NO115429B - - Google Patents

Description

Fremgangsmåte til fremstilling av et nytt antibiotisk aktivt stoff ved hjelp av aktinomyceter av slekten Streptomyces.

Denne oppfinnelse angår en fremgangsmåte

til fremstilling av et nytt antibiotisk virksomt

stoff ved at man under gunstige betingelser

dyrker en mikroorganisme som nylig er blitt

oppdaget av ansøkerne.

Oppfinnelsen angår denne fremgangsmåte

til fremstilling av det nye antibiotikum, utvinning og konsentrering av dette fra fermen-teringsvæsken, samt rensing av antibiotikumet

og fremstilling av salter av det.

Den nye mikroorganisme som beskrives

nedenfor er klassifisert som en aktinomycet av

slekten Streptomyces. Hvis den nye mikroorga-nismes egenskaper studeres i forhold til Bergey's

«Manual of Determinative Bacteriology» (1948),

synes den å høre til gruppen IA6 av slekten

Streptomyces, som også omfatter artene Streptomyces erythreus. Den adskiller seg imidlertid så

meget fra den sist nevnte mikroorganisme at

den må klassifiseres som en annen art. Dyrk-ningsegenskapene av denne mikroorganisme,

som ansøkerne har kalt Streptomyces bottropensis,

er i tabell I sammenliknet med egenskapene av

et autentisk slag av Streptomyces erythreus

(Waksman og Curtis), som er erholdt fra «Cen-traal Bureau voor Sehimmelcultures» i Baarn,

Holland. I denne tabell er det vegetative

mycelium kalt «kolonien», mens det sporogene

mycelium er kalt «luft-mycelium».

Ansøkerne har funnet, at det ved hjelp av

Streptomyces bottropensis kan fremstilles et nytt

og meget egnet antibakterisk stoff, som både

med hensyn til sammensetning og antibiotiske

egenskaper er helt forskjellig fra andre hittil

kjente antibiotika, som oksytetracyklin, kloro-tetracyklin, kloramfenicol, erytromycin og karbomycin.

Det antibiotikum som oppfinnelsen gjelder fremstilles ved at man under passende betingelser dyrker Streptomyces bottropensis, hvis egenskaper beskrives nedenfor, og deretter fra kulturen utvinner det således dannede antibiotikum, som ansøkerne har kalt B-mycin, hvis egenskaper også blir beskrevet detaljert nedenfor.

Betegnelsen Streptomyces bottropensis er her ikke utelukkende begrenset til å gjelde aktinomyceter som uten variasjon og rigorøst svarer til den nedenfor gitte beskrivelse, men omfatter også alle beslektede slag av aktinomyceter som stort sett har de samme artsegenskaper og som produserer det antibiotiske B-mycin, og som kan betraktes som underarter, varieteter, raser, former, grupper av serologiske eller andre typer, varianter, faser, spontane mutanter, modifika-sjoner og liknende, av denne art. Det er klart, at dette også omfatter de mutanter av Streptomyces bottropensis som kan fås derav ved hjelp av midler eller stoffer som bevirker mutasjon, f. eks. bestråling eller behandling med toksiske stoffer.

De i parenteser angitte data i den oven-nevnte tabell er farger i henhold til «A Dictio-nary of Color» ved A. Maerz og M. Rea Paul, 2nen utgave 1950.

<*>) Betegnelsen Waksman med et nummer refererer til næringsmediets nummer som S. A. Waksman bruker i sin bok «The Actinomycetes», 1950. ;Den organisme som i henhold til oppfinnelsen anvendes for fremstilling av B-mycin, som angitt foran, må klassifiseres med aktinomyceter av slekten Streptomyces, og er ikke identiske med noen av de hittil beskrevne arter av Streptomyces. Den ble av ansøkerne isolert fra en prøve jord som var tatt i Ruhrdistriktet. ;På potet-agar gir den et blågrått forgrenet luftmycelium, som har korte, åpne spiraltvin-ninger. Disse spiraler er ikke tette, hvorfor den nyoppdagede Streptomyces bottropensis hører til gruppe 3 av klassifiseringen i henhold til Waksman og Henrici (se S. A. Waksman: «The Actinomycetes» 1950, page 30). Diameteren av luftmyceliet på potetagar varierer fra 0,6—1,2 ii. I det av Gram beskrevne slag viser myceliet en positiv reaksjon; i det av Ziehl-Neelsen beskrevne er det ikke syrefast. De dannede conidia har en diameter av 0,6—1,2 / i, mens deres lengde varierer fra 1 til 4 u. Sporenes form er som regel sylindrisk, stavliknende, men også elliptiske til nesten sfæriske former fore-kommer ved siden av noen få krumme former. ;Det nye antibiotikum, B-mycin som kan fås av kulturer av Streptomyces bottropensis er hovedsaklig aktivt mot de såkalte Gram-positive bakterier. I tabell II er det gitt en oversikt over B-mycins antibiotiske egenskaper, ;og den mengde B-mycin i mikrogram/ml ;næringsmedium som såvidt bevirker fullstendig ;vekststans for hver bakterietype er angitt. Av ;denne tabell fremgår den store aktivitet mot ;stafylokokker tydelig. Alle de undersøkte slag ;av disse bakterier skrev seg fra klinikker, og ;mange av dem var såkalt «totalt motstandsdyktig» slag, dvs. motstandsdyktig mot penicillin, streptomycin, klortetracyklin, oksytetracyklin og kloramfenikol. ;;Da den av fagfolk kjente opptreden i klinikker av stafylokokker som er motstandsdyk-tige begynner å anta en alarmerende karakter utgjør det nye antibiotikum B-mycin et verdi-fullt tilskudd til det antibiotiske materiale. B-mycins aktivitet in vitro mot mycobakterier, innbefattet de for mennesker patogene former, er også slående. B-mycin viser ikke noen «kryss-motstand» med karbomycin eller erytromycin. ;En annen viktig egenskap hos B-mycin er at dette stoff er overordentlig lite giftig, resor-beres tilfredsstillende i det dyriske legeme, og utskilles på normal måte. ;B-mycin er et hvitt amorft stoff av basisk karakter. Det er forholdsvis lite oppløslig i vann. Merkverdig nok løses det lettere i kaldt enn i varmt vann. I vann av 0°C løses 2,3 mg/ml, i vann av 30° C 1,3 mg/ml. På den annen side er B-mycin lett oppløslig i organiske oppløs-ningsmidler, som alkoholer (deriblant metanol, etanol, butanol, amylalkohol, cykloheksanol), estere (inkl. etylacetat, butylacetat, amylacetat), aromatiske kullvannstoffer (deriblant bensol, toluol, xylol), substituerte aromatiske kullvannstoffer (f. eks. klorbensol, nitrobensol), etere (f. eks. dietyleter, dioksan), ketoner (som aceton, metylisobutylketon), og enn videre i kloroform, tetra klorkullstoffmog dikloretan. I alifatiske kullvannstoffer, som pen tan, cykloheksan og liknende, er derimot stoffet lite oppløslig. ;Stoffet B-mycin er meget stabilt, både fast, tørr form og i vandig oppløsning. Således kan en vandig oppløsning med pH 2,0—9,0 opp-hetes i 15 minutter ved 90 ° C uten å miste sin biologiske aktivitet. Hvis opphetningstiden for-lenges finner man at oppløsningen er mere stabil i pH-området 2,0—7,0 enn i et alkalisk medium. ;B-mycins smelte- eller spaltningstempera-tur er 143—155° C, og den spesifikke dreining ~ ~f20 a j-) er ~ 14,2° i en 5%'s oppløsning i 96%'s etanol. ;Stoffets molekylvekt er ca. 770. Dets sann-synlige empiriske formel er C38H£7-H0N7O7-sS. En elementæranalyse ga: C = 59,58%, H 7,69%, N 12,79%, S 4,20% og O 15,74% (ved differanse). ;Ved undersøkelse av det ultrafiolette ab-sorpsjonsspektrum ble det funnet at B-mycin gir et absorpsjonsmaksimum ved 2030 Å og en «skulder» ved ca. 2400 Å. I det infrarøde spektrum ble det målt følgende absorpsjons-bånd ved anvendelse av en suspensjon av B-mycin i nujol (fig. I) resp. heksaklorbutadien (fig. II), i resiproke centimeter): 3333 (temmelig sterkt), 2985 (temmelig sterkt), 1739 (temmelig sterkt), 1650 (meget sterkt), 1502 (svakt), 1366 (svakt), 1312 (svakt), 1258 (temmelig sterkt), 1171 (svakt), 1145 (svakt), 1119 (svakt), 976 (svakt), 806—800 (svakt). ;B-mycin kan adsorberes på forskjellige adsorpsjonsmidler, f. eks. på aktivert kullstoff, fra hvilket det kan elueres, f. eks. ved hjelp av en blanding av aceton og saltsyre. Det foregår ingen absorpsjon på aluminium-hydroksyd eller på cellulosepulver. ;Svakt sure ioneutvekslere, som Amberlite IR-C 50, hadde for liten kapasitet til å kunne anvendes for adsorpsjon av B-mycin. Derimot forener B-mycin seg med den sterkt sure ione-utveksler Amberlite IR-120. Fra denne type av ioneutvekslere kan stoffet elueres med en 10%'s oppløsning av vanlig salt. ;Magnesiumsilikater, som «Magnesol» (Dixon Trading Corporation) og «Florisil» (Floridin Company) er egnede adsorpsjonsmidler for B-mycin. B-mycin som er adsorbert på «Magnesol» kan elueres med en blanding av bensol og metanol. ;I henhold til en spesifikk utførelsesform av oppfinnelsen nyttes med fordel «Florisil»s ab-sorberende egenskaper. Ved hjelp av en kro-matografisk søyle av dette stoff kan det oppnås en særlig god atskillelse mellom B-mycin og forurensningene fra kulturmediet. ;Ved kromatografi med papir viste det seg at ved anvendelse av Eaton-Dikeman papir No. H.613 ved 26° C og et elueringsmiddel som besto av vannmettet butanol med 2,5% eddiksyre var B-mycins Rf-verdi ca. 0,94. ;Det skal her bemerkes, at det er kjent i og for seg å rense antibiotika ved kromatografering. ;Som basisk stoff kan B-mycin danne salter med forskjellige anorganiske og organiske syrer, som klorvannstoffsyre, svovelsyre, fosforsyre, eddiksyre, fenyleddiksyre (smp. 125—127° C), 3-nitro-ftalsyre (smp. 153—155° C), salicylsyre, acetyl-salicylsyre (smp. 142—145° C), p-amino-salicylsyre, 3,5-dibromsalicylsyre, 3,5-dinitro-salicylsyre (sm.p. 162—163° C), 3,5-dibrom-4-aminosalicylsyre (sm.p. 159—160°C), pikrin-syre (sm.p. 158—163 °C), bensolsyre (sm.p. 130 —132° C), 3,5-dinitrobensoesyre, penicillin og antranilsyre (sm.p. 133—135° C). ;Mange av disse salter erholdtes i krystallinsk tilstand. Deres fremstilling og rensing blir beskrevet nærmere nedenfor. ;Den nyoppdagede aktinomycet Streptomyces bottropensis er utmerket egnet for fremstilling av det nye antibiotiske B-mycin. For dette formål blir Streptomyces bottropensis dyrket aerobt, enten i stasjonære kulturer eller neddyrket i et flytende næringsmedium under sterile betingelser i lukkede beholdere, som er utstyrt med røreverk og til hvilke det for luft-ning kan tilledes sterilt surstoff eller luft. ;Dyrkningstiden, -temperaturer og andre betingelser som må overholdes for å gi gode utbytter av antibiotika blir diskutert mere detaljert nedenfor. ;Næringsmediet skal inneholde en kilde for kullstoff og en kilde for organisk og/ellei anorganisk kvelstoff, og også tilstedeværelse a-v mineralsalter, som fosfater, kalium- og natrium-salter og spor av mange salter, er ønskelig. Ofte er imidlertid de grunnmaterialer som brukes for fremstillingen av næringsmediet tilstrekkelig forurenset med disse mineralsalter, slik at spesiell tilsetning av disse ikke er nødvendig. ;Som kullstoffkilde kan det anvendes såvel oppløslige som uoppløslige kullhydrater, f. eks. glykose, sakkarose, laktose eller stivelse. Også sukkeralkoholer, f. eks. glyserin, er egnet. Mengden av kullstoffholdig materiale i mediet kan variere betydelig alt etter arten av det anvendte kullvannstoff og de ytterligere be-standdeler av mediet; som regel ligger mengden mellom 0,5 og 5% av mediets vekt. Som kvelstoffkilde kan det brukes mange forskjellige slags stoffer. Blant disse kan det nevnes hydrolysert eller ikke hydrolysert kasein, mais-støpvæske, pepton, kjøttsuppe, soyabønnemel, ;peanøttmel, fiskemel og nitrater. Valget av kvelstoffkilde vil stort sett avhenge av mediets ;videre sammensetning som igjen velges slik at ;antibiotiket kan fremstilles på den mest økonomiske måte. Små mengder av kvelstoffholdige basiske stoffer, f. eks. gjærekstrakter, oppløste destillater og oppløslige deler av fisk, osv. gir i visse medier et betydelig utbytte av antibiotika. ;Fermenteringens varighet er i stor grad avhengig av næringsmediets sammensetning. Som regel varierer den mellom 72 og 168 timer, men hvis det ønskes kan fermenteringen fort-sette i en lengre periode, hvis det derved opp-nådde økede utbytte av antibiotikum rettferdig-gjør den større utgift som en lengre fermen-teringsperiode medfører. ;Fermenteringstemperaturen ligger prinsipi-elt mellom 20 og 35° C. Fortrinsvis anvendes det 26—28° C. ;For at det skal oppnås optimal vekst av organismen og optimalt utbytte av antibiotikumet er det nødvendig at pH holdes innenfor temmelig snevre grenser, spesielt i den første fase av fermenteringen, f. eks. mellom 5,0 og 8,0. Etter steriliseringen innstilles næringsmediets pH på mellom 6 og 7. Fortrinsvis foretas fermenteringen ved en pH mellom 6,5 og 8,0 idet forsøk har vist at de største utbytter ;oppnås ved denne verdi. Den anvendte pH kan ;holdes konstant under fermenteringen ved at det med regelmessige mellomrom tilsettes sterilt alkalihydroksyd eller steril syre. Som regel anvendes kalsiumkarbonat, i mengder som f. eks. varierer mellom 0,2 og 1,0 vekts-% av mediet, som puffer for oppløsningen. ;Mengden av steril luft som innføres under fermenteringen er i høy grad avhengig av be-holderens form, omrøringshastigheten og røre-verkets form. Som regel benyttes det mellom 0,5 og 4 liter luft pr. liter næringsmiddelmedium pr. minutt. ;Det inokuleringsmateriale som fortrinsvis anvendes, i hovedfermenteringsbeholderen består av 48 til 72 timer gamle forkulturer av Streptomyces bottropensis. For å oppnå gode utbytter og unngå varierende resultater skjer inokuler-ingen fortrinsvis med kulturmengder som svarer til 3—6 volum-% av næringsmediet i hovedfermenteringsbeholderen. Det er klart, at hvis det anvendes store fermenteringsbeholdere må det benyttes flere trinn av for-kulturer. Det er imidlertid også mulig å lagre en porsjon av kulturen, f. eks. 10%, i hovedfermenteringsbeholderen, for start av en ny kultur. Hele fermenteringen kan også utføres kontinuerlig. ;B-mycinet kan isoleres fra kulturmediet på mange helt forskjellige måter. I henhold til oppfinnelsen kan man med fordel utnytte anti-biotikumets gode oppløslighet i de fleste organiske oppløsningsmidler, og dets basiske evner og evner til saltdannelse. Etter at myeeliet er fjernet blir det klare kulturmediet ekstrahert ved pH 7,0 eller høyere med et organisk opp-løsningsmiddel som er lite eller ikke blandbart med vann. Som regel vil valget av et sådant middel bestemmes av økonomiske hensyn. Egnede ekstraksjonsmidler er for eksempel butylacetat og dietyleter. På denne måte fås det en oppløsning av B-mycin i et organisk oppløsningsmiddel. Denne oppløsning blir deretter, om nødvendig etter konsentrering og rensing, ekstrahert med en vandig pufferopp-løsning av pH = 1,0—4,0. fortrinsvis ca. 2.0, som består av 1 mol H3P04 hvis pH er regulert til 2,0 med en oppløsning av natriumhydroksyd, hvoretter stoffet i form av et salt går inn i det vandige lag. Volumene av det organiske opp-løsningsmiddel og av pufferoppløsningen velges slik at det oppnås såvel en konsentrering som en rensing av det aktive stoff. ;Når man deretter gjør den vandige opp-løsning alkalisk, kan det aktive stoff atter tas opp i et organisk oppløsningsmiddel. Når det på denne måte er blitt oppnådd tilstrekkelig rensing og konsentrering kan stoffet felles ut, idet man nytter dets lille oppløslighet i vann ved pH = 7,0—9,0. ;I eri foretrukken rensemetode blir det rå antibiotikum absorbert i en søyle av Florisil og deretter eluert fraksjonært. Denne eluering kan med fordel foretas ved hjelp av en blanding av kloroform og alkohol. En slik blanding som inneholder 5—10%, fortrinsvis 7,5%, etanol er meget tilfredsstillende. På denne måte kan det fås rent B-mycin. ;I en annen isoleringsmetode i henhold til oppfinnelsen nyttes B-mycinets evne til å danne salter med organiske syrer. Til dette egner seg særlig derivater av bensoesyre som er substituert i den aromatiske kjerne, f. eks. 3,5-dinitrobensoesyre, salicylsyre, p-amino-salicylsyre og 3,5-dibromsalicylsyre, som danner krystallinske salter med B-mycin. En oppløsning av de oven-nevnte syrer eller salter derav blir da, om ønsket etter rensing og konsentrering, satt til en ekstrakt av kulturmediet som inneholder B-mycin. Den derved erholdte krystallinske utfelling renses ved omkrystallisering fra passende opp-løsningsmidler. De erholdte rensede salter har fullstendig biologisk aktivitet. Ved spaltning med sure eller alkaliske midler kan B-mycinet utvinnes av disse salter. ;En spesielt viktig forbindelse som kan fremstilles i henhold ti) oppfinnelsen er det ovenfor nevnte salt av B-mycin med penicillin. Det fås f. eks. ved dobbeltomsetning mellom B-mycinfosfat og natrium-penicillin, eller ved å la en oppløsning av B-mycin i et organisk oppløsningsmiddel reagere med penicillin, som likeledes er oppløst i et organisk7 oppløsnings-middel. Det kan anvendes forskjellige penicillin-slag, f. eks. penicillin, K, F, O og G. Den krystallinske forbindelse av B-myciri og penicillin G smelter ved 157—159° C (under spaltning) og er lite oppløslig i vann. Dette stoff kan i vandig suspensjon injiseres intrariiuskulært eller subkutant, og gir da en forlenget virkning, både hva egenskapene av antibiotiket penicillin og B-mycin angår. Den terapeutiske betydning av dette preparat kan ved fortsatte kliniske anvendelser vise seg å være av stor verdi, spesielt når preparatet betraktes i lys av de undersøkelser som er gjort om visse mikro-organismers, spesielt stafylokokkers, økede mot-standsevne (smlgn. f. eks. Proe. Soc. Exptl. Biol.Med. 82 (1953) 124—31). ;Oppfinnelsen belyses ytterligere ved de følgende eksempler. ;Eksempel I. ;Fremstilling av inokuleringskulturen. ;Fra et rør som inneholder en kultur av Streptomyces bottropensis på eksémpelvis Emer-son^ agar, på hvilken en god sporedanrielse har funnet sted. overføres det sterilt små mengder av conidia til rysteflasker av ca. 2 liters kapasitet, i hvilke det er anbrakt 500 ml av et flytende næringsmedium. Dette medium består av: ;Etter inkubering og kontinuerlig rysting ved 26<0> C i 48 timer er kulturen egnet til å inokuleres i hovedfermenteringsmediet. ;Eksempel II. ;Dannelse av B- mycin. ;1 liter inokuleringskultur, som er fremstilt i henhold til eksempel I, innføres sterilt i en fermenteringsbeholder som er utstyrt med et røreverk og en anordning til innblåsing av steril luft, og som inneholder 15 liter kulturmedium av følgende sammensetning: ;Etter 120 timers inkubering ved 27° C under stadig lufting og omrøring er det dannet 120 mikrogram B-mycin pr. ml kulturmedium. ;Andre medier som gir utbytter av samme størrelsesorden er følgende: ;A. ;;Med dette medium erholdtes 135 mikrogram B-mycin pr. ml fermenteringsvæske ved inokulering av 4% og inkubering og lufting i 144 timer ved 26° C. ;B. ;;Med dette medium erholdtes 105 mikrogram B-mycin pr. ml fermenteringsvæske ved inokulering med 6% og inkubering og lufting i 120 timer ved 26° C. ;C. ;;Ved inokulering av kulturen med 5% av dette medium erholdtes 95 mikrogram B-mycin pr. ml fermenteringsvæske ved inkubering og lufting i 168 timer ved 26° C. ;Eksempel III. ;Isolering og utvinning av rått B- mycin. ;Det ble filtrert 60 1 kulturmedium. hvis fermentering var avsluttet og som inneholdt 100 mikrogram B-mycin pr. ml ved hjelp av et flltreringsstoff (Hyflo 1,2 kg). Filtratet ble ved pH = 7,8 ekstrahert med 8,7 liter butylacetat (ekstrakt I). Deretter ble denne ekstrakt i vakuum inndampet til 2,7 liter (ekstrakt II) Derpå ble den rystet med 0.4 1 fosfatpufferopp-løsning av pH = 2,0, som var fremstilt ved å sette en natriumhydroksydoppløsning til en 0,1 mol oppløsning av fosforsyre. Det aktive stoff går da over i det vandige lag (ekstrakt III). Denne oppløsnings pH ble innstilt på 9,0 med konsentrert natriumhydroksydoppløsning, deretter ble den ekstrahert med 100 ml eter (ekstrakt IV) og til slutt rystet med 250 ml fosfat-pufferoppløsning av pH = 2,0 (ekstrakt V). Ved alkalisering til pH 9,0 falt det fremdeles uren B-mycin ut. Vekten var 8,4 g og antallet av mikrogram aktivt stoff pr. mg var 515. Iso-leringsutbyttet var altså 72% beregnet på mengden av aktivt stoff i kulturmediet hvis fermentering var ferdig. ;Eksempel IV. ;Rensing av det rå B- mycin. ;8 g av det etter eksempel III erholdte rå antibiotikum ble løst opp i 45 ml kloroform og ledet gjennom en søyle av aluminiumoksyd (diameter; 1,0 cm, høyde 10 cm). Søylen ble vasket med 5 ml kloroform. ;Den perkolerte væske ble deretter ført gjennom en søyle av Florisil (diameter 2,7 cm. høyde 28 cm, vekt av adsorpsjonsmiddel 83 g). ;Den perkolerte væske inneholdt ikke noe aktivt stoff. Antibiotikumet ble deretter eluert fra Florisilet ved hjelp av en blanding av kloroform og 7,5% etanol. Eluatet ble oppsamlet som 6 fraksjoner. Under elueringen opptrådete det like overfor det hvite adsorpsjonsstoff tre gule til brune bånd, som beveget seg langsomt ned-over. Etter at det første eluat var oppsamlet hadde det nederste bånd nettopp nådd bunnen av søylen. Etter eluatfraksjon nr. 2 var dette bånd vasket bort. Etter at eluatfraksjon nr. 3 hadde perkolert var det midtre bånd nettopp forsvunnet fra søylen. Under elueringen med fraksjon nr. 4 ble det tredje bånd forskjøvet til bunnen av søylen. Eluat nr. 5 inneholdt den største del av dette bånd. Det aktive stoff var fordelt på følgende måte i eluatene: ;Eluat nr: ;0 80 ml 1 100 ml, som ikke inneholdt noe aktivt stoff. 2 12 ml, som bare inneholdt spor av det aktive stoff. 3 10 ml, som inneholdt ca. 2% av det aktive stoff. 4 60 ml, som inneholdt ca. 60% av det aktive stoff. 5 20 ml, som inneholdt ca. 10% av det aktive stoff. 6 150 ml. som inneholdt ca. 25% av det aktive stoff. ;Etter syring med 0,1 n svovelsyre ble eluatene befridd for organisk oppløsningsmiddel i vakuum. I de gjenblivende væsker ble det aktive stoff utfelt ved alkalisering til pH = 9,0. Fra det fjerde eluat ble det utvunnet 2,1 mg rent B-mycin, et hvitt amorft stoff, som inneholdt ca. 1000 mikrogram aktivt stoff pr. mg. Smelte-(spaltnings-)området var 142—153 ° C. ;Eksempel V. ;Rensing av det rå B- mycin. ;7,4 g rått B-mycin, med en aktivitet av ca. 900 mikrogram pr. mg, ble løst opp i ,20 ml butylacetat. Etter filtrering ble det tilsatt 1,54 g p-aminosalicylsyre oppløst i 50 ml butylacetat. Etter 24 timers henstand ved romtempe-ratur ble den dannede utfelling filtrert fra. Etter tørking veiet det faste stoff 6,57 g. Etter lagring i iskasse ble det ytterligere erholdt 546 mg, slik at det samlede utbytte ble 79,6%. For videre rensing ble det først erholdte produkt omkrystallisert fra 170 ml butylacetat. Det erholdtes da 3,1 g av et krystallinsk salt som smeltet ved 180—182° C. Dette salts aktivitet var ca. 830 mikrogram pr. mg. En elementær - ånalyse av p-amino-salicylsyresaltet av B-mycin ga følgende resultat: C = 59,77%, H = 7,11%, N = 12,25%, S = 3,64% og O = 17,23% (ved differanse). ;Av dette rene salt ble 1,674 g suspendert i 100 ml vann, på hvilket det var blitt helt 100 ml eter. pH ble regulert til 11,0 med natriumhyd-roksydoppløsning under omrøring. Etter kraftig rysting bis eterlaget skilt fra. Det vandige lag ble ekstrahert to ganger til, med 50 ml eter. Etter tørking ble eteroppløsningen dampet inn og man fikk en hvit, amorf rest som veiet 0,75 g og hadde et smelte-(spaltnings)område av 143—155° C. I henhold til mikrobiologisk undersøkelse inneholdt dette produkt ca. 1000 mikrogram B-mycin pr. mg. ;Eksempel VI. ;Fremstilling av salicylatet av B- mycin. ;7,4 g rått B-mycin, med en aktivitet av ca. 900 mikrogram pr. mg, ble løst opp i 20 ml ;butylacetat. Etter filtrering ble det tiisatt en oppløsning av 1,38 g salicylsyre i 20 ml butylacetat. Etter noen tids henstand ved romtem-peratur begynte salicylat av B-mycin å falle ut. ;Etter 24 timers henstand ved 5° C ble stoffet filtrert fra og tørket. Vekten var 7,35 g. Dette salt ble omkrystallisert fra 40 ml butylacetat. Man fikk da 5,2 g av et hvitt, krystallinsk produkt som smeltet ved 160—161° C. Aktiviteten var ca. 850 mikrogram pr. mg. Elementæranalyse ga: C = 59,93%, H = 7,11%, N = 11,08%, S = 3,72% og O = 18,16% (ved differanse). ;Eksempel VII. ;Fremstilling av 3, 5- dinitrdbensoatet av B- mycin. ;7,4 g rått B-mycin, med en aktivitet av ca. 900 mikrogram pr. mg, ble løst opp i 20 ml butylacetat. Etter filtrering ble det tilsatt en oppløsning av 2,11 g 3,5-dinitrobensoesyre i 70 ml butylacetat. Etter noen få dagers henstand ble det filtrert fra 3,3 g lyst gulfargét krystallinsk salt. Dette produkt ble omkrystallisert fra 35 ml butylacetat. ;Man fikk 1,6 g 3,5-dinitrobensoat av B-mycin. Smeltepunktet var 158—160° C. Aktiviteten var ca. 780 mikrogram pr. mg. Elemen-tæranalysen ga: C = 56,25%, H = 6,7%, N = 12,43%, S = 2,90% og O = 21,72% (ved differanse). ;Eksempel VIII. ;Isolering av B- mycin over p- aminosalicylatet. ;Av den vandige oppløsning av B-mycin i fosfatpufferoppløsning av pH = 2,0 (ekstrakt ;III), som var fått etter eks. III, ble 100 ml (1,2 g B-mycin) regulert til pH = 9,1 med 3%'s natriumhydroksydoppløsning og rystet tre ganger med ialt 30 ml butylacetat. Etter tørk-ing med natriumsulfat ble det til denne opp-løsning satt 0,3 g p-aminosalicylsyre oppløst i 10 ml butylacetat. ;Etter noen tids henstand fant krystallisa-sjon sted. Man fikk 0,95 g av et brunfarget produkt som inneholdt ca. 810 mikrogram B-mycin pr. mg. Ved gjentatt omkrystallisering fra butylacetat erholdtes 0,52 g rent p-amino-salicylat av B-mycin. ;Eksempel IX. ;Isolering av B- mycin over p- aminosalicylatet. ;Til 25 ml ekstrakt IV, erholdt ifølge eks. ;III, som inneholdt 1,15 g B-mycin oppløst i eter, ble det satt 0,3 g p-aminosalicylsyre opp-løst i 35 ml eter. Etter 24 timers henstand ved 5° C ble de dannede krystaller filtrert fra. Vekten var 0,7 g, aktiviteten ca. 800 mikrogram B-mycin pr. mg. Ved omkrystallisering fra butylacetat erholdtes 0,4 g rent p-amino-salicylat av B-mycin. ;Eksempel X. ;Fremstilling av 3, 5- dibromsalicylat av B- mycin. ;Til 0,74 g rent B-mycin oppløst i 2 ml butylacetat ble det satt en oppløsning av 0,3 g 3,5-dibromsalicylsyre i 10 ml butylacetat. Etter noen få timer skilte det seg ut et hvitt krystallinsk stoff. Vekten var 0,83 g. Etter omkrystallisering fra butylacetat var smeltepunktet 171—172° C. Stoffets aktivitet var ca. 720 mikrogram pr. mg. En elementæranalyse av 3,5-dibrom-salicylatet av B-mycin ga følgende resultat: C = 51,28%, H = 5,98%, N = 9,32%, S = 3,04%, Br = 15,19% og O = 15,19% (ved differanse). ;Eksempel XI. ;Fremstilling av B- mycin- acetat. ;0,74 g rent B-mycin ble løst opp i 2 ml butylacetat. Hertil ble det satt 0,72 g eddiksyre (98%'s) oppløst i 5 ml butylacetat, hvorved det spontant dannet seg en hvit utfelling. Etter 12 timers henstand ved 5° C ble dette salt filtrert fra og løst opp i 8 ml varmt butylacetat. Etter avkjøling falt 0,35 g B-mycin-acetat ut. Stoffet er amorft, lite oppløslig i vann, og har et smelte-(spaltnings)område av 138—148° C. ;Eksem, pel XII. ;Fremstilling av klorhydratet av B- mycin. ;5 g rent B-mycin ble løst opp i 2 1 eter. Klorvannstoffgass ble ledet inn i denne opp-løsning inntil det ikke lenger dannet seg noen utfelning. Deretter ble eteren dampet av, resten tatt opp noen få ganger i etanol for å fjerne overskuddet av klorvannstoff, og derpå ble etanolen dampet bort. Til slutt ble stoffet på nytt løst opp i etanol, filtrert og felt ved hjelp av eter. Denne behandling ble gjentatt en gang, hvoretter stoffet ble tørket. ;Det således erholdte klorhydrat av B-mycin (3,5 g) er et fløtefarget amorft stoff, som er lite oppløslig i vann og har et smelte-(spaltnings-) område av 190—210° C. Elementæranalyse ga: C = 57,28%, H = 7,42%, N = 12,35%, S = 3,73%, Cl = 4,75% og O = 14,52% (ved differanse). ;Eksempel XIII. ;Fremstilling av sulfatet av B- mycin. ;1,48 g rent B-mycin ble løst opp i 4 ml butylacetat. Til denne oppløsning ble det suksessivt satt 40 ml eter og noen få dråper ;konsentrert svovelsyre. Utfellingen ble filtrert fra, vasket med eter og tørket. Produktet ble renset ved flere ganger å løses opp i 20 ml etanol og etter filtrering å felles ut igjen med eter. Tilslutt erholdtes etter frafiltrering og tørking 1,02 g svovelsurt salt av B-mycin. Det er et amorft stoff, som er fløtefarget og mere oppløslig i vann enn klorhydratet er. Smelte-(spaltnings-)området er 189—196° C. ;Eksempel XIV. ;Fremstilling av fosfatet av B- mycin. ;På samme måte som i eks. XIII erholdtes fosforsyresaltet av B-mycin av 1,48 g rent B-mycin ved hjelp av fosforsyre. Det er et fløtefarget, amorft stoff, som er temmelig lett oppløslig i vann og har et smelte-(spaltnings-) område av 174—178° C. ;Eksempel XV. ;Fremstilling av p- aminosalicylatet, av B- mycin. ;1,0 g B-mycin-fosfat ble ved svak opp-varming løst opp i 20 ml vann til hvilket det var blitt satt ca. 20% etanol. Til denne opp-løsning ble det satt 0,25 g natriumsalt av p-aminosalicylsyre, oppløst i 5 ml vann. Straks ;falt p-aminosalicylatet av B-mycin ut. Etter ;tørking var vekten 0,89 g. Stoffet ble omkrystallisert fra butylacetat. Det erholdtes 0,55 g rent salt, som hadde et smeltepunkt av 180 —182° C. ;Eksempel XVI. ;Fremstilling av bensylpenicillatet av B- mycin. ;0,75 g rent natriumpenicillin G (1640 en-heter pr. mg) ble løst opp i 5 ml vann av 0° C. Under omrøring og avkjøling ble denne opp-løsnings pH omhyggelig innstilt på pH = 2,0 med 2 n fosforsyre, og deretter rystet to ganger, hver gang med 5 ml, butylacetatet som var avkjølt tii 0° C. Ekstrakten ble tørket en kort tid med natriumsulfat og etter fjernelse av sistnevnte stoff satt til en oppløsning av 1,48 g rent B-mycin i 5 ml butylacetat. Det spontant utfelte, delvis krystallinske salt av B-mycin og penicillin G ble filtrert fra etter noen tids henstand, vasket med butylacetat og tørket. Vekten var 1,83 g. Stoffet ble renset ved omkrystallisering fra etylacetat. På denne måte fikk man 1,2 g rent salt av B-mycin med penicillin G. Det hvite, krystallinske stoff smelter ved 157 —159°C (under spaltning). En elementæranalyse ga følgende resultat: C = 59,35%, H = 7,10%, N = 11,50%, S = 5,76%, og O = 16,29% (ved differanse). ;Eksempel XVII. ;Fremstilling av bensoatet av B- mycin. ;Til 0,74 g rent B-mycin oppløst i 2 ml ;butylacetat ble det satt en oppløsning av 0,132 g ;bensoesyre i 2 ml butylacetat. Etter noen få ;timer var det fremkommet en hvit, amorf utfelling. Vekten var 0,70 g. Produktet ble løst ;opp i 6 ml varmt butylacetat. Etter avkjøling ;erholdes en utfelling av 0,15 g av et hvitt ;amorft stoff. Smeltepunktet var 130—132° C, ;under spaltning. Stoffets aktivitet var ca. 870 ;mikrogram pr. mg. ;Eksempel XVIII. ;Rensing av del rå B- mycin. ;50 g rått B-mycin, med en aktivitet av ;ca. 800 mikrogram pr. mg, ble løst opp i 125 ml ;butylacetat. Etter filtrering ble det tilsatt 1,5 1 ;dietyleter. Den dannede utfelling ble filtrert fra ;og kastet, hvoretter 25 g salicylsyre, oppløst ;i 100 ml dietyleter, ble satt til den klare opp-løsning. Etter 24 timers henstand i kjøleskap ;ble den dannede utfelling filtrert fra og vasket ;med dietyleter. Etter tørking veiet stoffet 52 g. ;For videre rensing ble produktet omkrystallisert fra 250 ml etylacetat. Man fikk 26 g av et ;krystallinsk salt som smeltet ved 159—161 ° C. ;Dette salts aktivitet var ca. 840 mikrogram ;pr. mg. ;10 g av dette krystallinske salt ble løst ;opp i 220 ml aceton. Deretter ble oppløsningen ;fortynnet med 650 ml vann. Til denne oppløs-ning ble det suksessivt satt 400 ml dietyleter ;og 10 ml 1 n natriumhydroksyd. Etter kraftig ;rystning ble eterlaget skilt fra. ;Det vandige lag ble ekstrahert tre ganger ;til med ialt 600 ml dietyleter. Etter tørking ;ble etéroppløsningene dampet inn, og man ;fikk 8,2 g av et hvitt, amorft stoff, av smeltepunkt (med spaltning) 144—152° C. Ifølge ;mikrobiologiske forsøk inneholdt dette produkt ;ca. 1000 mikrogram B-mycin pr. mg. *

Claims (8)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av et nytt antibiotisk aktivt stoff ved hjelp av aktinomyceter av slekten Streptomyces, karakterisert ved, at man dyrker Streptomyces bottropensis nov. spee. under passende betingelser og av kulturen utvinner det dannede antibiotikum, kalt B-mycin. som har et smelteområde (under spaltning) fra 143—155° C, en spesifikk dreining T~ " 20 n jj på -M4,2° i en 5%'s oppløsning i 96%'s etanol, en molekylarvekt på ca. 770, et mak-simum i det ultrafiolette spektrum ved 2030 Å og en «skulder» ved ca. 2400 Å, og eventuelt omdanner antibiotikumet til salter.

2. Fremgangsmåte ifølge påstand 1, karakterisert ved, at etter dyrkningsperioden blir kulturen ekstrahert ved en pH 7 eller høyere med et organisk oppløsningsmiddel som prak-tisk talt ikke er blandbart med vann; og at den erholdte ekstrakt, eventuelt etter å være blitt konsentrert, ekstraheres med en vandig pufferoppløsning som har sur reaksjon, og at disse operasjoner gjentas inntil det er fått en tilstrekkelig konsentrert oppløsning til at B-mycin felles ut når den sure vandige oppløsning gjøres alkalisk.

3. Fremgangsmåte ifølge påstand 1 og 2, karakterisert ved, at den rå B-mycin renses ved kromatografering ved hjelp av magnesiumsilikater.

4. Fremgangsmåte ifølge påstand 3, karakterisert ved, at B-mycin som er absorbert på magnesiumsilikat elueres med en blanding av kloroform og en alkohol.

5. Fremgangsmåte ifølge påstand 4, karakterisert ved, at elueringen utføres med en blanding av kloroform og 5—10%, fortrinsvis 7,5% etanol.

6. Fremgangsmåte ifølge påstand 1, karakterisert ved, at for dannelsen av et salt anvender man et derivat av bensoesyre som er substituert i den aromatiske kjerne, som f. eks. salicylsyre, p-aminosalicylsyre, 3,5-dibromsalicylsyre eller 3,5-dinitrobensoesyre, eller et salt av nevnte derivater.

7. Fremgangsmåte ifølge påstand 1, karakterisert ved, at penicillin eller et salt derav, spesielt penicillin G eller et salt derav, anvendes for dannelsen av et salt av B-mycin.

8. Fremgangsmåte ifølge påstand 1 for rensning av rått B-mycin, karakterisert ved, at det rå B-mycin omdannes til et salt og at B-mycin frigjøres fra dette salt.