DE1150348B

DE1150348B - Verfahren zur Herstellung von Gibberellinsaeure

Info

Publication number: DE1150348B
Application number: DEI14399A
Authority: DE
Inventors: Antony Borrow; Edward Garstang Jefferys; Ian Stewart Nixon
Original assignee: Imperial Chemical Industries Ltd
Current assignee: Imperial Chemical Industries Ltd
Priority date: 1957-02-13
Filing date: 1958-02-12
Publication date: 1963-06-20
Also published as: BE567956A

Description

Verfahren zur Herstellung von Gibberellinsäure Die vorliegende Erfindung betrifft ein verbessertes biochemisches Verfahren zur Herstellung von Gibberellinsäure.
Gibberellinsäure ist ein Pflanzenwuchsstoff, der aus den Filtraten von Kulturen bestimmter aktiver Stämme des Schimmelpilzes Gibberella fujikuroi (Fusarium monilifoizne) erhältlich ist. Es ist bereits bekannt, Gibberellinsäure herzustellen, indem man einen aktiven Stamm von Gibberella fujikuroi in einem gerührten und belüfteten Nährmedium kultiviert, das eine Kohlenstoffquelle, z. B. Glukose, eine Stickstoffquelle, z. B. Ammoniumnitrat, bestimmte Metallsalze, wie z. B. Magnesiumsulfat und Kaliumdihydrogenphosphat, und Spurenmetalle, wie Eisen, Kupfer, Zink, Mangan und Molybdän, enthält. Es ist kennzeichnend für dieses Gärverfahren, daß der überwiegende Teil der Säure dann erzeugt wird, wenn die reine Proteinsynthese bzw. der aktive Wuchs des Pilzes gehemmt ist. Diese Hemmung des aktiven Wuchses kann man darauf zurückführen, d.aß einer der notwendigen Bestandteile des Nährmediums, z. B. Stickstoff oder Kohlenstoff, aufgebraucht ist. Die Veränderung des Nährmediums, beispielsweise seines Zucker- bzw. Stickstoffgehalts, zur Erzielung höherer Ausbeuten eines gewünschten Produkts ist an sich bei Gärverfahren bekannt, beispielsweise bei der Alkoholgärung der Hefe oder der Citronensäuregärung, jedoch kann man von den bei einem Mikroorganismus gegebenen Verhältnissen keineswegs auf die Kultur eines anderen, die fast immer ganz andere Zwischenstufen aufweist, Rückschlüsse ziehen.
Nach einem älteren Vorschlag zur Verbesserung der Gibberellinsäurebildung wird Gibberella fujikuroi NRRL 2633, NRRL 2634, NRRL 2635, NRRL 2636 oder NRRL 2637 unter Verwendung üblicher zucker-und stickstoffhaltiger Nährmedien, die einen Gehalt an üblichen Nährsalzen und Spurenelementen aufweisen, in zwei oder mehr Stufen gezüchtet, wobei die erste Stufe oder Stufen des aktiven Wachstums des Pilzes in einem Nährmedium mit einer Stickstoffkonzentration von 0,017 bis 0,25 Gewichtsprozent/ Volumprozent und einem Kohlenstoff-Stickstoff-Verhältnis von etwa 10: 1 bis 25: 1 durchgeführt werden und in der Endstufe die Züchtung in einem Nährmedium mit einem Kohlenstoff-Stickstoff-Verhältnis von 25: 1 bis 200: 1, vorzugsweise 30: 1 bis 55: 1, fortgeführt wird.
Es wurde nun gefunden, daß innerhalb bestimmter Grenzen das Ausmaß der Gibberellinsäurebildung bei einem Ein- oder Mehrstufenverfahren um so höher liegt, je mehr assimilierbarer Kohlenstoff während der Stufe der Gibberellinsäurebildung zur Verfügung steht.
Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur Herstellung von Gibberellinsäure durch submerse Züchtung von Gibberella fujikuroi NRRL 2633, NRRL 2634, NRRL 2635, NRRL 2636 oder NRRL 2637 in einem eine assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquelle sowie Nährsalze und Spurenelemente enthaltenden Nährmedium nach einem Ein- oder Mehrstufenverfahren vorgeschlagen, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß man in der Gibberellinsäurebildungsstufe die Konzentration der assimilierbaren Kohlenstoffquelle im Bereich von 0,1 bis 10 Gewichtsprozent/Volumprozent annähernd konstant hält.
Die Kohlenstoffquelle kann man kontinuierlich oder in Anteilen in bestimmten Zeitabständen zusetzen, und eine geeignete Kohlenstoffquelle kann ein Zucker, wie z. B. Rohrzucker oder Glukose, ein mehrwertiger Alkohol, wie Glycerin oder Ester desselben, oder ein pflanzliches Öl sein.
Die im Nährmedium angewandte Stickstoffquelle kann ein Ammoniumsalz, ein Nitrat, Maisquellwasser oder :ein Proteinauszug, wie Pepton, oder eine andere Quelle, die assimilierbaren Stickstoff enthält, sein. Erfindungsgemäß ist es möglich, ein starkes aktives Wachstum des Pilzes auszulösen und dennoch seinem Kohlenstoffbedarf während der Stufe der Gibberellinsäurebildung zu entsprechen.

Die Erfindung wird im folgenden näher erläutert. Beispiel 1 Zwei Gärbehälter A und B wurden angesetzt, von denen jeder 301 eines Mediums der folgenden Zusammensetzung enthielt:

Gärbehälter

A I B

Glukosemonohydrat, g/100 ccm 10 10

Ammoniumnitrat, g/100 ccm ... 0,48 0,24

Kaliumdihydrogenphosphat,

g/100 ccm . . . . . . . . . . . . . . . . . ' 0,5 0,5

Magnesiumsulfatheptahydrat,

g/100 ccm ................. 0,1 0,1

Spurenelementkonzentrat *),

ccm/100 ccm . . . . . . . . . . . . . . 0,2 0,2

Wasser ...................... Rest Rest

*) Das Spurenelementkonzentrat setzte sich wie folgt zu-

sammen:

Ferrosulfatheptahydrat ............. 0,1 g

Kupfersulfatpentahydrat . . . . . . . . . . . 0,015 g

Zinksulfatheptahydrat ............. 0,1 g

Mangansulfatheptahydrat .......... 0,01 g

Kaliummolybdat (K2Mo04) . . . . . . . . 0,01 9

Wasser ........................... 100cem

Die Nährmedien wurden mit einem der vorgenannten Stämme von Gibberella fujikuroi (Proben sind in den Kultursammlungen des Commonwealth Mycological Institute, Kew, im Bureau voor Schimmelkultures, Baam, und in der Northern Utilisation Research and Development Division of the United States Department of Agriculture, Peoria, Illinois, USA., niedergelegt, und zwar bei der letzteren Stelle unter der Bezeichnung NRRL 2633, NRRL 2634, NRRL 2635, NRRL 2636 und NRRL 2637) angeimpft und auf einer Temperatur von 26,2° C gehalten, wobei Luft in die Nährmedien mit einer Geschwindigkeit von 151/Min. eingeleitet wurde. Nachdem die Gärung 118 Stunden verlaufen war, wobei nach dieser Zeit das aktive Wachstum wegen Erschöpfung des Stickstoffgehalts der Nährmedien praktisch unterbunden wurde, wurde Glukosemonohydrat aseptisch in Anteilen von 150 g zugesetzt, um die Zuckerkonzentration in den Medien oberhalb 2 g/ 100 ccm zu halten.

In der folgenden Tabelle sind der gesamte, vom Pilz verbrauchte Zucker und die Gibberellinsäurekonzentration in den .beiden Medien bei fortlaufender Kultivierung aufgeführt:

Zeit (Stunden Gibberellinsäure Zucker
nach dem (m9/1) (g/1)
Animpfen) Gärbehälter Gärbehälter
A I B A I B
48 5 5
69 11 12
76 15 16
93 44 25
99 57 29

(Fortsetzung)
Zeit (Stunden Gibberellinsäure Zucker
nach dem (m9/1) (g/1)
Animpfen) Gärbehälter Gärbehälter
A I B A I B
117 98 52
119 98 56
124 106 56
141 0 129 68
148 135 69
166 48 153 78
171 0 157 79
189 Spuren 86 172 87
215 Spuren 115 193 95
238 63 147 209 109
285 '° 87 178 219 -
334 135 252 246 109
405 192 , 297 278 -
501 251 375 265 167
573 324 409 355 237

Das im Gärbehälter A angewandte Medium war in bezug auf Kohlenstoff und Stickstoff nahezu ausgeglichen, d. h., es enthielt diese beiden Nährstoffe ungefähr in den Mengenanteilen, in dem sie vom aktiv wachsenden Pilz verbraucht wurden. Folglich mußte der Kohlenstoffgehalt etwa zur gleichen Zeit wie der Stickstoff erschöpft werden, und ohne weitere Zusätze von Nährstoffen konnte die Menge an später gebildeter Gibberellinsäure erwartungsgemäß 120 mg/] nicht übersteigen. Die Tabelle zeigt jedoch, daß, wenn nach Abschluß des aktiven Wachstums weiterhin eine Kohlenstoffquelle, in diesem Falle Glukosemonohydrat, zugesetzt wird, die Bildung von Gibberellinsäure mindestens so lange aufrechterhalten werden kann, bis die Konzentration auf 324 mg/1 ansteigt.

Im Falle des Gärbehälters B enthielt das Medium ursprünglich überschüssigen Kohlenstoff, der weiterhin zur Verfügung stand, als der Stickstoffgehalt erschöpft worden war, und die normalerweise gebildete Menge an Gibberellinsäure konnte erwartungsgemäß 240 mg/1 betragen. Durch Zusatz von Zucker, um den Gehalt an zur Verfügung stehendem Kohlenstoff aufrechtzuerhalten, konnte jedoch die Säurekonzentration auf sogar 409 mg/1 ansteigen.
Die Menge, in der man die Kohlenstoffquelle dem Medium gegen Ende der Stufe des aktiven Wachstums zusetzt, wird geregelt, um zu verhindern, daß der Pilz in Hinsicht auf die Bildung von Gibberellinsäure gehemmt wird. Ein großer Überschuß an Kohlenstoffquelle ist in der Stufe der Säurebildung nachteilig; und ein angemessener Überschuß kann z. B. bei Verwendung von Glukose zwischen 0,1 und 10 g Glukose und insbesondere zwischen 1 und 4 g Glukose je 100 ccm Nährmedium liegen.

Die bevorzugte Kohlenstoffquelle ist ein Zucker, wie z. B. Rohrzucker oder Glukose. Die bevorzugte konstante Konzentration kann man erreichen, indem man in Abständen von z. B. 12 bis 24 Stunden weitere Zuckermengen dem Medium in der letzten, unter Bildung von Gibberellinsäure verlaufenden Stufe zusetzt. Auf diese Weise kann man ein Kulturmedium erhalten, das bis zu etwa 1000 mg Gibberellinsäure je Liter Nährmedium enthält, wobei man die Säure aus dem Medium in bekannter Weise isolieren kann. Beispiel 2 Herstellung von Impfmaterial 51 eines Nährmediums, das 8 g Glukosemonohydrat, 0,4g Ammoniumnitrat, 0,5g Kaliumdihydrogenphosphat, 0,1 g Magnesiumsulfatheptahydrat und 0,2 ccm eines Spurenelementkonzentrates, dessen Zusammensetzung bereits weiter oben beschrieben wurde, in je 100 ccm ,enthält, wurden bei pg 3,47 mit einem der vorgenannten Stämme von Gibberell.a fujikuroi aus einer Agarkultur angeimpft. Das Medium wurde dann auf 25° C gehalten, gerührt und mit Luft in einer Menge von 2,51/Min. belüftet. Erzeugung von Gibberellinsäure Nach 80 Stunden wurden 5 1 der vorstehenden Kultur in ein 100-1-Gärgefäß eingebracht, das 75 1 eines Nährmediums der folgenden Zusammensetzung enthielt:

Glukosemonohydrat ....... 8 g/100 ccm

Ammoniumnitrat . . . . . . . . . . 0,24 g/100 ccm

Magnesiumsulfatheptahydrat 0,1 g/100 ccm

Kaliumhydrogenphosphat . . 0,5 g/100 ccm

Spurenelementkonzentrat) 0,2 ccm/100 ccm

Wasser ................... Rest

*) Die Zusammensetzung des Spurenelementkonzentrats

wurde bereits weiter oben beschrieben.

Das Medium war vorher sterilisiert und anschließend abgekühlt worden.

Das Medium wurde gerührt und auf einer Temperatur von 26° C gehalten und mit Luft in einer Menge von 0,5 Volumteilen je Volumteil Kulturmedium je Minute belüftet. Als das aktive Wachstum des Pilzes abfiel, d. h. als die Stickstoffquelle vollständig aufgebraucht war, setzte die Bildung von Gibberellinsäure ein, und der restliche Gehalt an Kohlenstoff (Glukose) nahm schnell ab. 39 Stunden nach Beginn der Bildung von Gibberellinsäure in der Säureerzeugungsstufe betrug die Glukosekonzentration etwa 0,9 g je 100 ccm und dann wurden weitere Mengen Zucker dem Nährmedium in Abständen von 12 Stunden zugesetzt, um eine Konzentration von ungefähr 2 g Glukose je 100 ccm Nährmedium während der restlichen Zeit der Säureerzeugungsstufe der Gärung aufrechtzuerhalten. In der folgenden Tabelle ist die Konzentration an Gibberellinsäure im Nährmedium in bezug auf die bei fortschreitender Gärung verbrauchte Glukose aufgeführt.

Zeit (Stunden Gibberellinsäure verbrauchter

nach dem Animpfen) Zucker

(mg/,) (g/100 ccm)

48 23 4,9

71 105 6,8

144 268 10,6

191 352 12,1

336 489 16,5

359 618 17,1

Der Inhalt des Gärbehälters wurde anschließend filtriert und eine Probe (581) des Filtrates mit Äthylacetat extrahiert, um Gibberellinsäure abzutrennen, die anschließend nach bekannten Verfahren gewonnen wurde. Dabei wurden 33,48 g Gibberellinsäure als farbloses, kristallines Pulver erhalten. F. 233 bis 235°C (unter Zersetzung). Eine weitere Menge Gibberellinsäure kann aus dem beim Umkristallisieren anfallenden Filtrat erhalten werden.

Beispiel 3 Das Verfahren des Beispiels 2 wurde wiederholt, nur wurden nicht 8 g Glukosemonohydrat und 0,24 g Ammoniumnitrat je 100 ccm in dem bei der Stufe der Gibberelfnsäurebildung angewandten Nährmedium eingesetzt, sondern 20 g Glukosemonohydrat und 0,4 g Ammomumnitrat je 100 ccm Nährmedium. Während der Stufe der Gib berellinsäurebildung wurde die im Nährmedium vorliegende überschüssige Glukose schnell aufgebraucht, und es wurden weitere Mengen Glukosemonohydrat nach etwa 74 Stunden in Abständen von jeweils 12 Stunden zugesetzt, um eine Konzentration von ungefähr 4 g Glukose je 100 ccm Nährmedium während der restlichen Zeit der Gibberellinsäurebildung aufrechtzuerhalten. In der folgenden Tabelle ist die Konzentration an Gibberellinsäure im Nährmedium in bezug auf die verbrauchte Glukose bei fortschreitender Gärung aufgeführt:

Zeit (Stunden Gibberellinsäure Verbrauchter
Zucker
nach dem Animpfen)
(mg/1) (g/100 ccm)
76 6 6,5
100 46 10,4
112 79 12,3
124 133 13,4
136 138 14,6
148 229 16,3
160 245 17,9
172 291 18,5
184 306 19,1
232 350 21,0
244 428 22,3
268 453 23,9
280 487 24,7
292 520 25,4
304 541 26,2
316 559 27,1
329 610 27,7
341 624 28,7
364 646 30,2
376 640 30,8
412 670 33,1
460 768 34,2
484 794 34,4
508 826 35,0

Beispiel 4 Das im Beispie12 beschriebene Verfahren wurde wiederholt, nur wurden nicht 8 g Glukosemonohydrat und 0,24g Ammoniumnitrat je 100 ccm in dem bei der Stufe der Gibberellinsäurebildung angewandten Nährmedium eingesetzt, sondern 20 g Glukosemonohydrat und 0,4 g Ammoniumnitrat je 100 ccm Nährmedium. Während der Stufe der Gibberellinsäurebildung wurde die im Nährmedium vorliegende Glukose schnell aufgebraucht, und es wurden weitere Mengen Glukosemonohydrat nach etwa 26 Stunden in Abständen von je 12 Stunden zugesetzt, um eine Konzentration von ungefähr 10 g Glukose je 100 ccm im Nährmedium während der restlichen Zeit der Gibberellinsäurebildung aufrechtzuerhalten. In der folgenden Tabelle ist die Konzentration an Gibberellinsäure im Medium in bezog auf die verbrauchte Glukose bei fortschreitender Gärung aufgeführt:

Zeit (Stunden Gibberellinsäure Verbrauchter
nach dem Animpfen) Zucker
(mg/,) (g/100 ccm)
28 10 6,4
30 22 8,1
52 67 9,4
64 100 11,2
76 115 12,1
88 121 13,7
100 160 14,2
112 192 14,8
124 203 15,7
136 249 16,8
148 261 17,6
184 272 19,0
208 285 20,3
220 350 21,0
244 383 22,6
256 445 23,2
268 520 24,0
293 541 25,6
304 546 26,5
328 583 28,3
412 754 32,7
460 794 33,7
508 820 34,4
532 840 34,6
580 905 35,0

Beispiel 5 Das im Beispie12 beschriebene Verfahren wurde wiederholt, nur wurden nicht 8 g Glukosemonohydrat und 0,24 g Ammoniumnitrat in. dem bei der Gibberellinsäurebildung angewandten Nährmedium eingesetzt, sondern 16,0 g Glukosemonohydrat und 0,4 g Ammoniumnitrat je 100 ccm Nährmedium. Während der Stufe der Gibberellinsäurebildung wurde die überschüssige, im. Nährmedium vorliegende Glukose aufgebraucht, und nach 162 Stunden wurden weitere Mengen Glukosemonohydrat in Abständen von jeweils 12 bis 24 Stunden zugesetzt, um eine Konzentration von ungefähr 1 bis 3 g Glukose je 100 ccm im Nährmedium während des restlichen Verlaufs der Säurebildung in dieser Stufe aufrechtzuerhalten. In der folgenden Tabelle ist die Konzentration in Gibberellinsäure im Nährmedium in bezug auf die Glukosekonzentration bei fortschreitender Gärung aufgeführt:

Zeit (Stunden Gibberellinsäure Konzentration
des Zuckers
nach dem Animpfen)
(mg/,) (g/100 ccm)
16 15,95
40 15,5
46 14,16
52 14,05
64 12,36
69 10,99

(Fortsetzung)
Zeit (Stunden Gibberellinsäure Konzentration
nach dem Animpfen) des Zuckers
(m9/1) (g/100 ccm)
75 10 9,35
88 42 7,83
93 60 8,70
100 88 5,94
111 107 4,77
124 - 3,51
136 198 2,59
148 206 1,63
160 253 0,75
172 306 0;93
184 311 0,94
208 449 1,53
232 449 3,2
256 478 2,13
280 507 1,78
304 558 1,72
328 642 1,72
352 692 3,17
376 765 3,31
400 809 3,3
424 - 2,35
448 838 2,43
472 864 1,43
496 864 1,5
520 956 1,41

Die Gibberellinsäure wurde in bekannter Weise isoliert, indem das Gärmedium filtriert und das Filtrat (631) durch Kohle geschickt wurde. Die adsorbierte Gibberellinsäure wurde dann durch Herauslösen entfernt und durch Kristallisation gereinigt. Dabei wurden 63,0 g Gibberellinsäure als farbloses kristallines Produkt erhalten. F. 233 bis 235° C (unter Zersetzung). Beispiel 6 Das im Beispie12 beschriebene Verfahren wurde wiederholt, nur wurden nicht 8 g Glukosemonohydrat und 0,24 g Ammoniumnitrat in dem bei der Gibberellinsäurebildung angewandten Nährmedium eingesetzt, sondern 20 g Glukosemonohydrat und 0,4 g Ammoniumnitrat je 100 ccm Nährmedium. Während der Stufe der Gibberellinsäurebildung wurde die im Nährmedium vorliegende überschüssige Glukose aufgebraucht, und nach 154 Stunden wurden weitere Mengen Glukosemonohydrat in Abständen von jeweils 12 Stunden zugesetzt, um eine Konzentration von ungefähr 1 bis 4 g Glukose je 100 ccm Nährmedium während des restlichen Verlaufs der Säurebildung aufrechtzuerhalten. In der folgenden Tabelle ist die Konzentration der Gibberellinsäure im Medium in bezug auf die Glukosekonzentration bei fortschreitender Gärung aufgeführt:

Zeit (Stunden Gibberellinsäure Konzentration
nach dem Animpfen) des Zuckers
(mg/,) (g/100 ccm)
9 18,25
40 17,97
44 16,98
57 16,2
63 15,43

(Fortsetzung)
Zeit (Stunden Gibberellinsäure Konzentration
nach dem Animpfen) des Zuckers
(mg, 1) (g100 ccm)
82 6 12,69
106 46 8,73
118 79 6,86
130 133 5,76
142 138 4,6
154 229 3,84
166 245 4,23
178 291 4,07
190 305 4,09
202 - 4,06
214 - 4,14
226 - 4,09
238 350 3,82
250 427 3,86
262 427 3,68
274 452 3,4
286 486 3,31
298 519 3,13
310 558 3,05
322 591 2,79
335 634 2,46
347 623 2,54
358 623 2,07
370 645 1,88
382 639 3,3
394 660 1,5
406 669 1,35
418 669 0,21
430 669 i 1,12
442 669 0,84
466 940 0,8
490 792 0,13
514 825 -
538 - -
562 809 -
586 812 -

Beispiel 7 Das im Beispiel 2 beschriebene Verfahren wurde wiederholt, nur wurden nicht 8 g Glukosemonohydrat und 0,24 g Ammoniummtrat je 100 ccm in dem bei der Gibberellins äurebildung angewandtenNährmedium eingesetzt, sondern 10 g Glukosemonohydrat und 0,4 g Ammoniumnitrat je 100 ccm Nährmedium. Während der Stufe der Gibberellinsäurebildung wurde die im Nährmedium vorhandene überschüssige Glukose aufgebraucht, und nach 60,5 Stunden wurden weitere Mengen Glukosemonohydrat in Abständen von jeweils 12 bis 24 Stunden zugesetzt, um eine Konzentration von ungefähr 2 bis 4 g Glukose je 100 ccm im Nährmedium während des restlichen Teils der Säurebildungsstufe aufrechtzuerhalten. In der folgenden Tabelle ist die Konzentration der Gibberellinsäure im Medium in bezug auf die Glukosekonzentration bei fortschreitender Gärung aufgeführt:

Zeit (Stunden Gibberellinsäure Konzentration

nach dem Animpfen) des Zuckers

(-g/1) (g/100 ccm)

16 10,58

40 8,39

46 6,9

(Fortsetzung)
Zeit (Stunden Gibberellinsäure Konzentration
nach dem Animpfen) des Zuckers
(mg 1) (g/100 ccm)
52 5 5,44
60 14 3,58
64 29 4,87
69 65 3,67
75 93 2,86
88 128 3,69
93 154 2,83
100 174 2,49
111 195 2,54
124 225 2,54
136 276 2,54
148 293 2,76
160 323 2,95
184 406 3,18
208 491 3,77
232 500 4,52
256 569 4,6
280 590 4,04
304 - 3,96
328 698 2,79
352 762 2,84
376 825 2,41
400 901 2,16
424. - 0,84
448 973 0,33
472 1002 0,22
496 989 0,26
520 - 0,21

Die Gibberellinsäure wurde in bekannter Weise durch Filtrieren des Gärmediums und Durchschicken des Filtrats (601) durch Tierkohle isoliert. Die absorbierte Gibberellinsäure wurde dann durch Herauslösen entfernt und durch Umkristallisieren gereinigt. Dabei wurden 63,6 g Gibberellinsäure als farbloser kristalliner Feststoff erhalten. F. 233 bis 235° C (unter Zersetzung). Beispiel 8 In sechs 500-ml-Erlenmeyer-Kolben wurden mit je 100 ccm Nährmedium Gärungen angesetzt. Das Nährmedium enthielt (Angaben in g/100 ccm) 0,22% Ammoniumnitrat, 0,5 % Kaliumdihydrogenphosphat, 0,1% Magnesiumsulfatheptahydrat und 0,2 Volumprozent der oben beschriebenen Spurenelementkonzentratmischung. Dem Nährmedium wurden in den verschiedenen Kolben, in der folgenden Tabelle aufgeführte Mengen an Glukosemonohydrat zugesetzt, und die Kolben wurden mit Wattestopfen verschlossen, sterilisiert und abgekühlt.

Die Flaschen wurden dann mit einer Mycelsuspension aus einer Agarkultur eines vorgenannten Gibberella-fujikuroi-Stammes beimpft und bei 25° C auf einer Horizontalschüttelmaschine, die die Kolben kreisförmig mit einer Geschwindigkeit von 250 Umdrehungen pro Minute bewegte, bebrütet. Jedem Kolben wurden von der Zeit ab, wo die Glukosemenge im Medium durch das Wachstum des Pilzes auf weniger als 1,0g/100 ccm vermindert worden war, täglich 0,33 Volumprozent sterilisiertes Arachisöl zugesetzt, wobei der erste derartige Zusatz nicht vor Ablauf von 24 Stunden der Gärung vorgenommen wurde. Die nach diesem Verfahren gewonnenen Mengen an Gibberellinsäure sind in der folgenden Tabelle aufgeführt:

Gesamtmenge Gibberellinsäure-
Glukose des zugesetzten ausbeute
im Gärmedium Arachisöls nach 200 Stunden
Gärdauer
(g/100 ccm) (Volumprozent) (-g/1)
6,0 keines 200
6,0 1,65 250
5,0 1,65 230
4,0 1,32 220
3,0 1,32 225
2,0 2,64 260

Beispiel 9 20 Das im Beispie18 beschriebene Verfahren wurde wiederholt, außer daß dem Nährmedium verschiedene Mengen an Glycerin und Glukose und kein Öl zugesetzt wurde. Die gewonnenen Mengen an Gibberellinsäure sind in der folgenden Tabelle aufge- 25 führt:

Gibberellinsäure-
Glukose Glycerin ausbeute
im Gärmedium im Gärmedium nach 260 Stunden
Gärdauer
(g/100 ccm) (g/100 ccm) (m9/1)
8 0 200
6 2 240
4 4 260
2 6 270
0 8 160

Claims

PATENTANSPRUCH: Verfahren zur Herstellung von Grbberellinsäure durch submerse Züchtung von Gibberella fujikuroi NRRL 2633, NRRL 2634, NRRL 2635, NRRL 2636 oder NRRL 2637 in einem eine assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquelle sowie Nährsalze und Spurenelemente enthaltenden Nährmedium nach einem Ein- oder Mehrstufenverfahren, dadurch gekennzeichnet, daß man in der Gibberellinsäurebildungsstufe die Konzentration der assimilierbaren Kohlenstoffquelle im Bereich von 0,1 bis 10019 Gewichtsvolumen annähernd konstant hält. In Betracht gezogene Druckschriften: Deutsche Auslegeschrift F 11441 IVa/ 6 b (bekanntgemacht am 28. 6. 1956); H. Kretzschmar, »Hefe und Alkohol«, 1955, S. 88 bis 90; Macher, »Biologische Brennerei-Betriebskontrolle«, 1950, S.97.