassen. Danach wurden 4 ml der überstehenden Flüssigkeit auf das 10.000-fache mit sterilisiertem Wasser verdünnt. Dann wurden 0,5 ml der so verdünnten Flüssigkeit in eine zu-10 vor sterilisierte Petrischale gegeben und vollständig mit 20 ml eines Agarmediums zum Trenne, wie es nachfolgend beschrieben wird, vermischt, bei 45 bis 50 C gehalten und dann verfestigt.

* Die Petrischale wurde 10 Tage bei 28°C kultiviert und

Kolonien aus dem SF-2103-Stamm, die auf dem Agarmedium wuchsen, wurden zu einer Hefe-Stärkeagar-Schrägkultur (Hefeextrakt: 0,2 %, lösliche Stärke: 1,0 %, Agar: 2,0 %; pH 7.,O) überführt.
20

Die Zusammensetzung des Agarmediums zum Trennen war die folgende: Hefeextrakt: 0,05 %, lösliche Stärke: 0,25 %, Agar: 2,0 %, Rest: Leitungswasser; pH 7,0.

Die Eigenschaften des Actinomyces SF-2103-Stammes sind die folgenden.

(I) Morphologische Eigenschaften 30

Mycele und Sporen werden auf Kulturmedien, wie Stärkeagar, Weizenmehlagar und Hefemalzagar, gebildet. Die

Verzweigungen der aerialen Mycele ist monopodial und quirlähnliche Verzweigungen werden nicht gefunden. Am Ende der Aerialen Mycele befinden sich fast gerade Sporenketten. Keine speziellen Strukturen, wie Sclerotium und Sporangium, wurden festgestellt.

Mikroskopische Beobachtungen zeigen, dass Sporen mit einer glatten Oberfläche in ovaler oder eiförmiger Form einer Grosse von 0,7 bis 0,8 χ 1,0 bis 1,5 um vorliegen und im allgemeinen eine Kette aus 10 oder mehr Sporen bilden.

15 (II) Kultureigenschaften

Die Kultureigenschaften von SF-2103-Stamm auf verschiedenen Kulturmedien werden in Tabelle 1 gezeigt. Die Beobachtungen wurden nach einer 14- bis 29-tägigen KuI-tivierung bei 28°C durchgeführt. Die in Tabelle 1 gezeigte Farbe wurde identifiziert gemäss dem Farbstandard des Color Harmony Manual, 4. Ausgabe, veröffentlicht von Container Corporation if America, Chicago, III·., USA (1958).

Die schwach-rosa Farbe der aerialen Mycele auf Stärkeagar-, Weizenmehlagar- und Hefemalzagarmedien verschwand mit zunehmender Sporenbildungsfähigkeit. Weiterhin zeigten die aerialen Mycele eine stärkere Tendenz zum Schmelzen und Verschwinden wie die Kultivierung während einer gewissen Zeitdauer fortschritt.

Tabelle 1

Kulturmedium	Wachstum und Umkehr färbung.	aeriales My eel	lösliches Pigment
Saccharose-Nitratagar	sehr geringes Wachs tum, farblos	keines	keines
Glukose-Asparaginagar	geringes Wachstum, farblos	Il	Il
Glyzerin-Asparaginagar	Il	Il	Il
Stärkeagar	massiges Wachstum, hellbeige	massig hell- rosa (5cb)	etwas grau- rosa
Weizenmehlagar	Il	Il	keines
Hefemalzagar	gutes Wachstum, hellbeige	ti	Il
Tyrosinagar	schlechtes Wachstum, farblos	keines
Nähragar	Il	It	Il
Kalziummalatagar	Il	Il	Il
Bennet's Agar	gutes Wachstum, gerunzelt

ro --j oo co

- ίο -

(III) Physiologische Eigenschaften

(1) Wachstumstempera^urbereich: wächst auf Stärkeagar im Bereich von 15 bis 45°C und · die Optimaltemperatur beträgt 25 bis 35°C.

(2) Verflüssigung von Gelatine: positiv

C3) Hydrolyse von Stärke: positiv 10

(4) Koagulation von entrahmter Milch: negativ Peptonisierung von entrahmter Milch: positiv

15 (5) Reduktion von Nitrat: negativ

(6) NaCl-Toleranz: Wachstum findet auf einem Kulturmedium, dem 3 % NaCl zugegeben wurden, statt, aber nicht auf einem solchen, dem

20 5 % NaCl zugegeben wurden

(7) Herstellung von Melanoidpigment: negativ

(IV) Verwendung von Kohlenstoffguellen (Pridham & Gottlieb Agarmedium bei 28°C)

(1) verwertbar: D-Glukose, L-Thamnose, D-Fruktose, D-Xylose, L-Arabinose, D-Mannit,

Saccharose

(2) nicht verwertbar: Raffinose, I-Inosit

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Zusammensetzung der Zellwandung

Eine Analyse nach dem Verfahren gemäss Becker et al in Applied Microbiology, Bd. 13, S. 236 (1965) zeigt, dass die in der Zellwandzusammensetzung enthaltende Diaminopimelinsäure vom LL-Typ ist.

Fasst man die obigen Ergebnisse zusammen, so gehört der SF-2103-Stamm zum Genus Streptomyces und das obere Ende des aerialen Mycels ist gerade und die Oberflächenstruktur der Sporen ist glatt.

Der Farbton in den gereiften aerialen Mycelen gehört zur Rotfarbserie von H.D. Tresner und E.J. Backus, Applied Microbiology, Bd. 11, S. 335 (1963), und die

Umkehrfarbe ist schwach beige. Es wird keine Bildung von melanoidem Pigment festgestellt.

Vergleicht man die vorstehenden taxonomisehen Eigenschäften des SF-2103-Stammes mit solchen von bekannten Stämmen vom Genus Streptomyces, so kann man den neuen SF-2103-Stamm identifizieren.

Es wurde festgestellt, dass kein Stamm bekannt war, der 25 identisch hinsichtlich der Eigenschaften des SF-2103-Stammes ist. Etwas ähnlich waren Streptomyces alborubidus (International Journal of Systematic Bacteriology? Bd. 22, S. 271-273 )1972)).

Es wurden deshalb der Standardstamm von Streptomyces alborubidus, ISP Nr. 5464 (ISP; International Streptomyces Project, International Journal of Systematic

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Bacteriology, Bd. 18, S. 69 (1968)) und der SF-2103-Stamm verglichen.

Sie zeigten deutliche Unterschiede voneinander hinsichtlieh des Wachstums auf verschiedenen Agarböden, obwohl· sie verhältnismässig ähnlich in der Farbtönung der aerialen Mycele und in der Verarbeitung von Zucker waren. Das heisst, dass das Wachstum von Streptomyces alborubidus auf Saccharosenxtratagar und Glukoseapsaraginagarmedium gut war und die Bildung von aerialen Mycelen auf gut war, wogegen das Wachstum des SF-2103-Stammes auf den vorerwähnten Medien sehr gering war und keine Bildung von aerialen Mycelen beobachtet wurde. Vielmehr wuchs der SF-2103-Stamm auf Weizenmehlagarmedium gut unter Bildung von aerialen Mycelen, wogegen das Wachstum von Streptomyces alborubidus schlecht war. Weiterhin wurde häufig festgestellt, dass die oberen Enden der aerialen Mycele von Streptomyces alborubidus eine Kreis- oder Hakenform hatten, wogegen das obere Ende des SF-2103-Stammes immer geradkettig war. Darüber hinaus zeigte kein bekannter Stamm die Farbtönung des aerialen Mycels, die Rotfarbserie, die geradkettige aerialen Mycelform und die glatte Sporenoberflache, wie man sie bei dem SF-2103-Stamm fand.

Es wurde infolgedessen daraus geschlossen, dass der SF-2103-Stamm unterschiedlich von allen Spezies von Genus Streptomyces ist und dass er neu ist und deshalb wurde der SF-2103-Stamm Streptomyces sulfonofaciens sp. nov.

30 genannt.

Dieser Stamm wurde als Streptomyces sp". SF-21O3 im

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Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry of Japan unter der Hinterlegungsnummer FERM-P 5636 (21. Juni 1980) (jetzt die Hinterlegungsnummer von FERM-BP Nr. 5 (1. Mai 1981)) (gemäss dem Budapest Treaty On The International Recognition Of The Deposit Of Microorganisms For The Purposes Of Patent Procedure) und beim American Type Culture Collection (ATCC) unter der ATCC Nr, 31892 $. Mai 1981) hinterlegt.

ge-Ar.ciert

Der SF-2103-Stamm verändert sehr leicht seine Eigenschaften, wie dies bei Stämmen vom Genus Streptomyces ebenfalls der Fall ist. Solche Veränderungen können durch Bestrahlung, beispielsweise mit ultraviolettem Licht, Röntgenstrahlen, radioaktiven Strahlen und chemisch verursacht werden. Deshalb kann man alle Verwandten und Mutanten beim erfindungsgemässen Verfahren verwenden, solange sie die Fähigkeit haben, die

20 SF-21O3A~Sübstanz zu produzieren.

Nach dem erfindungsgemässen Verfahren wird der vorerwähnte Stamm in einem Medium, das von bekannten Mikroorganismen assimilierbare Nährstoffe enthält, kultiviert. Solche Nährstoffe können die bekannten Stoffe sein, wie sie üblicherweise zur Kultivierung von Actinomyces-Stämmen verwendet werden. Beispiele für Kohlenstoffquellen sind Glukose, Glyzerin, Stärke, Dextrin, Maltosesirup, Melasse und Sojabohnenöl. Bei-

30 spiele für Stickstoffquellen sind Sojabohnenmehl,

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Weizenkleie, Baumwollsamenmehl, Fleischextrakt, Pepton, Hefeextrakt, Maismeische, Ammoniumsulfat und Natriumsulfat. Gewünschtenfalls können anorganische Salze, wie Kalziumkarbonat, Natriumchlorid, Magnesiumsulfat, Natriumsulfat, Kobaltchlorid, Ferrosulfat und Phosphate (insbesondere Natriumsulfat und Kobaltchlorid) sowie auch solche organischen und anorganischen Stoffe, die das Mikrobenwachstum unterstützen und die Produktion der gewünschten SF-21O3A-Substanz erhöhen, zugegeben werden. Weiterhin kann man gegebenenfalls auch ein Entschäumungsmittel, z.B. ein Silikon (Silikon KM68-2F, hergestellt von der Shin-Etsu Chemical Industry Co., Ltd., Tokyo) zugeben.

Für die Kultivierung von Str ep t ornyces sp. SF-2103 sind Flussigkultumethoden und insbesondere Tauchkultumethoden unter Belüftung besonders geeignet, wie man sie auch bei der Herstellung bekannter Antibiotika anwendet. Eine für die Kultivierung geeignete Temperatur liegt bei 2O bis 35°C. In vielen Fällen ist es bevorzugt, die Kultivierung im Temperaturbereich von 23 bis 30⁰C vorzunehmen. Die Produktion von SF-21O3A-Substanz erreicht ihr Maximum im allgemeinen in 1 bis 10 Tagen in einer Schüttelkultur und einer Tankkultur (Taachkultur), wobei jedoch die optimalen Zeiten von der Art des verwendeten Mediums und der Kultivierungsmethode abhängig sind.

Die SF-21O3A-Substanz kann man quantitativ bestimmen, indem man wie bei üblichen Antibiotika deren antibakterielle Aktivität durch eine Bioassay bestimmt, unter Verwendung eines geeigneten Stammes als Testorganismus,

denn diese Substanz hat antibakterielle Aktivität gegen gram-positive und gram-negative Bakterien. Da jedoch die SF-21O3A-Substanz dadurch charakterisiert ist, dass sie eine starke ß-Laktamase-inhibierende Aktivität und eine antibakterielle Aktivität aufweist, kann man eine neu entwickelte ß-Laktamase-Inhibierungsaktivitätsassay, wie sie nachfolgend beschrieben wird, zur schnellen und genauen Bestimmung anwenden.

Gemäss der neuen Untersuchungsmethode wird Endo-ß~ laktamase, das von Proteus vulgaris M-8243 gebildet wird, als ß-Laktamase verwendet. Die Endo-ß-laktamase wird in einer 2 % Kyokuto-Bouillon-Lösung (pH 7, vor der Sterilisierung) inokuliert und bei 32 C inkubiert. Unmittelbar nach Beginn der Inkubation und 2 Stunden und 4 Stunden nach Beginn der Inkubation wird ein Benzylpenicillinkaiumsalz als ß-Laktamase-induzierende Substanz bis zu einer Konzentration von 250 ng/ml zugegeben und die Inkubierung wird 7 bis 8 Stunden nach deren Beginn fortgesetzt. Dann wird die Inkubierung abgestoppt und der Stamm durch Zentrifugenabtrennung gesammelt. Die Masse der so erhaltenen feuchten Zellen wird in einer 0,1M Phosphatpufferlösung (pH 7,0), deren Volumen zweimal so gross ist wie das der Zellen, suspendiert und dann in eine Zellmühle (z.B. eine französische Druckzelle) gegeben, wo die Zellen zerstört werden. Die erhaltene Suspension wird einer Zentrifugenabtrennung (10.000 Upm, 10 Minuten) unterworfen und die ausgefallenen Zellfragmente werden entfernt. Die dabei

30 erhaltene überstehende Flüssigkeit wird über Nacht mit 0,1M Phosphatpufferlösung (pH 7,0) bei 5°C dialysiert

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und die erhaltene Dialysatlösung stellt eine rohe ß-Laktamase-Enzymlösung dar. Die Dialysatlösung hat eine ß-Laktamase-Aktivität von 5000 bis 6000 Einheiten (u/ml) , bestimmt nach der modifizierten Methode von Sergeant, zum Messen der Enzymaktivität, wie sie nachfolgend noch beschrieben wird.

Die so erhaltene ß-Laktamase wird zur Herstellung einer Assayplatte verwendet. Eine 2,3 %-ige Lösung von Nähragar (hergestellt von Difco Corp.) wird in einem Autoklaven sterilisiert und auf 45°C gekühlt. Zu 250 ml der Lösung gibt man 0,5 ml von Bacillus subtilis ATCC 6633, das zuvor für Saatzwecke kultiviert worden war, hinzu, sowie eine Menge von 125 Einheiten der vorher erwähnten ß-Laktamase-LÖsung und mischt beides. Das erhaltene Gemisch wird auf 250 mm χ 320 mm gros.se, glatte Platten gegossen und verfestigt darauf.

Zur Durchführung der Assay werden 20ul einer zu untersuchenden Lösung auf eine Papierscheibe (Durchmesser 8 mm) aufgebracht, auf welche 20 aal einer 50 %-igen wässrigen Acetonlösung von Cefalotinnatriumsalz in einer Konzentration von 50 ng/ml aufgetragen und dann an der Luft getrocknet worden sind. Die so zubereitete Papierscheibe wird in die Assayschale gegeben und nachdem sie dort 15 bis 17 Stunden bei 37°C gehalten wurde, tritt eine Inhibierungszone in Abhängigkeit von der Konzentration der SP-21O3A-Substanz auf.

Bei dieser Assay zeigen der Logarithmus der Konzentration der SF-21O3A-Substanz und der Durchmesser der

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Inhibierungszone eine lineare Beziehung im Bereich von 0,03ng/ml bis 1 ug/ml der Konzentration der SF-21O3A-Substanz. Auf diese Weise kann man die SF-21O3A-Substanz genau quantitativ bestimmen.
5

Die SF-21O3A-Substanz akkumuliert hauptsächlich in einem Kulturbrühefiltrat. Die in der Kulturbrühe enthaltene SF-21O3A-Substanz kann extrahiert und gereinigt werden, so dass sie dann die physikalischen und chemisehen Eigenschaften aufweist, die nachfolgend beschrieben werden. Für eine solche Extraktion und Reinigung wird folgendes Verfahren vorteilhaft angewendet:

Eine Kulturbrühe, enthaltend die gewünschten Substanzen, wird von den Feststoffen abfiltriert und das Filtrat wird auf Aktivkohle adsorbiert und dann mit 50 %-iger wässriger Acetonlösung eluiert.

Fraktionen, welche die gewünschten Substanzen enthalten, v/erden gesammelt und konzentriert. Nach dem Abdestillieren des Acetons werden die gewünschten Substanzen mit einem Haloalkan, z.B. Dichlormethan, enthaltend ein quaternäres Ammoniumsalz, wie Benzyldimethylcetylammoniumchlorid oder Benzyldimethyltetradecylammoniumchlorid, extrahiert und dann werden sie reextrahiert mit Natriumiodid enthaltendem Wasser und gefriergetrocknet, wobei man ein Rohprodukt der SF-21O3A-Substanz erhält.

Zur weiteren Reinigung der rohen SF-*21O3A-Substanz wendet man Chromatografie unter Verwendung von Anionenaustauschharzen, wie DEAE-Sephadex A-25, QAE-Sephadex A-25,

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DEAE-Zellulose und Dowex 1x2, wiederholt an. Zusätzlich kann man Gelfiltermedien, wie Biogel P-2, poröse Harze, wie Amberlite XAD, Zellulosesäulen und dergleichen, zur weiteren Reinigung der rohen SF-21O3A-Substanz anwenden.

Eine Analyse des so gereinigten SF-21O3A-Substanzpulvers durch Dünnschichtchromatografie unter Anwendung von verschiedenen Lösungsmitteln, sowie andere Analysemetho^ den (z.B. Hochspannungspapierelektrophorese und Hochgeschwindigkeits-Flüssigchromatografie) bestätigen, dass es sich um eine einzelne Substanz handelt.

Die SF-21O3A-Substanz ist bei Temperaturen oberhalb Raumtemperatur oder im sauren oder alkalischen Zustand, wie er nachfolgend noch erläutert wird, ausserordentlich instabil. Beim Isolieren der SF-2iO3A-Substanz aus einer Kulturbrühe muss man aufpassen, dass die Lösung nicht, zu sauer oder zu alkalisch wird und alle Massnahmen sollten schnell bei niedrigen Temperaturen vorgenommen werden.

Weiterhin ist es schwierig, die SF-21O3A-Substanz als freue Säure zu gewinnen, weil sie, wie vorher erwähnt, im sauren Zustand sehr instabil ist. Man gewinnt die SF-21O3A-Substanz deshalb als Salz in Form eines hellgelben oder weissen amorphen Pulvers durch Gefriertrocknen einer wässrigen neutralen Lösung. Die Reinheit der SF-21O3A-Substanz variiert in Abhängigkeit von der

30 Stärke der Kulturbrühe.

Die Art des Salzes wird durch das bei der Reinigung verwendete Kation bestimmt. Wird die Reinigung beispielsweise chromatografiesch unter Verwendung von DEAE-Sephadex A-25 und von NaCl-Wasser als Eluierungsmittel durchgeführt, so erhält man die SF-21O3A-Substanz als Natriumsalz. Andere pharmazeutisch annehmbare Salze sind Alkalisalze (z.B. das Kaliumsalz), Erdalkalisalze (z.B. Kalziumsalze), anorganische Salze (z.B. Aluminiumsalze und Ammoniumsalze) und organische Salze

10 (z.B. substituierte Ammoniumsalze), die in gleicher

Weise wie bei der Herstellung des Natriumsalzes hergestellt werden können. Um das Natriumsalz in ein anderes Salz zu überführen, kann man eine wässrige Natriumsalzlösung durch ein kationenaustauschharz leiten, z.B. durch Dowex 5OW, in dem zuvor die für den Austausch gewünschten Kationen ausgetauscht worden sind. Nachfolgend werden die physikalischen und chemischen Eigenschaften des Natriumsalzes der SF-21O3A-Substanz, von der man annimmt, dass sie die reinste Form des Produktes darstellt, beschrieben. Es ist jedoch festzuhalten, dass die SF-21O3A-Substanz-Natriumsalz Wasser oder andere Verunreinigungen enthalten kann, weil sie als gefriergetrocknetes Pulver erhalten wird.

25 Die Eigenschaften der neuen antibiotisehen SF-21O3A-

Substanz und deren Salze werden nachfolgend gezeigt. Die Eigenschaften des Natriumsalzes der SF-21O3A-Substanz sind die folgenden:

30 (1) Farbe und Form; erhalten als weisses Pulver

durch Gefriertrocknung,

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- 20 -

(2) Schmelzpunkt: kein klarer Schmelzpunkt. Verfärbung nach braun und Zersetzung unter Blasenbildung bei 168°C.

— —?o (3) Spezifische Drehung: /.O^/q -16,3 (c 1, Wasser)

(4) Elementaranalyse und Molekularformel (Probe wurde über Phosphorpentoxid bei Raumtemperatur während 27 Stunden vakuumgetrocknet und dann untersucht):

	Berechnet % für ^C9^H8^NOiO^S2^Na3-^2H2°	Gefunden %
C	23,53	23,62
H	2,61	2,44
N	3,05	3,00
0	41,83	42,16
S	13,94	13,81
Na	15,03	14,97 (bestimmt durch Atomab sorpt ions spektroskopie)

Das Molekulargewicht wird mit etwa 450 berechnet, aufgrund der Werte der Elementaranalyse und des kernmagne— tischen Resonanzspektrums. "

(5) Ultraviolettabsorptionsspektrum: Das Ultraviolettabsorptionsspektrum wird in einer 0,02M Phosphatpufferlösung (pH 7,2) bestimmt und

zeigt maximale Absorptionen bei 266 bis 267 nm (e]* =126) und 230

I CIU

Fig. 1 gezeigt wird.

J_1n = 126) und 230 nm (E]*_m. = 118) wie in

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(6) Infrarotabsorptionsspektrums Das Infrarot- ^: absorptionsspektrum, bestimmt durch die
Kaliumbromid-Tablettenmethode, wird in Fig» 2 gezeigt und zeigt Absorptionsbanden bei

3450, 1755, 1610, 1390, 1220, 1080, 1040,

940, 900, 780 cm"¹ . ■ ,:....

(7) Kernmagnetisches Resonanaspektrum; Das 100 MHz kernmagnetische Resonanzspektrum wird in

schwerem Wasser mit Tetramethylsilan als

äusserer Standard bestimmt und wird in Fig» 3 gezeigt und zeigt die Signale bei cf 1,55 (d, 3H), 6 2,99 (dd, 1H), d3,44 (dd, 1H), (J 3 _f 94 (dd, 1Ii), 6 4,48 (m, 1H) und 0 4_P94 (m, 1H).

(8) Dünnschichtchromatografie;

(a) Rf-Werte, bestimmt auf einer dünnen
Zelluloseschicht (Zellulose F»,.«, hergestellt

20 von Mercj und Co) mit den nachfolgend gezeig

ten Lösungsmitteln bei 5°C sind folgendes

Lösungsmittel Rf-Wert

n-Butanol;Isopropanol;Wasser (7;7;6 VoI)	0,30
70 Vol.%-ige wässrige n= Propanollösung	0,52
70 Vol.%-ige wässrige Ethanollösung	0,62
80 Vol.%-ige wässrige Äceto- nitrillösung	0,37

22

(b) Bestimmt auf DEAE-Zellulose (Polygram CEL 300 DEAE der Mercherry Nagel Corp.) mit einem Ö,Ö2M PhöSphatpüffer (pH 7,2), enthaltend Ö,1M Natriumchlorid bei 5°C und unter S Verwendung" von MC 696-SY2-A-Substanz als

Kontrolle (die Substanz wird in Journal of Antibiotic^/ Bd, 30, S. 770 (1970) beschrieben und ist die gleiche wie MM 4550-Sübstanz (beschrieben in The Journal of Antibiotics, Bd. 32, S* 295 (1979) ergibt Rf-Werte von 0,31,

Wogegen die Rf-Werte Von SF-21O3A-Substanz der vorliegenden Erfindung 0,14 sind.

(9) Hoöhspannungspapierelektrophorose: Bei Durch-

1B führung der Elektrophorese auf einem Filter

papier, Toyö Filter Paper Nr. 51 (hergestellt Von tföyö Röshi Co., Ltd.) einer Breite von ■ IS CM mit dem nachfolgend beschriebenen Puffer bei einer konstanten Spannung von 2800 ν während 15 Minuten in einer Hochspannungspapier-

elektröphorese^Vorrichtung (hergestellt von Servant Instrument Corp., Hochspannungsquelle: HV 5000 A; Elektrophoresetank Modell LT 48Λ), MC 696^SY2^A als Kontrolle (beschrieben in der japanischen Offeniegungsschrift 14 594/79

findet Wanderung zur Anodenseite bei 9,3 cm statt, Während SF>21O3A-Substanz gemäss der Erfindung 2ur Anodenseite bei 15,3 cm wandert. Die Pufferlösung wird hergestellt, indem man

SO Wasser zu 200 ml Pyridin und 8 ml Essigsäure

gibt bis zu einem Gesamtvolumen von 3 1, wobei

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der pH 6,4 beträgt.

(10) Hochgeschwindigkeits-Flüssigchromatograf ie:

Unter den nachfolgend angegebenen Bedingungen für eine Hochgeschwindigkeits-Flüssigchromatografie beträgt die Verweilzeit von MC 696-SY2-A (wie vorher erwähnt) 5 Minuten und 40 Sekunden, während die erfindungsgemässe SF-21O3A-Substanz eine Verweilzeit von etwa 20 Minuten hat.

Bedingungen: Hochgeschwindigkeits-Flüss.igchromatografie,

Vorrichtung: ALC/GPC Modell 244 (hergestellt

von Waters Corp.)/

Säule: ZIPAX SAX (hergestellt von Du Pont Co., Innendurchmesser 7,9 mm, Länge 50 cm), 20

Eluierungsmittel: hergestellt durch Auflösen von Natriumnitrat in einem 0,05M Phosphatpuffer (pH 7,2) in einer Konzentration von 0,05M,

25 Fliessrate: 3 ml/min

Ultraviolettabsofptions-Nachweiswellenlänge: 3313 nm und 254 nm,

30 Temperatur: Raumtemperatur (etwa 20⁰C).

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(11) Löslichkeit: Gut löslich in Wasser, löslich in Methanol und unlöslich in Ethylacetat, Chloroform und Benzol.

(12) Farbreaktion: Positiv zu Lemieux- und Ehrlich-

Reagen, negativ zu Ninhydrinreagenz.

Aufgrund der vorher angegebenen physikalischen und chemischen Eigenschaften hat man geschlossen, dass die Substanz (als Trinatriumsalz) die folgende Strukturformel hat:

SO_xNa

NaO-SO 15 ^ό

Die SF-21O3A-Substanz wirkt synergistisch in Kombination mit Penicillin- und Cephalosporxnantibiotika, die nicht gegenüber laktarnasebildenden Bakterien beständig sind, weil sie eine ß-Laktamase-Inhibierungsaktivität hat, von der man annimmt, dass dies eine Hauptcharakteristik der SF-21O3A-Substanz ist und ausserdem auch eine antibakterielle Aktivität aufweist.

Zum Nachweis solcher Aktivitäten der SF-21O3A-Substanz wurden die nachfolgenden Versuche durchgeführt.

Die antibakterielle Aktivität der SF-21O3A-Substanz-Natriumsalz wurde bestimmt durch Agarverdunnungsmethode nach der von der Japanese Chemotherapy Association

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(siehe Chemotherapy, Bd. 22, S. 1126-1128 (1974)) angegebenen Standardmethode, und die Ergebnisse werden in der nachfolgenden Tabelle 2 gezeigt.

. Tabelle 2

Testorganismus	Minimale Inhibierungs- konzentration ( ng/ml)
Staphylococcus aureus 2O9P	25
Staphylococcus aureus Smith	25
Bacillus subtilis ATCC 6633	50
Escherichia coli Nr. 29	3,13
Escherichia coli NIHJ JC-2	12,5
Klebsieila pneumoniae PCI 602	50
Proteus mirabilis GV 310	50
Proteus vulgaris GN 76/C-1	25
Proteus morganii Kono	25
Shigella dysenteriae Shigae	3,13
Citrobacter freundii GN 34 6	6,25
Serratia marcescens Nr. 1	50
Pseudomonas aeruginosa E-2	>100

Bei dieser Bestimmung wurde Herzinfusionsagar (hergestellt von Eiken Chemical Co., Ltd.) als Medium verwendet.

Die Bestimmung von ß-Laktamase-Inhibierungsaktivität von

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SF-21O3A-Substanz durch Sargent's Methode (siehe M.G. Sargent, Journal of Bacteriology, Bd. 95, S. 1493 (1968)) hat gezeigt, dass eine starke ß-Laktamase-Inhiblerungsaktivität vorliegt.

Assay von ß-Laktamase-Aktivität nach der Sargent-Methode;

Die Sargent-Methode wurde etwas wie folgt modifiziert.

Reagenz A: Enzymlösung, die mit 0,1M Phosphatpuffer

(pH 7,0) verdünnt ist, bis sie eine optische Dichte von O,6 des Jodverbrauchs bei 490 nm

zeigt, gemessen unter den nachfolgenden Bedingungen.

Reagenz B: Wässrige Lösung eines 1,3 %-igen Penicillinkaliumsalzes für Penicillinaseassay. Wässrige

Lösung von 1,3 % Cefalotin-Natriumsalz für Cephalosporinaseassay (ß-Laktamase von Proteus vulgaris M-8243 oder Citrobacter freundii GN 346).
25

Reagenz C: 0,1M Phosphatpuffer (pH 7,0).

Rsagenz D: Jodacctat-Pufferlösung, hergestellt durch Zugabe von 5 ml einer Vorratsjodlösung (Vorratsjodlösung enthält O,32N Jod und 1,2M.

Kaliumjodid, hergestellt durch Auflösen von

- 27 -

20,3 g Jod und 100 g Kaliumjodid in 500 ml destilliertem Wasser) zu 95 ml pH 4,0 Acetatpuffer (80 g wasserfreies Natriumacetat, eingestellt auf pH 4.0 mit Essigsäure und aufgefüllt mit 2 1 destilliertem Wasser.

10 Ein Reaktionsgemische bestehend aus 0,5 ml Reagenz B

und 2 ml Reagenz C wird 5 Minuten bei 30°C vorinkubiert und dazu werden 0,5 ml Reagenz A gegeben und das Ganze wird 30 Minuten bei 30 C gehalten. Nach Beendigung der ümsetzung gibt man unter schnellem Mischen 5 ml Reagenz

D hinzu und hält 10 Minuten bei 30°C und dann misst man die optische Dichte bei 490 nm.

Bei einer Blindprobe wird ein Inkubierungsijemiöch, enthaltend 0,5 ml Reayonz B und 2 ml Reagenz C 30 Minuten bei 30 C gehalten und danach gibt man 5 ml Reagenz D und 0,5 ml Reagenz A zu. Dann wird die optische Dichte in gleicher Weise gemessen.

25 Assay von ß-Laktamase-Inhibierungsaktivität

Die Bestimmung der ß-Laktamase-Inhibierungsaktivität wird in gleicher Weise wie die vorerwähnte Bestimmung der ß-Laktamase-Aktivität bestimmt, mit der Ausnahme, dass man als Reagenz C eine Lösung verwendet, die hergestellt wurde durch Verdünnen einer Inhibierungssubstanz mit dem Reagenz C.

- 28 -

Die Blindprobe wird in gleicher Weise wie bei der Assay der ß-Laktamase-Aktivität durchgeführt, unter Verwendung des Inhibor enthaltenden Reagenz C. Auf diese Weise wird die Konzentration an SF-21O3A-Substanz, die erforderlich ist, um 50 %-ige Inhibierung von Penicillinase zu bewirken, bestimmt.

Um die Inhibierungsaktivität der antibiotischen SF-21O3A-Substanz gegen andere ß-Laktamase, d.h. ein Enzym das von Proteus vulgaris M-824 3 gebildet wird, und ein Enzym, das von Citirobjicter freundii GN 346 gebildet wird (beide wurden in der vorerwähnten Weise hergestellt) wurde das gleiche Verfahren wie bei der Penicillinase durchgeführt mit der Ausnahme, dass die beiden erwähn— ten ß-Laktamasen anstelle von Penicillinase im Reagenz A und ein Cefalotinnatriumsalz anstelle des Penicillin-G-Kaliumsalzes in Lösung B verwendet wurden. Die Ergebnisse v/erden in Tabelle 3 gezeigt.

Eine Einheit an ß-Laktamaseaktivität nach der hier angewendeten Sargent-Methode ist definiert als die Menge des Enzyms, die erforderlich ist, um 1 umol eines Penicillin-G-Kaliumsalzes oder von Cefalotinnatriumsalz pro 60 Minuten unter den Bedingungen der vorliegenden Be-

25 Stimmungsmethode zu zersetzen.

- 29 -

Tabelle 3

ß-LAKTAMASE-INHIß 1 KRUlSJGSAKTIVITÄT VON SF-21 O37\-SUBSTANZ

ß-Laktarnase Penicillinase

gajris M~824~3

Citrobacter freundii GN 34 6

Substrat

Penicillin-G-Kaliumsalz

Cefalotinnatriumsalz

Inhibierung s verhältnis

34,4 % bei 10 ^ug/ml

50 %-ige Inhibierung skonzentration (I50): 0,013 ng/ml

50 %-ige Inhibierung skonzentration (I50): 0,18 jug/ml

Die Wirkung der SF-21O3A-Substanz als ein ß-Laktamase-Inhibitor gegen ß-laktamasebildende Bakterienstärame wurde untersucht gegenüber Ampicillin, Carbenicillin, Cefalotin, Cefaloridin. Als ß-laktamasebildende Stärrane wurden Proteus vulgaris M-824 3 (der einen weiten Bereich an Cephalosporinase produziert) , .P^otou¹·⁰· rettgeri GN 6 24 (der eine typische Cephalosporina&e produziert) und Citrobacter freundii GN 346 (der typische Cephalosporinase produziert) verwendet. Ässayagarplatten, die mit diesen Stämmen inokuliert waren, wurden in üblicher Weise hergestellt. Jeweils 10ug Ampicillin, 2 pg Carbenicillin, 2 ng Cefalotin und 5ug Cefaloridin wurden auf eine Papierscheibe mit einem Durchmesser von 8 mrn gegeben und dazu wurde die SF-21O3A-Substanz in einer Menge von

- 30 -

1 ug , 0,2 ug und 0,04 iig gegeben, wie dies in Tabelle 4 gezeigt wird.

Diese Papierscheiben wurden auf die Agarplatten mit
den ß-laktamasebildenden Stämmen gegeben und die Inkubierung wurde 16 Stunden bei 37°C durchgeführt, um
die Anwesenheit einer Inhibierungszone zu untersuchen. Die Ergebnisse werden in Tabelle 4 gezeigt.

Tabelle 4

SYNERGISTISCHE WIRKUNG VON SF-2103A-SUBSTANZ IN KOMBINATION MIT ß-LAKTAM-ANTIBIOTIKA -

Antibiotikum	Durchmesser der Inhibierungs-	zone (ram)	Citrobacter
		Proteus	freundii
	Proteus	rettgeri	GN 34 6
	vulgarls	GN 624
	M-8243		0
Ampicillin		0
dcyig)	0 -		19,7
" +SF-2103A		14,6
(1/ig)	20,9		11,3
¹¹ +SF-2103A		10,0
(0,2^g)	20,0		0
¹¹ +SF-2103A		0
(0,04yug)	18,0

- 31

Fortsetzung Tabelle 4

Antibiotikum

Carbenicillin (2/ag)

¹¹ +SF-21O3A

(1/ig)

" +SF-21O3A (0,2/ig )

" +SF-21O3A (0,04yug)

Cefalotin
(2/ig)

¹¹ +SF-21O3A

¹¹ +SF-21O3A (0,2/ig )

" +SF-21O3A (0,04yug)

Cefaloridin (5/ig)

" +SF-21O3A

Π/ag)

¹¹ +SF-21O3A (0,2/ig )

¹¹ +SF-21O3A (0,04yug )

SF-2103

(1/g)

Durchmesser der Inhibierungszone (mm)

Proteus

vulgaris

M-8243

Proteus rettgeri GN 624

16,7 11,1

11,5 0
0

14,3 9,0 0

Citrobacter freundii GN 34

32 -

Bei den Papierscheiben, die keine SF-21O3A-Substanz enthielten, wurde keine Inhibierungszone festgestellt, wogegen bei den Papierscheiben, die die SF-2TO3A-Substanz in Kombination mit den ß-Laktamantibiotika enthielten, Inhibierungszonen festgestellt wurden und zwar unterschiedlich, je nach der Konzentration von. SF-21O3A-Substanz. Dies zeigt an, dass die SF-21O3A-Substanz, die von den Testorganismen produzierte ß-Laktamase inhibiert und als Ergebnis kann das ß-Laktam-Antibiotikum die antibakterielle Wirkung zeigen. Bei alleiniger Verwendung der SF-21O3A-Substanz wird keine Inhibierungszone bei den Testorganismen gezeigt und zwar auch wenn maximale Konzentration (1 ug) vorliegt.

Daraus geht hervor, dass die SF-21O3A-Substanz eine antibakterielle Aktivität und gleichzeitig eine synergistische Wirkung in Kombination mit ß-Laktam-Antibiotika aufweist.

Die antibakterielle Aktivität von SF~21O3A-Substanz wurde an Mäusen im Mäuseschutztest, wie er nachfolgend beschrieben wird, untersucht und es wurde festgestellt, dass die SF-21O3A-Substanz ein Antibiotikum ist, das eine ausreichende Wirksamkeit bei der praktischen Anwendung als Heilmittel gegen Infektionen aufweist und zwar entweder allein oder in Kombination mit jeweils anderen geeigneten antimikrobiellen Mitteln (z.B. ß-Laktam-Antibiotika).

Vier Wochen alte männliche Mäuse vom ICR-JCL-Stamm (Durchschnittsgewicht 20,6 g) wurden in Gruppen von jeweils 5 verwendet.

-

3Ί32786

Escherichia coli GN 206 oder Proteus vulgaris GN 76/C-1 wurden auf Platten von HerzinJJusionsageir (hergestellt von Eiken Chemical Co. Ltd.) inokuliert und 20 Stunden bei 37°C kultiviert. Die gebildeten Zellen wurden gesammeltund in einer physiologischen Kochsalzlösung suspendiert unter Erhalt einer Zellsuspension, enthaltend eine vorbestimmte Anzahl der Zellen. Gleiche Volumina der Zellsuspensionen und eine 5 %-ige Mucinlösung (hergestellt von Nakarai Chemicals Co. Lud.) wurden vermischt unter Erhalt einer Zellösung mit einer Zellkonzentratic
Einheit).

zentration von 7_r1 χ 10⁷ CFU/ml (CFU = koloniebildende

Dann wurden 0,5 ml der wie oben hergestellten ZeIllösung intraperitoneal Mäusen infiziert. Einmal nach 1 Stunde oder zweimal nach 1 oder 2 Stunden nach der Infizierung wurde das Testantibiotikum subkutan verabreicht, anschliessend wurden die Mäuse 7 Tage beobachtet.
20

Versuch 1

Escherichia ccxLi GN2O6 wurde als Infektionsbakterium verwendet und eine Dosis von 2 mg/Maus der SF-21O3A-Substanz, gelöst in 1/75M Phosphatpuffer (pH 7,0, enthaltend 0,85 % Natriumchlorid) wurde einmal 1 Stunde nach der Infizierung mit den Bakterien verabreicht und eine Dosis von 1 mg/Maus von SF~21O3A-Substanz wurde zweimal 1 und auch 2 Stunden nach der Infektion verabreicht. Im ersteren Fall überlebten 2 von 5 Mäusen,

- 34 -

während im zweiten Fall 4 von den 5 Mäusen überlebten. Bei der Kontrollgruppe, bei der nur 0>2 ml des Phosphat puffers verabreicht worden waren überlebten keine Mäuse.

Versuch 2

Proteus vulgaris GN7 6/C-1 wurde als Infektionsbakterium verwendet und ein 1:1 Mischarzneimittel aus SF-21Q3A-Sübstanζ und Cefalotin (hergestellt von Shionogi & Go. Ltd.) wurde verabreicht. Das Mischarzneimittel wurde zweimal (nach 1 und nach 2 Stunden nach der Infektion mit den Bakterien) jeweils in einer Dosis von 0,5 mg/ Maus oder zweimal (nach 1 und nach 2 Stunden nach der Infektion) jeweils in einer Dosis von 1 mg/Maus verabreicht. Im ersteren Fall überlebten 3 von 5 Mäusen und im letzteren Fall alle 5 Mäuse. Bei-einer Kontrollgruppe, die nur mit der Phosphatpufferlosung behandelt worden war, überlebte keine Maus.

Die Toxizität der SF-21O3A-Substanz-Natriumsalz wurde durch ora3.e Verabreichung, intramuskuläre Injektion oder intravenöse Injektion bei Mäusen oder Ratten untersucht. Die LD_ro-Werte bei oraler Verabreichung, intramuskuläre Injektion und intravenöse Injektion waren alle höher als 2000 mg/kg.

Die SF-21O3A-Substanz ist ein wertvolles Antibiotikum das nicht nur antimikrobielle Aktivität gegenüber verschiedenen gram-positiven und gram-negativen Bakterien

- 35 -

zeigt, sondern auch wirksam ist gegen resistente Bakterien, die ß-Laktamase produzieren. Daher kann es als Arzneimittel für Menschen und Haustiere verwendet werden und ausserdem auch als Sterilisierungsmittel für die Lagerung von Nahrungsmitteln, für medizinische Instrumente oder Apparaturen.

Die SF-21O3A-Substanz und deren Salze können oral, topisch oder parenteral in Form von Zubereitungen verabreicht werden, z.B. in Form von Tabletten, Kapseln, Cremes, Sirupen, Suspensionen, flüssigen Zubereitungen _r Pulvern oder Injektionen oder Injektionen, die sterilisierbar sind.

Obwohl man die SF-21O3A-Substanz alleine verwenden kann, kann man sie sehr wirkungsvoll in Kombination mit anderen Antibiotika, insbesondere ß-Laktam-Antibiotika, verwenden, wegen des dadurch erzielten synergistischen Effektes.

Wird die SF-21Q3A-Substanz oder ein Salz davon in Kombination mit ß-Laktam-Antibiotika verwendet, so kann das Gewichtsverhältnis der SF-21O3A-Substanz oder eines Salzes davon zu der ß-Laktam-Antibiotika im Bereich von etwa 20:1 bis etwa 1:12 und vorzugsweise 10:1 bis 1:10, insbesondere aber 3:1 bis 1:3, betragen.

Die SF-21O3A-Substanz oder ein Salz davon kann in einer Dosis von 50 bis 6000 mg, im allgemeinen 500 bis 3000 mg, pro Tag verabreicht werden.

- 36 -

Ein Vergleich der physikalischen und chemischen Eigenschaften sowie der biochemischen Eigenschaften mit denen von bekannten-Antibiotika, wie er vorher durchgeführt wurde, zeigt, dass die SF-21O3A-Substanz ein neues Antibiotikum ist.

In den nachfolgenden Beispielen bedeuten Prozente immer Gewichtsprozent, wenn nicht anders angegeben.

Beispiel 1

Ein flüssiges Medium, enthaltend 1 % Glukose _r 1 % Stärke, 2 % Sojabohnenpulver, 0,5 % Baumwollsamenkuchen, 0,2 % Natriumsulfat, 0,2 % Kalziumkarbonat und 0,0001 % Kobaltchlorid, wurde auf pH 7 eingestellt. Dann wurden 80 ml-Antelle 'des flüssigen Mediums getrennt in einhundert 500 ml-Erlenmeyer-Kolben eingefüllt, die jeweils mit

einem Baumwollpfropfen verschlossen und bei 120°C unter Druck 10 Minuten sterilisiert wurden. Die SF-21O3Ä-Substanz (FERM-P Nr. 5636) wurde in einem Vorkultivierungsmedium, enthaltend 1 % Glukose, 1 % Stärke, 0,2 % Sojabohnenpulver, 0,5 % Pepton, 0,3 % Hefeextrakt, 0,2 % Fleischextrakt und 0,2 % Kalziumkarbonat, zur Herstellung einer Saatkultur vollständig wachsen gelassen. Dann wurden 1,5 %-Anteile der so hergestellten Saatkultur jeweils in das flüssige Medium inokuliert und in einem Schüttler 3 Tage bei 28°C inkubiert, wobei man 7 1

eines Mediums, enthaltend 3,5yUg/ml der SF-21O3A-Substanz erhielt.

- 37 -

Beispiel 2

Ein flüssiges Medium mit einem Gehalt an 1 % Glukose, 1 % löslicher Stärke, 0,2 % Sojabohnenpulver, 0,5 % Pepton, 0,3 % Hefeextrakt, 0,2 % Fleischextrakt und 0,2 % Kalziumkarbonat wurde hergestellt und auf pH 7,0 eingestellt. Dann wurden 80 ml-Anteile des flüssigen Mediums getrennt in drei 500 ml-Erlenmeyer-Ko]ben eingefüllt, die jeweils mit einem Baumwollpfropfon verstopft und 15 Minuten in einem Autoklaven bei 120°C

sterilisiert wurden. Mit einem Platindraht wurde jeweils eine geringe Menge der SF-21O3A-Substanz (FERM-P Nr. 5636) in jedes der flüssigen Medien inokuliert und dann 2 Tage auf einem Schüttler inkubiert_r unter Erhalt

einer Saatkultur. Anschliessend wurden 600 ml-Anteile des gleichen Mediums wie oben getrennt in drei 5 I-Erlenmeyer-Kolben gegeben, die jeweils mit einem Buumwollpfropfen verschlossen und in einem Autoklaven sterilisiert wurden. Jede der in einem 500 ml-Kolben

20 hergestellten Saatkulturen wurde in jedem der 5 1-Kolben inokuliert. Nach der Inkubierung auf einem Schüttler bei 28 C während 2 Tagen wurde ein ausreichendes Wachstum festgestellt.

25 Dann wurden 200 1 eines Kulturmediums, enthaltend 2,0 % Stärkesirup, 1,2 % Sojabohnenpulver, 1,2 % Weizenkeime, 0,3 % Sojabohnenöl, 0,02 % Natriumsulfat, 0,0005 ί Gerrosulfat, 0,00005 % Kobaltchlorid und 0,1 % Kalziumkarbonat in einem 300 1 Fermentationstank (hergestellt

von Marubishi Co., Ltd.) (pH vor der Sterilisierung 7,0) hergestellt und unter Druck 30 Minuten bei 120°C

- 38 -

sterilisiert. Nach dem Abkühlen des Kulturmediums wurde die oben hergestellte Kultur (alle drei 5 1-Erlenmeyer-Kolben) in das Kulturmedium inokuliert und die Kultivierung wurde unter Belüftung und Rühren bei 28°C durchgeführt. Dabei wurde mit 100 Upm zu Beginn und nach 40 Stunden mit 150 Upm gerührt. Die Belüftung betrug 200 1/rnin während der gesamten Kultivierungszeit. Nach 68 Stunden wurde die Kultivierung abgebrochen und eine Kultur erhalten, die 4,1 iig/ml der SF-21O3A-Substanz

10 enthielt.

Beispiel 3 15

(1) Das gleiche Verfahren wie in Beispiel 2 wurde wieder-olt unter Verwendung von drei 300 1-Fermentation:; tanks, wobei man 450 1 eines KuIturfiltrates der SF-21O3A-Substanz (FERM-P Nr. 5636) erhielt. Die durchschnittliche Einheit der SF-21O3A-Substanz war 2,1 ng/ml.

(2) Die SF-21O3A-Substanz wurde wie folgt isoliert: Nach Einstellung von 425 1 des wie oben erhaltenen KuI-turfiltrats auf pH 5,0 mit 6N Chlorwasserstoffsäure wurden 12,7 kg Aktivkohle, hergestellt von der Wako Pure Chemical Industries Ltd.) zugegeben und 30 Minuten in einem Rührtank gerührt, um die wirksamen Bestandteile darauf zu absorbieren. Die Aktivkohle wurde abfiltriert und nach Waschen mit 50 1 Wasser wurden 100 1 50 %-iges wässriges Aceton zugegeben. Das erhaltene Gemisch wurde mit 5N Natriumhydroxidlösung auf pH 8,0 eingestellt und

- 39 -

30 Minuten gerührt, um die Bestandteile wirksam zu eluieren. Nach der Abtrennung der Aktivkohle wurden 100 1 der so eluierten Lösung durch Abdestillicren des Acetons auf 45 1 konzentriert. Dann wurden 30 1 Dichlormethan, enthaltend 0,2%(W/V) Benzyldimethylcetylammoniumchlorid zu der konzentrierten Lösung gegeben und verrührt, um die wirksamen Bestandteile zu extrahieren. Zu dem so erhaltenen Extrakt wurden 4 1 einer wässrigen Lösung, enthaltend 1 % (W/V) Natriumiodid, ge-

10 geben, um die wirksamen Bestandteile in die wässrige

Schicht zu überführen. Die wässrige Schicht wurde durch eine Säule laufen gelassen, die mit 1,5 1 DEAE-Sephadex A-25 (hergestellt von Pharmacia Co.) gefüllt war und die mit einem Phosphatpuffer mit einem pH von 7,4 gepuffert war, um eine Absorption der wirksamen Bestandteile darauf zu bewirken. Nach einem ersten Waschen mit 15 1 einer 0,1M wässrigen NaCl-Lösung, gelöst in 20 mMol Phosphatpuffer (pH 7,4) wurden die wirksamen Bestandteile mit 0,2M einer wässrigen NaCl-Lösung, gelöst im gleichen Puffer wie oben, eluiert. Das Eluat wurde in 100 ml Fraktionen aufgeteilt und die Fraktionen 108 bis 132 waren dia aktiven Fraktionen. Dann wurden 24 der aktiven Fraktionen durch eine Säule geschieht, die mit 240 ml Aktivkohle gefüllt war, um die wirksamen

25 Bestandteile auf der Aktivkohle zu adsorbieren. Nach

dem Waschen der Säule mit 400 ml Wasser wurden die wirksamen Bestandteile mit 1 1 einer 50 %-igen wässrigen Acetonlösung eluiert. Das Eluat wurde unter vermindertem Druck konzentriert. Beim Gefriertrocknen der konzentrierten Flüssigkeit erhielt man 709 mg eines Pulvers aus roher SF-21O3A-Substanz (Reinheit: etwa 24 %) .

(3) Das gleiche Verfahren wie in (1) wurde wiederholt, unter Verwendung von zwei 300 1-Fermentationstanks, wobei man 285 1 (2,6 ng/ml) eines Kulturfiltrats erhielt. Das Kulturfiltrat wurde mit 6N Chlorwasser— stoffsäure auf pH 6,2 eingestellt. Zu diesem Filtrat wurden 95 1 Dichlormethan, enthaltend 0,2 % (W/V) Benzyldimethyltetradecylammoniumchlorid gegeben und das erhaltene Gemisch wurde 1 Stunde gerührt, um die wirksamen Bestandteile zu extrahieren. Zu dem so erhaltenen Extrakt wurden 8,5 1 einer 0,7 % (W/V) wässrigen Natriumjodidlösung gegeben und das Gemisch wurde 20 Minuten gerührt um die wirksamen Bestandteile in die wässrige Schicht zu überführen. Die wässrige Schicht wurde unter vermindertem Druck durch Abdestillieren von Diehlormethan konzentriert. Die so konzentrierte Flüssigkeit wurde durch eine mit 400 ml Aktivkohle (hergestellt von Wako Pure Chemical Industries Ltd.) gefüllten Säule, die mit Wasser beladen v/ar, geschieht und die Aktivkohle wurde mit 300 ml Wasser gewaschen. Die Flüssigkeit und das Waschwasser, welches durch die Aktivkohle lief, wurden vereint und 8,3 1 der vereinten Flüssigkeit wurden durch eine Säule geschickt, die mit 1 1 DEAE-Sephadex A-25 (hergestellt von Pharmacia Co.) gefüllt war und zuvor mit einem Phosphatpuffer mit einem pH von 7,4 gepuffert worden war, wobei die wirksamen Bestandteile adsorbiert wurden. Nach einem erstmciligen Waschen mit 10 1 einer 0,2M wässrigen NaCl-Lösung, gelöst in einem 20 mMol Phosphatpuffer (pH 7,4) wurden die wirksamen Bestandteile mit 0,3M einer wässrigen NaCl-Lösung, die in dem gleichen Puffer wie oben gelöst war, eluiert. Das Eluat wurde in 150 ml-Fraktionen aufgeteilt, wobei die

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3Ί32786

Fraktionen 17 bis 53 als aktiv bestätigt wurden. Diese aktiven Fraktionen wurden vereint und 5,5 1 der vereinten aktiven Fraktionen wurden durch eine Säule geschickt, welche mit 1,2 1 Aktivkohle (hergestellt von Wako Pure Chemical Industries Ltd.) gefüllt war und die zuvor mit Wasser beladen worden war, wobei die aktiven Bestandteile adsorbierten. Nach dem Waschen der Säule mit 2,3 Wasser wurden die wirksamen Bestandteile mit 5,5 1 50 %-igem wässrigen Aceton eluiert. Das Eluat wurde unter vermindertem Druck konzentriert. Beim Gefriertrocknen der konzentrierten Flüssigkeit wurden 540 mg eines Pulvers aus roher SF-21O3A-Substanz (Reinheit etwa 40 %) erhalten.

(4) Das in einer Menge von 540 mg gemäss (3) erhaltene Pulver der rohen SF-21O3A-Substanz wurde in 40 ml Wasser gelöst. Die Lösung wurde durch eine mit 100 ml DEAE-Sephadex A-25 gefüllte Säule, die zuvor mit einem Phosphatpuffer mit einem pH von 7,2 gepuffert wordeii war, laufen gelassen, wobei die wirksamen Bestandteile adsorbierten. Nach dem Waschen mit 200 ml eines 20 mMol Phosphatpuffers (pH 7,2) wurden die wirksamen Bestandteile mit einer 0,2M wässrigen NaCl-Lösung,

25 gelöst in dem gleichen Puffer wie oben, eluiert.

Das Eluat wurde in 20 ml-Fraktionen aufgeteilt, wobei bestätigt wurde, dass die Fraktionen 110 bis 165 aktiv waren. Diese aktiven Fraktionen wurden vereint und durch eine Säule, die mit 175 ml Aktivkohle gefüllt war laufen gelassen, um die wirksamen Bestandteile zu adsorbieren.

- 42 -

Nach dem Waschen der Aktivkohle mit 300 ml W.asser wurden die wirksamen Bestandteile mit 800 ml 50 %-igem wässrigen Aceton eluiert.

Nach dem Konzentrieren unter vermindertem Druck und Gefriertrocknen wurde das Natriumsalz der SF-21O3A-Substanz in einer Menge von 206 mg (Reinheit etwa 64 %) als hellgelbes Pulver erhalten.

Dann wurden 200 mg des Pulvers in 2 ml Wasser gelöst und die erhaltene Lösung wurde durch eine Säule geschickt, die mit 200 ml eines Diaion HP-20AG-Harzes gefüllt war (hergestellt von der Mitsubishi Chemical Indusi tries Ltd.) . Nach dem Entwickeln mit Wasser wurde das Eluat in 7 ml-Fraktionen aufgeteilt, wobei die Fraktionen 18 bis 26 die wirksamen Bestandteile enthielten. Von diesen aktiven Fraktionen wurden die Fraktionen 22 bis 24 ausgewählt und kombiniert, unter vermindertem Druck konzentriert und gefriergetrocknet, wobei man 60 mg des Natriuinsalzes der SF-2iO3A-Substanz (Reinheit etwa 77 %) als hellgelbes Pulver erhielt.

(5) In 1 ml Wasser wurden 60 mg des gemäss (4) erhaltenen hellgelben Pulvers gelöst. Die Lösung wurde durch eine Säule geschickt, die mit 200 ml Sephadex G-10 (von der Pharmacia Co.) gefüllt war, und mit Wasser entwickelt. Das Eluat wurde in 7 ml-Fraktionen. aufgeteilt und die Fraktionen 11 bis 16 als aktive Fraktionen bestätigt. Die Fraktionen 12 und 13 wurden kombiniert, unter vermindertem Druck konzentriert und

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- 43 -

gefriergetrocknet, wobei man 32 mg eines Natriumsalzes von reiner SF-21O3A-Substanz als weisses Pulver erhielt.

Die Verfahrensweisen gemäss (2) bis (5) wurden unter Niedrigtemperaturbedingungen (etwa 4°C) durchgeführt.

Leerseite

Claims

HOFFiIANN * JCITLJW Λ PAItTNKR

ΡΛ.Τ K N TAN WALT K

DR. ING. E. HOFFMANN (1930-197«) . I)IIH. -IMG. W.EITLE · D R. RER. N AT. K. H O FFMAN N . D I PL.-I NG. W. IEH N

DIPL.-ING. K. FDCHSLE · DR. RER. NAT. B. HANSEN ARADELLASTRASSD 4 · D-8000 MÜNCHL'N 81 . TE LE FON (089) 911087 · TElEX 05-29619 (PATH E)

35 385 o/wa

MEIJI SEIKA KAISHA LTD., TOKYO / JAPAN

Antibiotikum SF-21O3A und Verfahren zu dessen Herstellung

PATENTANSPRÜCHE

Antibiotikum SF-21O3A oder ein Salz davon, wobei """"" das Trinatriumsalz folgende Eigenschaften hat:

(1) Farbe und Aussehen: erhalten als weisses Pulver durch Gefriertrocknen;

(2) Schmelzpunkt: zeigt keinen ausgeprägten

Schmelzpunkt und wird braun und zersetzt sich

unter Blasenbildung bei 168°C;

— ~2O ο

(3) spezifische Drehung: l&-l/_O -16,3 (c 1, Wasser)?

(4) Elementaranalyse für C₉HgNO₁QS₃₃₃

C 23,53 23,62 (bestimmt durch
Atomabsorptions
analyse) H 2,61 2,44 N 3,05 3,00 O 41,83 42,16 S 13,94 13,81 Na 15,03 14,97

(5) Ultraviolettabsorptionsspektrum: wie in Fig. 1

gezeigt, liegt eine maximale Absorption in einem 0,02K Phosphatpuffer (pH 7,2) bei 266 bis 267 nm (E]*_m = 126) und 230 ran (D¹J_1n = 118) vor?

(6) Infrarotabsorptionsspektrum, bestimmt durch die Kaliumbromid-Tablettenmethode, wird in

Fig. 2 gezeigt mit Absorptionsbanden bei 3450, 1755, 1610, 1390, 1220, 1080, 1040, 940, 900, 780 cm"¹;

(7) kernmagnetisches Resonanzspektrum: das 100 MHzkernmagnetische Resonanzspektrum,bestimmt in schwerem Wasser mit Tetramethylsilan als äusserer Standard, wird in Fig. 3 gezeigt und zeigt Signale bei c£i,55 (d, 3H), 5 2,99 (dd, IH), 6 3,44 (dd, 1H), £3,94 (dd, 1H), ö"4,48 (m, 1H) und 6 4,94 (m, 1H);

(8) Dünnschichtchromatografie:

(a) Rf-Werte auf einer dünnen Zellulose-Schicht (Zellulose F_?l~₄, hergestellt von Merck Co.), entwickelt bei 5°C mit folgendem Lösungsmittel:

Lösungsmittel _B£_

n-Butanol:Isobutanol:Wasser

(7:7:6 Vol.) ■ 0,30

70 Vol.%-ige wässrige n-Propanollösung 0,52

70 Vol.%-ige wässrige

Ethanollösung 0,62

80 Vol.%-igo wässrige Ace-

tonitri!lösung 0,37

(b) nach Entwicklung auf DEAE-Zellulose

(Polygram CEL 300 DEAE von Mercherry Nagel Corp.) bei 5°C mit einem 0,02M Phosphatpuffer (pH 7,2), enthaltend 0,1M Natriumchlorid, unter Verwendung von MC 696-5Y2-A-Substanz

15 als Kontrolle, wurden Rf-Werte von 0,31 fest

gestellt, wogegen die SF-2103-A-Substanz Rf-Werte von 0,14 hat;

(9) Löslichkeit: gut löslich in Wasser, löslich

in Methanol, unlöslich in Ethylacrylat, Chloro-20 form und Benzol;

(10) Farbreaktion: postiv für Lemieux-und Ehrlich-Recigenz und negativ für Ninhydrin-Reagenz.

2. Antibiotikum SF-21O3A der Formel

HO₃Sd

COOH

oder ein Salz davon
3. Verfahren zur Herstellung eines Antibiotikums SF-21O3A oder eines Salzes davon, dadurch g e kennzeichnet , dass man einen SF-21O3A-Substanz herstellenden Stamm vom Genus Streptomyces in einem Nährmedium kultiviert und die SF-21O3A-Substanz oder ein Salz davon aus der Kulturbrühe gewinnt.
4. Verfahren gemäss Anspruch 3, dadurch g e k e η η zeichnet, dass der SF-21O3A-Substanz produzierende Stamm Streptomyces sp. SF-2103-Stamm ist.
5. Antibiotische Zusammensetzung, enthaltend Antibiotikum SF-21O3A-Substanz oder ein Salz davon gemäss Ansprüchen 1 oder 2, neben gegebenenfalls üblichen Trägermaterialien. ,
6. Antibiotische Zusammensetzung gemäss Anspruch 5, enthaltend zusätzlich ein Penicillin- oder Cephalo-

20 sporinantibiotikum.
7. Biologisch reine Kultur von Streptomyces sp. SF-2103-Stamm mit der FERM-Hinterlegungsnummer FERM-P 5636 und der ATCC-Hinterlegungsnummer 31892.