NO127316B - - Google Patents

Description

Fremgangsmåte til fremstilling av L-6-diazo-5-oksonorleucin på biologisk vei.

Foreliggende oppfinnelse angår en

fremgangsmåte til på biologisk vei å frem-stille L-6-diazo-5-oksonorleucin.

Denne forbindelse har enestående tera-pevtiske egenskaper, således som det vil

fremgå av den følgende beskrivelse. Den

inneholder bare elementene kullstoff

hydrogen, oxygen og nitrogen og den har

den empiriske formel CuH<,N30.,. Dens mole-kylvekt er 171 og den kan representeres av

strukturf ormelen:

Den er relativt ustabil overfor varme og spaltes før den smelter. Spaltningen inntrer ikke ved noen bestemt temperatur og spaltnings- og smeltepunktene varierer innen et stort område avhengig av den metode som brukes til bestemmelsen av disse. Spaltningen begynner i alminnelighet ved omkring 145° C og kan fortsette inntil en temperatur på 155° C er nådd. Spaltningen ledsages av gassutvikling. Forbindelsen spaltes i vandige syrer under frigjør-ing av nitrogen. Hydrogenbindingskurver viser verdier for pK'a i vann på 2,1 og 8,95. Den spesifikke optiske dreiningsevne r 126 for u D for L-6-diazo-5-oksonorleucin er + 21° (5,4 pst. i vann). L-6-diazo-5-oksonorleucin er meget

lett oppløselige i vann men uoppløselige i

vanlige ikke polære organiske oppløsnings-midler. Den er bare ganske lite oppløselig i absolutt metanol, absolutt etanol og aceton i kold tilstand, men er oppløselig i varme blandinger av disse oppløsningsmidler med vann. Forbindelsen gir spesielle blå purpur ninhydrin farveprøve. Ved oksyda-sjon av L-6-diapzo-5-oksonorleucin med perjodsyre får man L-glutarsyre.

Forbindelsen danner metallsalter ved reaksjonen med hydroksyder, karbonater, bikarbonater og oksyder av alkalimetallér eller jordalkalimetaller og med alkoholater, amider og lignende.

I vandige fosfatpufferoppløsninger med pH-verdi på 7, får man karakteristiske ab-sorbsjonsmaksima i det ultrafiolette om-råde på É ^ ^ == 683 ved en bølgelengde på 274 millimikroner og på 376 ved en bølgelengde på 244 milimikroner. L-6-diazo-5-oksonorleucin har et eien-dommelig absorbsjonsspektrum i det infra-røde område. Bestemt ved kaliumbromid-skivemetoden viser spektrert absorbsjons-topper ved følgende bølgelengder: 3,19, 3,32, 3,78, 4,66, 6,14, 6,30, 6,59, 6,90, 7,18, 7,39, 7,54, 8,33, 8,66, 8,98, 9,36, 9,71, 10,08. 10,22, 10,59, 11,65, 12,08, 12,34 og 1316 mikroner.

Forbindelsen har fremtredende fyto-toksiske (plantedrepende) egenskaper og er særlig fordelaktig som herbicid middel, til bekjempelse av ugress og lignende. Den er også fordelaktig ved at den har en hemmende virkning på biosyntese frem-brakt av levende celler, av viktige nuklein-syrer og av stoffer som danner sådanne syrér. Videre har forbindelsen en hemmende virkning på veksten av neoplasmer, og er av denne grunn pootensielt verdifull for behandling av neoplasme-sykdommer hos mennesker og dyr.

L-6-diazo-5 oksonorleucin er særlig aktivt mot gjærarter. På grunn av denne

egenskap er anvendelse av forbindelsen fordelaktig ved isolering av bakterier fra kolonier bestående av blandinger av forskjellige mikroorganismer i hvilke én eller flere av bestanddelene er gjærsopper.

Ifølge foreliggende oppfinnelse frem-stilles L-6-diazo-5-oksonorleucin ved en mikrobiologisk syntese, omfattende dyrkning av en mikro-organisme som her be-tegnes Streptomyces C-2943 under kunstige betingelser i et passende nærende medium. Detaljene ved denne fremgangsmåte bekrives i det følgende.

Streptomyces C-2943 er en hittil ukjent mikro-organisme som forekommer i jord-bunnen. Den ble først isolert fra en jord-prøve som var oppsamlet ved Chincha, Peru. Kulturer av den levende organisme er innlemmet i de permanente samlinger i Culture Bureau hos Parke, Davis & Compa-ny Detroit 32, Michigan, under nr. 04997 og i kultursamlingene i Fermentation Division, Northern Utilization Research Branch, U.S. Departement of Agriculture' Peoria, Illinois,

U. S. A.

Kulturer av den nevnte mikro-organisme kan fåes ved at man fremstiller en suspensjon i sterilt vann av en jordbunn-prøve inneholdende mikro-organismen, lar de tyngre partikler bunnfelles, platter ut den herved erholdte": suspensjon i seriefor-tynninger på plater med nærende agar, inkuberer platene ved 24 til 28° C for å frem-bringe vekst av mikro-organismen og over-føre utvalgte, enkelte kolonier som ligner Streptomyces. C-2943 til nye plater med nærende agar. Ved gjentagne ganger å ut-velge og overføre ikke forurensede karakteristiske kolonier til nye plater med nærende agar, fåes rene kulturer av den ønskede mikro-organisme.

Streptomyces C-2943 er et aerobt og i luften sporeutviklende medlem av familien Actinomycetales og tilhører arten Streptomyces som beskrevet i 6te utgave av Ber-gey's Manual of Determinative Bacteriology. Organismen har følgende karakteris-tika: når den dyrkes på media bestående av glykose-trypton eller nærende agar, er det primære mycelium i de underliggende sjikt grått til sort, ved dyrkning på media bestående av asparaginglycerol' eller glykose-syntetisk agar, er myceliet hvitt eller lysegrått til lyst purperfarvet eller lysé-rødt til grått og ved dyrkning på Czapek's medium eller kalsiummalat-agarmedia, er myceliet hvitt til lysegult til grått. Ved anvendelse av disse media er luftmyceliet først hvitt og blir senere grått. Når organismen dyrkes i media bestående av gly- - kose-trypton eller nærende agar, viser det seg en mørkebrun eller mørk farvning i substratet, men når organismen dyrkes i glycerol-asparagin, Czapek's medium eller kalsium-malat-agarmedium, forblir mediets farve i det vesentlige uforandret. Sett under mikroskopet er lufthyfene lange, idet deres lengde varierer fra omkring 100 til 500 mikroner. Der inntreffer primære og i noen tilfelle sekundære forgreninger. Der forekommer også endeløkker og spira-ler. Spiralenes lengde varierer og de består av 2 til 15 vindinger. Vindingene er ofte løse og uregelmessige. Ytre (distale) deler av disse lufthyfer deler seg i spore-kjeder.

Organismen overfører langsomt gela-tin i flytende form, idet den farver mediet mørkebrunt. I alminnelighet peptoniserer den ikke lakmusmelk. I syntetiske media

(Pridham et al. J. Bacteriology, '56,108 1948)

nyttiggjør organismen seg tallrike kull-stoffkilder hvoriblant L-arabinose, cellobi-ose, dekstrin, glykose, D-galaktose, glycerol, i-inositol, inulin, laktose, levulose, mal-tose, D-mannitol, D-mannose, melibiose, raffinose, rhamnose, stivelse, sukrose, tre-halose og D-xylose mindre lett adonitol, aesculin og salicin, men nyttiggjør seg ikke dulcitol, melezitose og D-sorbitol. Organismen nyttiggjør seg anorganiske og organiske nitrogenkilder.

Fremstilling av L-6-diazo-5-oksonorleucin under anvendelse av Streptomyces C-2943 utføres ved å pode et passende, sterilt vandig nærende medium med Streptomyces C-2943, inkubere den resulterende blanding under sterile, aerobe betingelser ved temperaturer mellom omkring 20 og 35° C, fjerne det faste materiale som er tilstede i dyrkningsblandingen og isolere den ønskede L-6-diazo-5-oksonorleucin fra den vandige kulturvæske.

Til podningen kan der brukes sporer eller konidier av Streptomyces C-2943 så vel som vandige suspensjoner av samme inneholdende en liten mengde såpe eller annet fuktningsmiddel. Til dyrkninger i stor målestokk foretrekkes det å bruke kraftige, unge kulturer av Streptomyces C-2943 istedet for sporene eller konidiene eller vandige suspensjoner av disse. Egnede vandige, nærende medie er dem som har en pH-verdi på mellom 5,0 og 8,5 og inneholder kilder for kullstoff og nitrogen samt anorganiske salter. Blant de egnede kilder for kullstoff og nitrogen er soyabønnemel, hvetegluten-mel, ølgjær, svi-hemave (ekstrahert med saltvann), kjøtt-proteinhydrolysater, «distillers solubles» og faste stoffer fra kornstøpvæsker. Det er funnet at også flere kombinasjoner av disse kilder for kullstoff og nitrogen med andre nitrogenholdige materialer som blandinger av soyaoljebønnemel, syrehydrolisert kasein og avbitret gjær, blandinger av svinemave-ekstrahert med saltvann og soyabønnepep-ton og blandinger av soyaoljebønnemel og kasein hydrolysert med syre, frembringer særlig gode resultater. De optimale konsentrasjoner for disse bestanddeler varierer fra 1,5 til 2 pst. beregnet på mediets total-vekt. Kilden for kullstoff kan bestå ute-lukkende av de foran nevnte materialer, men de beste resultater opnåes når glykose eller galaktose tilsettes mediet. Konsentrasjonen av glykose eller galaktose kan variere fra 0 til 2 pst. Konsentrasjoner over 2 pst. synes å ha en skadelig virkning på utbyttet av det ønskede produkt. Som anorganiske 'salter kan der brukes natrium-klorid, ammoniumklorid, ammoniumnitrat, kaliumklorid, kalsiumkarbonat og lignende. Ammoniumsalter som ammoniumklorid og ammoniumnitrat er. særlig fordelaktige bestanddeler og fører til høye utbytter av det ønskede produkt. Den optimale konsentrasjon av disse ammoniumsalter er mellom 0,1 og 0,5 pst. beregnet på det nærende medium.

Dyrkningen av Streptomyces C-2943 i vandige, nærende media kan utføres på flere forskjellige måter. Således kan f. eks. mikro-organismene dyrkes under aerobe betingelser på overflaten av slike media, eller de kan dyrkes under medienes overflate, dvs. under submerse betingelser hvis oxygen samtidig tilføres.

Den foretrukne metode for fremstilling av L-6-diazo-5-oksonorleucin ved dyrkning i stor målestokk omfatter bruken av submerse kulturer eller dypkulturer av Streptomyces C-2943. I denne utførelsesform for dyrkning podes et sterilt, vandig nærende medium med Streptomyces C-2943 og inkuberes under omrøring og luftning véd temperaturer mellom omkring 20 og 35° C, fortrinnsvis omkring 23—29° C, inntil L-6-diazo-5-oksonorleucin har dannet seg i en høy konsentrasjon i kulturvæsken. Det tidsrom som kreves for den maksimale pro-duksjonen av L-6-diazo-5-oksonorleucin varierer med den anvendte apparaturs stør-relse og type. Således oppnåes ved dyrkning i stor industriell målestokk, som den utføres i dyrkningsapparater av tanktypen, en maksimal produksjon av L-6-diazo-5-oksonorleucin i løpet av omkring 32 timer eller mindre. Når rystekolber brukes til dyrkningen, kan oppnåelsen av maksimal produksjon kreve lengere tid, enn dyrkningen i stor målestokk i kar, nemlig fra 3 til 8 døgn. Under submerse dyrk-ningsbestémmelser utvikler mikroorganismen seg som mer eller mindre distinkte partikler som er fordelt gjennom hele det nærende medium, i motsetning til de mere eller mindre kontinuerlige hinner ^om er tilstede på mediets overflate veri overflatekulturmetoden. På grunn av denne fordeling av organismen gjennom hele mediet, kan stor volum av det podede, nærende medium dyrkes på samme tid i de tanker og kar som i alminnelighet brukes i gjær-ingsindustrien. Stasjonære dyrkningskar forsynt med passende anordninger for om-røring og/eller luftning såvel som dyrkningsapparater i form av horisontale trom-ler, er funnet å være særlig fordelaktige i denne henseende. For fremstilling av mindre mengder av det antibiotiske middel eller av kulturer av "mikroorganismen, kan imidlertid dyrkningen under submerse betingelser utføres i små kolber eller kruk-ker som kan rystes eller i hvilke der kan omrøres med passende mekaniske anordninger.

Omrøring og luftning av kulturene kan utføres på flere måter. Omrøringen kan besørges av turbiner, skovler, sentrifugal-rørverk («impellers») eller andre mekaniske omrøringsanordninger, ved å la dyrk-ningsapparatet rotere eller ved å ryste det. ved forskjellige pumpeanordninger eller ved å lede luft eller andre oksygenholdige gasser gjennom mediet. Luftning kan ut-føres ved å blåse luft eller andre oksygenholdige gasser inn i dyrkningsblandingén gjennom rør med åpne munninger, perfo-rerte rør, porøse diffusjonsinnretnihger som kullstaver, karborundum, sintret glass og liknende eller luftning kan utføres ved å dusje mediet, plaské i det eller å la det løpe over inn i eller gjennom en oksygen-holdig atmosfære.

Overflatekulturmetoden til fremstilling aV L-6-diazo-5-oksonorleucin omfatter de trinn at man poder et tynt sjikt (i alminnelighet med mindre enn 2 cm dybde) av et stérilt vandig nærende medium med Streptomyces C-2943 og inkuberer blandingen under aerobe betingelser ved en temperatur mellom omkring 20 og 25° C, fortrinnsvis i nærheten av 23—29° C. En lengere inkubasjonsperiode enn den som brukes i dypkulturmetoden~. er i alminnelighet nødvendig for ,å oppnå den maksimale produksjon av L-6-diazo-5-oksqnor-leucin. I alminnelighet er inkubasjonsperioden fra omkring tre til åtte døgn.

Etter fullførelsen av dyrkningstrinnet i fremgangsmåten fjernes det faste materiale fra kulturvæsken f. eks. ved filtrering, sentrifugering osv. L-6-diazo-5-oksonorleucin som inneholdes i den væske man får herved, isoleres i konsentrert eller krystal-linsk form. En hensiktsmessig metode. til isolering av produktet omfatter de trinn at man konsentrerer den klarede kulturvæske til lite volum, f. eks. en femtedel til en tyvendedel av det opprinnelige volum, til-setter fra omkring tre til ti ganger kon-sentratets volum av et med vann blandbart organisk oppløsningsmiddel som metanol eller .etanol, skiller de herved utfeldte forurensninger fra oppløsningen, underkaster den således rensede oppløsning adsorpsjon og eluerihg med et adsorpsjonsmiddel "for . L-6-diazo-5-oksonorleucin og utvinner produktet fra eluatet.

Én annen hensiktsmessig metode omfatter de trinn at man inndamper den klarede kulturvæske til tørrhet, ekstra-herer residuet med et med vann blandbart organisk oppløsningsmiddel inneholdende mindre enn 50 pst. vann, underkaster ekstraktet adsorpsjon og eluering med et adsorpsjonsmiddel for L-6-diazo-5-oksonorleucin og utvinner produktet fra eluatet. Adsorpsjonen utføres ved å lede den rensede oppløsning eller ekstraktet gjennom, en adsorpsjonskolonne inneholdende et nøytralt adsorpsjonsmiddel hvis pH-verdi ligger mellom 5 og 8, fortrinnsvis mellom 6 og 8, eller er innstillet på en så-dan pH-verdi. Eksempler på egnede ad-sorpsjonsmidler er aluminiumoksyd eller Brockmann's aluminiumoksyd. Produktet elueres fra adsorpsjonsmidlet med vann eller, en blanding av vann med et med vann blandbart organisk oppløsningsmid-del.

Eluatet oppsamles i fraksjoner og de fraksjoner som viser den sterkeste adsorpsjon i det ultraviolette område ved en bøl-gelengde på omkring 275 millimikroner, tørres. På grunn av at produktet er usta-bilt ved høyere temperaturer foretrekkes det å, fjerne elueringsmidlet ved å fryse eluatet og utsette den frosne masse for et høyt vakuum.

Produktet kan renses ytterligere ved adsorpsjon og eluering under anvendelse av

aktivt kull. For dette formål oppløses det tørre produkt, fremstillet som ovenfor beskrevet, i en liten mengde vann inneholdende en mindre mengde av et med vann blandbart organisk oppløningsmiddel. Oppløsningens pH-verdi innstilles derpå om . nødvendig, på 6 til 7, oppløsningen ledes gjennom en adsorpsjonskolonne inneholdende aktivt kull og kolonnen elueres med vann inneholdende en' mindre mengde av et med vann blandbart organisk opp-løsningsmiddel, fortrinnsvis aceton. Som oppløsning for absorpsjonstrinnet er vann inneholdende en mindre mengde av et organisk oppløsningsmiddel som aceton, metanol,, etanol, fenol eller liknende, tilfreds-stillende. Fortrinnsvis brukes der vann inneholdende omkring 1 pst. aceton og man anvender en mengde oppløsningsmiddel som er tilstrekkelig til å gi en oppløsning inneholdende omkring 2 til 10 mg av L-6-diazo-5-oksonorleucin pr. ml. Den mengde aktivt kull som kreves til å absorbere hele mengden av det ønskede produkt fra opp-løsningen, varierer med konsentrasjonen av L-6-diazo-5-oksonorleucinet i det tørre produkt. Således krever i alminnelighet materiale inneholdende 5 pst. L-6-diazo-5-oksonorleucin omkring 15 g aktivt kull pr. g. De beste resultater oppnåes når det aktive kull på forhånd suspenderes med diåtoméjord, på grunn av at sistnevnte stoff bidrar til å opprettholde en tilfreds-stillende strømningshastighet. Etter ad-sorpsjonstrinnet elueres kolonnen ved å vaske. den med et passende elueringsmiddel som vann inneholdende mindre enn 25 pst. av et med vann blandbart organisk

oppløsningsmiddel. Man får de beste resultater når man bruker en 1 pst.'s oppløs-ning av aceton i vann. Eluatet oppsamles i fraksjoner og de fraksjoner som viser den sterkeste absorpsjon i det ultraviolette område ved en bølgelengde på omkring 275 millimikroner, tørres i frossen tilstand. Om ønskes kan det således erholdte, tørre produkt viderebehandles véd omkrystalli-sasjon fra et passende oppløsningsmiddel som vandig metanol, etanol og liknende. Produktet er i enhver henseende identisk med det produkt man får ved kjemisk syntese.

De følgende eksempler illustrerer i detalj fremstilling av L-6-diazo-5-oksonorleucin ved mikrobiologisk syntese.

Eksempel 1.

Av et nærende medium med følgende sammensetning: ..... anbringes porsjoner på hver 300 ml i to en-liters Erlenmeyer-kolber og mediets pH-verdi innstilles på 7,5 med 6 n natri-umhydroksyd-oppløsning. Mediet steriliseres derpå ved å oppvarme kolbene ved 120° G i 25 minutter. Mediet avkjøles og mediet i hver av kolbene podes med 2 ml av en suspensjon i 40 ml steril 0,01 ,pst.'s Kastilsåpeoppløs-ning eller med sporer fra fire agar (glykose-trypton-mineralsalter) platekulturer av Streptomyces C-2943. Kolbene holdes ved romtemperatur (24—26° C) i 90 timer under omrøring frembragt ved mekaniske rysteapparater som bringer kolbene til å rotere med en hastighet på 160 omdreininger pr. min i en sirkel med 6 cm's diameter. Kulturvæsken inneholder omkring 1 mg L-6-diazo-5-oksonorleucin bestemt ved skive-plate-agardiffusjonsprøver («disk -plate-agar-diffusion-tests») som omfatter måling av den utstrekning i hvilken veksten av gjær ar ten Torulopsis albida NRRL Y1400 forhindres. Kulturvæsken filtreres og det ønskede produkt L-6-diazo-5-oksonorleucin isoleres fra filtratet ved adsorb-sjons- og elueringsmetoder som beskrives i detalj i det følgende.

Eksempel 2:-

12 liter av et medium med følgende sammensetning:

Natriumhydroksydoppløsning

(10 n) tilstrekkelig til å bringe pH-verdien på 7,5.

anbringes i et 30-liters dyrkningskar av glass forsynt med utstyr av rustfritt stål, omfattende fordeler, sentrifugalrøreverk,

støtvegger og ledning for uttagning av prøver. Mediet steriliseres ved opphetning til 121° C i to timer. Mediets pH-verdi etter steriliseringen er 7,8. Mediet avkjøles og podes med en suspensjon i 10 ml steril 0,1 pst.'s natriumheptadecylsulfatoppløsning av sporer fra en agar (glykose-trypton-mineralsalter) platekultur av Streptomyces C-2943. Det podede medium inkuberes ved 25—26° C i 72 timer og mediet omrøres derunder med et røreverk hvis hastighet er 225 omdreininger pr. min, mens steril luft ledes inn i mediet med en hastighet på 12 liter pr. min. Under inkuberingen tilsettes 98 ml av en steril blanding av talgolje og mineralolje inneholdende mono- og diglyserider etter behov for å begrense skumning. Den således erholdte inkuberte kultur brukes til å pode de hovedkulturer som beskrives i det følgende.

Fire 30 liters dyrkningskar av glass, hvert inneholdende 16 liter av det ovenfor beskrevne medium, steriliseres ved 121° C i to timer. pH-verdien etter steriliseringen er 7,6. Man lar dyrkningskarene inneholdende det sterile medium avkjøles til romtemperatur. Porsjoner på hver 800 ml av den ovenfor beskrevne inkuberte kultur anbringes i hvert dyrkningskar og de podede media inkuberes ved 25—26° C i 40 timer. Under hele inkuberingsperioden til-føres luft gjennom en spreder med en hastighet av 16 liter pr. min, og omrøringen besørges av et sentrifugalrøreverk («im-peller») hvis hastighet er 200 omdreininger pr. min. Under inkuberingen tilsettes etter behov for å begrense skumning 30 ml av en steril blanding av talgolje og mineralolje til hvert dyrkningskar. Konsentrasjonen av. L-6-diazo-5-oksonorleucin i dyrknings-mediene etter inkubasjonen, er omkring 37 mikrog pr. ml.

De faste stoffer som er tilstede i de inkuberte dyrkningsmedia fjernes ved å røre ut i mediene 1 pst. diatoméjord og derpå filtrere. Filtratene har den ønskede biologiske aktivitet. Således, forhindrer f. eks. daglige intraperitonale injeksjoner på 0:1 ml av filtratene i løpet av 5 døgn i høy grad veksten av innpodede Sacroma 180-tumorer på mus.

Filterkaken vaskes med vann og filtratene og vaskevannene forenes (41,5 liter). De inndampes derpå i vakuum til et volum på 1920 ml. Konsentratet tilsettes etanol i slik mengde at volumet bringes på 19,2 liter, det bunnfall som herved dannes fjernes ved filtrering og filteirkaken vaskes med etanol. Det alkoholiske filtrat (pH-verdi 6,5) ledes gjennom en adsorpsjonskolonne som er forberedt slik som det beskrives i det følgende.

2,3 kg aluminiumoksyd omrøres med fortynnet saltsyre slik at pH-verdien forblir konstant 6,4. Aluminiumoksydet skil-les fra saltsyren, vaskes med vann og aktiveres ved oppvarmning til 200 ° C i 4 timer. Aluminiumoksydet omrøres derpå med 90 pst.'s vandig etanol og pakkes i en kolonne hvis diameter er 10 cm (det volum kolonnen kan oppta er 2300 ml, strømningshas-tigheten ved væskens tyngde er 5 liter pr. time).

Det alkoholiske filtrat som er fremstillet således som ovenfor angitt, ledes inn i adsorbsjonskolonnen og kolonnen vaskes med 1,9 liter 90 pst.'s vandig etanol og derpå med 12,1 liter 75 pst.'s vandig etanol. Perkolatet kastes vekk. Kolonnen elueres derpå med 18 liter 25 pst.'s vandig etanol og eluatet oppsamles i en-liters fraksjoner. De første fem fraksjoner av eluatet inndampes i vakuum og konsentratet tørres i fros-' sen tilstand under høyt vakuum. Det tørrede produkt har den ønskede biologiske aktivitet. Således forhindrer f. eks. intraperito-nal injeksjon to ganger daglig i 5 døgn av 0,5 ml av en vandig oppløsning av produktet (300 gamma pr. ml) i høy grad veksten av innpodede Sarcoma 180 tumorer hos mus.

8-5 g av det tørrede materiale som ved undersøkelse viser omkring 4 pst. L-6-diazo -5-oksonorleucin, oppløses i 150 ml av en 1 pst.'s oppløsning av aceton i vann (pH-verdi 6,2). En adsorbsjonskolonne forbere-des ved å føre en suspensjon av 125 g aktivt kull og 125 g diatoméjord i en oppløsning av 1 pst. aceton i vann inn i en kolonne med diameter 6,5 cm (det volum kolonnon kan oppta er 800 ml, strømningshastigheten ved væskens tyngde 750 ml pr. time). Den vandige oppløsning inneholdende L-6-. diazo-5-oksonorleucin, ledes gjennom kolonnen og kolonnen vaskes med 4,8 liter av en 1 pst.'s acetonoppløsning. Eluatet oppsamles i fraksjoner hver på 100 ml. Den 15de til 23de inklusive av fraksjonene konsentreres og konsentratet tørres i frossen tilstand under høyt vakuum. Det tørrede materiale oppløses i varm 90 pst.'s vandig metanol og man lar oppløsningen stå ved 5° C i flere timer. L-6-diazo-5-oksonor-lcucin, som herved skiller seg ut i krystal-linsk form, oppsamles og tørres i vakuum.

1 °/

E '° = 643 ved 274,5 millimikroner.

1 cm

Produktets kjemiske, biologiske og fysikalske egenskaper er de i den foregående beskrivelse angitte.

Eksempel 3.

a) I en en-liters Erlenmeyer-kolbe anbringes 150 ml av et nærende medium med

følgende sammensetning:

Det nærværende medium steriliseres derpå ved å oppvarme kolben ved 121° C i en halv time, hvorpå det avkjøles og podes med 5 ml. av en suspensjon i 10 ml. steril 0,1 pst. natrium-heptadecyl-sulfat-opp-løsning av sporer fra en agar-(glu-kose-trypton-mineralsalter)-platekultur av Streptomyces C-2943. Kolbens innhold inkuberes ved 26° C i 72 timer under om-røring som besørges av et mekanisk ryste-apparat. Dette bringer kolben til å rotere med en hastighet på 160 omdreininger pr. min. i en sirkel med 6 cm diameter. Den således erholdte inkuberte kultur brukes til å pode 57 liter av det medium som beskrives under b) i det følgende. b) 57 1 nærende medium med den sammensetning som er angitt under a) ovenfor, anbringes i et 114-liters dyrkningskar av rustfritt stål og mediet steriliseres ved oppvarmning til 121° Ci en time. Mediets pH-verdi etter steriliseringen er 6,9. Mediet avkjøles og podes med 90 ml. av den ovenfor beskrevne inkuberte kultur. Det podede medium inkuberes ved 26° C i 24 timer. Under inkubasjonsperioden tilføres mediet steril luft gjennom en fordeler med hastighet på 968 liter pr. min., mens blandingen omrøres med et sentrifugalrøreverk hvis hastighet er 200 omdreininger pr. min. Den således erholdte inkuberte kultur av Streptomyces C-2943 anvendes til å pode 568 liter av det medium som beskrives under c) i det følgende. c) 568 liter nærende medium med den under a) ovenfor beskrevne sammensetning, anbringes i en 757 liters dyrknings-beholder av rustfritt stål og steriliseres ved oppvarming til 121° C i en time. Mediets pH-verdi etter steriliseringen er 6,7. Mediet avkjøles og podes med 57 liter av den under b) ovenfor beskrevne inkuberte kultur. Blandingen inkuberes ved 27° C i 27 timer.

Under inkubasjonsperioden tilføres blandingen steril luft gjennom en fordeler med en hastighet på 707 liter pr. min. og blandingen omrøres med et sentrifugalrøre-verk hvis hastighet er!200 omdreininger pr. min. For å begrense skumning tilsettes fra tid til annen og etter behov, 2,4 liter av en steril blanding av lardolje og mineraloljer inneholdende mono- og diglycerider.

Det faste stoff som er tilstede i den inkuberte blanding fjernes ved filtrering gjennom en filterpresse av plate- og ram-metypen og i hvilken filtrene på forhånd er dekket med diatoméjord. Filtratet inndampes under redusert trykk til et volum på omkring 30 liter. Konsentratet blandes med 272,5 liter etanol og det bunnfall som herved danner seg, fjernes og kastes vekk. d) En porsjon (180 liter) av etanolfiltra-tet hvis totalvolum er 290 liter og pH-verdi 5,9), ledes gjennom en adsorpsjonskolonne som er fremstillet på følgende måte: 22,7 kg aluminiumoksyd omrøres med fortynnet saltsyre inntil dets pH-verdi holder seg konstant på 6,0. Aluminiumoksydet filtreres, vaskes med deionisert vann og aktiveres ved å oppvarmes til 200° C i 4 timer. Aluminiumoksydet omrøres derpå med 90 pst.'s vandig etanol og pakkes i en 183 cm lang kolonne med diameter 152 mm (det volum kolonnen kan oppta er 17>8 liter, og strømningshastigheten er 34 liter pr. time under et trykk på 0,85 kg/cm2).

Det alkoholiske filtrat hvis fremstilling er angitt ovenfor, perkoleres gjennom ad-sorpsjonskolonnen under et overtrykk på 0,85 kg/cm2. Kolonnen vaskes med 17,8 liter 90 pst.'s vandig etanol og derpå med 120 liter 75 pst.'s vandig etanol. Kolonnen elueres derpå med 108 liter 25 pst.'s vandig etanol og eluatet oppsamles i faksjoner på 9,1 liter. Den 4de, 5te og 6te fraksjon forenes, inndampes i vakuum ved 35° C og konsentratet tørres i frossen tilstand under høyt vakuum.

e) De gjenværende 110 liter av etanol-filtratet fra c) kromatograferes gjennom

12,3 kg aluminiumoksyd ved hjelp av den metode som er beskrevet i d) ovenfor, og eluatet konsentreres og tørres i frossen tilstand.

De tørre pulvere som er erholdt under

d) og e) blandes. Det således erholdte produkt inneholder 2,16 g L-6-diazo-5-oksonorleucin. Produktet renses ved adsorbsjon og eluering på følgende måte: en suspensjon av 780 g aktivt trekull og 780 g diatoméjord i en 1 pst.'s oppløsning av aceton i vann bringes inn i en kolonne med leng-

de 150 cm og diameter 102 mm. Det adsor-berende sjikt har etter bunnfellingen en høyde på 56 cm og det opptar et volum på 4 liter. Væskens strømningshastighet gjennom sjiktet ved dens tyngde er 1,75 liter pr. time ved en væskesøyle på 96,5 cm. Produktet oppløses i 858 ml av en 1 pst.'s oppløsning av aceton i vann og oppløsnin-gen perkoleres gjennom kolonnen. Kolonnen elueres med 20 liter av en 1 pst.'s opp-løsning av aceton i vann. Der oppsamles fraksjoner på hver 500 ml. Fraksjoner nummer 17 til 20 inklusive, forenes og inndampes i vakuum, konsentratet fryses og isen sublimeres fra samme under høyt vakuum. Produktet L-6-diazo-5-oksonorleu~ cin omkrystalliseres fra 90 pst.'s vandig metanol.

1 °/

E 1 cm = 676 ved en kølengde på 274

millimikroner.

Det krystallinske produkt har den ønskede biologiske aktivitet. Således forhindrer f. eks. daglige intraperitonale injeksjoner av en vandig oppløsning av produktet (0,25 mg pr. kg legemsvekt) i fem dager i høy grad veksten av innpodede Sarcoma 180 tumorer hos mus. Produktets kjemiske, biologiske og fysikalske egenskaper er de i den foregående beskrivelse angitte.

Claims (7)

1. Fremgangsmåte til fremstilling av L-6-diazo-5-oksonorleucin, karakterisert ved at man poder med Streptomyces C-2943 et sterilt, vandig nærende medium med en pH-verdi mellom 5,0 og 8,5 og som inneholder passende kilder for kullstoff og nitrogen samt mineralsalter, inkuberer den resulterende blanding under aerobe betingelser ved temperaturer mellom omkring 20 og 35° C, fjerner de faste stoffer som er tilstede i kulturblandingen og isolerer L-6-diazo-5-oksonorleucin fra den vandige kulturvæske.

2. Fremgangsmåte ifølge påstand 1, karakterisert ved at man inkuberer det podede medium under submerse, aerobe betingelser ved en temperatur mellom 23 og 29° C.

3. Fremgangsmåte ifølge påstand 1 eller 2, karakterisert ved at man bruker et nærende medium som inneholder ett eller flere av de følgende nærende stoffer i to-talmengder mellom 1,5 og 2 pst: soya-bønneoljemel, hveteglutenmel, ølgjær, svinemave ektrahert med saltoppløsning' hydrolysat av kjøttprotein, «distiller's solubles», kornstøpvæske, soyabønne-pep-ton og hydrolysert kasein.

4. Fremgangsmåte ifølge hvilken som helst av de foregående påstander, karakterisert ved at det nærende medium som anvendes inneholder mindre enn 2 pst. glykose og/eller galaktose, samt mellom 0,1 og 0,5 pst. av et anorganisk ammoniumsalt.

5. Fremgangsmåte ifølge hvilken som helst av de foregående påstander, karakterisert ved at man isolerer L-6-diazo-5-oksonorleucin ved å konsentrere kulturvæsken til et lite volum, tilsette konsentratet et med vann blandbart, organisk oppløsningsmiddel, fraskille herved utfeldte forurensninger og underkaste den gjenværende oppløsning adsorbsjon og eluering med et adsorberingsmiddel for L-6-diazo-5-oksonorleucin.

6. Fremgangsmåte ifølge påstand 5, karakterisert ved at man isolerer L-6-diazo -5-norleucin ved å konsentrere kulturvæsken til fra en femtedel til en tyvendedel av dens opprinnelige volum, tilsette konsentratet fra ca. tre til ti ganger dens volum av et med vann blandbart, organisk oppløsningsmiddel, fraskille herved ut-felte forurensinger, bringe den gjenværende oppløsning i kontakt med aluminiumoksyd hvis pH-verdi ligger mellom 5 og 8> hvorved L-6-diazo-5-oksonorleucin adsorberes, eluere det adsorberte L-6-diazo-5-oksonorleucin med et elueringsmiddel av den gruppe som består av vann og vandige oppløsninger av med vann blandbare, organiske oppløsningsmidler, fortrinsvis etanol, og fjerne elueringsmidlet fra den del av eluatet som inneholder L-6-diazo-5-oksonorleucin.

7. Fremgangsmåte ifølge hvilkensom-helst av de foregående påstander karakterisert ved at man isolerer L-6-diazo-5-oksonorleucin ved å konsentrere kulturvæsken til fra en femtedel til en tyvendedel av dens opprinnelige volum, tilsette konsentratet fra omkring tre til ti ganger dens volum av et med vann blandbart, organisk oppløsningsmiddel, fraskille herved utfeldte forurensninger, bringe den gjenværende oppløsning i kontakt med aluminiumoksyd hvis pH-verdi ligger mellom 5 og 8, hvorved L-6-diazo-5-oksonorleucin adsorberes, eluere det adsorberte L-6-diazo-5-oksonorleucin med et elueringsmiddel av den gruppe som består av vann og vandige oppløsninger av med vann blandbare organiske oppløsnings-midler, fjerne elueringsmidlet fra eluatet inneholdende L-6-diazo-5-oksonorleucin, danne en fortynnet oppløsning i vann inneholdende en mindre mengde av et med vann blandbart organisk oppløs-ningsmiddel av det således erholdte L-6-diazo-5-oksonorleucinet, innstille oppløs-ningens pH-verdi på 6 til 7, bringe oppløs-ningen i kontakt med aktivt kull, hvorved L-6-diazo-5-oksonorleucin adsorberes, eluere det adsorberte L-6-diazo-5-oksonorleucin med vann inneholdende mindre enn 25 pst. av et med vann blandbart organisk oppløsningsmiddel fortrinsvis aceton og fjerne elueringsmidlet fra eluatet inneholdende L-6-diazo-5-oksonorleucin.