DE1150348B - Verfahren zur Herstellung von Gibberellinsaeure - Google Patents
Verfahren zur Herstellung von GibberellinsaeureInfo
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Description
- Verfahren zur Herstellung von Gibberellinsäure Die vorliegende Erfindung betrifft ein verbessertes biochemisches Verfahren zur Herstellung von Gibberellinsäure.
- Gibberellinsäure ist ein Pflanzenwuchsstoff, der aus den Filtraten von Kulturen bestimmter aktiver Stämme des Schimmelpilzes Gibberella fujikuroi (Fusarium monilifoizne) erhältlich ist. Es ist bereits bekannt, Gibberellinsäure herzustellen, indem man einen aktiven Stamm von Gibberella fujikuroi in einem gerührten und belüfteten Nährmedium kultiviert, das eine Kohlenstoffquelle, z. B. Glukose, eine Stickstoffquelle, z. B. Ammoniumnitrat, bestimmte Metallsalze, wie z. B. Magnesiumsulfat und Kaliumdihydrogenphosphat, und Spurenmetalle, wie Eisen, Kupfer, Zink, Mangan und Molybdän, enthält. Es ist kennzeichnend für dieses Gärverfahren, daß der überwiegende Teil der Säure dann erzeugt wird, wenn die reine Proteinsynthese bzw. der aktive Wuchs des Pilzes gehemmt ist. Diese Hemmung des aktiven Wuchses kann man darauf zurückführen, d.aß einer der notwendigen Bestandteile des Nährmediums, z. B. Stickstoff oder Kohlenstoff, aufgebraucht ist. Die Veränderung des Nährmediums, beispielsweise seines Zucker- bzw. Stickstoffgehalts, zur Erzielung höherer Ausbeuten eines gewünschten Produkts ist an sich bei Gärverfahren bekannt, beispielsweise bei der Alkoholgärung der Hefe oder der Citronensäuregärung, jedoch kann man von den bei einem Mikroorganismus gegebenen Verhältnissen keineswegs auf die Kultur eines anderen, die fast immer ganz andere Zwischenstufen aufweist, Rückschlüsse ziehen.
- Nach einem älteren Vorschlag zur Verbesserung der Gibberellinsäurebildung wird Gibberella fujikuroi NRRL 2633, NRRL 2634, NRRL 2635, NRRL 2636 oder NRRL 2637 unter Verwendung üblicher zucker-und stickstoffhaltiger Nährmedien, die einen Gehalt an üblichen Nährsalzen und Spurenelementen aufweisen, in zwei oder mehr Stufen gezüchtet, wobei die erste Stufe oder Stufen des aktiven Wachstums des Pilzes in einem Nährmedium mit einer Stickstoffkonzentration von 0,017 bis 0,25 Gewichtsprozent/ Volumprozent und einem Kohlenstoff-Stickstoff-Verhältnis von etwa 10: 1 bis 25: 1 durchgeführt werden und in der Endstufe die Züchtung in einem Nährmedium mit einem Kohlenstoff-Stickstoff-Verhältnis von 25: 1 bis 200: 1, vorzugsweise 30: 1 bis 55: 1, fortgeführt wird.
- Es wurde nun gefunden, daß innerhalb bestimmter Grenzen das Ausmaß der Gibberellinsäurebildung bei einem Ein- oder Mehrstufenverfahren um so höher liegt, je mehr assimilierbarer Kohlenstoff während der Stufe der Gibberellinsäurebildung zur Verfügung steht.
- Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur Herstellung von Gibberellinsäure durch submerse Züchtung von Gibberella fujikuroi NRRL 2633, NRRL 2634, NRRL 2635, NRRL 2636 oder NRRL 2637 in einem eine assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquelle sowie Nährsalze und Spurenelemente enthaltenden Nährmedium nach einem Ein- oder Mehrstufenverfahren vorgeschlagen, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß man in der Gibberellinsäurebildungsstufe die Konzentration der assimilierbaren Kohlenstoffquelle im Bereich von 0,1 bis 10 Gewichtsprozent/Volumprozent annähernd konstant hält.
- Die Kohlenstoffquelle kann man kontinuierlich oder in Anteilen in bestimmten Zeitabständen zusetzen, und eine geeignete Kohlenstoffquelle kann ein Zucker, wie z. B. Rohrzucker oder Glukose, ein mehrwertiger Alkohol, wie Glycerin oder Ester desselben, oder ein pflanzliches Öl sein.
- Die im Nährmedium angewandte Stickstoffquelle kann ein Ammoniumsalz, ein Nitrat, Maisquellwasser oder :ein Proteinauszug, wie Pepton, oder eine andere Quelle, die assimilierbaren Stickstoff enthält, sein. Erfindungsgemäß ist es möglich, ein starkes aktives Wachstum des Pilzes auszulösen und dennoch seinem Kohlenstoffbedarf während der Stufe der Gibberellinsäurebildung zu entsprechen.
- Die Erfindung wird im folgenden näher erläutert. Beispiel 1 Zwei Gärbehälter A und B wurden angesetzt, von denen jeder 301 eines Mediums der folgenden Zusammensetzung enthielt:
Gärbehälter A I B Glukosemonohydrat, g/100 ccm 10 10 Ammoniumnitrat, g/100 ccm ... 0,48 0,24 Kaliumdihydrogenphosphat, g/100 ccm . . . . . . . . . . . . . . . . . ' 0,5 0,5 Magnesiumsulfatheptahydrat, g/100 ccm ................. 0,1 0,1 Spurenelementkonzentrat *), ccm/100 ccm . . . . . . . . . . . . . . 0,2 0,2 Wasser ...................... Rest Rest *) Das Spurenelementkonzentrat setzte sich wie folgt zu- sammen: Ferrosulfatheptahydrat ............. 0,1 g Kupfersulfatpentahydrat . . . . . . . . . . . 0,015 g Zinksulfatheptahydrat ............. 0,1 g Mangansulfatheptahydrat .......... 0,01 g Kaliummolybdat (K2Mo04) . . . . . . . . 0,01 9 Wasser ........................... 100cem - In der folgenden Tabelle sind der gesamte, vom Pilz verbrauchte Zucker und die Gibberellinsäurekonzentration in den .beiden Medien bei fortlaufender Kultivierung aufgeführt:
Zeit (Stunden Gibberellinsäure Zucker nach dem (m9/1) (g/1) Animpfen) Gärbehälter Gärbehälter A I B A I B 48 5 5 69 11 12 76 15 16 93 44 25 99 57 29 (Fortsetzung) Zeit (Stunden Gibberellinsäure Zucker nach dem (m9/1) (g/1) Animpfen) Gärbehälter Gärbehälter A I B A I B 117 98 52 119 98 56 124 106 56 141 0 129 68 148 135 69 166 48 153 78 171 0 157 79 189 Spuren 86 172 87 215 Spuren 115 193 95 238 63 147 209 109 285 '° 87 178 219 - 334 135 252 246 109 405 192 , 297 278 - 501 251 375 265 167 573 324 409 355 237 - Im Falle des Gärbehälters B enthielt das Medium ursprünglich überschüssigen Kohlenstoff, der weiterhin zur Verfügung stand, als der Stickstoffgehalt erschöpft worden war, und die normalerweise gebildete Menge an Gibberellinsäure konnte erwartungsgemäß 240 mg/1 betragen. Durch Zusatz von Zucker, um den Gehalt an zur Verfügung stehendem Kohlenstoff aufrechtzuerhalten, konnte jedoch die Säurekonzentration auf sogar 409 mg/1 ansteigen.
- Die Menge, in der man die Kohlenstoffquelle dem Medium gegen Ende der Stufe des aktiven Wachstums zusetzt, wird geregelt, um zu verhindern, daß der Pilz in Hinsicht auf die Bildung von Gibberellinsäure gehemmt wird. Ein großer Überschuß an Kohlenstoffquelle ist in der Stufe der Säurebildung nachteilig; und ein angemessener Überschuß kann z. B. bei Verwendung von Glukose zwischen 0,1 und 10 g Glukose und insbesondere zwischen 1 und 4 g Glukose je 100 ccm Nährmedium liegen.
- Die bevorzugte Kohlenstoffquelle ist ein Zucker, wie z. B. Rohrzucker oder Glukose. Die bevorzugte konstante Konzentration kann man erreichen, indem man in Abständen von z. B. 12 bis 24 Stunden weitere Zuckermengen dem Medium in der letzten, unter Bildung von Gibberellinsäure verlaufenden Stufe zusetzt. Auf diese Weise kann man ein Kulturmedium erhalten, das bis zu etwa 1000 mg Gibberellinsäure je Liter Nährmedium enthält, wobei man die Säure aus dem Medium in bekannter Weise isolieren kann. Beispiel 2 Herstellung von Impfmaterial 51 eines Nährmediums, das 8 g Glukosemonohydrat, 0,4g Ammoniumnitrat, 0,5g Kaliumdihydrogenphosphat, 0,1 g Magnesiumsulfatheptahydrat und 0,2 ccm eines Spurenelementkonzentrates, dessen Zusammensetzung bereits weiter oben beschrieben wurde, in je 100 ccm ,enthält, wurden bei pg 3,47 mit einem der vorgenannten Stämme von Gibberell.a fujikuroi aus einer Agarkultur angeimpft. Das Medium wurde dann auf 25° C gehalten, gerührt und mit Luft in einer Menge von 2,51/Min. belüftet. Erzeugung von Gibberellinsäure Nach 80 Stunden wurden 5 1 der vorstehenden Kultur in ein 100-1-Gärgefäß eingebracht, das 75 1 eines Nährmediums der folgenden Zusammensetzung enthielt:
Glukosemonohydrat ....... 8 g/100 ccm Ammoniumnitrat . . . . . . . . . . 0,24 g/100 ccm Magnesiumsulfatheptahydrat 0,1 g/100 ccm Kaliumhydrogenphosphat . . 0,5 g/100 ccm Spurenelementkonzentrat) 0,2 ccm/100 ccm Wasser ................... Rest *) Die Zusammensetzung des Spurenelementkonzentrats wurde bereits weiter oben beschrieben. - Das Medium wurde gerührt und auf einer Temperatur von 26° C gehalten und mit Luft in einer Menge von 0,5 Volumteilen je Volumteil Kulturmedium je Minute belüftet. Als das aktive Wachstum des Pilzes abfiel, d. h. als die Stickstoffquelle vollständig aufgebraucht war, setzte die Bildung von Gibberellinsäure ein, und der restliche Gehalt an Kohlenstoff (Glukose) nahm schnell ab. 39 Stunden nach Beginn der Bildung von Gibberellinsäure in der Säureerzeugungsstufe betrug die Glukosekonzentration etwa 0,9 g je 100 ccm und dann wurden weitere Mengen Zucker dem Nährmedium in Abständen von 12 Stunden zugesetzt, um eine Konzentration von ungefähr 2 g Glukose je 100 ccm Nährmedium während der restlichen Zeit der Säureerzeugungsstufe der Gärung aufrechtzuerhalten. In der folgenden Tabelle ist die Konzentration an Gibberellinsäure im Nährmedium in bezug auf die bei fortschreitender Gärung verbrauchte Glukose aufgeführt.
Zeit (Stunden Gibberellinsäure verbrauchter nach dem Animpfen) Zucker (mg/,) (g/100 ccm) 48 23 4,9 71 105 6,8 144 268 10,6 191 352 12,1 336 489 16,5 359 618 17,1 - Beispiel 3 Das Verfahren des Beispiels 2 wurde wiederholt, nur wurden nicht 8 g Glukosemonohydrat und 0,24 g Ammoniumnitrat je 100 ccm in dem bei der Stufe der Gibberelfnsäurebildung angewandten Nährmedium eingesetzt, sondern 20 g Glukosemonohydrat und 0,4 g Ammomumnitrat je 100 ccm Nährmedium. Während der Stufe der Gib berellinsäurebildung wurde die im Nährmedium vorliegende überschüssige Glukose schnell aufgebraucht, und es wurden weitere Mengen Glukosemonohydrat nach etwa 74 Stunden in Abständen von jeweils 12 Stunden zugesetzt, um eine Konzentration von ungefähr 4 g Glukose je 100 ccm Nährmedium während der restlichen Zeit der Gibberellinsäurebildung aufrechtzuerhalten. In der folgenden Tabelle ist die Konzentration an Gibberellinsäure im Nährmedium in bezug auf die verbrauchte Glukose bei fortschreitender Gärung aufgeführt:
Zeit (Stunden Gibberellinsäure Verbrauchter Zucker nach dem Animpfen) (mg/1) (g/100 ccm) 76 6 6,5 100 46 10,4 112 79 12,3 124 133 13,4 136 138 14,6 148 229 16,3 160 245 17,9 172 291 18,5 184 306 19,1 232 350 21,0 244 428 22,3 268 453 23,9 280 487 24,7 292 520 25,4 304 541 26,2 316 559 27,1 329 610 27,7 341 624 28,7 364 646 30,2 376 640 30,8 412 670 33,1 460 768 34,2 484 794 34,4 508 826 35,0 Zeit (Stunden Gibberellinsäure Verbrauchter nach dem Animpfen) Zucker (mg/,) (g/100 ccm) 28 10 6,4 30 22 8,1 52 67 9,4 64 100 11,2 76 115 12,1 88 121 13,7 100 160 14,2 112 192 14,8 124 203 15,7 136 249 16,8 148 261 17,6 184 272 19,0 208 285 20,3 220 350 21,0 244 383 22,6 256 445 23,2 268 520 24,0 293 541 25,6 304 546 26,5 328 583 28,3 412 754 32,7 460 794 33,7 508 820 34,4 532 840 34,6 580 905 35,0 Zeit (Stunden Gibberellinsäure Konzentration des Zuckers nach dem Animpfen) (mg/,) (g/100 ccm) 16 15,95 40 15,5 46 14,16 52 14,05 64 12,36 69 10,99 (Fortsetzung) Zeit (Stunden Gibberellinsäure Konzentration nach dem Animpfen) des Zuckers (m9/1) (g/100 ccm) 75 10 9,35 88 42 7,83 93 60 8,70 100 88 5,94 111 107 4,77 124 - 3,51 136 198 2,59 148 206 1,63 160 253 0,75 172 306 0;93 184 311 0,94 208 449 1,53 232 449 3,2 256 478 2,13 280 507 1,78 304 558 1,72 328 642 1,72 352 692 3,17 376 765 3,31 400 809 3,3 424 - 2,35 448 838 2,43 472 864 1,43 496 864 1,5 520 956 1,41 Zeit (Stunden Gibberellinsäure Konzentration nach dem Animpfen) des Zuckers (mg/,) (g/100 ccm) 9 18,25 40 17,97 44 16,98 57 16,2 63 15,43 (Fortsetzung) Zeit (Stunden Gibberellinsäure Konzentration nach dem Animpfen) des Zuckers (mg, 1) (g100 ccm) 82 6 12,69 106 46 8,73 118 79 6,86 130 133 5,76 142 138 4,6 154 229 3,84 166 245 4,23 178 291 4,07 190 305 4,09 202 - 4,06 214 - 4,14 226 - 4,09 238 350 3,82 250 427 3,86 262 427 3,68 274 452 3,4 286 486 3,31 298 519 3,13 310 558 3,05 322 591 2,79 335 634 2,46 347 623 2,54 358 623 2,07 370 645 1,88 382 639 3,3 394 660 1,5 406 669 1,35 418 669 0,21 430 669 i 1,12 442 669 0,84 466 940 0,8 490 792 0,13 514 825 - 538 - - 562 809 - 586 812 - Zeit (Stunden Gibberellinsäure Konzentration nach dem Animpfen) des Zuckers (-g/1) (g/100 ccm) 16 10,58 40 8,39 46 6,9 (Fortsetzung) Zeit (Stunden Gibberellinsäure Konzentration nach dem Animpfen) des Zuckers (mg 1) (g/100 ccm) 52 5 5,44 60 14 3,58 64 29 4,87 69 65 3,67 75 93 2,86 88 128 3,69 93 154 2,83 100 174 2,49 111 195 2,54 124 225 2,54 136 276 2,54 148 293 2,76 160 323 2,95 184 406 3,18 208 491 3,77 232 500 4,52 256 569 4,6 280 590 4,04 304 - 3,96 328 698 2,79 352 762 2,84 376 825 2,41 400 901 2,16 424. - 0,84 448 973 0,33 472 1002 0,22 496 989 0,26 520 - 0,21 - Die Flaschen wurden dann mit einer Mycelsuspension aus einer Agarkultur eines vorgenannten Gibberella-fujikuroi-Stammes beimpft und bei 25° C auf einer Horizontalschüttelmaschine, die die Kolben kreisförmig mit einer Geschwindigkeit von 250 Umdrehungen pro Minute bewegte, bebrütet. Jedem Kolben wurden von der Zeit ab, wo die Glukosemenge im Medium durch das Wachstum des Pilzes auf weniger als 1,0g/100 ccm vermindert worden war, täglich 0,33 Volumprozent sterilisiertes Arachisöl zugesetzt, wobei der erste derartige Zusatz nicht vor Ablauf von 24 Stunden der Gärung vorgenommen wurde. Die nach diesem Verfahren gewonnenen Mengen an Gibberellinsäure sind in der folgenden Tabelle aufgeführt:
Gesamtmenge Gibberellinsäure- Glukose des zugesetzten ausbeute im Gärmedium Arachisöls nach 200 Stunden Gärdauer (g/100 ccm) (Volumprozent) (-g/1) 6,0 keines 200 6,0 1,65 250 5,0 1,65 230 4,0 1,32 220 3,0 1,32 225 2,0 2,64 260 Gibberellinsäure- Glukose Glycerin ausbeute im Gärmedium im Gärmedium nach 260 Stunden Gärdauer (g/100 ccm) (g/100 ccm) (m9/1) 8 0 200 6 2 240 4 4 260 2 6 270 0 8 160
Claims (1)
- PATENTANSPRUCH: Verfahren zur Herstellung von Grbberellinsäure durch submerse Züchtung von Gibberella fujikuroi NRRL 2633, NRRL 2634, NRRL 2635, NRRL 2636 oder NRRL 2637 in einem eine assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquelle sowie Nährsalze und Spurenelemente enthaltenden Nährmedium nach einem Ein- oder Mehrstufenverfahren, dadurch gekennzeichnet, daß man in der Gibberellinsäurebildungsstufe die Konzentration der assimilierbaren Kohlenstoffquelle im Bereich von 0,1 bis 10019 Gewichtsvolumen annähernd konstant hält. In Betracht gezogene Druckschriften: Deutsche Auslegeschrift F 11441 IVa/ 6 b (bekanntgemacht am 28. 6. 1956); H. Kretzschmar, »Hefe und Alkohol«, 1955, S. 88 bis 90; Macher, »Biologische Brennerei-Betriebskontrolle«, 1950, S.97.
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1958
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Also Published As
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