NO134605B

NO134605B -

Info

Publication number: NO134605B
Application number: NO740780A
Authority: NO
Inventors: R I Leininger; J R Preston; B R Lower
Original assignee: Ortho Pharma Corp
Priority date: 1973-03-07
Filing date: 1974-03-06
Publication date: 1976-08-09
Also published as: IL44363A0; SE401319B; AU6621174A; JPS49126196A; IN139926B; FR2220284A1; US4137922A; IE39335L; IE39335B1; PH10674A; FR2220284B1; NO134605C; ZA741466B; SU535885A3; AR197859A1; BR7401695D0; DE2410933A1; BE812023A; CH562603A5; IL44363A

Description

Fremgangsmåte til fremstilling av et nytt antibiotikum, chalcomycin.

Foreliggende oppfinnelse angår en

fremgangsmåte til fremstilling av et nytt

antibiotikum som er kalt chalcomycin, ved

fermentasjon av en utvalgt Streptomyces-organisme under kunstige betingelser. Vi-dere omfatter oppfinnelsen metoder til isolering av den nye forbindelse fra dyrk-ningsmediene og metoder til rensning av

forbindelsen.

Chalcomycin er en nøytral, hvit, krystallinsk forbindelse som bare inneholder

elementene kullstoff, hydrogen og oxygen.

Den er oppløselig i alkylestere av lavere

fettsyrer som etylacetat og amylacetat, i

lavere alkanoler som metanol og etanol, i

aromatiske kullvannstoffer som toluen og

benzen, i etylendiklorid og i kloroform, lite

oppløselige i kullstofftetraklorid, i vann og

i eter, og relativt uoppløselig i petroleter.

Chalcomycin er optisk aktiv idet det

27

har en spesifikk dreining på [aj D = — 43,5° (c = 1 % i etanol). Forbindelsens

smeltepunkt varierer med oppvarmings-hastigheten og det anvendte apparat. På

oppvarmede blokker observeres en verdi på

121—123° C. Chalcomycin inneholder ca.

60 % kullstoff (området for eksperiméntelt

bestemte verdier er fra 59,5 til 59,97 %), ca.

8 % hydrogen (området for eksperimentelt

bestemte verdier er fra 8,08 til 8,32 %) og

ca. 32 % oxygen (området for eksperimentelt bestemte verdier er fra 31,43 til

32,05 %). Chalcomycinets molekyl vekt er

ca. 600 (området for eksperimentelt bestemte verdier er fra 575 til 592).

I de vedføyede tegninger viser fig. 1 chalcomycinets spektrum i det ultrafiolette område (0,00228% i absolutt etanol). Et absorpsjonsmaksimum viser seg ved 218

m^, E j1 ^ = 319. Der er en avtrapning i området omkring 240 m^.

Chalcomycinets absorpsjonsspektrum i det infrarøde område er i høy grad karakteristisk for dette stoff. I fig. 2 vises dette spektrum bestemt i kloroformoppløsning. De viktigste absorpsjonsmaksima ligger ved ved ca. 2,83, 3,34, 3,40, 5,83, 5,89, 6,00, 6,13, 6,86, 7,23, 7,40, 7,53, 7,78, 8,00, 8,54, 8,70, 9,00, 9,22, 9,41, 9,67, 10,20, 10,71, 11,20, 11,57 og 11,69 mikroner. I fig. 3 vises chalcomycinets absorpsjonsspektrum i det infrarøde område, bestemt i en kaliumbromid-skive. De viktigste absorpsjonsmaksima ligger ved ca. 2,84, 3,35, 3,40, 5,81, 5,89, 6,02, 6,12, 6,84, 7,20, 7,38, 7,51, 7,77, 8,08, 8,52, 9,22, 9,40, 9,63, 10,15, 11,19, 11,59 og 12,70 mikroner.

Chalcomycin avfarver vandige per-manganatoppløsninger ved romtemperatur, adderer brom når forbindelsen er oppløst i kullstofftetraklorid ved romtemperatur og gir direkte en positiv hydroxamatreaksjon. Det gir en negativ Tollens reaksjon, en negativ Fehlings reaksjon og en negativ jodo-formreaksjon.

Chalcomycin viser et laktons kjemiske egenskaper. Umettede bindinger og for-esterbare hydroxylgrupper er også tilstede. Ved acetylering av chalcomycin med eddiksyreanhydrid i pyridin ved romtemperatur får man den krystallinske forbindelse chalcomycindiacetat.

Chalcomycin absorberer hydrogen i nærvær av edelmetalkatalysatorer og under lempelige betingelser så at der dannes en rekke hydreringsprodukter. Ett av disse hydreringsprodukter er tetrahydrochalcomycin som dannes ved hydrering av chalcomycin oppløst i etanol, ved romtemperatur og atmosfæretrykk samt i nærvær av en palladiumkatalysator. Denne forbindelse karakteriseres lett ved det krystallinske tetrahydrochalcomycin-diacetat.

Antibakterievirkningene av chalcomycin, av oppløsninger og blandinger som inneholder denne forbindelse samt av derivater av chalcomycin bestemmes hensiktsmessig ved å måle den hemmende (inhi-berende) virkning av slike preparater på Sarcina lutea. Den sterke aktivitet som chalcomycin viser mot denne organisme, går tapt ved sur eller alkalisk hydrolyse av forbindelsen og særlig ved å oppvarme den under tilbakeløpskjøling i 10 minutter med en 1-molar oppløsning av saltsyre i vandig metanol eller ved å la forbindelsen henstå ved romtemperatur i 24 timer i en 0,1-molar oppløsning av natriumhydroxyd i vandig metanol.

De stoffer som dannes ved sur og alkalisk hydrolyse av chalcomycin, er kry-

stallinske og nyttige ved identifisering og karakterisering av chalcomycin.

De ovenfor nevnte derivater og produkter som dannes ved endring av chalcomycin, vil bli beskrevet nærmere i eksemplene i det følgende.

Chalcomycin er ytterligere karakteristisk ved dets spektrum for antibakteriell aktivitet. Det antibakterielle spektrum for forbindelsen, uttrykt som den minimale hemmende konsentrasjon i mikrogram pr. milliliter, overfor flere forskjellige mikro-organismer fremgår av nedenstående tabell 1. Det flertall av angivelser som fin-nes under visse arter i denne tabell, repre-senterer forskjellige stammer av vedkom-mende organisme og hensikten med dem er å vise de variasjoner som er observert for forskjellige stammer av en og samme art. Den soyakultur som ble brukt i disse forsøk var «Trypticase Soy Broth» hvis sammensetning er angitt i «Products for the Microbiological Laboratory», Fourth Edition, Bal-timore Biological Laboratory, Inc., Balti-more, Maryland. Sterk aktivitet mot en organisme påvises ved en hemning av organismens vekst ved en chalcomycinkonsentrasjon som er mindre enn 1 mikrogram pr. ml, mens en relativ inaktivitet mot en organisme påvises ved en hemning av dens vekst ved en chalcomycinkonsentrasjon som er så høy som 25 mikrogram pr. ml eller høyere.

Ifølge oppfinnelsen fremstilles chaco-mycin ved å dyrke en utvalgt, i det følgen-de nærmere beskrevet stamme av organismen Streptomyces bikiniensis under kunstige betingelser i et passende nærende medium inntil mediet har fått en vesentlig antibakteriell aktivitet. Etter dyrknings-eller inkubasjonsperioden kan chalcomycin utvinnes fra mediet ved fremgangsmåter som vil bli beskrevet i det følgende, og kan underkastes ytterligere rensning i den ønskede grad.

Stammer fra Streptomyces bikiniensis som er egnet til fremstilling av chalcomycin er erholdt ved å bestråle actinomyceter fra jordbunn på Cuba med ultrafiolette stråler. Den organisme som brukes i frem-gangsmåten ifølge oppfinnelsen ble erholdt fra en actinomycet som opprinnelig ble isolert ved seriefortynning på plater av næringsagar, fra en jordbunnprøve oppsamlet på en maisåker i San Vicente, Cuba. Denne actinomycet frembragte bare en liten antibiotisk virkning mot gram-nega-tive organismer. Dens evne til å produsere antibiotikum ble endret ved å utsette den for bestråling med ultrafiolette stråler og formere de organismer som overlevet denne bestråling.

Behandlingen ble utført på følgende måte: Kulturen av den opprinnelige actinomycet ble spredt på en maltose-agar-plate og inkubert i 7 døgn. Sporene fra denne plate ble tilsatt til 10 ml steril 0,85 %'s natriumkloridoppløsning og den herved erholdte suspensjon ble rystet i 30 min. Spo-resuspensjonen ble derpå anbragt i en steril Petri-skål uten lokk og bestrålet i 1 min. med en 4 watts lampe for utsendelse av ultrafiolette germicide stråler, idet lampens pære ble anbragt 11,4 cm fra suspensjonen. Den bestrålte suspensjon ble overført på Andersons maltose-agar og inkubert i 7 døgn ved 28° C. Platene ble derpå anbragt i kjøleskap i 10 døgn. Deretter ble enkelte kolonier utvalgt og overført til plater som var fremstilt med Anderson's maltose-agar. Platene ble inkubert i 8' døgn ved 28° C. Den actinomycet som man erholdte fra en av disse plater, er den stamme av Streptomyces bikiniensis som anvendes til fremstilling av chalcomycin ved fremgangsmå-ten ifølge oppfinnelsen.

Kulturer av denne organisme er depo-nert i United States Department of Agri-culture, Northern Utilization Research & Development Division, Peoria, Illinois og oppbevares i denne institusjons permanen-te kultursamling under betegnelsen NRRL 2737.

Organismen er et aeorobt og i luften, sporedannende medlem av ordenen Actino-mycetales. Den tilhører arten Streptomyces som beskrevet i syvende utgave av «Bergey's Manual of Determinative Bacteriology». Dens makroskopiske kulturkarakteristika på medier som er fordelaktig til identifisering av medlemmer av denne art, vises i nedenstående tabell 2.

Når organismen dyrkes på visse agar-medier er luftmyceliet først hvitt og blir senere grått. Luftmyceliet er fløyelsaktig, leilighetsvis litt dunet og er ofte dugget med klare og gjennomsiktige små dråper. Substratmyceliet er hvitt til gult eller gul-brunt og blir senere grått. På medier som inneholder komplekse kilder for nitrogen, blir substratmyceliet i alminnelighet brunt, brungrått eller sort og der dannes et mør-kebrunt eller sort, oppløselig pigment i sub-stratet.

Lufthyfene er gjennomsiktige og klare samt rettlinjede eller bølgeformede med leilighetsvis forekommende endeløkker ved anvendelse av noen av medier som glycerol-asparagin-agar og glykose sammen med nærings-agar. Lufthyfene varierer i lengde og forgrener seg heterogent. Spredte distale deler av lufthyfene deler seg opp i spore-kjeder hvis lengde varierer fra ca. 10 til 200 mikroner. De vegetative hyfer er gjennomsiktige og klare samt fra omkring 0,6 til 1,4 mikroner brede. Sporene er i alminnelighet avlange, leilighetsvis ovale eller kuleform-ede. Deres diameter varierer fra ca. 0,6 til

1,5 mikroner og deres lengde varierer fra 0,8 til 2,0 mikroner.

I forsøk med utnyttelse av kullstoff-holdige materialer ble en god til temmelig god vekst oppnådd med de følgende kilder for kullstoff hver for seg: dekstrose, maltose, D-mannose og stivelse. Ingen eller dårlig vekst inntraff ved anvendelse av: L-arabinose, adonitol, cellulose, i-inositol, inulin, laktose, D-mannitol, melezitose, me-libiose, raffinose, rhamnose, D-sorbitol, sukrose og trehalose.

I luftmyceliets farve og i flere hense-ender med hensyn til hyfe-mikromorfolo-gien ligner organismen Streptomyces bikiniensis som beskrevet av D. B. Johnstone og S. A. Waksman (J. Bact. 55, 317 (1948)). I visse andre karakteristika er organismen bemerkelsesverdig forskjellig fra S. bikiniensis som beskrevet av Johnstone og Waksman (Tabell 3) så vel som fra den S. bikiniensis-lignende organisme som er beskrevet av Hamada (Tabell 4). Organismen iføl-ge oppfinnelsen betraktes derfor som en ny og distinkt stamme av Streptomyces bikiniensis og denne stamme identifiseres ved kulturnummeret NRRL 2737.

Ifølge foreliggende oppfinnelse fremstilles chalcomycin ved å pode et sterilt, vandig næringsmedium med en chalcomycin-produserende stamme av Streptomyces bikiniensis, utføre en fermentasjon under aseptiske, aerobe btingelser ved en temperatur mellom ca. 20 og 35° C inntil dyrkningskulturen har fått vesentlig antibakteriell aktivitet og derpå isolere chalcomycinet fra kulturen.

Til podningen kan der brukes sporer eller conidia av den utvalgte kultur av Streptomyces bikiniensis. Vandige suspen-sjoner av sporer eller conidia som inneholder en liten mengde såpe eller andre fukt-ningsmidler kan hensiktsmessig anvendes. For fermentas joner i større målestokk er det fordelaktig å bruke kraftige, unge, luftede og omrørte kulturer av mikroorganismen.

Egnede vandige næringsmedier er dem som inneholder assimilerbare kilder for kullstoff og nitrogen og som har en pH-verdi mellom ca. 6 og 8,5. Blant de kilder for kullstoff som er assimilerbare og tilfredsstillende for anvendelse i fremgangs-måten, er rene kullhydrater som kan nyt-tiggjøres av organismen såvel som i han-delen tilgjengelige blandinger av kullhydrater. Noen eksempler på de materialer som er egnet for dette formål, er glukose, maltose, mannose, stivelse og modifiserte stivelsesarter, maissirup, maltholdige væs-ker, «black-strap» melasse, glycerol og lignende. Konsentrasjonen av kullhydratet i næringsmediet er ikke særlig kritisk og kan variere fra 0,5 til 5 vektprosent beregnet på mediets vekt. Mengdeforhold som ligger noe utenfor dette område kan også anvendes.

Kildene for nitrogen i næringsmediet kan være av organisk, anorganisk eller både organisk og anorganisk natur. Noen eksempler på de mange nitrogenholdige stoffer som kan brukes i næringsmediet er aminosyrer, peptoner, hydrolyserte eller ikke hydrolyserte proteiner, fiskemel, soya-bønnemel, maisstøpvæske, avvannet mais-støpvæske, kjøttekstrakter, jordnøttmel, anorganiske nitrater, urinstoff og ammo-niumsalter. På grunn av at de fleste lett tilgjengelige kilder for nitrogen er urene, varierer den mengde som bør tilsettes til mediet i overensstemmelse med stoffenes renhet og det lar seg ikke angi bestemte mengdeforhold mellom nitrogenholdig materiale og mediets øvrige bestanddeler. Det kan imidlertid sies at for praktiske formål behøver ikke mengden av nitrogenholdig materiale å overstige 6 % av hele dyrk-ningsmediets vekt og det kan være tilstede i betydelig lavere konsentrasjoner.

Nærvær av mineralsalter i visse mengder samt av vekstfaktorer med ukjent sammensetning er fordelaktig for oppnåelse av optimale utbytter av chalcomycin. Mange lett tilgjengelige materialer som maisstøp-væske, butanolaceton-fermentasjonsresi-duer, gjærpreparater, soyabønnemel og andre produkter av lignende natur inneholder slike anorganiske salter og vekstfaktorer og tilstedeværelse av ett eller flere av slike materialer i fermentasjonsmediet er ferdelaktig. For å sikre nærvær av mediets mineralbestanddeler i tilstrekkelige mengder, er det også i mange tilfelle fordelaktig å tilsette anorganiske salter som natrium-klorid, natriumbikarbonat, kalsiumkarbo-nat, natriumacetat og lignende. De foretrukne konsentrasjoner av mineralsalter ligger mellom 0,1 og 1 vektprosent beregnet på næringsmediets vekt.

Dyrkningen av den utvalgte stamme av Streptomyces bikiniensis i det vandige næringsmedium kan utføres på flere forskjellige måter. Således kan f. eks. organismen dyrkes under aerobe betingelser på mediets overflate eller den kan dyrkes under mediets overflate, dvs. under submerse betingelser, forutsatt at man sørger for til-strekkelig tilførsel av oxygen.

Den foretrukne metode til fremstilling av chalcomycin i stor målestokk består i fermentasjon av en chalcomycin-produser-ende stamme av Streptomyces bikiniensis i submerse kulturer eller dypkulturer. Iføl-ge denne utførelsesform for oppfinnelsen poder man sterile, vandige næringsmedia med den utvalgte kultur og inkuberer mediet under omrøring og luftning ved en temperatur mellom ca. 20 og 35° C, for-trinnsvis omkring 23—30° C inntil chalcomycinet er tilstede i kulturvæsken i høy konsentrasjon. Det tidsrom som kreves for å oppnå et optimalt utbytte av chalcomycin, varierer med den anvendte apparaturs størrelse og type, hastighetene for omrøring og luftning, den spesielle organisme som brukes og med andre faktorer. I fermentasjon i stor målestokk for industriell frem-stiling hvor fermentasjonen utføres i dyrk-ningskar av tank-typen, oppnåes den mak-simale produksjon av chalcomycin etter ca. 1 til 4 døgn. Kortere dyrkningsperioder kan også brukes, men gir i alminnelighet et lavere utbytte av chalcomycin. Når dyrkningen utføres i kolber som rystes, kan den nødvendige tid for oppnåelse av maksimal produksjon av chalcomycin være noe len-ger enn ved anvendelse av store dyrknings-kar.

Under submerse dyrkningsbetingelser utvikler mikroorganismen seg som relativt distinkte partikler som er dispergert i næringsmediet, i motsetning til den relative kontinuerlige hinne som danner seg på mediets overflate ved anvendelse av over-flatedyrkning. På grunn av denne fordeling av organismen gjennom hele mediet kan store volum av det podede næringsmedium brukes ved dyrkning av organismen i tan-ker og andre kar som vanlig brukes i fer-mentasjonsindustrien. Stasjonære fermen-tasjonskar forsynt med røreverk og anordninger for luftning er særlig godt egnet for fremstilling av chalcomycin i stor målestokk, imidlertid kan fermentasjonsutsty-ret av annen art også brukes. Til fremstilling av chalcomycin i mindre mengder eller til fremstilling av kulturer av organismen for anvendelse som podningsmiddel for fermentasjoner i stor målestokk kan den submerse dyrkningsmetode utføres i små kolber eller krukker som rystes eller hvis innhold omrøres med passende mekaniske anordninger.

I den submerse kulturmetode kan om-røring og luftning av kulturmediet utføres på flere måter. Omrøringen kan frembringes ved turbiner, skovler, sentrifugalrøre-verk eller andre mekaniske anordninger for omrøring, ved å rotere eller ryste fermentasjonsbeholderen, ved forskjellige pumpe-anordninger eller ved å lede luft eller oxygen gjennom mediet. Luftningen kan frembringes ved å blåse luft eller oxygen inn i dyrkningsmediet gjennom åpne rør, per-forerte rør eller rør forsynt med en porøs del gjennom hvilken gassen kan dif f un-dere, eller luftningen kan frembringes ved å sprøyte, skvette eller helde mediet inn i eller gjennom en oxygenholdig atmosfære.

Et alternativ til den foretrukne submerse dyrkningsmetode er anvendelse av overflatekulturmetoden til fremstilling av chalcomycin. I denne metode podes et tynt skikt, i alminnelighet med tykkelse mindre enn 2 cm av et sterilt, vandig næringsmedium med en chalcomycin-produseren-de stamme av Streptomyces bikiniensis, hvorpå detipodede medium inkuberes under aerobe betingelser ved en temperatur mellom ca. 20 og 35° C. Produktet isoleres derpå på en måte lignende dem som beskrives i det følgende i forbindelse med den submerse dyrkningsmetode.

Den mengde eller konsentrasjon av chalcomycin som er tilstede etter dyrknings-perioden eller på et hvilket som helst tids-punkt under denne periode, kan bestemmes ved biologisk analyse. For dette formål uttas en representativ prøve fra dyrkningsmediet og filtreres for å fjerne faste stoffer. Mediets antibiotiske potensial kan derpå bestemmes ved å måle den grad i hvilket det hemmer veksten av mikroorganismen Sarcina lutea under betingelser som normalt er gunstige for denne organismes vekst. Ved utførelsen av denne biologiske analyse fremstiller man en plate agar-kultur av forsøksorganismen. Filtrerpapir - skiver som inneholder en avmålt mengde av en fastslått fortynning av mediet, an-bringes mot agar-kulturens overflate og hemningen i organismens vekst observeres etter en viss inkubasjonsperiode. Denne biologiske analyse beror på den kjennsgjer-ning at chalcomycin på |en karakteristisk måte motvirker organismens vekst med det resultat at den hemningssone som omgir filtrerparpirskiven varierer med den mengde chalcomycin som er fordelt i filtrerpa-pirskiven. Angivelsen av verdien for potensialet er basert på den fortynning av kulturmediet som kreves for å frembringe en vilkårlig valgt diameter for hemningssonen under stardardiserte forsøksbetingelser således som det vil bli beskrevet nærmere i eksemplene i det følgende.

Potensialet av chalcomycin-kulturme-dier kan også bestemmes ved hjelp av andre metoder som f. eks. ved å måle den fortynning av kulturmediet som kreves for å gi en veksthemning på 50 % i en turbidi-metrisk prøve med mikroorganismen Agro-bacterium tumefaciens etter en 2<3>4 times inkubasjonsperiode ved 37° C, på kulturme-dium av hjerne-hjerteekstrakt.

Etter fullføring av fremgangsmåtens fermentasjonstrinn er det ønskede produkt særlig tilstede i kulturvæsken og isoleres fra denne væske. Ved fremstilling av chalcomycin ved den submerse dyrkningsmetode er det fordelaktig å fraskille myceliet ved midler som filterering eller sentrifu-gering og derpå ekstrahere den filtrerte væske med et oppløsningsmiddel som ikke er blandbart med vann, f. eks. etylendiklorid, kloroform, etylacetat, amylacetat. Det erholdte ekstrakt som altså inneholder chalcomycinet, underkastes ytterligere behandling som er avhengig av sluttproduk-tets ønskede renhet. Således kan f. eks. det organiske ekstrakt vaskes med en fortynnet base, en fortynnet syre og vann og inndampes til tørrhet. Det erholdte residuum bestående av chalcomycin i form av råprodukt, ekstraheres med et ikke polart oppløsningsmiddel som benzen og ekstrak-tet helles i en kromatografisk kolonne som er fyllt med aluminiumoxyd. Ved utvikling og eluering av kolonnen med i økende grad polare oppløsningsmidler og blandinger av oppløsningsmidler får man eluater som inneholder chalcomycin i høy konsentrasjon. Når så ønskes, utføres ytterligere rensning ved gjentatt kromatografi, omkrystallisa-sjon fra oppløsningsmidler, ved fordeling mellom oppløsningsmidlet ved ekstraksjon i motstrøm eller ved å kombinere disse eller lignende operasjoner. Etter en foreløpig rensning ved kromatografi i aluminiumoxyd eller fordeling mellom oppløsnings-midler kan ytterligere rensning utføres ved kromatografi i aktivert kull som eventuelt kan være blandet med diatomé jord. Utvik-lingen og elueringen av kolonnen bestående av aktivt kull kan utføres med hydro-xylgruppeholdige oppløsningsmidler eller keton-oppløsningsmidler som metanol, vandig metanol, aceton eller vandig aceton.

Chalcomycin er et verdifullt antibiotisk middel for behandling av bakterieinfeksjo-ner. Således er det f. eks. aktivt mot forskjellige gram-positive organismer. Det er i alminnelighet effektivt mot stafylokokker og pneumokokker og likeledes mot noen stammer av streptokokker. Chalcomycin er særlig fordelaktig for behandling av bak-terieinfeksjoner forårsaket av flere stafylokokk-organismer som er motstandsdyktige mot andre antibiotiske midler. Som et spe-sielt eksempel på anvendelse av chalcomycin, nevnes at det kan brukes i form av sal-ver for lokal anvendelse til bekjempelse av lokale stafylokokk-infeksjoner.

I det følgende beskrives som eksempler noen utførelsesformer for oppfinnelsen.

Eksempel 1: Fremstilling og undersøkelse av kulturvæsker som inneholder chalcomycin.

Der ble fremstillet et næringsmedium med følgende sammensetning: 2 liter av dette medium ble i 250 ml porsjoner fordelt i åtte 1-liters Erlenmeyer-kolber med vid åpning og som var lukket med bomullsgas og fibre. Kolbenes innhold ble sterilisert ved 120° C i 25 min. Man lot derpå kolbene avkjøle og podet hver av kolbenes innhold med 0,5 ml av en sporesuspensjon av Streptomyces bikiniensis tilsvarende NRRL 2737. Denne sporesuspensjon ble fremstillet fra en sporeholdig agar-plate av Anderson's maltose-agar ved å suspendere sporene i 12 ml steril 0,1 % na-trium-heptadecylsulfatoppløsning. Kolbene ble derpå inkubert ved 27° C i 72 timer, hvorunder luftning og omrøring ble besør-get av et roterende rysteapparat som be-skrev en sirkel med 6 cm's diameter ved 160 omdreininger pr. min.

Ved slutten av inkubasjonsperioden ble kulturvæskens chalcomycin-innhold bestemt ved en papirskiveagar-diffusjonsme-tode i skål lignende den metode som er beskrevet for undersøkelse av viomycin av Ehrlich, Iverson og Kohberger, «Antibiotics and Chemotharapy», 1, (3) : 211—216 (juni 1951). Ved tilpasning av denne metode for undersøkelse av chalcomycin gjorde man følgende modifikasjon: Den anvendte for-søksorganisme var Sar eina lutea PCI 1001 W. Podningsmediet for kulturskiktet ble fremstillet ved å la kulturen vokse på et medium som «Penassay Seed Agar» (Difco) i Roux-flasker ved 28° C i 18 timer. Cellene ble derpå innhøstet i et medium som «Penassay-Broth» (Difco). Sammensetningen av «Pennassay Seed Agar» og «Penassay Brotn» er beskrevet i «Difco Manual of Dehydrated Culture Media and Reagents for Microbiological and Clinical Laboratory Procedures», 9. utgave, og «Compilation of Tests and Methods of Assay for Antibiotic Drugs», Federal Security Agency, Food & Drug Administration. Agar og kulturvæsker med lignende sammensetning kan.også anvendes. Cellesuspensjonen fortynnes derpå med ytterligere mengder «Penassay Broth» slik at en fortynning i forholdet 1 : 10 gir 16 % lystransmisjon i et Coleman Jr. spek-trofotometer, modell 6A ved en bølgelengde på 550 m\ i. Den cellesuspensjon som er erholdt før fortynningen i forholdet 1 : 10 for spektrofotometrisk bestemmelse anvendes i den biologiske analyse.

Denne cellesuspensjon fortynnes i forholdet 1 : 600 med «Penassay Seed Agar» og 25 ml av den fortynnede suspensjon hel-des i hver skål. Man anvender ikke noe grunnskikt i denne prøve. Inkubasjonen ut-føres ved 37° C i 18 timer.

Den antibiotika-holdige kulturvæske som ble erholdt i dette eksempel, ble gitt

et potensial på 8 enheter pr. ml. Denne an-givelse av potensialet er basert på den kjensgjerning at en åtte gangers fortynning av kulturvæsken med fosfatpuffer med pH-verdi 7,8 (sluttelige pufferkonsen-trasjon 0,1 M) ga en vilkårlig valgt gjen-nomslittlig diameter for hemningssonen på 13,9 mm ved prøvning under de foran angitte undersøkelsesbetingelser.

Når man baserer seg på potensialen-heter som er definert på denne måte, gir rent, krystallinsk chalcomycin et potensial på 1025 enheter pr. mg. En enhet represen-terer følgelig ca. 1 mikrogram chalcomycin.

Ved undersøkelse av chalcomycin-kulturvæsker fortynnes den standardprøve der refereres til samt prøvene av kulturvæsker i fosfatpuffer-oppløsninger til man får en pufferoppløsning med sluttkonsen tras jon tilsvarende 0,1 M. Når legemsvæsker under-søkes, fortynnes standardprøven og prøv-ene i den væske som skal undersøkes.

Eksempel 2: Fremstilling og isolering av chalcomycin.

Der ble fremstillet et næringsmedium

med følgende sammensetning:

12 liter av dette medium ble anbragt og omrørt i en 30 liters krukke forsynt med anordning for fordeling av gass, sentrifu-galrøreverk, støtvegger og ledning for ut-tagning av prøver. Mediet ble sterilisert ved å oppvarme det til 121° C i 90 min. En sporesuspensjon ble fremstillet fra 2-agar-plater med sporeholdig Streptomyces bikiniensis tilsvarende NRRL 2737, på Ander-son^ maltose agar, samt 20 ml av en steril 0,1 % natriumheptadecylsulfat-oppløsning. Denne sporesuspensjon ble anvendt til å pode det avkjølede dyrkningsmedium som etter podningen ble inkubert ved 26° C i 46 timer. Under inkuberingens forløp ble der omrørt med en hastighet av 210 omdreininger pr. min. mens luft ble tilført med en hastighet på 12 liter pr. min. Skumningshindrende middel ble tilsatt etter behov. 64 liter næringsmedium med den ovenfor angitte sammensetning ble anbragt i like store porsjoner i fire 30 liters fermen-tasjonskrukker med røre verk. Etter sterili-sering og avkjøling ble hver krukkes innhold podet med 800 ml av den ovenfor angitte 46 timers fermentasjonsblanding. In-kuberingen ble utført ved 26° C i 24 timer under omrøring med en hastighet av 200 omdreininger pr. min. samt luftning med 16 liter luft pr. min. Skumningshindrende middel ble tilsatt etter behov.

Fermentas jonsblandingen ble bragt sammen og filtrert, hvorved man fikk ca. 57,5 liter dyrkningsmedium. Dette dyrkningsmedium ble ekstrahert to ganger med 2,25 liters porsjoner etylendiklorid. Det erholdte organiske ekstrakt ble vasket med 2 %'s vandig natriumkarbonatoppløsning, 0,01 N saltsyre og sluttelig med vann. Derpå ble oppløsningsmidlet fordampet og residuet ekstrahert med benzen. Benzenek-straktet ble filtrert og heldt i en kromatografi-kolonne som var fyllt med 350 g aluminiumoxyd (pH-verdi 6,9) fra en benzen-suspensjon. Etter utvikling av kolonnen med 250 ml etylacetat ble den eluert med metanol. De enkelte metanol-eluater ble oppsamlet og residuet fra hvert eluat ble undersøkt på antibiotisk aktivitet. De ak-tive eluater ble derpå blandet og inndampet til tørrhet. En oppløsning av det erholdte residuum i 30 ml 18 %'s vandig aceton ble heldt i en kromatografikolonne fremstillet av 5,5 g aktivt kull. Som aktivt kull kan der brukes Darco G-60. Kolonnen ble utviklet med 18 %'s vandig aceton og produktet oppsamlet ved eluering med aceton. De aceton-eluater som viste antibiotisk aktivitet ble blandet og blandingen inndampet til tørrhet, hvorved man fikk det ønske-D

de chalcomycin, [a] 27 = — 4^>5° (c =

1% i etanol). Ved mikroanalyse ble det funnet at dette produkt inneholdt 59,84% kullstoff og 8,3 % hydrogen.

Eksempel 3: Fremstilling, rensning og karakterisering av chalcomycin.

Der ble fremstillet et næringsmedium (her betegnet «Medium C») på følgende måte:

37,85 liter av Medium C ble anbragt i en fermentasjonsbeholder av rustfritt stål med volum 113 liter. Mediet ble tilsatt 175 ml av et skumningshindrende middel som besto av en blanding av talg i form av råprodukt og mineraloljer inneholdende mo-no- og diglycerider. Mediet ble derpå sterilisert i 1 time ved 121° C, avkjølt og podet med 30 ml av en sporesuspensjon. Denne sporesuspensjon var fremstillet av tre plater inneholdende sporeholdig Streptomyces bikiniensis om tilsvarte NRRL 2737 ved å suspendere sporene fra hver av platene i 10 ml steril, 0,1 % natriumheptadecylsul-fat-oppløsning. Fermentas jonsblandingen ble inkubert i 32 timer ved 26° C under luftning og omrøring som ble frembragt ved å blåse inn luft med en hastighet på 184 liter pr. min. Ytterligere mengder skumningshindrende middel ble tilsatt etter behov.

Et annet næringsmedium (her betegnet «medium D») ble fremstillet på følg-ende måte:

Ca. 1135 liter av medium D ble anbragt i en fermentasjonsbeholder av rustfritt stål med volum 1900 liter og etter tilsetning av 1 liter skumningshindrende middel ble mediet sterilisert i 1 time ved 121° C. Man lot det heretter avkjøle og podet det med 37,85 liter av 32 timers fermentasjonsblanding. Der ble så inkubert i 24 timer ved 26° C. Omrøring ble besørget av et røreverk som arbeidet med 85 omdreininger pr. min. Luft ble ført inn i fermentas jonsblandingen med en hastighet på 1274 liter pr. min. Ytterligere mengder skumningshindrende middel ble tilsatt etter behov.

4,542 m<3> Medium D og 10 liter skumningshindrende middel ble anbragt i en fermentasjonsbeholder av rustfritt stål med volum 7,57 m<3> og blandingen ble sterilisert i 1 time ved 121° C. Den ble derpå avkjølet og podet med 568 liter av 24 timers fermentasjonsblandingen fra 1900 liters fermentasjonsbeholderen. Inkubasjonen ble utført i 40 timer ved 26° C under luftning med 3,396 m<3> luft pr. min. og ytterligere omrøring med et røreverk som arbeidet med 125 omdreininger pr. min. Ytterligere 8,2 liter skumningshindrende middel ble

tilsatt når det var nødvendig for å minske skumningen.

Etter inkubasjonsperioden ble fermentas jonsblandingen (volum 5,072 m<3>) oppsamlet og filtrert. Filtratet ble ekstrahert med etylacetat i en sentrifugalekstraktor som arbeidet etter motstrømsprinsippet

(en Podbielniak-esktraktor kan anvendes)

i et mengdeforhold på 1 del oppløsnings-middel til 4 deler vandig filtrat. Etylacetat-ekstraktet ble blandet med etylacetatek-strakter erholdt på samme måte fra tre lignende fermentasjoner med i det hele 14,232 m<3> kulturvæske. De blandede ekstrakter ble vasket godt med vann, hvorpå etylacetatet ble fjernet ved fordampning og erstattet med 24,1 liter etylendiklorid.

En kromatografi-kolonne med diameter 15,2 cm ble fyllt med 18 kg aluminiumoxyd (pH-verdi 4) fra en suspensjon i etylendiklorid. En porsjon på 13,9 liter av ety-lendikloridekstraktet (tatt ut fra oppløs-ningen av fermentasjonsproduktet i 24,1 liter etylenklorid) ble tørret over vannfritt natriumsulfat og derpå heldt i aluminiumoxyd-kolonnen. Kolonnen ble utviklet og eluert ved suksessiv tilsetning av (a) 4,5 liter 1 : 1 etylacetat, etylendiklorid, (b) 18,25 liter etylacetat, (c) 20 liter 1 : 9 metanol : etylacetat, (d) 6,4 liter 1 : 1 metanol : etylacetat og sluttelig (e) 8 liter 1 : 1 vann : etanol. De angitte mengdeforhold mellom oppløsningsmidlene er volumforhold. Eluatet fra kolonnen ble oppsamlet i fraksjoner og de fraksjoner som ved biologisk un-dersøkelse ble funnet å ha bemerkelsesverdig antibiotisk aktivitet, ble blandet og inndampet til tørrhet. Residuet ble oppløst i aceton, hvorved man fikk en oppløsning som hadde ca. 60 000 enheter chalcomycin pr. ml.

1,5 liter av denne oppløsning ble tilsatt til 6,5 liter vann og den uklare suspensjon man herved fikk, ble heldt i en kromatografikolonne fylt med 1,6 kg aktivert kull og 1,6 kg diatomé jord. Som aktivt kull kan der brukes Darco G-60 og Celite 545. Kolonnen ble utviklet og eluert med vandig aceton i porsjoner med øende acetoninnhold og sluttelig med aceton. Eluatet ble oppsamlet i fraksjoner og de fraksjoner som viste antibiotisk aktivitet, ble blandet og inndampet til tørrhet. En oppløsning av residuet i et lite volum benzen ble lyofili-sert, hvorved man fikk chalcomycin som et amorft pulver. Dette produkt viste en spesi-27

fik dreining [a] D = 143,5° (c = 1 % i etanol). To ganger utførte mikroanalyse gav som resultat 59,72 %, 59,97 % kullstoff og 8,32 %, 8,29 % hydrogen.

Dette produkts renhet kan betraktes ved å underkaste det motstrømsekstrak-sjon. Når man f. eks. bruker en 25-platers Craig motstrømsekstraktor og et oppløs-ningsmiddel-system som består av n-butanol, cyklohexan og vann (9 : 41 : 50, k = I, 07), isoleres chalcomycinet fra plater nr.

13. Ved mikroanalyse finner man at dette

produkt inneholder 59,84 %, 59,56 % kullstoff, 8,15 %, 8,08 hydrogen og 32,05 % oxygen. En C-metylgruppe-analyse gir en verdi på 10,9 %. Absorpsjonsspektret i det ultrafiolette område, bestemt i etanol, viser et maksimum ved 218 m|x, E ^ ^ = 319 og en avtrapning i området omkring 240 mjx.

Oppløst i kloroform viser chalcomycin absorpsjonsmaksima i det infrarøde område ved omkring 2,83, 3,34, 3,40, 5,83, 5,89, 6,00, 6,13, 6,86, 7,23, 7,40, 7,53, 7,78, 8,00, 8,54, 8,70, 9,00, 9,22, 9,41, 9,67, 10,20, 10,71, II, 20, 11,57 og 11,69 mikroner. Bestemt i en kaliumbromidskive viser absorpsjonsspektret i det infrarøde område maksima omkring 2,84, 3,35, 3,40, 5,81, 5,89, 6,02, 6,12, 6,84, 7,20, 7,38, 7,51, 7,77, 8,08, 8,52, 9,22, 9,40, 9,63, 10,15, 11,19, 11,59, og 12,70 mikroner.

Eksempel 4: Fremstilling av chalcomycin i industriell målestokk.

Der ble fremstillet et næringsmedium

som følger:

Ca. 1200 ml av dette medium ble inn-stillet på en pH-verdi av 7,5 ved tilsetning av 10 N natriumhydroxydoppløsning og 600 ml av mediet ble anbragt i hver sin av to 2-liters Erlenmeyer-kolber. Etter steriliser-ing av mediet ved 121° C i 15 min. ble mediet i begge kolber tilsatt 5 ml av en sporesuspensjon som var fremstillet ved å sus-pandere sporer fra en agar-plate med sporeholdig Streptomyces bikiniensis svarende til NRRL 2737 og dyrket på Anderson's maltose agar i 10 ml steril 0,1 % natriumhep-tadecylsulfat-oppløsning. Der ble så inkubert i 32 timer ved 27° C under omrøring og luftning frembragt av en roterende plate med 200 omdreininger pr. min. i sirkel med diameter 6 cm.

75,7 liter av et medium med den ovenfor angitte sammensetning ble blandet med

175 ml skumningshindrende middel og sterilisert i 62 min. ved 121° C i en 190 liters fermentasjonsbeholder av rustfritt stål. Blandingen ble avkjølet og derpå podet med 200 ml av produktet fra 32 timers fermentasjon samt inkubert i 40 timer ved 26° C under effektiv omrøring og gjennomled-ning av 275 liter luft pr. min.

1135,5 liter av et medium med den sammensetning som er angitt i begynnel-sen av dette eksempel ble blandet med 1 liter skumningshindrende middel og sterilisert i 65 min. ved 121° C i en 1900 liters fermentasjonsbeholder av rustfritt stål. Blandingen ble derpå avkjølet og podet med 75,7 liter av produktet fra 40 timers fermentasjon erholdt fra 190 liters fermentasjonsbeholderen og man utførte en fermentasjon i 24 timer ved 26° C under om-røring med 91 omdreininger pr. min. og luftning med 1274 liter luft pr. min. Skumningshindrende middel ble tilsatt etter behov, der ble anvendt ca. 300 ml.

Ca. 13,62 m<3> av et medium med den sammensetning som er angitt i begynnel-sen av dette eksempel, ble sterilisert i 66 min. ved 121° C i en 19 m<3> fermentasjonsbeholder av rustfritt stål og under tilsetning av skumningshindrende middel etter behov. Blandingen ble avkjølet og podet med 1135 av produktet fra 24 timers fermentasjon erholdt fra fermentasjonsbeholderen med volum 1900 liter. Fermentasjonen ble utført i 40 timer ved 26° C under omrøring med 112 omdreininger pr. min. og luftning med 6,23 m3 luft pr. min. Skumningshindrende middel ble tilsatt etter behov.

Den oppsamlede fermentasjonsblanding (volum ca. 14,383 m<3>) ble filtrert på to trommelfiltere under anvendelse av 56,8— 68,1 kg diatoméjord som filterdekke og 182 —227 kg diatoméjord som filtreringshjelpe-middel for hvert trommelfilter. Som diatoméjord kan der brukes produkter som «Celite 545». Den filtrerte kulturvæske ble ekstrahert med halvparten av sitt volum etylendiklorid. Det erholdte ekstrakt ble blandet med etylendiklorid-ekstrakter erholdt på samme måte fra ytterligere 393,9 m<3> av en lignende fermentasjonsblanding. De blandede etylendikloridekstrakter ble konsentrert til en sirup under forminsket trykk ved 35° C. Den erholdte sirup ble opp-løst i 178 liter metanol og oppløsningen ekstrahert i en motstrøms sentrifugalekstraktor med 6,737 m<3> heptan som var met-tet med metanol. Heptanekstraktet som har liten antibiotisk aktivitet, ble kastet vekk.

Metanolfasen ble inndampet under

forminsket trykk og ved en temperatur på mindre enn 20° C til et volum på 37,85 liter. En kromatografi-kolonne med diameter ca.

30 cm ble fylt med 37,4 kg aktivt stenkull

og 37 kg diatoméjord fra en metanolsus-pensjon. Som diatoméjord er «Darco G-60» og «Celite 545» tilfredsstillende. De 37,85 liter metanoloppløsning ble heldt i denne kromatografikolonne som derpå ble utviklet og eluert med i det hele 2,09 m<3> metanol og i det hele 1,117 m<3> aceton. Metanolelu-atene ble oppsamlet i 11 fraksjoner og ace-toneluatene i 7 fraksjoner. Hver av de således erholdte 18 eluatf raks joner ble un-derkastet biologisk analyse på antibiotisk aktivitet og de fraksjoner som viste en sterk aktivitet, ble for seg inndampet til tørrhet under forminsket trykk ved en temperatur under 25° C. Residuene fra disse fraksjoner ble oppløst i tertiær butanol og de erholdte oppløsninger ble lyofili-sert. De herved erholdte faste stoffer ble blandet og omkrystallisert fra tertiær butanol. Det herved erholdte krystallinske produkt ble oppsamlet på filter, vasket med tertiær butanol og tørret i vakuum i 56 timer. Det erholdte produkt er chalcomycin som inneholder tertiær butanol fra kry-stillisasjonsvæsken. Denne tertiære butanol kan ikke fjernes ved tørring ved romtemperatur under et trykk på 100 mikron i 1 uke. Det på denne måte erholdte produkt viser et absorpsjonsmaksimum i det ultrafiolette område ved 220 m(.i i absolutt etanol. E ^ ^ = 294. Den spesifikke drei-28

ning er [a]' D = 39,5° (c = 1 % i etanol). Ved mikroanalyse fant man etter tap av 12,77 % ved fordampning følgende verdier: 59,50 %, 59,78% kullstoff, 8,15%, 8,14 % hydrogen, 31,43 % oxygen og 0,32% aske.

Chalcomycin som inneholder tertiær butanol som krystallisasjonsvæske viser seg ved biologisk undersøkelse å være om-trentlig 85 % så aktivt mot Sarcina lutea PCI 1001 W som rent chalcomycin.

For å få rent chalcomycin, ble 1445 g av det krystallinske chalcomycin som inneholder tertiær butanol som krystallisasjonsvæske, oppløst i 2890 ml absolutt etanol som var oppvarmet til 55° C. Der ble derpå tilsatt 11 560 ml vann under stadig omrøring med påfølgende tilsetning av 300 ml etanol. Den klare oppløsning ble filtrert og filtratet holdt ved £0—24° C i 20 timer, derpå ved 5—8° C i 24 timer. De store, vel-definerte krystaller som herved skilte seg ut, ble oppsamlet på filter, vasket med is-vann og derpå tørret i vakuum. Det således erholdte produkt er chalcomycin som smelter på en oppvarmet blokk ved ca. 121—123° C. Produktet er i det vesentlige identisk med hensyn til sammensetning og fysikal-ske egenskaper med rent chalcomycin som erholdt ved å gå frem som angitt i de fore-gående eksempler.

Eksempel 5: Fremstilling av chalcomycindiacetat.

En oppløsning av 200 mg chalcomycin i 3 ml pyridin og 2 ml eddiksyreanhydrid hensettes ved ca. 25° C i 48 timer, hvorpå den inndampes til tørrhet i vakuum. Det erholdte residuum omkrystalliseres fra vandig metanol, hvorved man får chalcomycin-diacetat med smeltepunkt 148,5—150° C. Ved mikroanalyse ble det funnet at produktet inneholder 59,02 %, 58,85 % kullstoff, 7,51%, 7,67 % hydrogen og 10,50 %, 11,42 % acetyl. Absorpsjonsspektret i det ultrafiolette område viser et maksimum ved 217 m|x. E 1 c^ = 281. Oppløst i kloroform observeres fremtredende absorpsjonsmaksima i spektrets infrarøde område ved 2,83, 3,30, 3,37, 5,74, 5,84, 5,92, 6,04, 6,14, 6,85, 7,25, 7,38, 7,50, 7,80, 8,00, 8,51, 8,90, 9,17, 9,37, 9,50, 9,68, 10,19, 10,35, 11,20, 11,53 og 11,68 mikroner. Denne forbindelse er inaktiv mot Sarcina lutea ved en konsentrasjon på 500 mikrogram/ml.

Eksempel 6: Fremstilling av tetrahydrochalcomycin- diacetat.

0,896 g chalcomycin oppløst i 20 ml etanol rystes i kontakt med hydrogen ved romtemperatur og atmosfæretrykk i nærvær av palladium-på-kalsiumkarbonat-katalysator med 5 % palladium. En kataly-sator bestående av 5 % palladium på kull kan også brukes. Etter forbruk av ca. 2 mol hydrogen pr. mol chalcomycin ble kataly-satoren fraskilt ved filtrering og filtratet inndampet til tørrhet under forminsket trykk. Residuet består av tetrahydrochalcomycin i form av råprodukt og med mindre enn 5 % av chalcomycinets aktivitet mot Sarcina lutea. 250 mg av dette stoff ble oppløst i en blanding av 3 ml pyridin og 3 ml eddiksyreanhydrid. Man lot oppløs-ningen stå ved romtemperatur i 48 timer, hvorpå man inndampet den til tørrhet under forminsket trykk. Ved omkrystallisa-sjon av residuet fra vandig metanol fikk man tetrahydrochalcomycin-diacetat med smeltepunkt 178—179° C. Ved mikroanalyse fant man 58,79 %, 58,70 % kullstoff og

8,43 %, 8,17 % hydrogen. Ved bestemmelse i en kaliumbromidskive viser maksima i det infrarøde område seg ved 2,87, 3,40, 5,72, 5,84, 6,85, 7,24, 8,05, 8,28, 8,53, 8,87, 9,10, 9,34, 9,96 og 10,36 mikroner. I etanolopp-løsning observeres et absorpsjonsmaksimum i det ultrafiolette område ved 286 m\ i. 2 cm = 0,63. Denne forbindelse er inaktiv mot Sarcina lutea ved en konsentrasjon på 1 mg/ml.

Eksempel 7: Sur hydrolyse av chalcomycin.

En oppløsning av 908 mg chalcomycin i 40 ml 50 %'s vandig metanol, 1-molar med hensyn til saltsyren ble oppvarmet under tilbakeløpskjøling i 10 min. Metanolen ble derpå fjernet ved destillasjon under forminsket trykk og det vandige residuum ekstrahert med tre porsjoner kloroform. Klo-roformekstraktene ble blandet og inndampet til tørrhet, hvorpå residuet ble omkrystallisert fra en blanding av isopropyleter og aceton. Det krystallinske produkt erholdt ved sur avbygning av chalcomycin smelter ved ca. 187—189° C og viser seg ved mikroanalyse å inneholde 60,35 %, 60,19% kullstoff og 7,95 %, 8,08 % hydrogen. Et absorpsjonsmaksimum i det ultrafiolette om-1 °Io

råde observeres ved 308 mjx. E j cm = 1,13.

Spekteret i det infrarøde område bestemt i en kaliumbromidskive er karakteristisk ved absorpsjonsmaksima ved 2,90, 3,36, 3,43, 3,54, 5,80, 5,85, 5,93, 6,08, 6,87, 7,24, 7,35, 7,59, 7,90, 8,56, 8,76, 8,91, 9,21, 9,38, 9,56, 10,26, 10,45, 10,87, 11,62, 12,54, 13,27 og 14,13 mikroner. Denne forbindelse er inaktiv mot Sarcina lutea ved en konsentrasjon på 1 mg/ml.

Eksempel 8: Alkalisk hydrolyse av

chalcomycin.

En oppløsning av 1,03 g chalcomycin i 100 ml 50 %'s vandig metanol som er 0,1-molar med hensyn til natriumhydroxyd ble hensatt ved romtemperatur i 24 timer. Metanolen ble derpå fjernet ved fordampning og den tilbakeblivende vandige blanding ble vasket med tre porsjoner kloroform som ble kastet vekk. Det vandige residuum ble surgjort til en pH-verdi på 2 og ekstrahert med tre porsjoner kloroform. Kloroform - ekstraktene ble blandet og inndampet til tørrhet i vakuum. Residuet ble omkrystallisert fra en blanding av isopropyleter og metanol. Det herved erholdte krystallinske produkt smeltet ved 273—276° C og viser ikke noe bemerkelsesverdig absorpsjonsmaksimum i det ultrafiolette område fra

220 til 300 m^. Mikroanalyse viste at produktet inneholdt 59,13 % kullstoff, 8,19%

hydrogen og 31,83 % oxygen. Absorpsjons-spekteret i det infrarøde område, bestemt i

en kaliumbromidskive viser fremtredende

maksima ved 2,85, 3,39, 5,65, 5,81, 6,85, 7,20,

7,40, 8,55, 8,83, 9,20, 10,00 og 10,37 mikroner.

Denne forbindelse er inaktiv mot Sarcina

lutea ved en «konsentrasjon på 1 mg/ml.

Claims

Framgangsmåte til framstilling av et

nytt antibiotikum, chalcomycin, karakterisert ved at man poder et vandfg

næringsmedium som inneholder kilder for assimilerbart kullstoff og for nitrogen med en Streptomyces bikiniensis-kultur som til-svarer NRRL 2737, hvorpå man inkuberer det podede medium under aerobe betingelser ved temperaturer mellom 20 og 35° C ved en pH-verdi mellom 6 og 8,5 inntil mediet er bibragt vesentlig antibakteriell aktivitet, hvoretter man eventuelt skiller uopp-løst fast stoff fra den resulterende blanding og isolerer chalcomycin fra den vandige oppløsning.