NO123091B

NO123091B -

Info

Publication number: NO123091B
Application number: NO169452A
Authority: NO
Inventors: L Gasser; D Schadewald
Original assignee: Int Standard Electric Corp
Priority date: 1966-08-23
Filing date: 1967-08-22
Publication date: 1971-09-27
Also published as: ES344371A1; CH467567A; AT289212B; DE1487991A1; NL6711571A; DE1487991B2; US3538262A

Description

Fremgangsmåte til fremstilling av et nytt antibiotisk middel.

Foreliggende oppfinnelse angår fremstilling av et nytt antibiotisk middel som oppfinneren midlertidig har betegnet

«E.129» og denne betegnelse for midlet vil bli brukt i det følgende. Ifølge oppfinnelsen fremstilles E.129 ved dyrkning av passende organismer under neddykkede, aerobe betingelser.

Dette nye antibiotiske middel E.129 er

nemlig erholdt ved dyrkning under aerobe betingelser av en organisme som nylig er oppdaget av oppfinneren og identifisert som tilhørende familien . Streptomyces. Denne organisme som ble isolert av en jordprøve uttatt nær Jeriko i Jordan, er midlertidig betegnet med Streptomyces

E. 129 og denne betegnelse for organismen vil bli brukt i det følgende. Kulturer av organismen Streptomyces E. 129 er deponert i The National Collection of Industrial Bac-teria (N.C.I.B.) ved Department om Scien-tific and Industrial Research, Teddington, England for innlemmelse i dette institutts samling og er i denne gitt nr. N.C.I.B. 8792. Organismen er også deponert under navnet Streptomyces ostreogriseus i kultursamlin-gen hos Northern Regional Research La-boratories (N.R.R.L.) i Peoria, Illinois, U.S.A. og er i denne samling gitt nummeret N.R.R.L. 2558.

Oppfinnelsen vil i det følgende bli beskrevet fra de fire hovedsynspunkter, nemlig: (1) Det nye antibiotiske middels E.129

karakteristika og egenskaper.

(2) Organismens Streptomyces E. 129

karakteristika.

(3) Dyrkningen av Streptomyces E. 129 så at den gir E.129 som råprodukt. (4) Isolering og rensning av E.129. De data som her gis er de nyligst erholdte og de mest pålitelige som er tilgjen-gelige på dette tidspunkt, men de kan være gjenstand for modifikasjoner i lyset av fremtidig utvikling.

( 1) E. 129' s karakteristika og egenskaper.

Det nye antibiotiske middel E.129 er et nøytralt stoff som i rimelig grad er stabilt i et stort område for pH-verdien ved

normale temperaturer og i fravær av sterkt

lys. Det er temmelig oppløselig i mange

organiske oppløsningsmidler men mindre

oppløselig i vann og i kullvannstoff-oppløs-ningsmidler. E.129 har ingen betydelig ab-sorbsjonskarakteristika i spekterets ultrafiolette område, idet det bare viser sluttabsorpsjon men har et veldefinert og ene-stående absorpsjonsspektrum for infrarøde stråler. E.129 viser et bredt microbiologisk spektrum for antibakterievirkning. Det er hovedsakelig aktivt mot gram positive organismer men viser også noen aktivitet mot noen gram negative organismer. Det er meget lite giftig og dets aktivitet in vivo er godt sammenlignbart med dets aktivitet in vi tro.

I sammenligning med kjente antibiotiske midler har E.129 noen alminnelig likhet med erytromycin men kan lett skilles fra dette hovedsakelig ved sin nøytrale re-aksjon og ved sitt spektrum i det infrarøde område.

E.129 har imidlertid en fremtredende likhet med det antibiotiske middel streptogramin som er beskrevet av J. Charney og medarbeidere i Antibiotics Annual 1953/54, sider 171—173 og i engelsk patenskrift nr.

776 035. Det kan antas sannsynlig at E.129 er en kompleks blanding av stoffer av hvilke noen men ikke alle også er tilstede i streptogramin, og heller ikke er tilstede i streptogramin i de samme relative mengdeforhold. Særlig antas det at E.129 inneholder en bestanddel som ikke er tilstede i streptogramin som beskrevet av Charney og medarbeidere, og denne bestanddel har viktige egenskaper.

E.129 kan adskilles fra streptogramin ved flere fysikalske karakteristika deriblant særlig det førstnevnte stoffs spektrum i det infrarøde område og dets oppløselighet i vann. E.129 er mere effektivt som antibi-otikum enn streptogramin hva der er på-vist ved fysiologiske prøver som prøver med beskyttelse av mus.

I det følgende vil disse karakteristika bli behandlet mere detaljert: a) En av de mest karakteristiske trekk ved E.129 er dets nøytralitet i kjemisk hen-seende. Denne skyldes imidlertid ikke at stoffet er av amfotær natur. Såvidt det for tiden vites danner ikke E.129 salter med syrer og heller ikke med alkalier. Dette gir noen vanskeligheter med ekstraksjonen og rensning av det antibiotiske middel fra opløsninger som innholder det i uren tilstand. Streptogramin er imidlertid også et nøytralt stoff. ' b) E.129 er funnet å være i rimelig grad stabilt innen pH-verdi-området fra 2 til 10 ved romtemperatur, idet det ikke taper mere enn halvparten av sin aktivitet ved ekstreme pH-verdier i løpet av 45 min. ved romtemperatur. Stoffets stabilitet minsker ettersom temperaturen øker og det synes i alminnelighet å være mest stabilt ved en pH-verdi på 7. Det er i alminnelighet minst stabilt under alkaliske betingelser. Disse egenskaper vises av de resultater som er angitt i følgende tabell 1 og som ble erholdt ved å utsette porsjoner av filtrert E.129-inneholdende kultur med 100 enheter pr. ml for forskjellige pH-verdier og temperaturer i varierende tidsrom. «Enheten» for E.129 er basert på aktiviteten av et vilkårlig valgt preparat. Resultatene er uttrykt i disse enheter pr. ml. Det er å merke at streptogramin ved b2handling med alkalier sies å gå i oppløs- ling ved en pH-verdi på omkring 9,5 og ieretter å inaktiveres raskt. c) Det antibiotiske middel E.129 er meget oppløselig i metanol, etanol, butanol, aceton, metyl-isobutyl-keton, etylacetat, butylacetat, amylacetat, kloroform og benzen. Det er mindre oppløselig i eter og vann og er uoppløselig i petroleum. Det er videre minst to ganger så oppløselig i vann som streptogramin (dvs. det har en oppløselig-het i vann på minst 0,2 mg/liter ved 20° C). Faste stoffer som erisolert viser varierende smeltepunkter som ligger mellom 121° C og 134° C og en tilnærmet elementaranalyse på 64 % kullstoff, 7 % hydrogen og 8 % nitrogen. Streptogramin har et smelte-punkt på omkring 155" C og en elementaranalyse på 62,25 % kullstoff, 6,62 % hydrogen og 8,42 % nitrogen. d) Oppløsninger av E.129 i etanol viser ikke noe karakteristisk absorpsjonsspektrum i det ultrafiolette område men viser bare sluttabsorpsjon i dette område. E.129 har imidlertid et karakteristisk spektrum i det infrarøde område, således som vist i vedføyede tegninger.

Som det sees av disse tegningers fig. 1 har en 1 %'s oppløsning av E.129 i kloroform karakteristiske absorpsjonsbånd ved 1728 cm-i (2,99 (x), 1670 cm-<1> (5,99 p), 1623 cm-' (6,16 1595 cm-' (6,27 p), 1420 cm-i (7,04 |_t), 1360 cm-' (7,35

1340 cm-' (7,46 (.0, 1306 cm-' (7,66 u),

1148 cm-i (8,71 1104 cm-<1> (9,06 |x) 'og 958 cm-<1> (10,44 j.i). E.129 viser også karakteristiske bånd ved 3350 cm-<1> (2,99 ji), 996 cm-<1> (10,04 og 880 cm-<1> (11,36 [i). Streptogramin er i det foregående siterte litteratursted fra Antibiotics Annual og i

det likeledes i det foregående nevnte en-gelske patentskrift nr. 776 035 angitt å ha absorpsjonsbånd ved 3.05, 3.43, 3.54, 5.80, 6.02, 6.17, 6.23, 6.35, 6.46, 6.58, 6.94, 7.03, 7.32, 7.46, 7.64, 7.72, 7.96, 8.09, 8.20, 8.44, 8.61, 8.94, 9.45, 9.65, 9.78, 10.15, 10.26, 10.60, 10.80, 10.98, 11.29, 11.50, 11.78, 12.28, 12.68, 13.0, 13.23, 13.40 og 14.35 (.i En undersøkelse av det ab-sorpsjonsdiagram som er vedføyet engelsk patentskrift nr. 776 035 viser imidlertid at den ovenfor angitte liste er for omfattende, da mange av disse bånd i virkeligheten neppe kan sjeines. Praktisk talt synes det at de karakteristiske absorpsjonsbånd for streptogramin er ved 3.05, 3.43, 3.54, 5.80, 6.02, 6.17, 6.23, 6.35, 6.46, 6.58, 6.94, 7.03, 7.32, 7.46, 7.64, 7.72, 7.96, 8.20, 8.44, 8.61, 8.91, 9.45, 9.65, 9.78, 10.15, 10.26, 11.29, 13.25, 13.40 og 14,35 n.

Som det sees tilsvarer disse absorpsjonsbånd noenlunde absorpsjonsbåndene for E.129 med hensyn til stillingen, men i noen tilfelle er de i fremtredende og betegnende grad forskjellig fra de sistnevnte med hensyn til intensitet. Således er et spektrum av E.129 suspendert i nyjol (tung mineralolje) forskjellig fra streptogramins spektrum ved at det førstnevnte spektrum viser sterkere absorpsjon ved 810 cm—<1 >(12,35 u.) og 1058 cm-<1> (9,45 u.) mens streptograminets spektrum viser i betydelig grad sterkere absorpsjon ved 1022 cm—<1> (9,78 \ i) og 1575 cm-<1> (6,35 Disse forskjelligheter i spektrene i det infrarøde område er betegnende men relativt små og gir en indi-kasjon om en sterk likhet mellom E.129 og streptogramin med hensyn til kjemisk struktur. Forskjellighetene indikerer imidlertid noen strukturforskjelligheter mellom E.129's og streptograminets molekyler og disse forskjelligheter i den kjemiske struktur reflekteres også i de andre fysikalske og fysiologiske forskjelligheter som er fast-slått mellom E.129 og streptogramin. Det er f. eks. betegnende at de relative intensiteter for de forskjellige bånd i E.129's spektrum i det infrarøde område er forskjellige fra de relative intensiteter for bånd i streptograminets spektrum i det infrarøde område.

Streptograminets spektrum i det infra-røde område som angitt i engelsk patentskrift nr. 776 035 ble målt med en suspensjon av materiale i nyjol. Denne metode menes ikke å være så tilfredsstillende som målinger utført med virkelige oppløsninger, men da det er viktig å skjelne mellom E.129 og streptogramin, har oppfinneren bestemt E.129's spektrum i det infrarøde område under anvendelse av en suspensjon av dette material i nyjol. Dette spektrum vises på vedføyede tegningers fig. 2. Som nevnt ovenfor er de hovedtrekk som skiller de to stoffers spektrum i det infrarøde område de relative intensiteter av forskjellige absorpsjonsbånd. Disse forskjelligheter illustreres best ved følgende tabell (i hvilken de angitte tall refererer seg til spektra erholdt med en suspensjon i nyjol av vedkommende materiale).

e) E.129 har en temmelig stor likhet med erytromycin med hensyn til dets antibiotiske aktivitet. E.129 kan imidlertid lett skilles fra erytromycin på flere måter. For det første er erytromycin i kjemisk hen-seende et basisk stoff mens E.129 er nøy-tralt. For det annet er E.129's spektrum i det infrarøde område, således som ovenfor angitt, radikalt forskjellig fra erytromycinets spektrum i det infrarøde område. For det tredje er E.129 antibakteriespektrum klart forskjellig fra erytromycinets. Dessuten er det kjent at når erytromycin i vandig oppløsning blandes med 2 n svovelsyre og man lar blandingen stå i 30 min., viser den resulterende oppløsning et skarpt ab-sorpsjonsmaksimum ved 485 m|j, (jvf. Ford og medarbeidere, Analytical Chemistry

1953, 25 (8), 1195). Under disse betingelser

gir ikke E.129 noe skarpt absorpsjonsmak-simum ved 485 mjx.

De kvalitative forskjelligheter mellom de totale microbiologiske spektra er tildels betegnende men mindre avgjørende enn de kvantitative forskjelligheter. Den kvantitative forkjell kan vises ved variasjonen mellom den relative antibakterieaktivitet for E.129 og erytromycin mot flere forskjel-aktivitet viser i nedenstående tabell. Resul-lige organismer. Denne variasjon i relativ tatene er erholdt som følger:

Platene med nærende agar ble podet med tre forskjellige organismer og oppløs-ninger av E.129 og av erytromycin ble på-ført hver plate ved de samme relative konsentrasjoner (de absolutte konsentrasjoner ble minsket for en av prøveorganismene, nemlig Sarcina lutea på grunn av denne organismes større følsomhet). Aktiviteten av oppløsningene av hvert antibiotisk middel mot prøveorganismene ble notert uttrykt i diameteren av sonen for den resulterende hemning. Av disse resultater ble tilnærmede verdier for aktiviteten av E.129 mot hver prøveorganisme beregnet uttrykt som erytromycinets aktivitet mot vedkommende organisme i mikrogram erytromycin pr. milliliter.

Det vil forståes at i ovenstående tabell er de absolutte verdier for E.129's aktivitet uttrykt som erytromycin, ikke viktige. Det bemerkelsesverdige resultat som fremgår av tabellen er den syv gangers økning i E.129's aktivitet i forhold til erytromycin fra Sarcina lutea til Micrococcus flavus. Dette viser en klar forskjell mellom de to antibiotiske midler.

f) Det antibiotiske middels E.129 mi-krobiologiske spektrum vises i følgende

tabell:

I ovenstående tabell betegner:

a. d. følsomhetsbestemmelser ved agar-fortynning utført i nærende agar inneholdende 10 % blod inkubert ved 37° C i 24 timer.

b. d. følsomhetsbestemmelser ved fortynning av nærende uttrekk i reagensrør, inkubert ved 37° C i 24 timer.

g) E.129's aktivitet in vitro mot forskjellige organismer, særlig S. aureus, ned-settes ikke i bemerkelsesverdig grad ved nærvær i prøvemediet av blod i den tilstand det forekommer i legemet. En ganske liten nedsettelse av aktiviteten kan muligens forklares ved prøveorganismens kraftigere vekst i det relativt sterkt nærende medium inneholdende blod, skjønt E.129 er noe min-

dre stabilt i nærvær av naturlig blod («whole blood») enn i enkle bakteriologiske medier.

E.129's effektivitet in vivo kan sees fra forsøk med beskyttelse av mus, ved hvilke der ble erholdt de resultater som er angitt i nedenstående tabell 4a:

I disse forsøk ble den infiserende dose gitt ved intraperitonal injeksjon og be-handlingen ble utført med vandige suspen-sjoner av det antibiotiske middel, hvorved hver dose var 0,2 ml. Den første dose av det antibiotiske middel ble gitt 30 min. etter den infiserende dose, hvorpå der fulgte tre ytterligere doser etter henholdsvis 8 timer, 24 timer og 32 timer (fire doser i det hele).

Faste preparater med samme potensial (3000 enheter pr. mg) som den ovenfor an-vendte, hadde følgende giftighet:

Det sees at forsøkene viser at E. 129 absorberes fra tarmkanalen og at den kan anvendes oralt idet den da gir en terapeu-tisk konsentrasjon i forsøksdyrene, h) Kro-matografiske undersøkelser med E. 129 ga følgende resultater: Adskillelse ved papirkromatografi ble utført med filtrert kultur og delvis rensede konsentrater av E. 129, idet man brukte ut-vaskning i nedadgående strøm med nr. 1 papir ved 28° C. De følgende Rf-verdier ble observert: Med 1 %'s iseddik som vaskemiddel Rf = 0,64.

Med 3 %'s ammoniumkloridoppløsning

som vaskemiddel Rf = 0,65.

Med en blanding av metanol, aceton og vann (volumforhold 19 : 6: 75) som vaskemiddel Rf = 0,78.

( 2) Karakteristika for Streptomyces E. 129.

Streptomyces E. 129 ble isolert fra en jordbunnsprøve som var uttatt i en høyde på omkring 120 m over havets overflate nær byen Jeriko (Jordan). En porsjon av jordbunnsprøven ble fortynet betydelig med sterilt vann og like store prøver av suspen-sjonen ble innblandet i Bennetfs agar på petri-skåler. Etter inkubasjon ved 28° C i 5 døgn ble koloniene av aktinomyceter opp-samlet og vist seg å ha antibiotisk aktivitet ved dyrkning i ytterligere 5 døgn på overflaten av en potet-peptonagar. Skiver av agar som var skåret ut av kolonien ble så prøvet for aktivitet mot Staphylococcus aureus.

Dyrkning under neddykkede betingelser av porsjoner på 50 ml av forskjellige media i 250 ml koniske kolber ga utbytter av antibiotisk materiale i en periode på fra 1 til 4 dager. Den maksimale titer ble nådd meget raskt på omkring 24 til 36 log timer. Denne relativt raske utvikling er en av de karakteristiske trekk ved Streptomyces E. 129.

Streptomyces E.129 kan karakteriseres ved å undersøke naturen av denne organismes vekst på forskjellige organiske medier og dens evne til å nyttiggjøre forskjellige kullstoff-forbindelser, under de betingelser som er beskrevet av Pridham, T. G. og Gottlieb, D. (J. Bact., 1948, 56 (1), 107—114). Resultatene av slike undersøkelser er opp-ført i den følgende tabell 5a. Alle farveangivelser med store begynnel-sesbokstaver tilsvarer Ridgeway, Colour Standards & Nomenclature, Washington, 1912.

Alle notater er gjort ved observasjon etter tre døgns inkubasjon ved 28° C når ikke annet er spesielt angitt.

Det påpekes at de ovenfor angitte for-søk angående nyttiggjørelse av energikilder er utført under spesielle vekstbetingel-ser og at det forhold at aktinomyceten ikke nyttiggjør visse energikilder under de an-vendte forsøksbetingelser, ikke utelukker disse energikilders anvendelse under andre betingelser.

Mikroskopisk undersøkelse av Streptomyces E. 129 som er vokset på gelatinhin-ner, åpenbarer følgende karakteristika: Det primære mycelium viser meget fine monopodisk forgrenede hyfer, der er betydelig ulikhet i størrelse mellom hyfenes bredde i det primære og i det sekundære mycelium, og sporene utvikles i lange, rette og hovedsakelig ikke forgrenede kjeder samt er i alminnelighet ellipseformede med en størrelse på omkring 0,7|x x 0,5u.. Streptomyces E. 129's primære mycelium har en diameter på betydelig mindre enn 0,5^, mens det sekundære myceliums diameter er omkring 0,5jx.

Etter den veiledning angående artsbe-stemmelse som gis i Bergey's Manual of Determinative Bacteriology 6th Edition, er Streptomyces E. 129 noe lignende Streptomyces griseolus, men kan skilles fra sistnevnte art ved sammenligning av nyttig-gjørelsen av forskjellige kullstoff kilder som vist i følgende tabell 5b.

Når man følger det diagram for be-stemmelse av arter av antibiotikum-dan-nende isolater på basis av nyttiggjør eisen av kullstoff-forbindelser i et kjemisk definert medium som gis av Pridham, T.G. & Gottlieb, D., (lOc.cit.) side 113, er Streptomyces E. 129 en art av Nocordia, hva der klart nok ikke er logisk da dens vektska-rakteristika viser at Actlnomyceten tilhører familien Streptomyces av ordenen Actino-mycetales ifølge klassifikasjonen i Bergey's Manual of Determinative Bacteriology (6. utgave), side 938. Streptomyces E. 129 opp-føres derfor som en ny art.

( 3) Dyrkning av Streptomyces E. 129 for dannelse av E. 129 som råprodukt.

Det antibiotiske middel E. 129 dannes ved dyrkning under aerobe betingelser av passende stammer av organismen Streptomyces E. 129 på eller i medier som er av-passet til å understøtte denne organismes vekst. Disse medier er i sin alminnelighet av en type som er egnet for dyrkning av muggsopper av familien Streptomyces, og bør inneholde én eller flere kilder for assi-milerbart nitrogen, og kilde for kullstoff og energi, samt nærende salter. Dyrkningen utføres fortrinnsvis under aerobe og neddykkede betingelser.

Det foretrekkes i alminnelighet å bruke medier i hvilke kilden for nitrogen fore-ligger i form av komplekse, organiske materialer. Det er funnet at siktemel eller annet mel av bønner som søyabønner er tilfredsstillende, mens særlig havremel har vist seg å være i fremtredende grad fordelaktig for dette formål, særlig når det kom-pletteres med fiskemel eller kornstøpvæske.

Kilden for kullstoff og energi kan være en sukkerart som dekstrose, maltose, sukro-se (f. eks. brunt sukker) eller fortrinnsvis glykose, eller den kan i noen tilfelle fordelaktig være stivelse som allerede kan være tilstede i det organiske materiale som ut-gjør nitrogenkilden eller kan tilsettes dette.

Nærende salter må tilføres etter behov og det er funnet at anvendelse av de følg-ende salter enkeltvis eller i kombinasjon er fordelaktig: natriumklorid, magnesium-klorid, kaliumhydrogen-fosfat (K^HPCU og KH2PO4), kalsiumkarbonat og sulfater av magnesium, sink, ammonium, samt ferro-sulfat.

Eksempler på flere medier som er funnet å være egnet til undersøkelse av vekst av Streptomyces E. 129 så at der dannes det antibiotiske middel E. 129, gis i det følg-ende, utelukkende for. illustrerende formål. Det vil være klart for fagfolk at mange medier er egnet for dyrkning av E. 129 og egnede medier kan lett finnes ved forsøks-dyr kninger.

Ved å bruke de ovenfor angitte medier 4 og 8 har man oppnådd gode utbytter av E. 129 ved arbeide både i liten og i stor målestokk. For tiden foretrekkes det å bruke mediet 4 som er funnet for å gi meget gode resultater i 150 liters dyrkningstan-ker, skjønt dette medium sannsynligvis er mangelfullt (antagelig med hensyn til ni-trogeninnholdet) idet tilsetninger av korn-støpvæske og fiskemel har gitt økning av E. 129-aktiviteten ved dyrkninger i ryste-kolber.

Det er også funnet at forbedrede resultater, i særdeleshet forbedrede titere, oppnåes ved fremstilling av E. 129 ved dyrkning av en E. 129-produserende organisme, særlig Streptomyces E. 129 på eller i et passende medium, når mediet inneholder til-gjengelig lern i en konsentrasjon innen området fra 30 til 135 deler pr. million deler og fortrinnsvis innen området fra 35 til 55 deler pr. million deler. Jern i konsentrasjoner på over 135 deler pr. million deler begynner å vise en vesentlig hemmende virkning på organismens vekst.

Som angitt i det foregående foretrekkes det å fremstille E. 129 ved dyrkning un-

der neddykkede betingelser av en E. 129-produserende organisme i et nærende me-rium inneholdende en kompleks organisk kilde for nitrogen, som havremel, soyabøn-nemel, kornstøpvæske og lignende, et kull-hydrat og mineralsalter. Som kjent inneholder organiske materialer som de ovenfor nevnte kilder for nitrogen, ofte spor av jern, og dette må tas i beraktning når man beregner den mengde jern som skal tilsettes mediet i fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen. Det forholder seg imidlertid så at mange av de viktigere komplekse organiske kilder for nitrogen som anvendes ved dyrkning av mikroorganismer, inneholder omtrent samme mengde jern, dvs. fra 10 til 20 deler pr. million deler, så at en ytterligere mengde jern på minst 20 deler pr. million deler og ikke mer enn 115 deler pr. million deler i alminnelighet vil være tilfredsstillende. Når der brukes et organisk materiale hvis jerninnhold er meget forskjellig fra det nevnte, må selvfølgelig den mengde jern som tilsettes avpasses tilsvarende.

Naturen av kilden for det tilsatte jern synes ikke å være av betydning forutsatt at jernforbindelsen er oppløselig i dyrkningsmediet og er i det vesentlige ikke giftig overfor organismen samt forenelig med det resulterende antibiotiske middel. Der kan brukes jern både i toverdig og i tre-verdig tilstand. Der er funnet at egnede kilder for jern er ferricitrat, ferriklorid og ferroammoniumsulfat.

Det er kjent at kalksten (kalsiumkarbonat) danner chelater med jern. I visse av de medier som er brukt for fremstilling av E. 129 er kalksten anvendt som bestanddel sammen med jern, og tiltrots for det kjente forhold at kalksten sammen med jern danner chelater, erholdt man en økning i titeren.

Det er videre funnet at man oppnår en forbedret titer når kornstøpevæske brukes i medier inneholdende en kilde for kullhydrater. En særlig passende mengde korn-støpvæske er 0,4—0,9 % (beregnet på de faste stoffers vekt) av mediets vekt, fortrinnsvis 0,7 % beregnet på de faste stoffers vekt. Kornstøpvæsken brukes fortrinnsvis sammen med en annen kilde for nitrogen, særlig havremel, hvorved det fore-trukne mengdeforhold for havremel ligger innen området fra 1 til 5 %, fordelaktig 2,5 %.

Mengdeforholdet kornstøpvæske til oppløselige kullhydrater er også viktig for oppnåelsen av gode titere. Når således ingen bemerkelsesverdig forskjell i titer oppnåes i fravær av kornstøpvæske og under anvendelse av to medier som blant annet inneholder 0,5 henholdsvis 1,5 vekt% glykose, får man ved tilsetning av kornstøp-væske i en mengde på f. eks. 0,7 vekt%, beregnet på de faste stoffer til hvert medium, ikke bare en økning i titeren for hvert medium, men også en forbedret titer med mediet inneholdende 1,5 % glykose i sammenligning med det medium som bare inneholder 0,5 % glykose. Det synes derfor at korn-støpvæske sammen med en kilde for kullhydrater gir en synergistisk effekt.

Det er funnet at det i alminnelighet er å foretrekke å ha tilstede 1,5 % oppløselige kullhydrater, særlig glykose, når kornstøp-væske brukes.

Et medium som er funnet å være meget godt egnet for anvendelse for fremstilling av E. 129 inneholder siktemel fra havre (fortrinnsvis 2,5%), kalksten (fortrinnsvis 2,0 %) og glykose (fortrinnsvis 1,5 %) og som er innstillet på en pH-verdi på 6,8— 7,0 med f. eks. saltsyre, samt til hvilket der er tilsatt kornstøpvæske i et mengdeforhold som ovenfor angitt. Fortrinnsvis inneholder dette medium også tilsatt jern i et mengdeforhold som ovenfor angitt (fortrinnsvis 30 deler pr. million deler).

Dyrkningen bør fortrinnsvis utføres som en flertrinns-prosess på vanlig måte. Således kan en porsjon avskrapede sporer eller filtlignende myceliemasse av Streptomyces E. 129 erholdt fra en passende nærende agar, hensiktsmessig brukes til å ini-tiere et dyrkningstrinn i liten målestokk. En neddykket sporesuspensjon erholdt fra dette dyrkningstrinn kan om ønskes brukes direkte til å pode mediet for produksjon i stor målestokk, men det foretrekkes å bruke produktet fra det første dyrknings-stadium til podning i et utviklingstrinn. Mediet i dette trinn kan være det samme som det som brukes i det følgende trinn for produksjon i full målestokk, eller det kan modifiseres f. eks. ved å gjøres i sterkere grad nærende. Den frittvoksende og sporedannende vegetative kultur erholdt fra utviklingstrinnet, brukes derpå som podningsmiddel for mediet for produksjon i full målestokk. Det er funnet at tilfredsstillende resultater kan fåes ved å bruke dette vegetative podningsmiddel i et relativt mengdeforhold, f. eks. 2 % beregnet på hele produksjonsmediet.

Et karakteristisk trekk ved Streptomyces E. 129-dyrkninger er at den maksimale titer raskt inntreffer i 5- og 150-liters dyrkninger under anvendelse av de ovenfor angitte medier 4 og 8, inntraff dette maksi-mum etter mellom 16 og 28 timer.

I disse 150-liters dyrkninger var vek-

sten meget god, skjønt bare 2 % vegetativt podningsmiddel ble brukt, idet den maksimale titer ble nådd etter en dyrkningstid på 16 til 20 timer. En god titer kan hensiktsmessig defineres som et helt dyrk-ningsmedium som er i stand til å hemme Staphylococcus aureus ved fortynninger på 1 : 135 til 1 : 250 i forsøk med fortynning av

nærende media under anvendelse av inkubasjon ved 37° C i 18 timer.

Under dyrkning i 16 til 24 timer i 150-liters karene fant der ikke sted noen bemerkelsesverdig forandring i dyrkningsme-diets pH-verdi. I 5-liters dyrkninger under anvendelse av det ovenfor angitte medium 8, finner der sted en meget liten stigning av pH-verdien i dyrkningsmediet ved omkring 40 til 48 timer, dvs. pH-verdien øker til omkring 7,7.

Dyrkningen i havremel-mediet er karakteristisk ved dannelsen av et fremtredende gult pigment.

Det antibiotiske middel E. 129 kan på tilfredsstillende måte undersøkes ved den vanlige «cup-plate» teknikk, idet man bru-ker en passende Gram positiv prøveorga-nisme. Sarcina lutea er meget godt egnet på grunn av dens ytterst store følsomhet og mangel på patogene egenskaper. Fortynninger av det antibiotiske middel E. 129 og standardprøven for sammenligning (et delvis rent preparat av E. 129 med et på vilkårlig måte definert antall enheter) for-tynnes i en M/20 fosfatpufferoppløsning med pH-verdi 7,5 før de påføres under-søkelsesplaten, da det antibiotiske middels aktivitet med noen organismer øker med avtagende pH-verdi innen det område som tåles av prøveorganismen.

( 4) Isolering og rensning av E. 129.

Den antibiotiske E.129-aktivitet som frembringes ved dyrkning under neddykkede betingelser, synes å være tilstede hovedsakelig i oppløsningen og ikke i myceliet. Således er der under anvendelse av uttrekk erholdt fra medier 4 og 8 erholdt de følgende resultater:

Det er imidlertid å merke at disse observa-sjoner kan modifiseres noe ved anvendelse av andre og forskjellige dyrkningsmedier.

På grunn av denne kjennsgjerning er der utviklet flere ekstraksjonsmetoder bestemt til å utvinne den antibiotiske aktivitet fra filtrerte dyrkningsmedier, så at det antibiotiske middel isoleres fra forurensen-de materialer i myceliet og fra de hovedsakelig vannuoppløselige produkter fra dyrkningen.

En utvinningsmetode som er funnet å være tilfredsstillende omfatter ekstraksjon av den filtrerte kultur ved en pH-verdi på 7—9,5 med et ekstraksjonsmiddel for E.129 som ikke er blandbart med vann, som f. eks. benzen, etylacetat, butylacetat, kloroform eller n-butanol. Det antibiotiske middel E. 129 oppløses da i fasen bestående av det organiske oppløsningsmiddel som skilles fra den vandige fase på hvilken som helst hensiktsmessig måte. Det volum oppløs-ningsmiddel som kreves for en effektiv ekstraksjon, er avhengig av det oppløsnings-middel som brukes, men ekstraksjon med en volumdel oppløsningsmiddel lik volumet av den filtrerte kultur, er i alminnelighet tilstrekkelig til å fjerne nesten hele den antibiotiske aktivitet fra den vandige fase.

En annen metode omfatter adsorpsjon av E. 129 på syrevasket trekull, adskillelse av trekulladsorbatet fra den forbrukte kulturvæske og eluering av aktiviteten med oppløsningsmidler som 80 %'s aceton, sur, vandig aceton, n-butanol osv.

I en alternativ metode blir E. 129-aktiviteten adsorbert på magnesiumtrisilikat med påfølgende adskillelse av adsorbatet fra den forbrukte vandige kulturvæske og eluering med 80—100's vandig aceton.

Det er funnet at faste stoffer i form av råprodukter hensiktsmessig kan fremstilles av de således erholdte oppløsninger ved simpelthen å fjerne oppløsningsmidlene ved inndampning til tørrhet, fortrinnsvis i vakuum. Det er imidlertid fordelaktig å tørre ekstraktet over et avvanningsmiddel f. eks. vannfritt natriumsulfat, før denne inndampning utføres. Det på denne måte erholdte faste stoff er i alminnelighet brunlig gult farvet og er i det vensentlige oppløselig i etanol eller aceton, men ikke i noen bemerkelsesverdig grad i vann. Et bedre renset fast stoff kan erholdes ved å vaske disse tørre faste stoffer med et kull-vannstoff-oppløsningsmiddel i hvilket E. 129 er i det vesentlige uoppløselig, f. eks. lettpetroleum som fjerner noen inaktive forurensninger.

Et ytterligere rensningstrinn kan inn-

skytes når det antibiotiske middel er tilstede i et oppløsningsmiddel som ikke er blandbart med vann, f. eks. etylacetat, enten før eller etter adskillelsen av de urene faste stoffer. Dette rensningstrinn består i vaskning av oppløsningsmidlet med 0,01 n natriumbikarbonatoppløsning og 0,01 n saltsyre og vann, enten enkeltvis eller i den angitte følgerekke. De faste stoffer som erholdes fra oppløsninger som er vasket på denne måte har en lysere farve og et høyere potensial enn tilsvarende faste stoffer erholdt uten slike vaskninger.

I det følgende beskrives som eksempler noen utførelsesformer for oppfinnelsen. I disse vises fremstilling og isolering av E. 129 i det minste delvis renset tilstand.

Eksempel 1:

Dyrkning av Streptomyces E. 129 i labora-toriemålestokk for fremstilling av E. 129. 50 ml porsjoner av det ovenfor angitte medium III ble anbragt i 250 ml. Ehrlen-meyer-kolber og sterilisert ved 120° C i 20 minutter. Etter avkjøling ble kolbenes innhold podet med 2 ml av en 24 timers vegetativ vekst i Streptomyces E. 129. Det an-vendte podningsmedium var på forhånd dyrket i 50 ml's porsjoner av det nedenfor angitte sterile medium på et frem- og til-bakegående rysteapparat (175 svingninger pr. minutt, slaglengde 6,5 cm) ved 28° C.

Podningsmedium.

Dette medium ble podet med sporer av Streptomyces E. 129 erholdt fra overflaten av plater bestående av havremel, kalk, dekstrose og agar.

Kolbene inneholdende dyrkningsmediet ble inkubert ved 28° C i 48 timer under rystning. Etter forløpet av dette tidsrom hadde dyrkningskulturen en titer på 135 enheter pr. ml.

Eksempel 2:

Dyrkning i liten målestokk av Streptomyces E. 129 for fremstilling av E. 129.

Streptomyces E. 129- spovev ble fra en havremelkalk-dekstrose agarplate overført til 50 ml's porsjoner av sterilt utviklings-medium med følgende sammensetning:

Medium 9: ,

Mikroorganismen ble dyrket under neddykkede betingelser ved inkubasjon ved 28° C i 48 timer på et frem- og tilbakegå-ende rysteapparat med 6,5 slaglengde og med 175 svinger pr. minutt.

Podningsmedium fra flere av rystekolbene ble blandet under aseptiske betingelser og 75 ml av blandingen, likeledes under aseptiske betingelser, overført til 5 liters dyrkningskar med røreverk, hvert inneholdende 3 liter av det foran angitte medium 8 oppfyllt til 100 % med lednings-vann. pH-verdien ble innstillet på 6,4—6,6 med etsnatronoppløsning og det hele ble sterilisert i 75 minutter ved et trykk på 1,05 kg/cm-.

Etter avkjøling og podning ble 5 liters dyrkningskarene holdt på en temperatur på 28° C og deres innhold ble omrørt med en hastighet av 550 omdreininger pr. minutt. Innholdet ble luftet med steril luft som ble gjennomledet med en hastighet på 3 liter pr. minutt. Under dyrkningen og særlig under dens første 8 til 20 timer, var tilsetning av skumningshindrende midler nødvendig for å kunne opprettholde den ønskede hastighet av luftstrømmen. Dyrk-ningsmediets pH-verdi var 6,52 etter steri-lisering og under dyrkningsperioden (48 timer) steg den gradvis til 7,75.

Utbyttet av det antibiotiske middel E. 129 var maksimalt etter omkring 20 timer (ca. 200 til 300 enheter pr. ml) og falt til omkring 20 til 50 enheter pr. ml etter 48 timer.

Eksempel 3:

Dyrkning av Streptomyces E. 129 i forsøks-anlegg for fremstilling av E. 129.

Der ble fremstillet et vegetativt podningsmedium av Streptomyces E. 129 således som angitt i eksemplene 1 og 2.

Dette vegetative podningsmedium ble fra rystekolbene overført under aseptiske betingelser til 5 liters dyrkningskar hver inneholdende 3 liter av det i det foregående angitte medium 9. Dyrkningen ble utført i 25 timer ved 28° C, ved en omrøringshastig-het på 550 omdreininger pr. min. og gjennomledning av luft med en hastighet av 3 liter pr. min.

Kar inneholdende 150 liter av det følg-ende medium:

ble sterilisert i 45 minutter ved 120° C. Etter avkjøling ble dyrkningskarene tilsatt en steril oppløsning av dekstrose i slike mengdeforhold at den sluttelige dekstrose-konsentrasjon var 0,5 % (medium 4 angitt i det foregående).

Innholdet i disse kar ble så podet med 3 liter av det podningsmedium som var

fremstillet i 5 liters karene, således som angitt ovenfor.

Dyrkningen i disse kar ble utført ved 28° C, en omrøringshastighet med 350 omdreininger pr. min. og gjennomledning av luft med en hastighet på 113 liter pr. min. i de første 8 timer og 262 liter pr. min. i det følgende tidsrom. Dyrkningen var karakteristisk ved dannelsen av et fremtredende gult pigment.

Den maksimale titer ble nådd etter 16 til 24 timers dyrkning, avhengig av den nøyaktige vekst i hvert kar. Titerne var henholdsvis 252, 192, 270 og 258 enheter pr. ml i de fire dyrkningskar.

Eksempel 4:

Ekstraksjon av E. 129 fra kulturvæsken med oppløsningsmidler.

550 ml E.129-dyrkningskultur ble filtrert under anvendelse av kiselgur som fil-treringshjelpemiddel. Det resulterende fil-trat ble innstillet på en pH-verdi av 7,1 og ekstrahert med n-butanol i tre porsjoner, hver med et volum lik femteparten av kul-turvæskens volum. Butanolekstraktet ble under azeotropiske betingelser inndampet i vakuum under tilsetning av vann inntil alt butanol var fjernet. Den resulterende vandige suspensjon inneholdt 73% av den opprinnelige kulturvæskes aktivitet. Den gjenværende forbrukte kulturvæske viste ingen E.129-aktivitet.

Eksempel 5:

Ekstraksjon av E. 129 fra kulturvæske med oppløsning smidler og isolasjon av E. 129. 10 liter av en filtrert E.129-kulturvæske ble ekstrahert med halvparten av sitt volum etylacetat. Etylacetat-ekstraktet ble inndampet i vakuum til omkring 200 ml. Det ble derpå vasket med fem porsjoner 0,1 n natriumbikarbonat-oppløsnnig hver på 25 ml, 2 porsjoner 0,01 n saltsyre hver på 25 ml og to 25 ml's porsjoner vann. Ekstraktet ble derpå tørret over vannfritt natriumsulfat og oppløsningen inndampet til tørr-het i vakuum. Man fikk 350 mg fast stoff med orangebrun farve og dette materiale inneholdt 92 % av den opprinnelige filtrerte kulturvæskes aktivitet. Den følgende tabell ilustrerer forholdene ved denne ekstraksjon.

Eksempel 6:

Utvinning av E. 129 fra kulturvæske ved adsorpsjon på trekull.

I 2,45 liter filtrert E.129-kulturvæske ble suspendert 12,5 g syrevasket trekull av kvaliteten Sutcliffe Speakman 127W og 6 g kiselgur i 1 time. Trekullet ble derpå fra-skilt og eluert med 80 %'s vandig aceton, først med 250 ml og derpå med 200 ml. Man fikk de følgende resultater ved undersø-kelse av prøvene i sammenligning med den opprinnelige, filtrerte kulturvæske:

Eksempel 7:

Utvinning av E. 129 ved adsorpsjon og magnesiumtrisilikat. I 10 liter filtrert kulturvæske ble i en halv time utrørt 100 g magnesiumtrisilikat. Den resulterende blanding ble filtrert gjennom et kiselgur-sjikt og det faste stoff ble vasket med vann. Den aktive bestanddel ble derpå eluert fra adsorbatet med 1,5 liter ren aceton fulgt av 1 liter 80 %'s vandig aceton. De blandede eluater ble under va kuum og i vann inndampet, hvorved man fikk en fin suspensjon av det antibiotiske middel.

A. Eksempler som viser jernets virkning.

Eksempel 8:

I to sett dyrkningskar hvert bestående av fire 5 liters kar ble anbrakt basismediet med havremel og med 1,5 % glykose samt med 0,7 % kornstøpvæske, dvs.

I det ene sett dyrkningskar ble tilsatt ferricitrat i et mengdeforhold tilsvarende 60 deler pr. million deler. Hvert dyrkningskar ble podet med 2 % av en vegetativ kultur av Streptomyces E. 129 (dyrket på det ovenfor angitte havremelmedium uten tilsetning av kornstøpvæske og inneholdende bare 0,5% glykose). Mikroorganismen ble dyrket ved 27° C under gjennomledning av luft med en hastighet av 3 liter pr. minutt. Undersøkelser under anvendelse av Sarcina lutea ga følgende resultater uttrykt i enheter pr. ml:

Eksempel 9:

Jernets virkning ble undersøkt ytterligere under anvendelse av det samme medium og de samme betingelser som angitt i eksempel 8, men med jerninnhold på 30, 60 og 120 deler pr. million deler beregnet som jern. Også her ble jernet tilsatt i form av ferricitrat. Man fikk de følgende gjen-nomsnittlige titere (tre dyrkningskar i hvert sett):

Eksempel 10:

Man gikk frem som i eksempel 9 men under anvendelse av lavere jernkonsentra-sjoner, nemlig 15, 30 og 45 deler pr. million deler. Resultatene var følgende (gjennomsnitt av tre dyrkningsforsøk):

Eksempel 11:

For å forvisse seg om at forskjellige kilder for jern er like fordelaktig ble der forberedt tre sett, hvet bestående av fire dyrkningskar, således som angitt i eksemplene 8—10, men i alle ble der tilsatt 30 deler jern pr. million deler, idet der i ett sett ble brukt ferricitrat som i de foregående eksempler, i et annet sett ferriklorid og i det tredje sett ferro-ammonium-sulfat. Man fikk følgende resultater som gjennomsnitt for hvert sett:

Det er altså klart at hvilke som helst av disse salter kan brukes.

B. Eksempler som viser virkningen av kornstøpvæske.

Eksempel 12:

I hvert av tre 5-liters dyrkningskar blé anbrakt tre liter av følgende medium, idet mediets glykosebestanddel ble sterilisert separat:

Dessuten inneholdt dyrkningskarene faste stoffer fra kornstøpvæske i følgende mengdeforhold: 0,23% i det første dyrkningskar, 0,46 % i det annet og 0,70 % i det tredje. pH-verdien i hvert dyrkningskars innhold ble innstillet på 6,8—7,0 med na-triumhydroksyd.

Dyrkningen i hvert dyrkningskar ble utført ved 27—28° C og man fikk de føl-gende resultater:

Det sees at det minste innhold av korn-støpvæske ikke ga noen økning over den vanlige titer på 200—300 enheter pr. ml som etter hva erfaring har vist kan oppnås i basismediet. Derimot ga 0,46 og 0,70 % kornstøpvæske, beregnet som fast stoff, en vesentlig økning av titeren.

Eksempel 13:

For å bestemme den optimale verdi for innholdet av kornstøpvæske, ble der forberedt fire sett hver på tre 5-liters dyrkningskar inneholdende basismediet med havremel og med 1,5 % glykose. Til et sett ble tilsatt 0,45 % faste stoffer i kornstøp-væske, til det annet sett 0,7 %, til det tredje 0,9 % og til det fjerde 1,1 %. Dyrkningskarene ble podet og dyrkningen foretatt som angitt i det foregående. Resultatene angis i nedenstående tabell hvor hver verdi er gjennomsnittet for tre dyrkningskar:

Det er altså fra denne tabell åpenbart at 1,1 % faste stoffer i kornstøpvæske har en skadelig virkning på titeren og at 0,9 % er en rimelig maksimalverdi. C. Eksempel som viser glykosens virkning.

Eksempel 14:

Virkningen av ytterligere mengde glykose er her bestemt. 5-liters dyrkningskar inneholdende basismediet med havremel og med glykoseinnhold på 0,5 % og 1,5 %, samt dyrkningskar inneholdende samme medium plus 0,7 % faste stoffer i kornstøpvæske og likeledes 0,5 % og 1,5 % glykose ble forberedt, podet og dyrket som angitt i eksempel 12. Man fikk følgende resultater uttrykt i enheter pr. ml:

Det vil sees at bruken av 1,5 % glykose

i basismediet ikke gir noen bedre virkning enn 0,5 %, mens en vesentlig økning i titer oppnåes ved bruken av 1,5 % glykose når 0,7 % faste stoffer i kornstøpvæske også

er tilstede.

Eksempel 15:

Fremstilling av E. 129 i større målestokk. 378,5 1 av følgende medium ble podet med 800 ml av en aktivt voksende kultur av Streptomyces E. 129 fremstillet i rystekol-ber:

Mediet ble omrørt og tanken holdt på

27° C i 29 timer. Steril luft ble ledet gjennom med en hastighet av 17 1 pr. min. i de første åtte timer og deretter med en hastighet på 28 1 pr. min.

75,7—94,6 1 av den herved erholdte kul-

tur ble brukt til å pode 1883 1 av følgende medium i en tank:

Mediet ble omrørt og tanken holdt på

27° C i 20 timer. Der ble opprettholdt en luftstrøm gjennom mediet på 112 1 pr. min.

i de første åtte timer, 170 1 pr. min, i de påfølgende fire timer og deretter 198 1 pr. min.

757—941 1 av den herved erholdte kul-

tur ble brukt til i en tank å pode 18,83 m<:i >av følgende medium:

Mediet ble omrørt og tanken holdt på 27° C i 22 timer. Der ble opprettholdt en luftstrøm gjennom mediet på 5,64 m<:i> pr. min. i de første åtte timer og deretter på 12,73 m<:i> pr. min.

Dyrkningsmediet ble tilsatt kiselgur og myceliet fjernet ved filtrering på et va-kuumfilter forsynt med belegg av filtre-rende materiale. Filtratet ble derpå ekstrahert med etylacetat i motstrøm og i et tilnærmet forhold mellom kulturvæske og oppløsningsmiddel på 10 : 1. Man fikk i det hele 2,829 m:! etylacetat-ekstrakt som ble inndampet i vakuum ved omkring 25° C

til et volum på 294 1. Det erholdte konsentrat ble filtrert mettet med vann, vasket med 0,01 n saltsyre, derpå igjen med vann og tørret over natriumsulfat.

Det vaskede og tørrede konsentrat ble ytterligere inndampet i vakuum til et volum på 26,5 1. Under inndampingen skilte E.129 seg ut og ble frafiltrert i to porsjoner: Porsjon A: 1000 g, som viste 1,305 en heter/mg.

Porsjon B: 520 g, som viste 1,815 enheter/mg.

Filtratet ble tilsatt tre volumdeler petroleum (kokepunkt 100—120° C), hvorved man fikk: Porsjon C: 1540 g, som viste 2,565 en heter/mg.

Claims

Fremgangsmåte til fremstilling av et nytt antibiotisk middel, her betegnet E.129,

og som har følgende karakteristika: tilnærmet elementaranaiyse: 64% kullstoff, 7% hydrogen og 8 % nitrogen, lett oppløselig i metanol, etanol, butanol, aceton, metyl-isobutylketon, etylacetat, butylacetat, amylacetat, kloroform og benzen, mindre lett oppløselig i eter og vann og uoppløselig i petroleum, et nøytralt stoff som ikke danner salter med de vanlige syrer og heller ikke med de vanlige baser, er aktivt hovedsakelig mot Gram positive organismer, har en oppløselighet i vann på minst 0,2 mg/ml

ved 20° C, og har et absorpsjonsspektrum i det infrarøde område med karakteristiske absorpsjonsbånd ved 810 cm—<1>, 1058 cm—<1>, 1022 cm—<1> og 1575 cm—<1>, hvilke maksimas karakteristiske relative intensiteter er '810/ U022 større enn 0,5, <J>810/<T>1575 større enn 0,4, "1058/'1022 større enn 0,95, <1>1058/11575 større enn 0,7, karakterisert ved at man, eventuelt under submerse aerobe betingelser dyrker organismen Streptomyces 129 på

eller i et nærende medium for samme inneholdende en assimilerbar kilde for nitrogen,

en kilde for kullstoff og energi samt nærende salter og deretter utvinner det herved dannede antibiotiske middel fra kulturvæsken.