KR840001256B1 - 신항생물질 sf-2103a 물질의 제조법 - Google Patents

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Abstract

내용 없음.

Description

신항생물질 SF-2103A 물질의 제조법
제1도, 제2도 및 제3도는 각각 SF-2103A 물질(나트륨염)의 자외부 흡수스펙트럼, 적외부흡수스펙트럼 및 핵자기공명 스펙트럼을 나타낸다.
본 발명은 신항생물질 SF-2103A 물질의 제조법에 관한 것이다. 본 발명자들은 기지의 항생물질의 내성균을 함유한 각종의 그람음성균 및 그람양성균에 항균활성을 가진 새롭고도 유용한 항생물질을 연구한 결과 스트렙토미세스(Streptomyces)속에 속하는 방사균을 영양배지중에 배양하여 얻은 신항생물질 SF-2103A 물질이 생산된다는 것을 발견하여 SF-2103A 물질을 분리시켜 이화학적 및 생화학적성상을 확정함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명에 사용된 SF-2103A 물질 생산균의 한예로서는 일본국 와카야마현가쓰우라(勝浦) 토양에서 다음의 방법으로 새로 분리된 방사균 SF-2103주이다. 채취된 토양 4g을 100ml용 3각플라스크중의 멸균수 40ml에 현탁하고 로터리세이커(rotary Shaker) 상에서 10분간 교반한 다음 15분간 정치하여 그 상중토양현탁액 4ml를 취해 멸균수로 1만배 희석하였다.
이 희석액 0.5ml를 페트리디쉬(petri dish)에 넣고 미리 멸균하여 45-50℃에서 보온된 다음의 분리용 한천배지 20ml와 잘 혼합하여 고화(固化)하였다.
이 페트리디쉬를 28℃에서 10일간 배양하고 한천배지상에서 생육한 SF-2103주의 콜로니(Colonies)를 이스트스타치(yeast Starch)한천(효모엑기스 0.2%, 가용성전분 1.0%, 한천 2.0%, pH7.0)의 슬란트(Slant)에 옮겨 배양하였다. 분리용 한천배지의 조성은 효모엑기스 0.05%, 가용성전분 0.25%, 한천 2.0%, 탭워터(tap water); pH7.0으로 하여 사용하였다. SF-2103주의 균학적성상은 다음과 같다.
1. 형태적 성질
기균사(氣菌사) 및 포자의 형성은 스타치한천, 오우트밀(Oatmeal) 한천, 이스트맥아한천등 배지상에서 확인되었다. 기균사의 분기는 단순분기로, 차축분기(車軸分機)는 확인되지 않았으며 기균사의 선단에는 거의 직선적으로 포자가 연쇄(連鎖)되어있다. 균핵, 포자등의 특수구조는 확인되지 않았다. 전자현미경의 관찰에 의한 포자표면은 평활형이며, 포자의 형은 장원형(長圓形) 내지 란형(卵形)으로 크기가 0.7-0.8×1.0-1.5미크론이며, 일반적으로 10개이상 연쇄를 형성한다.
2. 각종배지상의 생육상태 SF-2103주의 각종배지상에서 의생육상태는 다음표에서와 같다. 배양은 28℃, 관찰은 14-21일 배양후에 하였다. 색(色)의 기재의 ( ) 내에 표시한 표준은 미국 콘테이너코오포레이숀(Container Corporation) 사제의 칼리 하모니매뉴얼 U.S.A) (Color)을 사용하였다. 또 스타치한천, 오우트밀한천 및 이스트맥아한천 배지상에서 기균사의 담 핑크색의 착색은 포자형성능 저하에 따라 소실이 쉽다. 이에 또, 기균사는 배양이 일정기간 이상 진행함에 따라 용균(溶菌)하여 소실하려는 경향이 강하다.
[표 1]
Figure kpo00001
3. 생리적 성질
(1) 생육온도범위:스타치 한천에 있어서 15-45℃의 온도범위에서 생육하며 25-35℃에서 양호하게 생육한다.
(2) 젤라틴의 액화:양성
(3) 스타치의 가수분해:양성
(4) 탈지유의 응고:음성
탈지유의 페프톤화:양성
(5) 질산염의 환원:음성
(6) 내염성(耐鹽性):3% NaCl 첨가배지에서 생육하나 5% NaCl에서는 생육되지 않음.
(7) 멀라닌(melanine)과 같은 색소의 생성:음성
4. 탄소원의 이용성(pridham ＆ Gottlieb 한천배지 28℃)
(1) 이용당(利用糖):D-글루코오스, L-람노오스(Rhamnose), D-마니틀, L-아라비노오스, 수크로오스, D-프룩토오스, D-키실로오스
(2) 이용할 수 없는:당라피노오스(Raffinose), I-이노시톨(Inositol)
5. 세포벽조성
베커(Becker) 등의 방법(Applied microbilogy):13권 236면, 1965)에 의해 분석한 결과, 세포벽조성성분중 디 아미노피메린산은 LL형이었다. 이상의 성상을 요약하면, SF-2103주는 스트렙토미세스속에 소속하여 기균사 선단은 직선형으로 포자 표면구조는 평활하다.
성숙한 기균사의 색조는 트레스너와 맥커스(H.D. Tresner and E.J. Backus:Applied microbilogy, 11권 335면, 1963)의 “레드시어리”(Red Serier)에 속하며 이면(reverse surface)의 생육 색조는 담 베이지색이다. 멜라민과 같은 색소의 생성은 확인되지 않았다. 이들의 분류학적제 성상을 스트렙토미세스속의 기지균종의 성상과 비교하여 SF-2103주의 신종(新種)을 확인하였다.
기지균종중에 SF-2103주와 일치하는 균종은 발견되지 아니하였으나 비교적 근사한 종으로서 스트렙토미세스 알르보루비다스(Streptomyces alborubidus) (In tervetiouel Journal of systewatic Bacteriology, 22권, 271-273페이지, 1972)가 존재하였다. 여기서, 표준주 ISP No. 5464와 SF-2103주를 직접비교하여 보았다. 그 결과, 양자는 기균사색조 및 당의 이용성에 대하여 비교적 일치하고 있으나 각종의 한천배치상에서의 생육은 스트렙토미세스 알르보루비다스가 양호하며 기균사의 착상도 왕성하나 SF-2103주의 양 배지상에서의 생육은 극히 미약하며 기균사의 착생도 확인되지 아니하였다. 또 역으로 오우트밀 한천배지상에서 SF-2103주는 생육이 양호하고, 기균사도 착상하나 스트렙토미세스 알르보루비다스의 생육은 미약하였다.
또 스트렙토미세스 알르보루비다스의 기균사 선단은 만곡이자주 관찰되었으며, 한편 SF-2103주에서는 항상 직선상으로 양자는 일치되지 아니하였다. 기타, 기지균종에 있어서 기균사색조, 레드시어리스(Red series), 직선형 기균사형태, 평활형포자 표면의 성상을 나타내어 SF-2103주와 일치되지 아니하였다. 이상에서 SF-2103주는 지금까지 보고된 스트렙토미세스속에 속하는 어떠한 종(種)과도 다른 신 균종임을 판단하여 “스트렙토미세스 술포노파시엔스”(Streptomyces sulfonofaciens) SF-2103이라고 명명하였다. 또, 본균주(本菌株)는 일본 공업기술원미생물공업 기술연구소에 기탁되어 있고, 미생물보관 위탁번호는 FERM-P 제5636호이다(ATCC No. 31892).
SF-2103주는 다른 스트렙토미세스속의 균주인 경우에서와 같이, 그 성상에 있어서 변화하기가 용이한 바 예로서 자외선, X은, 방사선 및 약품등을 사용하는 인공적변이 수단으로 변이되며, 어떤변이주라도 SF-2103 물질의 생산능을 가진 균주는 모두 본 발명의 방법에 사용할 수 있다.
본 발명의 방법에 의하여 위 균주를 일반미생이 이용할 수 있는 영양물을 함유한 배지로 배양한다. 영양원으로서는 종래의 방사균배양에 이용되고 있는 공지의 것이 사용될 수 있다. 예로서 탄소원으로 글루코오스, 글리세롤, 전분, 덱스트린, 물엿(maltose Syrup), 당밀(molasses) 및 대두유 등을 사용할 수 있다. 또 질소원으로서 대두분(Soy beam meal), 소맥배아(wheat germ), 면실분(Cotton seed meal), 고기엑기스(meat extract), 펩톤(peptone), 효모엑기스(yeast extract), 콘스팁리커(Corn steep liquor), 황산암모늄, 질산나트륨등을 사용할 수 있다. 기타 필요에 따라 탄산칼슘, 염화나트륨, 황산마그네슘, 황산나트륨, 염화코발트, 황산제1철, 인산염 등 무기염류를 첨가하는 이외에 균의 발육을 도아 SF-2103A 물질의 생산을 조장, 촉진하는 유기 및 무기물을 적당하게 첨가할 수 있다.
또 필요에 따라 소포제(defoaming agent)를 첨가할 수 있다. 배양법으로서는 일반항생물질 생산의 공지 방법과 동일하게 호기적 조건하에서의 액체배양법, 특히 심부배양법(Submerged Cultivation method)이 가장 적당하다. 배양에 적당한 온도는 20-35℃이나 대부분의 경우 23-30℃의 범위에서 배양하는 것이 바람직하다.
SF-2103A 물질의 배양생산은 사양하는 배지나 배양방법에 의해 다르나 진탕배양법 또는 배양탱크를 사용하는 심부배양법에서는 일반적으로 1-10일간 그 축적이 최고에 달한다. SF-2103A 물질의 검정방법은 본 물질이 항균성 물질이며 그람양성 및 그람음성균에 대하여 항균활성을 갖고 있으므로, 일반 항생물질에 사용되는 것과 같이 적당한 검정균을 사용하는 바이오에세이(bioassay) 기술에 의해 항균활성을 측정하여 그 정량을 실시할 수 있다.
본 물질은 항균활성 이외에 강력한 β-락타마제(Lactamase) 저해활성을 갖고 있는 특정적인 성질을 갖고 있으므로 본 발명자들이 새로 연구하여낸 다음에 기술하는 β-락타마제 저해활성검정법을 사용하면 극히 신속하고도 정확하게 정량할 수 있다. 즉, β-락타마제로서는 표로티우스불가리스(proteus Vulgaris) GN76에 의해 생산되는 균체내 β-락타마제를 사용한다. 그 조제방법이 있으나 본균을 배지로하여 2% 코쿠토(極東) 부용용액(bouillon Solution)(살균전 pH7)에 접종하여 32℃에서 배양하였다.
배양개시시(開始時)와 배양개시 2시간후 및 4시간후에 각각 β-락타마제 유도물질로서 벤질페니실린칼륨염을 250㎍/ml의 농도로 되도록 첨가하여 배양을 계속하고, 배양개시 7-8시간후 배양을 정지하여 원심분리에 의해 균을 모았다. 얻어진 습윤균체를 균체량의 2배량인 0.1M 인산완충액(pH7.0)에 현탁시켜 세포파쇄기(예로는 프렌치프레스(French press))로 세포를 파쇄하여 원심분리(10,000rpm, 10분)로 침전하는 세포파편을 제거하였다.
얻어진 상중액을 50℃에서 0.1M 인산완충액(pH7.0)으로 하루밤 투석하여 투석내액을 β-락타마제 조효소액(粗酵素液)으로 얻었다. 이와같이 하여 얻어진 효소액의 β-락타마제 활성은 다음에 기술하는 서어젠트(Sergent)의 개량방법으로 효소활성을 축정하여 일반적으로 5,000-6,000단위(μ/ml)를 갖는다.
다음으로 위에서 기술한 방법으로 얻어진 β-락타마제를 사용하는 검정용 평판을 제조하나, 2.3% 영양한천용액(nutrient Agar, Difco Corp. 사제)을 오오토글레이브(auto clave)에서 살균하여 45℃에서 냉각한 다음 250ml에, 미리 시이드(Seed) 배양한 바실러스 서브릴리스(Bacillus Subtilis) ATCC6633의 종모(Seed)(種母) 0.5ml 및 위의 β-락타마제용액을 125 단위량 가하여 혼합하고 250mm×20mm 평판에 주입, 고화시킨다.
검정함에 있어서 페이퍼디스크(paper disc)(직경 8mm)에 미리 세파로틴나트륨염 50㎍/ml의 50% 아세톤수용액 20μl로 처리하며 피검액 20μl를 넣고 풍건(風乾)하였다. 이와같이 하여 얻어진 페이퍼디스크를 검정디쉬(dish)에 놓고 37℃에서 15-17시간 유지하면 SF-2103A 물질의 농도에 따라 저지원(阻止圓)이 나타난다.
이 검정방법에서 SF-2103A 물질의 농도 0.03㎍/ml-1㎍/ml 범위에서 농도의 대수(對數)(logarithm)와 저지원이 직경이 그라프상에서 직선관계를 나타내며 정도(精度)가 양호하게 정량할 수 있다.
SF-2103A 물질은 주로 배양 여액중에서 축적된다. 배양액중 SF-2103A 물질은 다음에 기술하는 이 화학성상을 갖고 있으므로 그 성상에 따라 추출, 정제할 수 있으며, 다음에 나타내는 방법이 효과적이다.
즉, 유효성분을 함유한 배양물에서 고형분을 여과하여 여액을 활성탄에 흡착시켜 50% 아세톤수로 용출시킨다. 유효성분을 함유한 프랙숀(fraction)을 농축하여 아세톤을 제거후 벤질디메틸세틸암모늄클로라이드 또는 벤질디메틸테트라데실암모늄클로라이드와 같은 제4급 암모늄염을 함유한 할로겐알칸, 예컨데 디클로로메탄으로 유효성분을 추출한 후 요오드화나트륨(Sodium ioclide)를 함유한 물로 다시 추출하고 동결건조하여 SF-2103A 물질의 조제물(粗製物)을 얻는다.
다시 이 물질을 정제하는데는 DEAE-Sephadex A-25, QAE-Sephadex A-25, DEAE-셀룰로오스 및 Dowex 1×2와 같은 음이온 교환담체를 사용한 크로마토그라피를 반복함으로써 SF-2103A 물질을 얻을 수 있다. 이외에 Biogel P-2와 같은 겔 여과제, 앰버라이트 XAD와 같은 다공성수지 또는 셀룰로오스컬럼 등을 적당하게 사용함으로써 정제가 가능하다. 이와같이 하여 얻어진 SF-2103A 물질의 분말을 각종의 용제계를 사용하는 박층크로마토그라피와 기타 분석수단(예컨데 고압여지전기영등이나 고속액체크로마토그라피)를 사용하여 검포되므로 어느 분석수단으로도 단일물질임을 확인하였다.
SF-2103A 물질은 다음에 표시한 바와같이 실온 이상의 고온 및 산, 알칼리성에서는 극히 불안정하므로 배양액에서 분리하는데 있어서 용액중 pH가 산 또는 알칼리성으로되지 않도록 세심한 주의를 하여야 하며 용액조작을 모두 저온에서 신속하게 실행하는 것이 중요하다. 또 SF-2103A 물질은 산성에서 극히 불안정하므로 유리산형태로 분리하는 것은 실질적으로 곤란하다. 이 때문에 SF-2103A 물질은 최종적으로 중성수용액을 동결건조함으로써 담황색 내지 백색무정형 분말상의 염으로 얻어진다.
이 순도는 배양역가에 따라 좌우된다. 염의 종류는 정제에 사용되는 양이온에 의해 유정되며, 예로서 DEAE-Sephadex A-25를 사용한 크로마토그라피로 식염수를 용리액으로하여 사용하면 나트륨염으로서 얻어진다. 나트륨염 이외의 학적으로 수용할 수 있는 염으로서 포타슘과 같은 알칼리금속염, 칼슘과 같은 알칼리토류금속염, 알루미늄, 암모늄염 등의 무기염 또는 치환암모늄염 등 유기염을 위 나트륨염과 동일한 방법으로 조제할 수 있다.
또 나트륨염에서 다른염으로의 교환은 Dowex 50W와 같은 양이온교환수지를 미리 교환하는 양이온으로 치환한 다음 나트륨염의 수용액을 통과시킴으로써 가능하다. 다음으로 이와 같이하여 얻어진 가장 순수한 제품인 SF-2103A 물질의 나트륨염의 이화학적성상에 대하여 설명한다. 그러나, 동결건조분말로 얻어지므로 물 또는 다른 불순물이 함유될 수 있다. 신항생물질 SF-2103A 물질 및 그 염류의 성상은 다음과 같다. 여기서 그 나트륨염이 다음의 성상을 갖고 있다.
(1) 물질의 색과 형상:동결건조에 의해 백색분말로서 얻어진다.
(2) 융점:명료한 융점을 나타내지 않으며, 168℃에서 갈색변화를 하며 발포분해를 한다.
(3) 비선광도:[α]D 20=16.3(C1, 물)
(4) 원소분석 및 분자식:5산화인으로 실온에서 27시간 진공건조한 시료에 대하여 측정한 결과 다음과 같다.
C9H8NO10S2Na3·2H2O(%)로서
계산치(%):C 23.53, H 2.61, N 3.05, O 41.83, S 13.94, Na 15.03
실측치(%):C 23.62, H 2.44, N 3.00, O(42.16), S 13.81, Na 14.97(원자흡광분석에 의해 측정)
분자량은 원소분석치 및 핵자기공명스펙트럼에서 약 450으로 취정된다.
(5) 자외부흡수스펙트럼(제1도):
pH7.2 0.02M 인산완충액중에서 극대흡수는
Figure kpo00002
및
Figure kpo00003
를 가진다.
(6) 적외부흡수스펙트럼:
취화포타슘정제중에서 측정한 적외부흡수 스펙트럼은 제2도와 같다.
(7) 핵자기공명스펙트럼:
중수중에서 외부기준으로 테트라메틸실란(tetramethyl Silane)을 사용하여 측정한 100MHz 핵자기공명스펙트럼은 제3도와 같이 δ1.55(d, 3H), δ2.99(dd, 1H), δ3.44(dd, 1H), δ3.94(dd, 1H), δ4.48(m, 1H) 및 δ4.94(m, 1H)의 시그날을 확인하였다.
(8) 박층크로마토그라피:
(가) 셀룰로오스박층(Cellulose F254, Merck 사제품)을 사용하여 다음의 각 전개용 매계로 5℃에서 전개할 때 다음의 Rf값을 나타낸다.
Figure kpo00004
(9) DEAE-셀룰로오스(Polygram CEL 300 DEAE, Mercherry Nagel 사제품) 사용하여 0.1M 염화나트륨을 함유한 pH7.2, 0.02M 인산완충액으로 5℃에서 전개할 때, 대조로서 MC696-SY2-A물질[이물질은 “The Journal of Antibotics”(제30권, 770면, 1970)에 기재되어 있고, MM 4550물질(“The Journal of Antibiotics”, 제32권, 295면(1979)에 기재되어있다)과 동일함]을 사용할 때 그 Rf값은 0.31에 대하여 본 물질의 Rf값은 0.14를 나타낸다.
(10) 고압여지 전기영동(High Voltage Filter Electrophoresis):
고압여지전기 영동장치(Servant Instrument 사제품, 고압전원 HV 5000A, 영동조모델 LT48A)를 사용하고, 여지폭 15cm를 가진 토요여지 No.51(日本東洋濾紙社製)로 다음의 완충액을 사용하여 정전압 2800V로 15분 영동을 실시할 때 대조물질로서 MC696-SY 2-A(일특개소 54-14594호 공보)가 양극(陽極) 측으로 9.3cm 이동하는데 대하여 본 물질은 15.3cm 양극측으로 이동한다.
완충액:피리딘 200ml와 초산 8ml를 전 용량 3ℓ가 되도록 정제수에 용해한 것으로 이때의 pH는 6.4이었다.
(11) 고속액체크로마토그라피:
본 물질을 다음의 조건에서 고속액체 크로마토그라피를 실시할 때 그 보지시간은, 대조되는 SF-2050물질(일특 개소 54-109901호 공보)이 4분 30초이며, MC696-SY 2-A(위와 같음)가 5분 40초이고, SF-2050B 물질(일본특개소 54-122203호 공보)이 12분일 때 본 발명의 물질은 약 20분의 보지시간을 갖는다.
조건:고속액체 크로마토그라피장치는 Waters 사제품 ALC/GPC 모델 244형, 컬럼(10Column)은 Du pont 사제품 ZIPAX SAX(내경 7.9mm, 길이 50cm)를 사용하고, 용출액은 pH7.2, 0.05M 인산완충액에 질산 나트륨을 0.05M의 농도가 되도록 용해하여 사용하며, 유속은 3ml/분으로 자외부흡수검출파장은 313nm 및 254nm를 사용하여 실온에서 실시하였다.
(12) 용해성:물에 용해하기 쉽고, 메타놀에 용해하며, 에틸아세테이트, 클로로포름 및 벤젠 등 용매에는 녹지않는다.
(13) 정색반응:레뮤(Lemieux) 시약에는 양성이며, 에르리히(Errlich) 서약에도 양성이고 닌히드린(ninhydrin) 시약에는 음성이다.
이상의 물리화학적 성상에서 본물질(3나트륨염으로서)은 다음의 구조식을 갖는다.
Figure kpo00005
SF-2103A 물질은 항균활성 및 특징적이라 할 수 있는 β-락타마제 저해활성을 가지며 그결과 β-락타마제를 생산하는 내성 병원균에 대하여 효력이 없는 페니실린계 및 세팔로스포린계항생물질과 혼합하여 사용함으로써 상승적으로 항균작용을 발휘한다. 다음에 이들의 실험예를 나타낸다.
SF-2103A 물질 나트륨염의 항균활성을 일본화학요법 학회추천표준법(Chemotherapy, 22권, 1126-1128면, 1974)에 따라 한천 희석법으로 희석한 결과는 다음표와 같다.
[표]
Figure kpo00006
배지는 하아트 인퓨죤아가(Hear Infusion Agar)(일본 榮硏化學 사제품)을 사용하였다. 또, SF-2103A 물질은 서젠트방법(M.M. Sargent Journal of Bacteriology, 95, 1493(1968)에 의해 측정하면 β-락타마제 저해활성을 갖고 있다는 것이 판명되었다. 즉, 시약으로서,
A액:페니실리나제(penicillinase)(미국, Carbio Chem Corp 사제품)를 pH7.0, 0.1M 인산 완충액에 용해하고 다음 측정조건에서 측정하여 490nm의 흡광도가 약 0.5를 나타내는 활성으로 되도록 희석하였다.
B액:1.3% 페니실린 칼륨염의 수용액
C액:pH7.0, 0.1M 인산완충액
D액:요오드와 초산완충액, 서젠트(Sargent) 방법에 따라 조제한다.
측정조작으로서 시험관에 B액 0.5ml와 C액 2ml를 합쳐 30℃에서 미리 5분간 유지하고, A액 0.5ml를 가하여 30℃에서 30분간 반응시킨 후 D액 5ml를 가하여 10분후 490nm에서의 흡광도를 측정한다.
블랭크(blank) 시험으로서는 활성측정과 동일하나 A액만을 D액을 가한직후 첨가하고 다음에 동일하게 조작한다. 저해력측정 시험으로는 그 블랭크 시험도 위와 동일하게 조작하나 저해물질을 C액에 적당히 희석한 액을 C액으로 사용한다.
위 측정법에 의해 SF-2103A 물질의 페니실리나제 활성을 50% 저해하는데 요하는 농도를 구하였다.
동일하게 다른 β-락타마제로서 위 프로테우스 불가리스 GN 76의 생산하는 효소와 시트로박터프로인디 GN-346의 생산하는 효소(양자 다같이 위 제조방법으로 제조된다)에 대하여 위 A액이 페니실리나제 대신 각각 β-락타마제를 사용하고, B액의 페니실린 G칼륨염대신 세팔로틴 나트륨염을 사용해서 동일하게 측정조작을 하여 다음 결과를 얻었다.
여기서, 서젠트 방법에 의한 β-락타마제 활성/단위는 본 측정법의 조건하에서 60분에 1μmole의 페니실린 G칼륨염 또는 세팔로틴나트륨염을 분해하는 효소량으로서 규정된다.
[표]
Figure kpo00007
β-락타마제 생산균주에 대한 SF-2103A 물질의 β-락타마제 저해제로서의 작용을 앰피실린(ampicillin), 카르베니실린(Carbenicillin), 세팔로틴(Cefalotin), 세팔로리딘(Cefaloridine)에 대하여 조사하였다.
β-락타마제 생산균주로서, 프로테우스불가리스(광범위한 세팔로스포리나제 생산), 프로테우스 레트게리(proteus rettgeri)(전형적인 세팔로스포리나제 생산) 및 스트로박터 프로인디(Citrobacter freundi)(전형적인 세팔로스포리나제 생산)을 사용하여 이들을 접종한 검정용 한천 평판을 통상의 방법으로 작성하여 β-락탐항생물질을 직경 8mm의 페이퍼디스크에 각각 암피실린 10㎍, 카르베실니린 2㎍, 세팔로틴 2㎍ 및 세팔로딘 5㎍으로 가하고, 다시 각각 1㎍, 0.2㎍ 및 0.04㎍의 SF-2103A 물질을 가하였다.
β-락타마제 생산균주의 한천 평판상에 이들의 페이퍼 디스크를 놓고 37℃에서 16시간 배양하여 저지원의 유무를 조사하였다.
이 결과는 다음 표에서와 같이, SF-2103A 물질을 결한 페이퍼디스크에서는 저지원이 확인되지 않았으며 β-락탐 항생물질에 상가적(相加的)으로 SF-2103A 물질을 가한 페이퍼디스크에서는 농도에 의존하여 저지원이 확인되었다.
이것은 SF-2103A 물질이 검정균주의 생산하는 β-락타마제를 저해하여 그 결과 β-락탐 항생물질이 작용하고 항균활성이 발현됨을 나타내고 있다.
또, SF-2103A 물질은 검정균주에 대하여 최고농도(1㎍) 저지원은 나타나지 않는다.
이와 같이 SF-2103A 물질은 항균력 이외에 β-락탐계 항생물질과 상승적으로 작용하여 항균력을 발휘한다는 것은 명백하다.
[표]
Figure kpo00008
이와같이 하여 SF-2103A 물질은 각종의 그람양성균 및 음성균에 대하여 활성일뿐만 아니라 β-락타마제 생산의 내성균에도 유효한 가치가 있는 항생물질이며, 사람 및 가축 동물의 의약으로서, 또 식품보전이나 의료기기의 살균제로서 이용할 수 있다.
SF-2103A 물질은 단독으로 사용하는 이외에 따른 항생물질, 특히 β-락탐 항생물질과의 병용이 효과적이다.
또 이상 기술한 이화학적, 생물학적 성상을 가진 SF-2103A 물질은 문헌상 해당하는 것이 없으며 따라서 본 발명의 신규성을 명백하다.
다음에 본 발명의 실시예를 예시하나 이들의 예는 단순한 예시에 불과하며 어느 것이든 본 발명을 한정하는 것은 아니다.
[실시예 1]
500ml용 3각플라스크 100개에 각각 글루코스 1%, 전분 1%, 대두분 2%, 면실박(cottonseed cake) 0.5%, 황산나트륨 0.2%, 탄산칼슘 0.2%, 염화코발트 0.0001%를 함유한 액체배지를 pH 7로 조제하여 80ml씩 분주(分注)하고 코튼패드(Cotton Pad)로 막아 120℃에서 10분간 가압 멸균하여 미리 글루코스 1%, 전분 1%, 대두분 0.2%, 펩톤 0.5%, 효모엑키스 0.3%, 고기엑기스 0.2%, 탄산칼슘 0.2%를 함유한 전배양배지에 충분히 생육시킨 SF-2103A주(徵工硏菌寄第5636호)의 종모배양물을 1.5%씩 식균하였다. 28℃에서 3일간 진탕배양하여 SF-2103A 물질 3.5㎍/ml을 함유한 배양액 7ℓ를 얻었다.
[실시예 2]
500ml용 3각플라스크 3개에 각각 글루코스 1%, 가용성전분 1%, 대두분 0.2%, 펩톤 0.5%, 효모엑기스 0.3%, 고기엑기스(meat extract) 0.2% 및 탄산칼슘 0.2%로 구성된 액체배지(멸균전 pH 7.0) 80ml를 분주하여 코튼패드로 막고 오우토글레이브에서 살균(120℃, 15분)한 후 SF-2103A주(徵工硏菌寄第5636호)를 1개의 백금루우프(platinum loop)마다 식균하여 28℃에서 2일간 진탕하고 배양하였다.
다음에 5ℓ용 3각플라스크 3개에 위 배지를 각각 600ml씩 넣고 코튼패드로 막고 오오토클레이브에서 살균하여, 위에서 얻어진 배양물을 종모로서 1개에 대하여 1개(전량)을 접종하였다.
28℃에서 2일간 진탕하고 배양하면 충분히 생육이 관찰하였다.
그 다음으로 300ℓ용 배양탱크(丸菱 사제품, 일본)에 전분시럽 2.0%, 대두분 1.2%, 소맥배아(wheat germ) 1.2%, 대두유 0.3%, 황산나트륨 0.02%, 황산제1철 0.0005%, 염화코발트 0.00005%, 탄산칼슘 0.1%로 구성된 생산배지(멸균전 pH 7.0) 200ℓ를 조제하고, 120℃, 30분간 가압, 살균하였다.
냉각후 위에서 얻어진 배양물(5ℓ 3각플라스크 3개 모두)을 식균하여 28℃에서 통기, 교반, 배양을 하였다. 그 사이의 회전수는 처음에 100rpm으로 실시하고, 40시간후에 회전수를 150rpm으로 증가시켰다.
통기량은 전배양 기간을 통하여 200ℓ분으로 하였다. 68시간후에 배양을 완료하고 이때 얻어진 배양액은 SF-2103A 물질의 생산이 4.1㎍/ml에 달하였다.
[실시예 3]
(1) 실시예 2와 동일한 조작으로 300ℓ 배양탱크 3기(基)를 사용하여 SF-2103A 주(徵工硏寄 제5636호)의 배양여액 450ℓ을 얻었다. 이때 SF-2103A 물질의 평균단위는 2.1㎍/ml이었다.
(2) SF-2103A 물질의 채취는 다음과 같이 하였다. 즉, 위와같이 하여 얻어진 배양여액 425ℓ를 6N염산을 이용하여 pH 6.0으로 조정한 후 활성탄소(일본, 祖生紀藥與品) 12.7kg을 가하여 교반조에서 30분간 교반하고 유효성분을 흡착시켰다. 활성탄을 여과하여 50ℓ의 물로 세척한 후 50% 아세톤수 100ℓ를 가하여 5N NaOH 용액으로 pH 8.0으로 조정하고 30분간 교반하여 유효성분을 용리하였다. 활성탄을 분리제거후 용출용액 100ℓ를 감압하에서 아세톤을 제거하여 45ℓ로 농축하였다.
0.2%(W/V)의 벤질디메틸세틸암모늄클로라이드를 함유한 디클로로메탄 30ℓ를 농축액에 가하고 교반하여 유효성분을 추출하였다. 이 추출액에 1%(W/V)의 요오드화 나트륨을 함유하는 수용액 4ℓ를 가하여 유효성분을 수액층으로 전용(轉溶)하였다. 이 수액층을 미리 pH 7.4의 인산완충액을 완충화한 DEAE-Sephadex A-25(pharmacia 사제품) 1.5ℓ의 컬럼에 통과시켜 유효성분을 흡착시켰다.
20mM 인산완충액(pH 7.4)에 용해한 0.1M의 식염수 15ℓ로 미리 세척하고, 다시 동일한 완충액에 용해한 0.2M 식염수로 유해성분을 용출하였다. 100ml씩 분액하여 프랙숀(fraction) 108-132에서 활성프랙숀이 얻어졌다. 이 활성프랙숀 24ℓ를 활성탄 240ml의 컬럼에 통과시켜 유효성분을 흡착시켰다. 이 컬럼을 400ml의 물로 세척후 50% 아세톤용액 1ℓ로 유효성분을 용출시켰다. 이 용출액을 감압하에서 농축하여 농축액을 동결건조하면 SF-2103A 물질의 거친 분말 709mg(순도 약 24%)이 얻어졌다.
(3) 또, 위 (1)과 동일한 조작으로 하여 300ℓ 배지 탱크 2기에서 얻어진 배양여액 285ℓ(2.6㎍/ml)를 6N 염산으로 pH 6.2로 조절하고 이 여액에 0.2%(W/V)의 벤질디메틸테트라데실암모늄클로라이드를 함유한 디클로로메탄 95ℓ를 가하여 1시간 교반하고 유효성분을 추출하였다. 이 추출액에 0.7%(W/V)의 요오드화나트륨수용액 8.5ℓ를 가하여 20분간 교반하고 유효성분을 수액층에 전용하였다.
이 수액층을 감압하에서 농축하여 디클로로메탄을 제거한 다음 미리 물로 충전한 활성탄소(和光純藥製品) 400ml의 컬럼을 통과시키고, 다시 300ml의 물로 활성탄소를 세척하였다.
통과액과 세액을 합친 8.3ℓ의 용액을, 미리 pH 7.4의 인산완충액으로 완충화한 DEAE-Sephadex A-25(pharmacia사 제품) 1ℓ의 컬럼에 통과시켜 유효성분을 흡착시켰다.
20mM 인산완충액(pH 7.4)에 용해한 0.2M 식염수 10ℓ로 미리 세척하고 다시 동일한 완충액에 용해한 0.3M 식염수로 유해성분을 용출하였다.
150ml씩 분액하여 프랙숀 17-53에서 활성이 확인되어 이 구분(5.5ℓ)을 합쳐서 미리 물로 충전한 활성탄소(和光純藥 제품) 1.2ℓ의 컬럼에 통과시켜 유효성분을 흡착시켰다.
이 컬럼을 2.3ℓ의 물로 세척한 다음 50% 아세톤수 5.5ℓ로 유효성분을 용출시켰다.
이 용출액을 감압하에서 농축하고 농축액을 동결건조시켜 SF-2103A 물질의 거친분말 540mg이 얻어졌다(순도 약 40%).
(4) (3)에서 얻어진 SF-2103A 물질의 거친 분말 540mg을 40ml의 물로 용해하고 미리 pH 7.2의 인산완충액에 완충화한 DEAE-Sephadex A-25 100ml의 컬럼에 통과시켜 유효성분을 흡착시켰다.
20ml 인산완충액(pH 7.2) 200ml로 세정한 다음, 다시 같은 완충액으로 용해한 0.2M 식염수로 유효성분을 용리시켰다. 용출액을 20ml 프랙숀으로 구분하여 프랙숀 110-165에 활성구분이 얻어졌다.
이 활성 프랙숀을 합쳐서 합성탄소 175ml의 컬럼에 통과시켜 유효성분을 흡착시켰다.
이 활성탄소를 300ml의 물로 세척한 후 50% 아세톤수 800ml로 유효성분을 용출시켰다.
이 용출액을 감압하에서 농축하고 동결건조하여 SF-2103A 물질의 나트륨염은 담황색 분말로서 206mg(순도 약 64%)이 얻어졌다.
다음에 이 분말 200mg을 2ml의 물에 용해시켜 Diaion HP-20AG(일본 三菱化成사 제품) 250ml의 컬럼에 통과시키고 물로 전개하여 7ml 프랙숀으로 용출액을 구분하고 프랙숀 18-26에서 유효물질이 유출되었다. 이 활성프랙숀 중 프랙숀 22-24를 합쳐 감압하에서 농축하고 동결 건조하여 SF-2103A 물질의 나트륨염이 미황색분말로서 60mg(순도 약 77%)이 얻어졌다.
(5) (4)에서 얻어진 미황색분말 60mg을 1ml의 물에 용해하고 Sephadex G-10(pharmacia Co.사 제품) 200ml의 컬럼에 통과시켜 물로 전개하였다.
7ml 프랙숀으로 용출액을 구분하여 프랙숀 11-16에서 활성프랙숀이 얻어지나 프랙숀 12와 13을 합쳐 감압하에서 농축하고 동결건조하여 SF-2103A 물질 나트륨염의 순품을 백색분말로하여 32mg을 얻었다.
이상의 조작 [(2)-(5)]은 모두 저온조건하(4℃)에서 실시하였다.

Claims (1)

  1. 스트렙토미세스(Streptomyces)속에 속하는 SF-2103A 물질 생산균을 영양배지중에 배양하여 그 배양물에서 신항생물질 SF-2103A 물질 또는 그 염을 채취함을 특징으로 하는 신항생물질 SF-2103A 물질의 제조법.
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