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Verfahren zur Herstellung von Gibberellin-Säure
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Gibberellin-Säure.
Gibberellin-Säure ist ein das Pflanzenwachstum förderndes Stimulans, das aus Kulturfiltraten bestimmter aktiver Stämme des Pilzes Gibberella fujikuroi (Fusarium moniliforme) erhalten werden kann. Es ist bekannt, Gibberellin-Säure herzustellen, indem ein aktiver Stamm des Gibberella fujikuroi in einem geeignet in Bewegung gehaltenen und belüfteten Nährmedium kultiviert wird, das als Kohlenstoffquelle, z. B. Glucose, als Stickstoffquelle, z. B. Ammoniumnitrat, bestimmte Metallsalze, z. B. Magnesiumsulfat und Kaliumdiphosphat, und Spuren von Metallen, z. B. Eisen, Kupfer, Zink, Mangan oder Molybdän, enthält. Für dieses Stoffwechselverfahren ist es charakteristisch, dass sich die Säure insbesondere dann bildet, wenn die gesamte Proteinsynthese oder das aktive Wachstum des Pilzes gehemmt ist.
Diese Hemmung des aktiven Wachstums kann die Folge einer Erschöpfung eines der wesentlichen Bestandteile der Nährlösung, das sind Stickstoff oder Kohlenstoff, sein.
Wenn das aktive Wachstum des Pilzes durch Verbrauch eines wesentlichen Bestandteiles des Mediums gehemmt werden soll, soll vorzugsweise dieser wesentliche Bestandteil nicht die Kohlenstoffquelle sein ; Kohlenstoff soll verfügbar sein, um den Erfordernissen des Pilzes während des Stadiums der Bildung der Gibberellin-Säure zu entsprechen.
Es wurde nun gefunden, dass besonders günstige Ausbeuten an Gibberellin-Säure erhalten werden können, wenn, nach Hemmung des aktiven Wachstums des Pilzes und praktischer Erschöpfung der Stickstoffquelle, während der Stufe der Gibberellin- Säure-Bildung, durch kontinuierlichen oder absatzweisen Zusatz einer Kohlenstoffquelle zur Nährlösung, die Konzentration der Kohlenstoffquelle zwischen 0, 1 und 10 g/IOO cm3 des Mediums aufrechterhalten wird.
In bestimmten Grenzen wird je mehr Kohlenstoff während des Stadiums der Säurebildung vorhanden ist, desto mehr Gibberellin-Säure gebildet werden. Jedoch kann eine hohe Konzentration an Kohlenstoff in dem Anfangsstadium des Verfahrens die Geschwindigkeit des Wachstums des Pilzes verzögern und daher eine nachteilige Wirkung auf das erzielte Gesamtergebnis haben. Erfindungsgemäss kann von einer verhältnismässig niederen Konzentration der Kohlenstoffquelle ausgegangen werden, wobei jedoch diese Kohlenstoffquelle, während der Säurebildung nicht einfach bis zur Erschöpfung aufgebraucht wird, wodurch die Säurebildung zum Stillstand kommt, sondern durch Hinzufügung einer zusätzlichen Kohlenstoffquelle die Konzentration der Kohlenstoffquelle in der Nährlösung innerhalb des oben angegebenen Bereiches gehalten wird.
Als Kohlenstoffquelle eignet sich ein Zucker, z. B. Sucrose oder Glucose, ein mehrwertiger Alkohol, z. B. Glyzerin oder deren Ester, oder ein Pflanzenöl.
Die in dem Medium verwendete Stickstoffquelle kann aus einem Ammoniumsalz, einem Nitrat oder Maisquellwasser oder einem abgebauten Protein, z. B. Pepton, oder andern assimilierbaren Stickstoff enthaltenden Quellen bestehen.
Zur Erläuterung der Erfindung seien folgende Versuche angeführt :
Zwei Fermentationsgefässe, A und B, wurden beide mit 301 eines folgenden Mediums versehen :
EMI1.1
<tb>
<tb> Fermentator <SEP> A <SEP> Fermentator <SEP> B
<tb> Glucosemonohydrat <SEP> 10 <SEP> g/100 <SEP> CD13 <SEP> 10 <SEP> g/100 <SEP> CD13
<tb> Ammoniumnitrat <SEP> ...................... <SEP> 0,48 <SEP> g/100 <SEP> CD13 <SEP> 0, <SEP> 24 <SEP> g/100 <SEP> cm3
<tb> KaliuD1phosphat. <SEP> ""'. <SEP> """'.'.'. <SEP> """.. <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> g/100 <SEP> CD13 <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> g/100 <SEP> CD13
<tb> Magnesiumsulfatheptahydrat <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> g/100 <SEP> cm3 <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> g/100 <SEP> cm3 <SEP>
<tb> Konzentrat <SEP> der <SEP> nicht <SEP> wesentlichen <SEP> Zusätze <SEP> *).
<SEP> 0, <SEP> 2 <SEP> Vol./Vol.-% <SEP> 0, <SEP> 2 <SEP> Vol./Vol.-% <SEP>
<tb> *) <SEP> Das <SEP> Konzentrat <SEP> hatte <SEP> folgende <SEP> Zusammensetzung <SEP> : <SEP>
<tb> Ferrosulfatheptahydrat..................0,1 <SEP> g
<tb> Kupfersulfatpentahydrat <SEP> 0, <SEP> 015 <SEP> g
<tb> Zinksulfatheptahydrat <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> g
<tb> Mangansulfatheptahydrat <SEP> 0, <SEP> 01 <SEP> g
<tb> Kaliummolybdat <SEP> (K2MoO4).......................0,01 <SEP> g
<tb> Wasser <SEP> ........................
<SEP> 100 <SEP> cm1
<tb>
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Die Medien wurden mit einem aktiven Stamm von Gibberella fujikuroi inokuliert (Proben hinterlegt in den Kultursammlungen des Commonwealth Mycological Institute in Kew, des Bureau voor Schimmelcultures in Baarn und des Northern Utilisation Research and Development Division of the United States Department of Agriculture in Peoria, Illinois, USA) und bei einer Temperatur von 26, 2' C gehalten, wobei in die Medien Luft mit einer Geschwindigkeit von 151/min eingeblasen wurde. Die Fermentation wurde 118 Stunden vor sich gehen gelassen, wonach das aktive Wachstum im wesentlichen durch Verbrauch des Stickstoffs in dem Medium gehemmt war. Hierauf wurde, um die Zuckerkonzentration in dem Medium über 2 g/100 cm3 zu halten, Glucosemonohydrat aseptisch in Anteilen von 150 g zugesetzt.
Die folgende Tabelle zeigt den von dem Pilz verbrauchten gesamten Zucker und die Konzentration an Gibberellin-Säure in beiden Medien bei fortschreitender Züchtung.
EMI2.1
<tb>
<tb>
Gibberellin-Saure <SEP> Verbrauchter <SEP> Zucker
<tb> (Stunden <SEP> mg/l <SEP> g/l
<tb> nach <SEP> der
<tb> Inokulation) <SEP> Fermentator <SEP> Fermentator <SEP> Fermentator <SEP> Fermentator
<tb> A <SEP> B <SEP> A <SEP> B
<tb> 48 <SEP> I <SEP> 5 <SEP> 5
<tb> 69 <SEP> 11 <SEP> 12 <SEP>
<tb> 76 <SEP> 15 <SEP> 16
<tb> 93 <SEP> 44 <SEP> 25
<tb> 99 <SEP> I <SEP> 57 <SEP> 29
<tb> 117 <SEP> I <SEP> 98 <SEP> 52 <SEP>
<tb> lig <SEP> 98 <SEP> 56
<tb> 124 <SEP> 106 <SEP> 56 <SEP>
<tb> 141 <SEP> I <SEP> 0 <SEP> 129 <SEP> 68
<tb> 148 <SEP> ! <SEP> IM <SEP> ! <SEP> 69
<tb> 166 <SEP> 1 <SEP> 48 <SEP> 153 <SEP> 78
<tb> 171 <SEP> 0 <SEP> 157 <SEP> 79 <SEP>
<tb> 189 <SEP> Spur <SEP> 86 <SEP> 172 <SEP> 87
<tb> 215 <SEP> Spur <SEP> 115 <SEP> 193 <SEP> 95
<tb> 238 <SEP> 63 <SEP> 147 <SEP> 209 <SEP> 109
<tb> 285 <SEP> 87 <SEP> I <SEP> 178 <SEP> 219 <SEP> i <SEP> - <SEP>
<tb> 334 <SEP> 135 <SEP>
J <SEP> 252 <SEP> I <SEP> 246 <SEP> 109
<tb> 405 <SEP> 192 <SEP> I <SEP> 297 <SEP> I <SEP> 278 <SEP> - <SEP>
<tb> 501 <SEP> I <SEP> 251 <SEP> : <SEP> 375 <SEP> 265 <SEP> 167
<tb> 573 <SEP> 324 <SEP> 409 <SEP> 355 <SEP> 237
<tb>
Das im Fermentationsgefäss A verwendete Medium war in bezug auf Kohlenstoff und Stickstoff im wesentlichen ausgeglichen, d. h. dass es die beiden Nährstoffe ungefähr in den Verhältnis enthielt, in welchem sie von dem wachsenden Pilz verbraucht werden. Daher war der Kohlenstoff ungefähr zur gleichen Zeit wie der Stickstoff verbraucht und es konnte nicht erwartet werden, dass der Gehalt an GibberellinSäure 120 mg/l übersteigt, da zusätzliche Nährstoffe nicht vorhanden waren.
Aus der Tabelle ist jedoch zu ersehen, dass, wenn nach Aufhören des aktiven Wachstums, eine Kohlenstoffquelle, in diesem Falle Glucosemonohydrat, zugesetzt wird, die Bildung von Gibberellin-Säure zumindest solange aufrechterhalten werden kann, bis deren Konzentration auf 324 mg/1 gestiegen ist.
Im Fermentationsgefäss B enthielt das Medium schon vom Anfang an einen Überschuss an Kohlenstoff, der noch vorrätig war, wenn der Stickstoffgehalt erschöpft war, so dass normalerweise die Bildung von 240 gm/1 Gibberellin-Säure erwartet hätte werden können. Infolge der durch den Zusatz von Zucker erfolgten Bereitstellung von Kohlenstoff wurde bewirkt, dass die Säurekonzentration auf 409 mg/l stieg.
Das für die Stufe des aktiven Wachstums des Pilzes verwendete Medium ist ein sogenanntes ausgeglichenes Medium, in welchem die Stickstoffkonzentration 0, 017-0, 26 g/100 cm3, z. B. in Form von 0, 05 bis 0, 75 g/100 cm3 Ammoniumnitrat, und vorzugsweise 0, 07 - 0, 17 gjl00 cm3 Stickstoff, z. B. in Form von 0, 2 bis 0, 5 gjlOO cm3 Ammoniumnitrat beträgt. Die Kohlenstoffkonzentration, z. B. in Form von Sucrose, Glucose oder Glycerin wird dann so gewählt, dass ein Medium hergestellt wird, in. welchem das Verhältnis von Kohlenstoff zu Stickstoff vorzugsweise zwischen den Verhältniswerten von 10 : 1 und 25 : 1 liegt. Ein typisches ausgeglichenes Medium, das sich für das aktive Wachstum eignet, kann z.
B. 0, 24 g/100 cm3 Ammoniumnitrat und 3, 18 g/ 100 cm3 Glucosemonohydrat, was einem Verhältnis von C : N von 14 : 1 entspricht, oder 0, 48 g/100 cm3 Ammoniumnitrat und 10 g/100 cm3 Glucosemonohydrat enthalten, was einem Verhältnis von C : N von 21 : 5 entspricht.
Wenn das aktive Wachstum durch Erschöpfung des Stickstoffes in einem ausgeglichenen Medium im wesentlichen gehemmt ist, verbleibt in dem Medium nur wenig oder kein Überschuss an Kohlenstoff, so dass nur wenig oder kein Kohlenstoff vorhanden ist, aus welchem der Pilz Gibberellin-Säure bilden kann. Das ist das Stadium, bei welchem eine zusätzliche Kohlenstoffquelle zu dem Medium hinzugefügt wird, um eine weitere Bildung von Gibberellin-Säure zu ermöglichen.
Die Menge der dem Medium gegen Ende der Stufe des aktiven Wachstums zugesetzten Kohlenstoffquelle wird geregelt, damit die Bildung von Gibberellin-Säure nicht gehemmt wird. Ein grosser Überschuss an der Kohlenstoffquelle ist während der Verfahrensstufe der Säurebildung unvorteilhaft ; ein zweckmässiger Überschuss ist z. B. in Form von zwischen 0, 1 und 10 g/100 cm3 Glucose und insbesondere in Form von zwischen 1 und 4 g/100 cm3 Glucose vorhanden. Das erfindungsgemässe Verfahren kann auch in einem Mehrstufenverfahren zur Herstellung von Gibberellin-Säure verwendet werden.
So kann die Züchtung des aktiven Stammes von Gibberella fujikuroi in zwei oder mehr Stufen, vorzugsweise in zumindest 3 Stufen, ausgeführt werden, wobei während der ersten Stufe ein aktives Wachstum der Pilze in einem ungefähr ausgeglichenen Medium, d. i. ein Medium mit einem C : N-Verhältnis, das zwischen 10 : 1 und 25 : 1 : liegt, vor sich geht, während in der zweiten Stufe
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EMI3.1
Magnesiumsulfatheptahydrat und 0, 2 g/100 cm3 eines Konzentrates mit nicht wesentlichen Bestandteilen enthält, eine Zusammensetzung, die schon beschrieben worden ist, wird bei einem pH-Wert von 3, 47 mit einer Agarkultur von Gibberella fujikuroi inokuliert.
Das Medium wird bei 25 C gehalten, gerührt und mit Luft mit einer Geschwindigkeit von 2, 5 1 Luftjmin belüftet.
Erzeugungsfermentation :
EMI3.2
ein Nährmedium folgender Zusammensetzung enthält :
EMI3.3
<tb>
<tb> Glucosemonohydrat....... <SEP> 8 <SEP> g/100 <SEP> cm3 <SEP>
<tb> Ammoniumnitrat........ <SEP> 0, <SEP> 24 <SEP> gj100 <SEP> cm3 <SEP>
<tb> Magnesiumsulfathepta-0, <SEP> 1 <SEP> g/100 <SEP> cm3 <SEP>
<tb> hydrat
<tb> Kaliumdiphosphat....... <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> gjlOO <SEP> cm3 <SEP>
<tb> Konzentrat <SEP> nicht <SEP> wesentlicher <SEP> Zusätze <SEP> *)....... <SEP> 0, <SEP> 2 <SEP> Vol. <SEP> -/Vol. <SEP> -% <SEP>
<tb> Wasser <SEP> zum <SEP> Auffüllen <SEP> auf
<tb> 751
<tb> *) <SEP> Das <SEP> Konzentrat <SEP> hatte <SEP> dieselbe <SEP> Zusammensetzung <SEP> wie <SEP> vorher <SEP> beschrieben.
<tb>
Das Medium wird sterilisiert, abgekühlt und mit 51 des oben beschriebenen Inokulates geimpft. Hierauf wird das Medium gerührt, bei einer Temperatur von 26 C gehalten und mit einem Luftstrom von 0, 5 Vol. Luft/Vol. Kultur- medium/min belüftet. Wenn das aktive Wachstum des Pilzes aufhört, das ist, wenn die Stickstoffquelle vollkommen verbraucht ist, beginnt die Bildung der Gibberellin-Säure, wobei die vorrätige Kohlenstoffquelle (Glucose) rasch an Konzentration abnimmt.
39 Stunden nach dem Beginn der Bildung von Gibberellin-Säure in der säurebildenden Stufe ist die Glucose-Konzentration ungefähr 0, 9 g/100 cm3, wonach Zucker zu dem Nährmedium in 12stündlichen Intervallen hinzugefügt wird, um eine Konzentration von 2 gjlOO cm3 Glucose in dem Nährmedium während des restlichen Abschnittes der Fermentationsstufe der Säurebildung aufrechtzuerhalten.
Die folgende Tabelle zeigt die Konzentration an Gibberellin-Säure in dem Medium mit Bezug auf die bei fortschreitender Fermentation verbrauchte Glucose :
EMI3.4
<tb>
<tb> Alter <SEP> (Stunden <SEP> nach <SEP> Gibberellin-Säure <SEP> Verbrauchter <SEP> Zucker
<tb> der <SEP> Inokulation) <SEP> mg/t <SEP> g/100 <SEP> cm <SEP>
<tb> 48 <SEP> 23 <SEP> 4, <SEP> 9 <SEP>
<tb> 71 <SEP> 105 <SEP> 6, <SEP> 8 <SEP>
<tb> 144 <SEP> 268 <SEP> 10, <SEP> 6 <SEP>
<tb> 191 <SEP> 352 <SEP> 12, <SEP> 1 <SEP>
<tb> 336 <SEP> 489 <SEP> 16, <SEP> 5 <SEP>
<tb> 359 <SEP> 618 <SEP> 17,1
<tb>
<Desc/Clms Page number 4>
Der Inhalt des Fermentationsgefässes wird dann filtriert und eine Probe (58 1) des Filtrates mit Äthylacetat zur Entfernung der Gibberllin-Säure extrahiert, die dann nach bekannten Verfahren isoliert wird.
Man erhält auf diese Weise 33, 48 g Gibberellin-Säure als farbloses kristallines Pulver, F=233-235 C unter Zersetzung. Aus dem Filtrat kann noch zusätzliche Gibberellin-Säure erhalten werden.
Beispiel 2 : Das Verfahren gemäss Beispiel 1 wird wiederholt, wobei jedoch die 8 g/100 cm3 Glucosemonohydrat und die 0, 24 gjlOO cm3 Ammoniumnitrat in dem während der Stufe der Gibberellin-Säure-Bildung verwendeten Medium durch 20 g/100 cm3 Glucosemonohydrat und
EMI4.1
rasch verbraucht ; zusätzliche Mengenanteile an Glucosemonohydrat werden in 12stündlichen Intervallen nach ungefähr 74 Stunden zugesetzt, um in dem Nährmedium während der restlichen Zeit dieser Fermentationsstufe eine ungefähre 4 g/100 cm3 Konzentration an Glucose aufrechtzuerhalten.
Die folgende Tabelle zeigt die Konzentration der Gibberellin-Säure in dem Medium mit Bezug auf die bei fortschreitender Fermentation verbrauchte Glucose :
EMI4.2
<tb>
<tb> Alter <SEP> (Stunden <SEP> nach <SEP> Gibberellin-Saure <SEP> Verbrauchter <SEP> Zucker
<tb> der <SEP> Inoku) <SEP> ation) <SEP> mg/l <SEP> g/lOOcm <SEP>
<tb> 76 <SEP> I <SEP> 6 <SEP> I <SEP> 6, <SEP> 5 <SEP>
<tb> 100 <SEP> 46 <SEP> 10, <SEP> 4 <SEP>
<tb> 112 <SEP> 79 <SEP> 12, <SEP> 3 <SEP>
<tb> 124 <SEP> 133 <SEP> 13, <SEP> 4 <SEP>
<tb> 136 <SEP> 138 <SEP> 14, <SEP> 6 <SEP>
<tb> 148 <SEP> 229 <SEP> 16, <SEP> 3 <SEP>
<tb> 160 <SEP> 245 <SEP> 17, <SEP> 9 <SEP>
<tb> 172 <SEP> 291 <SEP> 18, <SEP> 5 <SEP>
<tb> 184 <SEP> 306 <SEP> 19, <SEP> 1 <SEP>
<tb> 232 <SEP> 350 <SEP> 21, <SEP> 6 <SEP>
<tb> 244 <SEP> 428 <SEP> 22, <SEP> 3 <SEP>
<tb> 268 <SEP> I <SEP> 453 <SEP> 23,
<SEP> 9 <SEP>
<tb> 280 <SEP> I <SEP> 487 <SEP> 24, <SEP> 7 <SEP>
<tb> 292 <SEP> ! <SEP> 520 <SEP> 25, <SEP> 4 <SEP>
<tb> 304 <SEP> 541 <SEP> 26, <SEP> 2 <SEP>
<tb> 316 <SEP> 559 <SEP> 27, <SEP> 1 <SEP>
<tb> 329 <SEP> 610 <SEP> 27, <SEP> 7 <SEP>
<tb> 341 <SEP> 624 <SEP> 28, <SEP> 7 <SEP>
<tb> 364 <SEP> I <SEP> 646 <SEP> 30, <SEP> 2 <SEP>
<tb> 376 <SEP> 640 <SEP> 30, <SEP> 8 <SEP>
<tb> 412 <SEP> 670 <SEP> 33, <SEP> 1 <SEP>
<tb> 460 <SEP> 768 <SEP> 34, <SEP> 2 <SEP>
<tb> 484 <SEP> 794 <SEP> 34, <SEP> 4 <SEP>
<tb> 508 <SEP> 826 <SEP> 35, <SEP> 0 <SEP>
<tb>
Beispiel 3 :
Das Verfahren gemäss Beispiel l wird wiederholt, wobei jedoch die 8 gjlOO cm3 Glucosemonohydrat und die 0, 24 g/100 cm3 Ammoniumnitrat in dem zur Erzeugungsfermentation verwendeten Medium durch 20 g/100 cm3 Glucosemonohydrat und 0, 4 gjlOO cm3 Ammo- niumnitrat ersetzt werden. Während der Säurebildungs-Stufe wird der in dem Nährmedium vorhandene Überschuss an Glucose verbraucht ; zusätzliche Mengenanteile an Glucosemonohydrat werden in 12stündlichen Intervallen nach ungefähr 26 Stunden zugesetzt, um in dem Nährmedium während des restlichen Abschnittes dieser Fermentationsstufe eine Konzentration von ungefähr 10 g/100 cm3 Glucose aufrechtzuerhalten.
Die folgende Tabelle zeigt die Konzentration an Gibberellin-Säure mit Bezug auf die bei fortschreitender Fermentation verbrauchte Glucose :
EMI4.3
<tb>
<tb> Alter <SEP> (Stunden <SEP> nach <SEP> Gibberellin-Säure <SEP> Verbrauchter <SEP> Zucker <SEP>
<tb> der <SEP> Inokulation) <SEP> mg/l <SEP> g/lOOcmr <SEP>
<tb> 28 <SEP> 10 <SEP> 6, <SEP> 4 <SEP>
<tb> 30 <SEP> 22 <SEP> 8, <SEP> 1 <SEP>
<tb> 52 <SEP> 67 <SEP> 9, <SEP> 4 <SEP>
<tb> 64 <SEP> 100 <SEP> 11, <SEP> 2 <SEP>
<tb> 76 <SEP> 115 <SEP> 12, <SEP> 1 <SEP>
<tb> 88 <SEP> 121 <SEP> 13, <SEP> 7 <SEP>
<tb> 100 <SEP> 160 <SEP> 14, <SEP> 2 <SEP>
<tb> 112 <SEP> 192 <SEP> 14, <SEP> 8 <SEP>
<tb> 124 <SEP> 203 <SEP> 15, <SEP> 7 <SEP>
<tb> 136 <SEP> 249 <SEP> 16, <SEP> 8 <SEP>
<tb> 148 <SEP> 261 <SEP> 17, <SEP> 6 <SEP>
<tb> 184 <SEP> 272 <SEP> 19, <SEP> 0 <SEP>
<tb> 208 <SEP> 285 <SEP> 20,
<SEP> 3 <SEP>
<tb> 220 <SEP> 350 <SEP> 21, <SEP> 0 <SEP>
<tb> 244 <SEP> 383 <SEP> 22, <SEP> 6
<tb> 256 <SEP> 445 <SEP> 23, <SEP> 2 <SEP>
<tb> 268 <SEP> 520 <SEP> 24, <SEP> 0
<tb> 293 <SEP> 541 <SEP> 25, <SEP> 6 <SEP>
<tb> 304 <SEP> 546 <SEP> 26, <SEP> 5 <SEP>
<tb> 328 <SEP> 583 <SEP> 28, <SEP> 3 <SEP>
<tb> 412 <SEP> 754 <SEP> 32, <SEP> 7 <SEP>
<tb> 460 <SEP> 794 <SEP> 33, <SEP> 7 <SEP>
<tb> 508 <SEP> 820 <SEP> 34, <SEP> 4 <SEP>
<tb> 532 <SEP> 840 <SEP> 34, <SEP> 6 <SEP>
<tb> 580 <SEP> 905 <SEP> 35, <SEP> 0 <SEP>
<tb>
Beispiel 4 : Das Verfahren gemäss Beispiel l wird wiederholt, wobei jedoch die 8 g/100 cm3
EMI4.4
ersetzt werden.
Während der Fermentationsstufe der Bildung der Gibberellin-Säure wird der in dem Nährmedium vorhandene Glucoseüberschuss rasch verbraucht ; es werden zusätzliche Mengenanteile Glucosemonohydrat nach 162 Stunden und danach in 12- bis 24stündlichen Intervallen zugesetzt, um in dem Nährmedium während des restlichen Abschnittes der säurebildenden Fermentationsstufe eine Konzentration von ungefähr 1-3 g/100 cm3 Glucose aufrechtzuerhalten.
Die folgende Tabelle zeigt die Konzentration an Gibberellin-Säure in dem Medium mit Bezug auf die bei fortschreitender Fermentation vorhandene Glucosekonzentration :
<Desc/Clms Page number 5>
EMI5.1
<tb>
<tb> Alter <SEP> (Stunden <SEP> nach <SEP> Gibberellin-Säure <SEP> Konzentration <SEP> des
<tb> der <SEP> Inokulation) <SEP> (mg/l) <SEP> Zuckers <SEP> g/100 <SEP> cm2
<tb> 16 <SEP> 15, <SEP> 95
<tb> 40 <SEP> 15, <SEP> 5 <SEP>
<tb> 46 <SEP> 14, <SEP> 16 <SEP>
<tb> 52 <SEP> 14, <SEP> 05
<tb> 64 <SEP> 12, <SEP> 36
<tb> 69 <SEP> 10, <SEP> 99 <SEP>
<tb> 75 <SEP> 10 <SEP> 9, <SEP> 35 <SEP>
<tb> 88 <SEP> 42 <SEP> 7, <SEP> 83 <SEP>
<tb> 93 <SEP> 60 <SEP> 8, <SEP> 70 <SEP>
<tb> 100 <SEP> 88 <SEP> 5, <SEP> 94 <SEP>
<tb> 111 <SEP> 107 <SEP> 4, <SEP> 77 <SEP>
<tb> 124-3, <SEP> 51 <SEP>
<tb> 136 <SEP> 198 <SEP> 2,
<SEP> 59 <SEP>
<tb> 148 <SEP> 206 <SEP> 1, <SEP> 63 <SEP>
<tb> 160 <SEP> 253 <SEP> 0,75
<tb> 172 <SEP> 306 <SEP> 0, <SEP> 93 <SEP>
<tb> 184 <SEP> 311 <SEP> 0, <SEP> 94 <SEP>
<tb> 208 <SEP> 449 <SEP> 1, <SEP> 53 <SEP>
<tb> 232 <SEP> 449 <SEP> 3, <SEP> 2 <SEP>
<tb> 256 <SEP> 478 <SEP> 2, <SEP> 13 <SEP>
<tb> 280 <SEP> 507 <SEP> 1, <SEP> 78 <SEP>
<tb> 304 <SEP> 558 <SEP> 1, <SEP> 72 <SEP>
<tb> 328 <SEP> 642 <SEP> 1, <SEP> 72 <SEP>
<tb> 352 <SEP> 692 <SEP> 3, <SEP> 17 <SEP>
<tb> 376 <SEP> 765 <SEP> 3, <SEP> 31 <SEP>
<tb> 400 <SEP> 809 <SEP> 3,3
<tb> 424 <SEP> - <SEP> 2,35
<tb> 448 <SEP> 838 <SEP> 2, <SEP> 43 <SEP>
<tb> 472 <SEP> 864 <SEP> 1, <SEP> 43 <SEP>
<tb> 496 <SEP> 864 <SEP> 1, <SEP> 5 <SEP>
<tb> 520 <SEP> 956 <SEP> 1,41
<tb>
Gibberellin-Säure wird nach bekannten Verfahren durch Filtration des Fermentationsmediums und durch Leitung des Filtrates (631)
über Kohle erhalten. Die adsorbierte GibberellinSäure wird durch Elution entfernt, isoliert und durch Kristallisation gereinigt. Man erhält auf diese Weise 63, 0 g Gibberellin-Säure als farbloses kristallines Produkt, F = 233-235 C unter Zersetzung.
Beispiel 5 : Das Verfahren gemäss Beispiel 1
EMI5.2
setzt werden. Während der Fermentationsstufe der Gibberellin-Säure-Bildung wird der in dem Nährmedium vorhandene Überschuss an Glucose verbraucht ; es werden zusätzliche Mengenanteile von Glucosemonohydrat nach 154 Stunden und danach in 12stündlichen Intervallen zugesetzt, um in dem Nährmedium während des restlichen Abschnittes der Säurebildung eine Konzentration von ungefähr 1-4 gjlOO cm3 Glucose aufrechtzuerhalten.
Die folgende Tabelle zeigt die Konzentration an Gibberellin-Säure in dem Medium in Abhängigkeit von der Glucosekonzentration bei fortschreitender Fermentation.
EMI5.3
<tb>
<tb> Alter <SEP> (Stunden <SEP> nach <SEP> Gibbberellin-Säure <SEP> Konzentration <SEP> des
<tb> der <SEP> Inokulation) <SEP> (mg/l) <SEP> Zuckers <SEP> g/100 <SEP> cm' <SEP>
<tb> 9 <SEP> 18, <SEP> 25 <SEP>
<tb> 40 <SEP> 17, <SEP> 97 <SEP>
<tb> 44 <SEP> 16, <SEP> 98 <SEP>
<tb> 57 <SEP> 16, <SEP> 2 <SEP>
<tb> 63 <SEP> 15, <SEP> 43 <SEP>
<tb> 82 <SEP> I <SEP> 6 <SEP> 12, <SEP> 69 <SEP>
<tb> 106 <SEP> 46 <SEP> 8, <SEP> 73 <SEP>
<tb> 118 <SEP> 79 <SEP> 6, <SEP> 86 <SEP>
<tb> 130 <SEP> 133 <SEP> 5, <SEP> 76 <SEP>
<tb> 142 <SEP> 138 <SEP> I <SEP> 4, <SEP> 6 <SEP>
<tb> 154 <SEP> 229 <SEP> 3, <SEP> 84
<tb> 166 <SEP> 245 <SEP> 4, <SEP> 23
<tb> 178 <SEP> 291 <SEP> 4, <SEP> 07
<tb> 190 <SEP> 305 <SEP> 4,
09
<tb> 202-4, <SEP> 06 <SEP>
<tb> 214 <SEP> - <SEP> 4,14
<tb> 226-4, <SEP> 09 <SEP>
<tb> 238 <SEP> 350 <SEP> 3, <SEP> 82 <SEP>
<tb> 250 <SEP> 427 <SEP> I <SEP> 3, <SEP> 86 <SEP>
<tb> 262 <SEP> 427 <SEP> 3, <SEP> 68 <SEP>
<tb> 274 <SEP> 452 <SEP> 3, <SEP> 4 <SEP>
<tb> 286 <SEP> 486 <SEP> 3, <SEP> 31 <SEP>
<tb> 298 <SEP> 519 <SEP> 3, <SEP> 13 <SEP>
<tb> 310 <SEP> 558 <SEP> 3, <SEP> 05 <SEP>
<tb> 322 <SEP> 591 <SEP> 2, <SEP> 79 <SEP>
<tb> 335 <SEP> 634 <SEP> 2, <SEP> 46 <SEP>
<tb> 347 <SEP> 623 <SEP> 2, <SEP> 54 <SEP>
<tb> 358 <SEP> 623 <SEP> 2, <SEP> 07 <SEP>
<tb> 370 <SEP> 645 <SEP> 1, <SEP> 88 <SEP>
<tb> 382 <SEP> 639 <SEP> 3,3
<tb> 394 <SEP> 660 <SEP> 1,5
<tb> 406 <SEP> 669 <SEP> 1, <SEP> 35
<tb> 418 <SEP> 669 <SEP> 0, <SEP> 21
<tb> 430 <SEP> 669 <SEP> 1, <SEP> 12
<tb> 442 <SEP> 669 <SEP> 0, <SEP> 84
<tb> 466 <SEP> 940 <SEP> 0,
<SEP> 8 <SEP>
<tb> 490 <SEP> 792 <SEP> 0, <SEP> 13 <SEP>
<tb> 514 <SEP> 825 <SEP> - <SEP>
<tb> 538 <SEP> I <SEP> - <SEP> - <SEP>
<tb> 562 <SEP> 809 <SEP> I <SEP> - <SEP>
<tb> 586 <SEP> 812 <SEP> -
<tb>
Beispiel 6 : Das Verfahren gemäss Beispiel 1 wird wiederholt, wobei jedoch an Stelle der 8 gj100 cm3 Glucosemonohydrat und der 0,24 g/ 100 cm3 Ammoniumnitrat 10 g/100 cm3 Glucosemonohydrat und 0,4 g/100 cm3 Ammoniumnitrat eingesetzt werden.
Während der Fermentationsstufe der Gibberellin-Säure-Bildung wird der in dem Nährmedium vorhandene Überschuss an Glucose aufgebraucht ; es werden zusätzliche Mengenanteile an Glucose nach 60, 5 Stunden und danach in 12- bis 24stündlichen Intervallen zugesetzt, um in dem Nährmedium während des restlichen Abschnittes der Fermentationsstufe der Säurebildung eine Konzentration von ungefähr 2-4 g/100 cm3 Glucose aufrechtzuerhalten.
Die folgende Tabelle zeigt die Konzentration an Gibberellin-Säure in dem Medium in Abhängigkeit von der Glucosekonzentration bei fortschreitender Fermentation :
<Desc/Clms Page number 6>
EMI6.1
<tb>
<tb> Alter <SEP> (Stunden <SEP> nach <SEP> Gibberellin-Säure <SEP> Konzentration <SEP> des
<tb> der <SEP> Inokulation) <SEP> (mg/l) <SEP> Zuckers <SEP> g/100 <SEP> cm <SEP> ! <SEP>
<tb> 16 <SEP> 10, <SEP> 58 <SEP>
<tb> 40 <SEP> I <SEP> 8, <SEP> 39 <SEP>
<tb> 46 <SEP> 6, <SEP> 9 <SEP>
<tb> 52 <SEP> I <SEP> 5 <SEP> 5, <SEP> 44 <SEP>
<tb> 60 <SEP> I <SEP> 14 <SEP> 3, <SEP> 58 <SEP>
<tb> 64 <SEP> 29 <SEP> 4, <SEP> 87 <SEP>
<tb> 69 <SEP> 65 <SEP> 3, <SEP> 67 <SEP>
<tb> 75 <SEP> 93 <SEP> 2, <SEP> 86
<tb> 88 <SEP> 128 <SEP> 3, <SEP> 69 <SEP>
<tb> 93 <SEP> 154 <SEP> 2, <SEP> 83
<tb> 100 <SEP> 174 <SEP> I <SEP> 2, <SEP> 49 <SEP>
<tb> 111 <SEP> 195 <SEP> 2,
<SEP> 54
<tb> 124 <SEP> 225 <SEP> 2, <SEP> 54
<tb> 136 <SEP> 276 <SEP> 2,54
<tb> 148 <SEP> 293 <SEP> 2,76
<tb> 160 <SEP> 323 <SEP> I <SEP> 2, <SEP> 95 <SEP>
<tb> 184 <SEP> 406 <SEP> 3, <SEP> 18 <SEP>
<tb> 208 <SEP> 491 <SEP> 3, <SEP> 77 <SEP>
<tb> 232 <SEP> 500 <SEP> 4, <SEP> 52 <SEP>
<tb> 256 <SEP> 569 <SEP> 4, <SEP> 6 <SEP>
<tb> 280 <SEP> 590 <SEP> 4, <SEP> 04
<tb> 304-3, <SEP> 96 <SEP>
<tb> 328 <SEP> 698 <SEP> 1 <SEP> 2, <SEP> 79 <SEP>
<tb> 352 <SEP> 762 <SEP> 2, <SEP> 84 <SEP>
<tb> 376 <SEP> 825 <SEP> I <SEP> 2, <SEP> 41 <SEP>
<tb> 400 <SEP> 901 <SEP> 2, <SEP> 16 <SEP>
<tb> 424-0, <SEP> 84 <SEP>
<tb> 448 <SEP> 973 <SEP> 0, <SEP> 33 <SEP>
<tb> 472 <SEP> 1002 <SEP> 0, <SEP> 22 <SEP>
<tb> 496 <SEP> 989 <SEP> 0, <SEP> 26 <SEP>
<tb> 520-0,
<SEP> 21 <SEP>
<tb>
Gibberellin-Säure wird nach bekannten Verfahren durch Filtration des Fermentationsmediums und Leitung des Filtrates (601) über Kohle erhalten. Die adsorbierte Gibberellin-Säure wird durch Elution entfernt, isoliert und durch Kristallisation gereinigt. Man erhält auf diese Weise 63, 6 g Gibberellin-Säure als farblose kristalline Substanz, F = 233- 235 C unter Zersetzung.
EMI6.2
das Volumen des Nährmediums 100 cm3 beträgt. Das Nährmedium enthält 0, 22 g/100 cm3 Am-
EMI6.3
monohydrat wird dem Nährmedium in den in der folgenden Tabelle angegebenen Mengenanteilen in den betreffenden Kolben eingeführt, die Kolben mit Watte verschlossen, sterilisiert und gekühlt.
Die Kolben werden dann mit einer Mycelensuspension aus einer Agarkultur von Gibberella fujikuroi inokuliert und bei 25 C auf einer Vorrichtung inkubiert, welche die Kolben mit einer Geschwindigkeit von 250 Umdr/min einen horizontalen Kreis beschreiben lässt. Täglich werden jedem Kolben 0, 33 g/100 cm3 zuvor sterilisiertes Arachisöl zugesetzt ; mit diesem Zusatz wird begonnen, sobald die in dem Medium vorhandene Menge an Glucose durch das Wachstum des Pilzes weniger als 1, 0 g/lOO cm3 beträgt, wobei der erste derartige Zusatz nicht vor der 24. Stunde der Fermentation erfolgt. Die Ausbeuten an Gibberellin-Säure sind in der folgenden Tabelle angegeben.
EMI6.4
<tb>
<tb>
Glucose <SEP> im <SEP> Gesamtmenge <SEP> an <SEP> Gibberellin-Säuie
<tb> Fermentations- <SEP> zugesetztem <SEP> Arachis- <SEP> nach <SEP> 200stündiger
<tb> medium <SEP> (g/100 <SEP> cm3) <SEP> öl <SEP> (g/100 <SEP> cm2) <SEP> Fermentation <SEP> (mg/l)
<tb> 6, <SEP> 0 <SEP> 0, <SEP> 00 <SEP> 200
<tb> 6,0 <SEP> 1,65 <SEP> 250
<tb> 5, <SEP> 0 <SEP> 1, <SEP> 65 <SEP> 230
<tb> 4, <SEP> 0 <SEP> 1, <SEP> 32 <SEP> 220
<tb> 3, <SEP> 0 <SEP> 1, <SEP> 32 <SEP> 225
<tb> 2,0 <SEP> 2,64 <SEP> 260
<tb> !
<tb>
EMI6.5
bestimmten Mengenverhältnissen in das Fermentationsmedium Glyzerin und Glucose eingeführt werden und Ölzusätze nicht erfolgen.
Die Ausbeuten an Gibberellin-Säure sind in der folgenden Tabelle angeführt :
EMI6.6
<tb>
<tb> Glucose <SEP> im <SEP> Glyzerin <SEP> im <SEP> Gibberellin-Säure
<tb> Fermentations- <SEP> Fermentations- <SEP> nach <SEP> 260stündiger
<tb> medium <SEP> (g/100 <SEP> cm2) <SEP> medium <SEP> (g/100 <SEP> cm2) <SEP> Fermentation <SEP> (mg/l)
<tb> 8 <SEP> 0 <SEP> 200
<tb> 6 <SEP> 2 <SEP> 240
<tb> 4 <SEP> 4 <SEP> 260
<tb> 2 <SEP> 6 <SEP> 270
<tb> 0 <SEP> 8 <SEP> 160
<tb>
PATENTANSPRÜCHE :
1.
Verfahren zur Herstellung von GibberellinSäure durch Züchtung eines aktiven Stammes von Pilzen der Gattung Gibberella fujikuroi in einer durchlüfteten Kohlehydrat und assimilierbaren Stickstoff enthaltenden Nährlösung, wobei nach Hemmung des aktiven Wachstums des Pilzes, sobald die N-Quelle praktisch erschöpft ist, bei noch vorhandenem C-Quelle-Überschuss die Säurebildung verstärkt einsetzt, dadurch gekennzeichnet, dass während der Stufe der Gibberellin-Säure- Bildung durch kontinuierlichen oder absatzweisen Zusatz einer Kohlenstoffquelle zur Nährlösung die Konzentration der Kohlenstoffquelle zwischen 0, 1 und 10 g/100 cm3 des Mediums aufrechterhalten wird.
EMI6.7