NO122362B - - Google Patents

Description

Fremgangsmåte ved fremstilling av primycin.

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte til fremstilling av primycin. Det er kjent at det antibiotiske stoff primycin som opprinnelig blev erholdt ved dyrkning av organismen Streptomyces primycini, har meget verdifulle terapeutiske egenskaper. Det av organismen frembragte antibiotikum ble isolert ved direkte ekstraksjon av fermenteringsvæsken eller ved syring av fermenteringsvæsken og såkaldt feldningsabsorpsjon eller utsaltning.

Organismen Streptomyces primycini har på forskjellige, med hensyn til nitrogenkilder rike næringsmedier en særdeles lav produksjonsevne som hverken ved anvendelse av andre, fra de opprinnelige næringsmedier avvikende næringsmedier eller ved seleksjons- og fored-lingsforsok har kunnet heves til et nivå som muliggjorde rasjonell teknisk produksjon. Dyrkningen av produksjonsdyktige naturlige vari anter av denne organisme er også temmelig vanskelig fordi stammen Streptomyces prjmycini på forskjellige faste næringsmedier hverken frembragte luftmycelier eller sporer.

Foreliggende oppfinnelse angår en hittil ukjent fremgangsmåte til fremstilling av primycin, en fremgangsmåte som gir tilstrek-kelig utbytte til teknisk produksjon. Fremgangsmåten ifolge oppfinnelsen er eiendommelig ved det som er angitt i krav l's karakteristikk. Organismen Micromonospora galeriensis er hittil ukjent. En stamme av denne er deponert i det ungarske landsinstitutt for helsevesen under nr. 650.707. Den angjeldende organisme ble opprinnelig isolert fra det indre av en moseart, Galleria mellonella. Den ble forst henfort til slekten Thermopolyspora, hvorved bemerkes at avgrensningen mellom denne slekt og Micromonospora er vanskelig. Et kriterium for henfdr-ing til Thermopolyspora er imidlertid vekst over 55°C, og da organismen ikke utviser vekst ved over 55°C, er den nu henfort til slekten Micromonospora. Organismen må ansees for termotolerant, men ikke termofil.

Innenfor slekten Micromonospora synes Micromonospora galeriensis å stå nærmest de gronne arter av typen bicolor. Micromonospora galeriensis avviker imidlertid herfra i vesentlige henseender.

I motsetning til Micromonospora bicolor vokser Micromonospora galeriensis ikke på nitrater; carbonutnyttelsen på sådanne N-kilder er ge-nerelt negativ, mens Micromonospora bicolor på nitratholdige medier har positiv utnyttelse med hensyn til glucose, fructose og andre kullhydrater.

Komplekse nitrogenkilder egner sig best til dyrkning av Micromonospora galeriensis, hvilket skal belyses senere i beskrivel-sen, mens stammer av Micromonospora bicolor ikke vokser i nærvær av slike N-kilder, f.eks. proteiner. Dannelse av luftmycelium er ytterst rudimentær hos Micromonospora galeriensis, mens substratmyceliet utvikles meget godt på passende næringsmedier.

Micromonospora galeriensis adskiller sig mikromorfologisk vesentlig fra de til slekten Streptomyces horende organismer, således også fra Streptomyces primycini. Luftmycelier hos Micromonospora galeriensis har ikke de karakteristiske strukturegenskaper som forekommer hos slekten Streptomyces; således er myceliene ikke fragmentert i sporer, men de enkeltvis eller i grupper forekommende runde eller ova-le sporer utvikler sig på mycelienes korte forgreninger. Micromonospora galeriensis adskiller sig også fra Streptomyces primycini blant annet ved å frembringe store mengder sporer. Myceliet utviser i sine sene utviklingstrinn, i avhengighet av det anvendte næringsmedium, tilbøyelighet til å nedbrytes ved lysis.

De isolerte stammer av Micromonospora galeriensis over-treffer med sin hoye antibiotikumproduksjon samtlige varianter av Streptomyces primycine som i alminnelighet stabilt hoyst har kunnet frembringe 250 - 300 y/ml primycin. Streptomyces primycini har gan-ske visst forbigående kunnet gi ypperlige utbytter av det antibiotiske stoff, i et kjent tilfelle således llOO y/ml, men denne hoye produksjon kunne ikke opprettholdes stabilt under industrielle forhold.

I motsetning hertil har stammer av Micromonospora galeriensis, til-dels oppnådd ved mutagen behandling og seleksjon, vist sig velegnede til industriell antibiotikumproduksjon med en stabil produksjonsevne på 2000 til 4O0O y/ml.

Hovedtrekkene av artens morfologi er som folger: Micromonospora galeriensis er termotolerant og vokser ut-merket ved 45°C, men vokser ikke ved 55°C. Stammens velutviklede substratmycelium inneholder ikke transversale septa, og oidiesporer kan ikke iakttas. Den utviser ingen fragmentering. Diameteren er under 1 u.. Luftmyceliet utvikles ytterst dårlig. Konidioforene er grenede, av middels lengde, og de har en stor mengde isolerte sporer. Sporene er som regel stilkldse, men i sjeldne tilfelle sitter de på stilk. Ved elektronmikroskopisk undersokelse har sporeoverflaten vist sig å være glatt. Sporestdrrelsen er 0,8 - 1 il. Organismen er grampositiv.

Veksten er kraftig ved 38°C og 45°C.

På forskjellige næringsmedier forholder Micromonospora ga-lariensis sig som folger, idet der til farveangivelsene i kode er be-nyttet Helmut Krauser: Code for determining the colour/aerial mycelia of Streptomyces; H. Krauser et al., Application of colour code for the description of aerial mycelia of Streptomyces. Z. Allg. Microbio-logie 4, 95 - 98, 1964. I enkelte tilfelle (kodebetegnelser så ikke anvendt) er farvebestemmelsen skjedd ved hjelp av Tresner-Backus'kode.

Pepton-gjærekstrakt-

jernagar: Intet luftmycelium. Brunliggult, utviklet, meget foldet substratmycelium. Intet opploselig pigment. Akromogen ble observert efter annen og fjerde dag.

Tyrosinagar: Intet luftmycelium. Svakt utviklet, farveldst,

punktaktig substratmycelium. Intet opploselig pigment. Melaminproduksjon negativ.

Gjærekstrakt: Smelteekstrakt-agar (ved 38°C): Rynkede lichen-aktige kolonier. Substratmyceliets farve: "Y"-serien "CO 37" (1 uke) og "CO-74" (2 uker). Luftmycelium i spor. Lysebrunt opploselig pigment, kraftig vekst.

Håvreflak-agar

(ved 38°C): Intet.luftmycelium. Moderat utviklede punktaktige, flate kolonier. Substratmyceliets farve: "Y-serien" "CO-37". Intet opploselig pigment.

Stivelsesagar

(ved 38°C): Intet luftmycelium. Svakt utviklede flate,

punktaktige kolonier. Substratmycelie-ts farve: "Y-viridis,,-serien "CC-37" (1 uke), "GC 570"

(2 uker). Intet opploselig pigment.

Glycerol-aspargin-

agar,(38°C): Intet luftmycelium. Svakt utviklede, spredte punktaktige kolonier. Substratmyceliets farve: "Y"-serien "CO-35" (1 og 2 uker). Intet opploselig pigment.

N-fri Ashby agar: Absolutt ingen vekst.

Pepton-glycerol-agar

(næringsagar)(28°C): Intet luftmycelium. Overordentlig kraftig utviklet, kontinuerlig, furet substratmycelium farve, "Y"-serien "Co-44". Intet opploselig pigment.

Syntetisk agar

(N-kilde NaNO^)

(28°C): Absolutt ingen vekst. Det menes at stammen er ute av stand til å vokse på mineralske N-kilder.

Gause stivelsesagar

(28°C): Absolutt ingen vekst. N-kilde KN03-

Glucose-aspargin-

agar (28°C): Intet luftmycelium. Svakt utviklet, punktaktig substratmycelium,<M>Y"-serien "Co-44". Intet opploselig pigment.

Saccharose-nitrat-

agar (28°C): Absolutt ingen vekst.

Glycerol-glycol-

agar (28°C): Absolutt ingen vekst.

Bemerkninger om utnyttelse av N-kilden:

Micromonospora galeriensis horer til en forholdsvis sjel-den type aktinomyceter hvor utvikling og optimal vekst i forste rekke kun kan sikres ved hjelp av komplekse nitrogenkilder (f.eks. pepton etc). Organismen er ute av stand til å utnytte mineralske kilder, og ennvidere vokser den meget svakt eller slett ikke på aminosy-rer .

Prove på Pridham-Gottliebs syntetiske næringsmedium:

Micromonospora galeriensis utviser på forskjellige næringsmedier i hdy grad forskjellige farver; arten kan, avhengig dels av næringsmediets sammensetning, dels av andre påvirkninger (bestråling, kjemiske reagenser etc.) og også av myceliets alder, utvise nesten enhver farvetone fra skittenhvit over lysegul og gulbrun til morke-grdnn.

Koloniene har i alminnelighet på optimale næringsmedier rund, linsestor, oppragende krateraktig, radialfuret form; der kan imidlertid også, dels ved spontane mutasjoner, dels ved forskjellige påvirkninger (f.eks. ved rdntgenbestråling) fåes konsentriske ribbede eller uregelmessig skrumpede eller rynkede kolonier. På utilstrekke-lige næringsmedier fåes mindre, endog kun punktformede kolonier.

Når der anvendes et tykt, konsentrert inokulum, flyter koloniene på de fleste næringsmidler sammen til et furet, tykt belegg.

Der oppnåes alltid, helt uavhengig av formen, størrelsen og farven av koloniene, på egnede næringsmedier regelmessig gode gjæ-ringsresultater. For utviklingen av denne organisme er en hdyere temperatur (37°C) gunstigere enn den hos slekten Streptomyces i alminnelighet vanlige temperatur på 27°C, men man kan under industriforhold også oppnå gode resultater med den foreliggende organisme ved 27-28°C.

Luftmyceliene er, når de forekommer, fine og tynne, og på disse opptrer allerede forholdsvis tidlig, efter 48 timer, de karakteristiske små sporer hvis antall senere blir meget betydelig. Myceliene kan, avhengig av sammensetningen av næringsmediet og av tempe-raturen, undergå lysis efter tredje eller fjerde dag.

På 97 forskjellige næringsmedier ble det undersokt hvor-ledes Micromonospora galeriensis forholder sig. Resultatene av disse iakttagelser er sammenfattet i efterfdlgende tabeller I - III.

Tabell I viser på de som identifikasjonsgrunnlag interna-sjonalt anerkjente såkaldte Waksmanske identifikasjonsnæringsmedier iakttagelige karakteristiske vekstfenomener. I tabellens fdrste spalte angis data for en hvit stamme av Micromonospora galeriensis, i den annen spalte data for en grdnn stamme og i den tredje spalte data for en gul stamme.

Mikroorganismens vekst ble icikttatt fortlopende, og iakt-tagelsene registrert i forskjellige tidsintervaller efter 72, 120, 168, 240 eller 336 timers forlop.

Stammen i/l produserer på glucose-pepton-agar og potetstyk-ker et gront pigment, mens der av stammen l/2 på tyrosin-agar frem-bringes et brunt pigment•

Tegn:

Innflydelsen av forskjellige nitrogenkilder på veksten av Micromonospora galeriensis ble undersdkt ved at man i et Czapek-Dox medium erstattet det som uorganisk nitrogenkilde tilstedeværende nat-riumnitrat med ekvivalente mengder (regnet som nitrogen) av de forskjellige organiske nitrogenkilder.

I nedenstående tabell II vises de ved dyrkning på av forskjellige organiske nitrogenkilder modifiserte Czapek-Dox medier iakt-tatte vekstegenskaper hos de tre forannevnte stammer av Micromonospora galeriensis. Veksten og kolonienes pigmentfrembringelse ble registrert på forskjellige tidspunkter under organismens vekstperiode (efter 72, 120, 168, 240 og 336 timer).

Tegnforklaring: se tabell I.

Stammen I produserer på medier inneholdende 1-tryptoxan et brunt pigment.

Stammen I/l gir på flere forskjellige nitrogenkilder (dl-tyrosin, dl-fenylalanin, cytidin, 1-lysin, 1-arginin, ammoniumsulfat og andre) et gront pigment.

Stammen l/2 gir på medier inneholdende 1-tryptofan et brunt pigment.

Til beddmmelse av carbonutnyttelsesevnen hos den omhand-lede nitrogenkilde ble anvendt et Czapak-medium inneholdende uorganisk nitrogen, hvis kullhydratinnhold ble erstattet med samme mengde av de i tabell III angitte kullhydrater. Mikroorganismens vekst ble iakttatt efter inkubering i 72, 120, 168, 240 og 336 timer. De oppnådde resultater fremgår av tabell III.

Tegnforklaring: se tabell I

Da de foreliggende erfaringer tyder på at uorganiske nitrogenkilder i alminnelighet ikke er gunstige for utviklingen av Micromonospora galeriensis, er også innflydelsen av forskjellige kullhydrater på veksten av denne art i nærvær av en organisk nitrogenkilde (1-aspargin) blitt undersokt.

Som næringsmiddel ble også her brukt Czapek-Dox mediet, hvis natriumnitratinnhold imidlertid ble erstattet med en ekvivalent mengde l-aspargin, og hvis saccharoseinnhold ble erstattet med forskjellige mengder av de forskjellige i tabell III angitte kullhydrater

Mikroorganismens vekst ble iakttatt efter 72, 120, 168, 240 og 336 timers inkubasjon. De fundne resultater fremgår av nedenstående tabell IV.

Tegnforklaring: se tabell I

Til fremstilling av primycin dyrkes en stamme av arten Micromonospora galeriensis på et næringsmédium som inneholder kullhydrater såsom stivelse eller saccharose som organisk carbonkilde, nitrogenholdige organiske stoffer såsom soyamel, gjærcellesuspensjoner eller lignende nitrogenholdige kompleksstoffer som nitrogenkilde. Me-

diet kan tillike dels som skumdempningsmiddel, dels også som ytterli-

gere carbonkilde inneholde forskjellige dyriske eller vegetabilske oljer eller fettstoffer eller disses bestanddeler, f.eks. palmeolje, solsikkeolje, stearinsyre eller glycerol, og som uorganiske salter i forste rekke alkalifosfater og klorider samt kalsiumcarbonat.

Gjæringen kan med fordel gjennomfores ved temperaturer mel-

lom 27 og 40°C; ved de hdyere, til ca. 37°C hevede temperaturer, er organismens vekst hurtigere enn ellers, og gjæringstidan kan derved avkortes, men under industriforhold kan der også ved temperaturer om-kring 27 - 28°C oppnås særdeles gode resultater og hoye utbytter. Gjæringen utfores under omroring og luftning.

Det av mikroorganismen frembragte primycin kan isoleres

fra gjæringsproduktet ved sedvanlige ekstraksjonsrnetoder, f.eks. med n-butanol. Ved den her oppnådde, i sammenligning med den kjente fremgangsmåte til fremstilling av primycin langt hoyere primycinkonsentra-sjon, er imidlertid anvendelse av de sedvanlige organiske opplosnings-midler temmelig vanskelig, da primycin er uopploselig i upolare oppldsningsmidler og i alminnelighet dårlig opploselig i polare opplos-ningsmidler. Man kan derfor med stdrre fordel ifolge oppfinnelsen gå

frem som angitt i krav 2. Det betyr at man til isolering av det frembragte primycin fra myceliene anvender en binær eller ternær blanding

av polare oppldsningsmidler, hensiktsmessig f.eks. vandig, ca. 80 %'s methanol. Herved går man i praksis frem på folgende måte: Innholdet av aktivt stoff i gjæringsvæsken felles ved forholdsvis hoy temperatur, f.eks. ved 70 - 90°C, fra et svakt surt me-

dium, pH 5-7, sammen med myceliene, hvorefter antibiotikumet ekstraheres fra det vundne fuktige bunnfall ved kokning med en polar opplos-ningsmiddelblanding, hensiktsmessig med en vandig alkohol, f.eks. med

80 %'s methanol. -Råproduktet med stor antibiotisk aktivitet kan der efter isoleres ved inndampning av denne opplosningsraiddelblanding. Primycin er som kjent termostabilt, undergår f.eks. i vandig medium ved IO timers kokning ingen aktivitetsnedgang; det aktive stoff nedbrytes altså ikke ved kokning av gjæringsvæsken, men utskiller sig snarere absorbert til de ved kokningen denaturerte mycelier og andre tilstedeværende eggehvitestoffer. Det på denne måte vundne og antibiotikumet i adsorbert tilstand inneholdende bunnfall fraskilles derefter ved filtrering eller sentrifugering. Den ovenstående væske inneholder kun ubetydelige mengder, 2-20 y/ml, primycin, og kan kas-seres. Det fuktige mycelium kokes derefter fordelaktig med vandig methanol, hvorved nesten hele innholdet av virksomt stoff overgår i opplosningen. Den fra bunnfallet fraskilte oppldsning inndampes derefter i vakuum, hvorved det rå primycin spontant utskiller sig, mens de vannoppldselige forurensninger for storste delens vedkommende blir i den vandige moderlut og ved vakuumfiltrering lett kan adskilles fra det utskilte primycin. På denne måte vinnes et forholdsvis rent råprodukt med hoy antibiotisk aktivitet, 40 - 70 % primycininnhold, i særdeles godt utbytte, 70 - 90 % av gjæringsvæskens antibiotiske aktivitet.

Den videre rensning av det på den ovenfor beskrevne måte vundne råprodukt og utvinningen av primycinet i ICO %'s renhet kan gjennomfores på kjent måte. Herved befries primycinet i vandig-alko-holisk opplosning fra de alkoholopploselige eggehvitestoffer ved feld-ning med blysalter, mens de ennu tilstedeværende pigmentaktige forurensninger adsorberes ved hjelp av en blanding av aktivt kull med et kjemisk indifferent fast adsorberingsmiddel med stor specifikk over-flate (cellulosepulver, "Hyflo"-filterhjelp, feilet kalsiumcarbonat og lignende stoffer), hvorefter primycinet isoleres fra den nu rene oppldsning på i og for sig kjent måte.

Fremgangsmåten ifdlge oppfinnelsen skal i det fdlgende belyses nærmere ved noen utforelseseksempler: Eksempel 1 A. Gjæring med Micromonospora galeriensis i laboratoriet

Til frembringelse av en podningskultur anvendes folgende nær ing s med i um:

Dette næringsmedium oppvarmes i en autoklav under 1,5 atmosfærer i 24 minutter, hvorefter et antall porsjoner å lOO ml av dette medium i hver sin 500 ml store Erlenmeyer-kolbe podes med en spore- eller myceliumsuspensjon av Micromonospora galeriensis og rystes ved 27°C på et rystebord med en slaglengde på 5 cm i 48 - 60 timer .

Med den på denne måte fremstillede podekultur podes derefter et produksjonsmedium med folgende sammensetning:

Dette næringsmedium oppvarmes i en autoklav under 1,5 atmosfærer i 25 minutter og fordeles derefter i mengder på 30 - 35 ml i

500 ml store Erlenmeyer-kolber, hvorefter der tilsettes 1 - 5 % av den på den ovenfor beskrevne måte fremstillede podekultur. Kolbene rystes ved 28°C i 97 - 120 timer. Primycininnholdet i det fremkomne gjæringsprodukt kan bestemmes ved biologisk bestemmelse.

B. Utvinning av det rå primycin fra det i laboratoriet vundne gjæringsprodukt

Den ifolge A vundne gjæringsvæske hvis, ved titrering bestemte innhold av virksomt stoff var 520 - 530 y/ml, (svarer, beregnet på IO liter rystekultur, til et samlet innhold av rent primycin på 5,2 g), ble innstillet med 1 N H2S04til en pH-verdi på 5 - 6 og oppvarmet til 70°C til denaturering av myceliet. Det fraskilte mycelium som inneholdt en overveiende mengde av innholdet av aktivt stoff i adsorbert tilstand, ble fraskilt ved sentrifugering. Den ovenstående væske inneholdt kun 11 y/ml antibiotikum (2,1 % av den samlede pro-duserte aktivitet) og kunne derfor kastes bort.

Det fuktige bunnfall ble oppvarmet 6 ganger, hver gang med 1,5 liter 80 %'s methanol i 1 time på vannbad, hvorefter der ytterligere ble separert ved sentrifugering. Derved ekstrahertes det antibiotiske stoff over i den metanoliske fase; de forenede metanoliske ekstrakter (av hvilke de to siste som dårlig nok inneholdt mere primycin, uten vesentlig tap av det virksomme stoff kunne kastes bort) ble inn dampet i vakuum til et samlet volum på 1,25 liter, det utskilte rå produktet ble avnutsjet og torret i vakuum ved 40°C. Der ble utvunnet 10,6 g rått primycin; råproduktet viste ved biologisk bestemmelse 41 % antibiotisk aktivitet og inneholdt altså 4,35 g rent primycin. Beregnet på det samlede primycininnhold i gjæringsproduktet på 5,2 g var utbyttet altså 84 %. Moderluten inneholdt ennu 5 % primycin.

Eksempel 2 a. Produksjonsgjæring med Micromonospora galeriensis

Der ble forst fremstillet et for-inokulum på et næringsmedium med folgende samnensetning:

Næringsmediet steriliseres i en autoklav under 1,5 atmosfærer i 25 minutter og fordeles derefter i lOO ml store porsjoner i

Erlenmeyer-kolber og podes med en pode-myceliumsuspensjon av Micromonospora galeriensis, hvorefter der dyrkes på rystekultur ved 27°C i 48 - 60 timer. Den på denne måte vundne forkultur overfores derefter på et n&ringsmedium med folgende sammensetning:

Efter sterilisering i 1 time ved 1,3 - 1,5 atmosfærer an-bringes dette næringsmedium i en gjæringstank på ICO liters effektivt volun, og der tilsettes 1-5 volumprosent av den ovenfor beskrevna

forkultur, hvorefter der inkuberes ved 27 °C i 48 - 60 timer under omroring med 250 omdreininger pr- minutt og luftning. Den på denne måte vundne kultur brukes tilslutt som podningsmedium for selve produksjons-gjæringen.

Denne gjæring ble gjennomfort i en gjæringstank av jern eller rustfritt ståo l med effektivt volum på 1 m 3. I denne tank an-bringes et næringsmedium med folgende sammensetning:

Dette næringsmedium steriliseres 1 time ved 1,3 - 1,5 at-mosfærers trykk, og der tilsettes 10 volumprosent av det foran beskrevne podningsmedium. Gjæringen utfores ved 27°C i 96 - 120 timer under stadig omroring (minst 250 omdreininger pr. minutt) under luftning (minst 1:1).

B. Utvinning av rått primycin fra det industrielle gjæringsprodukt

Denlfdlge A vundne ialt 1 m 3 gjærxngsvæske, hvis ved titrering bestemte primycininnhold var 1600 y/ml, ble oppvarmet til 30 - 90°C og filtrert derefter i varm tilstand ved pH 6-7. Filtratet som bare hadde uvesentlig antibiotisk aktivitet (10 y/ml) ble kastet, og myceliemassen som inneholdt 70 % fuktighet og hadde en samlet vekt på 124,6 kg og et samlet innhold på 1,6 kg primycin, ble videre forarbei-det i to porsjoner.

a) Til den fors ts porsjon av det våte bunnfall som veiet ialt 61,2 kg, ble tilsatt 250 liter 80 %'s methanol som ble kokt og

omrdrt i 3 timer. Den flytende fase ble derefter fraskilt ved filtrering og det vundne filtrat (240 liter) utviste en biologisk aktivitet på 2860 y/ml, svarende til et primycininnhold på 287 g rent primycin, dvs. 43 % av den samlede aktivitet i utgangsvæsken.

b) Den annen porsjon av ovennevnte fuktige myceliemasse som veiet 63,4 kg ble forenet med den under a) vundne, allerede eks-traherte og avfiltrerte myceliemasse, og ble ekstrahert på lignende måte, men ved oppkokning med 400 liter 80 %'s methanol. Den ved fil-treringen fraskilte 430 liter store methanoliske oppldsning utviste en antibiotisk aktivitet på 2000 y/ml, altså et samlet innhold på

860 g rent primycin (54 %).

c) Det efter den annen ekstraksjon tilbakeværende 80 kg fuktig bunnfall ble oppkokt med ytterligere 400 liter 80 %'s methanol.

De oppnådde 300 liter filtrat inneholdt 50 y/ml antibiotisk aktivitet og inneholdt altså ikke mere enn 16,5 g rent primycin (1,03 %). I

disse tre ekstrakter ble altså vunnet 98 % av den samlede antibiotiske aktivitet i utgangsmaterialet; den tredje, ved ekstraksjon c) vundne methanoliske ekstrakt kunne imidlertid på grunn av det meget lave antibiotikuminnhold kastes bort.

Ekstraktene a) og b) ble forenet, og de på denne måte vundne 670 liter vandig methanolisk oppldsning ble inndampet i vakuum ved 40 - 45°C til et volum på 91 liter, hvorefter der ble avkjolet til +6°C, og det hele hensto i 20 timer. Det utskilte rå primycin ble avnutsjet i vakuum. Moderluten utviste en antibiotisk aktivitet på 40 y/ml.

Det frafiltrerte råprodukt ble tdrret i vakuum ved 40°C til

konstant vekt. Der ble utvunnet 1,93 kg rått primycin, hvis ved biologisk bestemmelse fastslåtte aktivitet svarte til et innhold på 1,25 kg rent primycin. Utbyttet var altså 78,3 % av den antibiotiske aktivitet som var tilstede i det umiddelbare gjæringsprodukt.

Claims (2)

1. Fremgangsmåte til fremstilling av primycin, karakterisert ved at man under aerobe betingelser i en omrort kultur i et næringsmedium inneholdende en organisk carbonkilde, en organisk nitrogenkilde, uorganiske salter og eventuelt tillike naturlige eller syntetiske eller både naturlige og syntetiske fettstoffer, oljer, fett-alkoholer eller fettsyrer dyrker en stamme av arten Micromonospora galeriensis, hvorpå man utvinner primycin fra dyrkningsmediet.

2. Fremgangsmåte ifolge krav 1, karakterisert ved at man utvinner det frembragte primycin ved oppvarmning av gjæringsvæsken med deri inneholdt mycelium ved pH 5-7, hvorefter myceliet med derpå "'.t primycin fraskilles og primycinet ekstraheres ved kokning av den fuktige myceliemasse med en blanding av polare opplosringsmidler, hensiktsmessig med vandig methanol.