DE1617383B2

DE1617383B2 - Verfahren zur Herstellung von Primycin

Info

Publication number: DE1617383B2
Application number: DE1617383A
Authority: DE
Inventors: Istvan Dr.-Ing.Chem. Horvath; Hegyaljai Geza Dr.-Ing.Chem. Kiss; Gabor Kulcsar; Karoly Dr.-Ing.Chem. Magyar; Imre Dr.-Ing.Chem. Szilagyi; Gabriella Dr.-Ing.Chem. Debrecen Valu; Tibor Dipl.-Ing.Chem. Prof.Dr. Valyi-Nagy
Original assignee: CHINOIN GYOGYSZER- ES VEGYESZETI TERMEKEK GYARA RT BUDAPEST
Current assignee: CHINOIN GYOGYSZER- ES VEGYESZETI TERMEKEK GYARA RT BUDAPEST
Priority date: 1965-10-20
Filing date: 1966-10-11
Publication date: 1974-09-12
Also published as: AT268522B; GB1159568A; NO122362B; US3498884A; DE1617383A1; CH505200A; BE688595A; SE346013B; FI43720B; DE1617383C3; DK116934B; ES332439A1; FI43720C

Description

Es ist bekannt, daß das Antibioticum, das Ursprung- lungsstufen — in Abhängigkeit vom verwendeten

lieh durch Züchten des Pilzstammes Streptomyces 15 Nährboden — Neigung zur Lyse.

primycini gewonnen wurde, sehr wertvolle thera- Der Stamm Thermopolyspora galeriensis zeigt

peutische Eigenschaften hat. Das von Pilzen produ- auf verschiedenen Nährböden sehr verschiedene Far-

zierte Antibioticum wurde durch Extraktion der Fer- ben, die von Schmutzigweiß über Hellgelb und GeIb-

mentationsflüssigkeit oder durch Ansäuern der Fer- braun bis Dunkelgrün variieren können, was von

mentationsflüssigkeit und sogenannte Fällungsadsorp- 20 der Zusammensetzung des Nährbodens, von äußeren

tion oder durch Aussalzen isoliert (vgl. Nature 174, Einflüssen (Bestrahlung, chemische Mittel usw.) und

1105 [1954]; Pharmazie 11, 304 [1956]; ungarische vom Alter der Mycels abhängt.

Patentschrift 146332 [1958] und 151 197 [1963]). Die Kolonien zeigen im allgemeinen — auf opti-

Der Stamm Streptomyces primycini zeigte aber auf malen Nährböden — eine runde, linsengroße, sich verschiedenen, an Stickstofflieferanten reichen Nähr- 25 hervorhebende kraterartige, radial gefurchte Form; boden eine sehr geringe Produktionsfähigkeit, die es können aber, teils durch spontane Mutationen, weder durch Änderung der Zusammensetzung noch teils durch verschiedene Einflüsse (z.B. durch Röntgendurch Selektions- und Veredelungsversuche auf ein bestrahlung) auch konzentrisch gerippte oder unregel-Niveau gesteigert werden konnte, daß eine wirt- mäßig geschrumpfte Kolonien erhalten werden. Auf schaftliche Produktion in großtechnischem Maßstab 30 unzureichenden Nährböden werden kleinere, sogar ermöglicht. Das Züchten von produktionsfähigen nur punktförmige Kolonien erhalten,
natürlichen Varianten dieses Stammes war auch des- Wird ein dickes, konzentriertes Inoculum angehalb schwierig, weil der Stamm S. primycini auf ver- wendet, fließen die Kolonien auf optimalen Nährschiedenen festen Nährböden weder Luftmycelien noch boden zu einem gefurchten dicken Belag zusam-Sporen bildete (vgl. Acta Pharm. Hung. XXXO, 3,133, 35 men.
140). Unabhängig von Form, Größe und Farbe der

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Produk- Kolonien werden auf geeigneten Nährböden immer

tion von Primycin durch Züchten von Mikroorganis- gleichmäßig gute Fermentationsergebnisse erhalten,

men in einem Nährmedium, das dadurch gekennzeich- Für die Entwicklung dieser Pilze ist eine höhere

net ist, daß man den Mikroorganismus Thermo- ₄₀ Temperatur (37° C) noch günstiger, als die bei Strep-

polyspora galeriensis, der bei dem ungarischen Lan- tomyceten allgemein üblichen 27° C, man kann aber

desinstitut für Gesundheitswesen unter der Nummer unter betrieblichen Verhältnissen auch bei 27 bis

650 707 hinterlegt ist, züchtet. 28° C gute Ergebnisse erreichen.

Der beim Verfahren gemäß Erfindung eingesetzte Die Luftmycelien sind fein und dünn, es erscheinen Stamm Thermopolyspora galeriensis unterscheidet ₄₅ daran schon verhältnismäßig früh (nach 48 Stunden) sich mikromorphologisch wesentlich von den Stäm- die charakteristischen kleinen Sporen, deren Zahl men der Gattung Streptomyces — so auch vom später sehr erheblich wird. Die Mycelien können, in Streptomyces primycini — und kann nach den Abhängigkeit von der Zusammensetzung des Nähr-Klassifikationssystemen Waksman(Waksman- ^; bodens und von der Temperatur, nach dem dritten Lechevalier: Aktinomycetes and their Antibi- 50 oder vierten Tag Lyse erleiden,
oties, William and Wilkins Comp., Baltimore 1953, Das Verhalten dieses neuen Thermopolyspora Stam-S. 35) bzw. von Krasilnikow (Diagnortic der mes wurde auf 97 verschiedenen Nährböden unterBakterien und Aktinomyceten, VEB Gustav Fischer sucht. Die Ergebnisse dieser Beobachtungen sind in Verl. 1959, S. 149) in die Gattung Thermopolyspora den nachstehenden Tabellen I bis III zusammen- bzw. Mikromonospora eingereiht werden. Die Luft- 55 gefaßt.

mycelien dieses Stammes zeigen nicht die charak- Die Tabelle I zeigt die auf dem als Identifizierungs-

teristischen strukturellen Eigenschaften der Gattung grundlage international anerkannten sogenannten

Streptomyces, d. h. die Mycelien sind nicht in Sporen Waksmanschen Identifizierungsnährböden beobach-

fragmentiert, sondern die einzeln oder in Gruppen teten charakteristischen Wachstumserscheinungen. In

erscheinenden runden oder ovalen Sporen entwickeln 60 der ersten Spalte der Tabelle sind die Daten der weißen

sich an den kurzen Verzweigungen der Mycelien. Der Variante von Thermopolyspora galeriensis, in der

gemäß Erfindung eingesetzte neue Stamm unter- zweiten Spalte die Daten einer grünen Variante und

scheidet sich von dem früher beschriebenen Stamm in der dritten Spalte die Daten einer gelben Variante

Streptomyces primycini unter anderem auch in den angegeben.

grundlegenden morphologischen Eigenschaften, daß 65 Das Wachstum der Mikroorganismen wurde forter große Mengen von Sporen erzeugt und auf den laufend beobachtet und die Beobachtungen in ververwendeten Nährböden gut entwickelte Luftmycelien schiedenen Zeitintervallen, und zwar nach 72, 120, bildet. Das Mycel zeigt in seinen späteren Entwick- 168, 240 bzw. 336 Stunden Inkubation registriert.

Tabelle I

Das Verhalten von drei Varianten der Thermopolyspora galeriensis auf verschiedenen Nährböden

(Waksman-Reihe)

I = Th. galeriensis, weiße Variante I/l = Th. galeriensis, grüne Variante 1/2 = Th. galeriensis, gelbe Variante

Nährboden Stärke des Wachsturas I/l

1/2

Czapek-Agar

Glucose-Asparagin-Agar

Glycerin-Agar

Tryosin-Agar

Fleisch-Pepton-Agar

Glucose-Pepton-Agar A

Glucose- Pepton-Gelatine

Fleisch-Pepton-Gelatine

Pepton-Gelatine

Stärke-Agar mit anorg. Stickstofilieferant Stärke-Ägar mit org. Stickstofflieferant

Eiweiß-Agar

Kartoffel-Agar

Kartoffel-Glucose-Agar

Stärke-NO₃-Agar

Glucose-Bouillon

Nähr-Bouillon

Czapek-Lösung

Stärke-Lösung

Hefeextrakt (A)

Hefeextakt (B) (Mg + Fe)

Hefe-Glucose-Agar

Emerson Agar

Maisquellwasser

Sojameh-Nährboden

Synthetischer Lactat-Nährboden

Calciummalat-Nährboden

Cellulose-Digestion

Lakmus-Milch

Pepton-Gelatine

Nitrat-Nährboden

Kartoffelschnitte

Gelbe-Rüben-Schnitte

Cyctin-Nährboden

*) Schwache Rotfärbung.

+■+

koaguliert nicht*) verflüssigt koaguliert nicht*) verflüssigt

koaguliert nicht*) verflüssigt

keine H₂S-Bildung

Die Variante I/l produziert auf Glucose-Pepton-Agar und auf Kartoffelschnitten ein grünes Pigment, während von der Variante 1/2 auf fryosin-Agar ein braunes Pigment gebildet wird.

Zeichenerklärung:

+ + + + = Sehr gutes Wachstum.

+ + + = Gutes Wachstum.

+ +(+) = Mittelmäßig gutes Wachstum.

+ + = Mittelmäßiges Wachstum.

+ ( + ) = Mittelmäßig schwaches Wachstum.

+ = Schwaches Wachstum.

( + ) = Sehr schwaches Wachstum.

— = Kein Wachstum.

Um den Einfluß von verschiedenen Stickstoff; Heferanten auf das Wachstum von Thermopolyspora galeriensis zu untersuchen, wurde in Czapek-Doxschen Nährböden das als anorganischer Stickstofflieferant vorhandene Stickstoffnitrat durch äquivalente Mengen (auf Stickstoff berechnet) der in Tabelle II angegebenen organischen Stickstofflieferanten ersetzt.

In Tabelle II wurden die auf den durch verschiedene organische Stickstofflieferanten modifizierten Czapek-Doxschen Nährböden beobachteten Wachstumseigenschäften der drei Varianten von Thermopolyspora galeriensis zusammengefaßt. Das Wachstum und die Pigmenterzeugung der Kolonien wurden zu verschiedenen Zeitpunkten der Wachstumsperiode des Stammes (nach 72, 120, 168, 240 und 336 Stunden) registriert.

Tabelle II

Das Wachstum der drei Varianten von Thermopolyspora galeriensis

auf verschiedene Stickstofflieferanten

enthaltenden Nährböden

20

	Stärke	I	H	des Wachstums	1/2
Stickstofflieferant		+ ( + )			4-4-
	+		I/I	^_
dl-Tyrosin			h4-(4-)	4-4-
Uracyl ........	+ +( + )		( + )	4-4-
dl-Glutamin ....	+ + ( + )		_{+ +}	4- (4-)
dl-Phenylalanin	+ + ( + )		4-4-	4- 4-
Adenylsäure ....	+		4-4-	_\|_
dl-Leucin			4-4-
Cytosin	( + )		( + )	-J \|_
Thymonuclein-	4-			+
säure	+ +		+	4-4-
Hypoxantin ..	+ 4- (4-)	H		4- 4- (4·)
dl-Norleucin . · ·	_{+ +}		4-4-	4-4-4-
dl-ValuV ^v .	4-4-		- 4- (4-)	4-4-
dl-Serin	+ + ( + )		- + ( + )	+ +( + )
1-Ornithin			- + ( + )	4- 4-
1-Asparagin ....	*( + )*		4-4-	(4-)
1-Cystein ,	4- 4- (4-)			4-4- (4-)
Sarcosin .......	4-		(4-)	+ ( + )
Cytidin . .				4- (4-)
d-Alanin	+ +( + )		₊	4-4-
dl-Prolin	+ +( + )		4-	4-4-
1-Threonin	4-4-
Glykokoll			h+( + )	4- (4-)
1-Lysin	4-			₊
1-Arginin	+ ( + )		4- (4-)	+ ( + )
Uridin	4-		4-	+ (4-)
1-Hystidin	+ ( + )		4-4-	4- (4-)
1-Tryptophan ...			( + )
1-Citrullin	4- (4-)		*l· + ( + )*	4- (+)
dl-a-Amino-	4-4-4-			4-4-
n-buttersäure	4-4-	*+ +*	4- (4-)
(NHJ₂SO₄		4-4-4-
Ribonucleinsäure	4-

55

65 Der Stamm I produziert auf 1-Tryptophan enthaltenden Nährböden ein braunes Pigment.

Die Variante I/1 erzeugt auf mehreren verschiedenen Stickstofflieferanten (dl-Tyrosin, dl-Phenylalanin, Cytidin, 1-Lysin, 1-Arginin, Ammoniumsulfat usw.) ein grünes Pigment.

Die Variante 1/2 erzeugt auf 1-Tryptophan enthaltenden Nährböden ein braunes Pigment.

Zur Ermittlung der Kohlenstoffverwertungsfähigkeit des neuen Stammes wurde ein anorganischen Stickstoff enthaltender Czapekscher Nährboden verwendet, dessen Kohlenhydratgehalt durch gleiche Menge der in Tabelle III angegebenen Kohlenhydrate ersetzt wurde. Das Wachstum der Mikroorganismen wurde 72, 120, 168, 240 und 336 Stunden nach der Inkubation registriert. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle III zusammengefaßt.

Tabelle III

Wachstum der drei Varianten

von Thermopolyspora galeriensis

auf verschiedenen Kohlenstofflieferanten

Kohlenstofflieferant	Stärke des Wachstums	I	I/I	1/2
	₊	₊	+ ( + )
Saccharose	4-	( + )	+
Glucose	4-	4-	+ ( + )
Mannit	—	(+)	( + )
35 Galactose	—	—	—
Sorbose		_	_ ■ ■ ■
Xylose ...... τ..	+ ( + )	+	+ +
Rhamnose	—	—	— '
₄₀ Arabinose	—	—■ ■	— ■ ■■
Lactose	—	—	■"(+Γ^:ΐ-
Fructose	—	—	—
Maltose	—	—	—
Ribose	. 4-	' 4-	4- (4-)
Glycerin	( + )	( + )	+ ( + )
Natriumacetat ..	—	—	—
Natriumeitrat ..	—	(+)	+ ( + )
Natriumtartrat	(+)	(+)	( + )
Natriumformiat

Zeichenerklärung: Siehe Tabelle I.

Da der anorganische Stickstofflieferant im allgemeinen für die Entwicklung von Thermopolyspora galeriensis nicht günstig ist, wurde der Einfluß verschiedener Kohlenhydrate auf das Wachstum dieses Stammes auch in der Anwesenheit eines organischen Stickstofflieferanten (L-Asparagin) untersucht.

Als Nährboden wurde dabei ebenfalls der Czapek-Doxsche Nährboden angewendet, dessen Natriumnitratgehalt aber durch die äquivalente Menge von L-Asparagin und der Saccharosegehalt durch die gleiche Menge der verschiedenen, in der Tabelle III aufgezählten¹ Kohlenhydrate ersetzt wurde.

Das Wachstum der Mikroorganismen wurde 72. 120,' !68, 240 bzw. 336 Stunden nach der Inkubation

bei 37° C registriert. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle IV zusammengefaßt.

Tabelle IV

Wachstum von Thermopolyspora galeriensis

auf verschiedenen Kohlenstofflieferanten

in Anwesenheit von organischem

Stickstofflieferant (L-Asparagin)

Stickstofflieferant

Stärke des Wachsturas

Saccharose + + + +

Glucose + + + +

Mannit + + + +

Galactose + +

Sorbose —

Xylose —

Rhamnose + + + +

Arabinose —

Lactose + + + +

Fructose —

Maltose + +

Ribose —

Glycerin + + + +

Natriumacetat + + + +

Natriumeitrat —

Natriumformiat +

Natriumtartrat +

Zeichenerklärung: Siehe Tabelle I.

Der Thermopolyspora galeriensis Stamm wird zur Primycinerzeugung zweckmäßig auf einem Nährboden gezüchtet, der als Kohlenstofflieferant Kohlenhydrate, vorteilhaft Stärke und/oder Saccharose, als Stickstofflieferant organische, natürlich vorkommende oder synthetisch hergestellte Verbindungen, vorteilhaft Aminosäuren, organische Basen, Säureamide, Sojamehl, Hefezellensuspensionen, Maisquellwasser, als anorganische Salze Phosphate, Nitrate, Chloride und/oder Carbonate, vorzugsweise Alkaliphosphate und -chloride und Calciumcarbonat enthält. Der Nährboden kann zusätzlich teilweise als weiteren Kohlenstofflieferanten und teilweise als Schaumbekämpfungsmittel natürlich vorkommende oder synthetisch hergestellte Fette, öle bzw. deren Bestandteilen, Fettalkoholen und Fettsäuren, wie Palmöl, Sonnenblumenöl, Stearinsäure, Glycerin usw. enthalten.

Die Fermentation wird vorteilhaft bei Temperaturen zwischen 27 und 40⁰C bei pH-Werten von 6 bis 9 durchgeführt; bei höheren Temperaturen bis itwa 37° C ist das Wachstum der Pilze schneller und Jie Fermentationszeit kürzer, aber beim Arbeiten im großtechnischen Maßstab können auch bei Temperaturen um 27 bis 28° C sehr gute Ergebnisse und lohe Ausbeuten erreicht werden. Die Fermentation vird unter Rühren und Belüften durchgeführt.

Das von den Mikroorganismen produzierte Prinycin kann aus dem Fermentationsprodukt auch lach den üblichen Extraktionsmethoden, z. B. mit i-Butanol, isoliert werden. Bei dem gegenüber den usher üblichen Fermentationsverfahren viel höhere Primycinkonzentrationen liefernden Verfahren gemäß Erfindung ist aber die Anwendung der üblichen organischen Lösungsmittel ziemlich schwierig, da das Primycin in apolaren Lösungsmitteln unlöslich und in polaren Lösungsmitteln gewöhnlich schlecht löslich ist. Es ist daher zweckmäßiger, zur Isolierung des erzeugten Primycins aus den Mycelien ein binäres oder ternäres Gemisch von polaren Lösungsmitteln, z.B. wäßrigen, etwa 80%igen Methylalkohol,zu verwenden. Dabei wird vorteilhaft folgendermaßen vorgegangen.

Der Wirkstoffgehalt der Fermentationsflüssigkeit wird bei höherer Temperatur, etwa bei 70 bis 90⁰C, aus schwach saurem Medium (pH = 5 bis 7), zusammen mit den Mycelien gefällt, das Antibioticum wird dann aus dem erhaltenen feuchten Niederschlag durch Kochen mit einem polaren Lösungsmittelgemisch, zweckmäßig mit einem wäßrigen Alkohol, z.B. mit 80%igem Methanol, extrahiert. Das rohe Produkt von großer antibiotischer Aktivität kann dann durch Einengen dieses Lösungsmittelgemisches isoliert werden. Das Primycin ist bekanntlich thermostabil, es zeigt z. B. in wäßrigem Medium bei lOstündigem Erhitzen zum Sieden keinen Aktivitätsverlust; der Wirkstoff wird also beim Abdampfen der Fermentationsflüssigkeit nicht zersetzt, scheidet sich vielmehr an den durch das Kochen denaturierten Myce-

. lien und sonstigen vorhandenen Eiweißstoffen, von denen es absorbiert wird, ab. Der auf diese Weise erhaltene Niederschlag wird dann durch Filtrieren oder Zentrifugieren abgetrennt. Die überstehende Flüssigkeit, die nur noch zu vernachlässigende Mengen (2 bis 20y/ccm) Primycin enthält, kann verworfen werden. Das feuchte Mycelium wird dann vorteilhaft mit wäßrigem Methanol zum Sieden erhitzt, wobei fast der gesamte Wirkstoffgehalt in Lösung geht. Die vom Niederschlag abgetrennte Lösung wird dann im Vakuum eingeengt, wobei das rohe Primycin sich spontan abscheidet, während die wasserlöslichen Verunreinigungen größtenteils in der wäßrigen Mutterlauge verbleiben und durch Vakuumfiltration leicht vom abgeschiedenen Primycin abgetrennt werden können. Auf diese Weise wird ein verhältnismäßig reines Produkt hoher antibiotischer Aktivität (40 bis 70% Primycingehalt) in sehr guter Ausbeute (70 bis 90% der antibiotischen Aktivität der Fermentationsflüssigkeit) erhalten.

Die weitere Reinigung des so erhaltenen rohen • Produktes und die Isolierung des Primycins in 100%igem Reinheitsgrad kann nach der in den ungarischen Patentschriften 146 332(1958) und 151197 (1963, Zusatzpatent zum ungarischen Patent 146 332) beschriebenen Methode durchgeführt werden. Nach dieser Methode wird das Primycin in wäßrigalkoholischer Lösung von den alkohollöslichen Eiweißstoffen durch Fällung mit Bleisalzen befreit, die noch vorhandenen pigmentartigen Verunreinigungen mit Hilfe eines Gemisches von Aktivkohle mit einem chemisch indifferenten festen Lockerungsmittel von großer spezifischer Oberfläche (Cellulosepulver, Filterhilfen, gefälltes Calciumcarbonat usw.) adsorbiert und das Primycin aus der nunmehr reinen Lösung in bekannter Weise isoliert.

Die Produktion von Primycin gemäß Erfindung durch Fermentation des neuen Mikroorganismenstammes und die Isolierung des rohen Primycins aus der Fermentationsflüssigkeit wird durch die nachstehenden Beispiele näher veranschaulicht.

409 537/325

IO

Beispiell

a) Fermentation von Thermopolyspora
galeriensis im Laboratorium

Zur Erzeugung des Inoculums wird ein Nährboden aus

Sojamehl 2,0%

Kartoffelstärke 2,0%

Calciumcarbonat 0,5%

Natriumchlorid 0,3%

Kaliumdihydrophosphat 0,1%

Palmöl 0,5%

pH vor der Sterilisierung 8,5%

im Autoklav unter 1,5 atm 24 Minuten erhitzt, sodann werden SOO-ccm-Erlenmeyerkolben, die je 100 ecm des Nährbodens enthalten, mit einer Sporen- bzw. Myceliensuspension des Stammes Thermopolyspora galeriensis beimpft und bei 27° C auf einem Schütteltisch von 5 cm Hublänge 48 bis 60 Stunden geschüttelt.

Zur Beimpfung mit dem auf diese Weise hergestellten Inoculum wird dann ein Produktionsnährboden folgender Zusammensetzung:

Sojamehl 4,0%

Kartoffelstärke 4,0% *⁵

Calciumcarbonat 0,5%

Natriumchlorid 0,3%

Kaliumdihydrophosphat 0,1%

Palmöl 0,5%

Stearinsäure 0,3%

pH vor der Sterilisierung 8,8%

nach Erhitzen im Autoklav unter 1,5 atm für 25 Minuten und nach Verteilen in Mengen von 30 bis 35 ecm auf 500-ccm-Erlenmeyerkolben mit 1 bis 5% des Inoculums versetzt. Die Kolben werden bei 28° C 97 bis 120 Stunden geschüttelt. Der Primycingehalt des erhaltenen Fermentationsproduktes kann durch biologische Messung bestimmt werden.

b) Gewinnung des rohen Primycins aus dem im. Labarotorium erhaltenen Fermentationsprodukt

Die so erhaltene Fermentationsflüssigkeit, deren durch Titrieren ermittelter Wirkstoffgehalt 520 bis 530y/ccm betrug (dieser Wirkstoffgehalt entspricht — auf 101 Schüttelkultur berechnet — einem Gesamtgehalt an reinem Primycin von 5,2 g) wurde mit In-H₂SO₄ auf pH 5 bis 6 eingestellt und zum Denaturieren der Mycelien auf 70° C erhitzt. Die ausgefallenen Mycelien, die auch die überwiegende Menge des Wirkstoffgehalts adsorbiert enthielten, wurden durch Zentrifugieren abgetrennt. Die überstehende Flüssigkeit enthielt nur 11 y/ccm Antibioticum (2,1% der produzierten gesamten antibiotischen Aktivität), sie konnte daher verworfen werden.

Der feuchte Niederschlag wurde sechsmal mit je 1,51 80%igem Methanol je 1 Stunde auf dem Wasserbad erhitzt und durch Zentrifugieren wieder abgetrennt, wobei das Antibioticum in die methanolischen Phasen extrahiert wurde, die vereinigten methanolisehen Extrakte (von denen die beiden letzten, die kaum mehr Primycin enthalten, ohne wesentlichen Wirkstoffverlust verworfen werden können) wurden im Vakuum auf ein Gesamtvolumen 1,25 1 eingedampft, das ausgefallene rohe Produkt abgenutscht und im Vakuum bei 40° C getrocknet, wobei man 10,6 g rohes Primycin erhielt, das bei der biologischen Bestimmung 41% antibiotische Aktivität zeigte, also 4,35 g reines Primycin enthielt. Die auf insgesamt 5,2 g Primycingehalt des Fermentationsproduktes berechnete Ausbeute betrug 84%. Die Mutterlauge enthielt noch 5% Primycin.

Beispiel 2

a) Betriebsfermentation mit Thermopolyspora galeriensis

Es wird zunächst ein Vorinoculum hergestellt, indem ein Nährboden folgender Zusammensetzung:

Sojamehl 4,0%

Kartoffelstärke 4,0%

Calciumcarbonat 0,5%

Natriumchlorid 0,3%

Kaliumdihydrophosphat 0,1%

Palmöl 0,5%

pH vor der Sterilisierung 8,5

im Autoklav unter 2,5 atm 25 Minuten sterilisiert, dann in Portionen von 100 ecm auf Erlenmeyerkolben verteilt, mit einer Sporen- oder Myceliumsuspension des Stammes Thermopolyspora galeriensis beimpft und bei 27° C 48 bis 60 Stunden geschüttelt wird. Das so erhaltene Vorinoculum wird dann auf einen Inoculum-Nährboden übertragen, indem man einen Nährboden folgender Zusammensetzung:

Sojamehl 4,0%

Kartoffelstärke 4,0%

Calciumcarbonat 0,5%

Natriumchlorid 0,3%

Kaliumdihydrogenphosphat 0,1%

Palmöl 1,0%

pH vor der Sterilisierung 8,8

nach einstündigem Sterilisieren bei 1,3 bis 1,5 atm in einem Fermenter von 1001 nützlichem Rauminhalt mit 1 bis 5 Volumprozent des obigen Vorinoculums versetzt und bei 27° C 48 bis 60 Stunden unter Rühren mit 250 U/Min, und Belüften die Inkubation durchführt. Die auf diese Weise erhaltene Kultur wird dann als Inoculum für die Produktionsfermentation verwendet.

Diese wird in einem Fermenter aus Eisen oder aus rostfreiem Stahl mit 1 m³ nützlichem Rauminhalt durchgeführt. In diesem Fermenter wird ein Nährboden der folgenden Zusammensetzung eingebracht:

Sojamehl 4,0%

Kartoffelstärke 4,0%

Calciumcarbonat 0,5%

Natriumchlorid 0,3%

Kaliumdihydrogenphosphat 0,1 %

Palmöl 0,6%

Stearinsäure 0,3%

pH vor der Sterilisierung 8,8 bis 9,0

1 Stunde bei 1,3 bis 1,5 atm sterilisiert und dann mit 10 Volumprozent des obigen Inoculums versetzt. Die Fermentation wird bei 27° C 96 bis 120 Stunden, unter stetigem Rühren (wenigstens 250 U/Min.) und Belüften (mindestens 1:1) fortgesetzt.

b) Gewinnung des rohen Primycins aus dem Betriebsfermentationsprodukt

Die so erhaltenen 1 m³ Fermentationsflüssigkeit, deren durch Titrieren ermittelter Primycingehalt loOOy/ccm betrug, wurde auf 80 bis 90⁰C erhitzt, dann bei pH = 6 bis 7 warm filtriert. Das nur unerheb-

liehe antibiotische Aktivität (10 y/ccm) zeigende FiI-trat wurde verworfen und die 70% Feuchtigkeit enthaltende Mycelienmasse von 124,6 kg Gesamtgewicht und 1,6 kg Primycin-Gesamtgehalt in zwei Portionen weiterverarbeitet.

a) Der erste, 61,2 kg betragende Teil des feuchten Niederschlags wurde mit 2501 80%igem Methanol versetzt, zum Sieden erhitzt, 3 Stunden gerührt und die flüssige Phase abfiltriert. Das erhaltene Filtrat (2401) zeigte eine biologische Aktivität von 2860 y/ccm, was einem Gehalt von 287 g reinem Primycin (43 % der gesamten Aktivität der Ausgangsflüssigkeit) entsprach.

b) Der zweite, 63,4 kg betragende Teil der feuchten Mycelienmasse wurde mit der unter a) erhaltenen, schon extrahierten und abfiltrierten Mycelienmasse vereinigt und in ähnlicher Weise, aber durch Erhitzen mit 4001 80%igem Methanol zum Sieden extrahiert. Die durch Filtration erhaltenen 4301 methanolische Lösung zeigten eine antibiotische Aktivität von 2000 y/ccm, was einem Gesamtgehalt von 860 g reinem Primycin (54%) entsprach.

c) Der nach der zweiten Extraktion als Rückstand erhaltene feuchte Niederschlag von 80 kg wurde mit weiteren 4001 80%igem Methanol nochmals zum Sieden erhitzt. Das erhaltene Filtrat von 3001 hatte eine antibiotische Aktivität von 50 y/ccm, was einem Gehalt von nur 16,5 g reinem Primycin (1,03%) entsprach. In diesen drei Extrakten war also 98% der gesamten antibiotischen Aktivität des Ausgangsproduktes enthalten; der dritte, bei der Extraktion c) erhaltene methanolische Extrakt konnte aber wegen seines niedrigen Antibioticumgehaltes schon verworfen werden.

Die Extrakte a) und b) wurden vereinigt, und die so erhaltenen 6701 wäßrig-methanolischer Lösung wurden im Vakuum bei 40 bis 45° C auf ein Volumen von 911 eingeengt, auf +6⁰C abgekühlt und 20 Stunden stehengelassen. Das ausgefallene rohe Primycin wurde im Vakuum abfiltriert. Diese Mutterlauge zeigte eine antibiotische Aktivität von nur 40 y/ccm.

Das abfiltrierte rohe Produkt wurde im Vakuum bei 40⁰C bis Gewichtskonstanz getrocknet. Man erhielt so 1,93 g rohes Primycin, dessen biologisch bestimmte Aktivität einem Gehalt von 1,25 kg reinem Primycin entsprach. Die auf die antibiotische Aktivität des unmittelbaren Fermentationsproduktes berechnete Ausbeute betrug also 78,3%.

Claims

ι 2

medium, dadurch gekennzeichnet, daß

Patentanspruch: man den Mikroorganismus Thermopolyspora ga-

leriensis, der bei dem ungarischen Landesinstitut

Verfahren zur Herstellung von Primycin durch für Gesundheitswesen unter der Nummer 650 707

Züchten von Mikroorganismen in einem Nähr- 5 hinterlegt ist, züchtet.