NO760873L - - Google Patents
Info
- Publication number
- NO760873L NO760873L NO760873A NO760873A NO760873L NO 760873 L NO760873 L NO 760873L NO 760873 A NO760873 A NO 760873A NO 760873 A NO760873 A NO 760873A NO 760873 L NO760873 L NO 760873L
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- streptomyces
- flasks
- medium
- culture
- solution
- Prior art date
Links
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 75
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 61
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 57
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 claims description 56
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 54
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 52
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 50
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 49
- XREUEWVEMYWFFA-CSKJXFQVSA-N carminomycin Chemical compound C1[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1C2=C(O)C(C(=O)C3=C(O)C=CC=C3C3=O)=C3C(O)=C2C[C@@](O)(C(C)=O)C1 XREUEWVEMYWFFA-CSKJXFQVSA-N 0.000 claims description 36
- 229950001725 carubicin Drugs 0.000 claims description 36
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 36
- 229930188550 carminomycin Natural products 0.000 claims description 35
- XREUEWVEMYWFFA-UHFFFAOYSA-N carminomycin I Natural products C1C(N)C(O)C(C)OC1OC1C2=C(O)C(C(=O)C3=C(O)C=CC=C3C3=O)=C3C(O)=C2CC(O)(C(C)=O)C1 XREUEWVEMYWFFA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 35
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 claims description 34
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 32
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 32
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 31
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 30
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims description 30
- 241000220254 Streptomyces coeruleorubidus Species 0.000 claims description 29
- FDDDEECHVMSUSB-UHFFFAOYSA-N sulfanilamide Chemical compound NC1=CC=C(S(N)(=O)=O)C=C1 FDDDEECHVMSUSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 29
- 229940124530 sulfonamide Drugs 0.000 claims description 29
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 25
- 229960001544 sulfathiazole Drugs 0.000 claims description 25
- JNMRHUJNCSQMMB-UHFFFAOYSA-N sulfathiazole Chemical compound C1=CC(N)=CC=C1S(=O)(=O)NC1=NC=CS1 JNMRHUJNCSQMMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 25
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 22
- FTOAOBMCPZCFFF-UHFFFAOYSA-N 5,5-diethylbarbituric acid Chemical compound CCC1(CC)C(=O)NC(=O)NC1=O FTOAOBMCPZCFFF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 20
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 20
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 20
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 claims description 19
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 16
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 15
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 15
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 15
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 claims description 14
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 13
- 239000000654 additive Substances 0.000 claims description 10
- 229960002319 barbital Drugs 0.000 claims description 10
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 10
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 claims description 9
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 claims description 9
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 claims description 9
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 claims description 9
- 241000203720 Pimelobacter simplex Species 0.000 claims description 8
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 claims description 8
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 claims description 8
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 7
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims description 7
- VLYWMPOKSSWJAL-UHFFFAOYSA-N sulfamethoxypyridazine Chemical compound N1=NC(OC)=CC=C1NS(=O)(=O)C1=CC=C(N)C=C1 VLYWMPOKSSWJAL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 229960004936 sulfamethoxypyridazine Drugs 0.000 claims description 7
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- WEXRUCMBJFQVBZ-UHFFFAOYSA-N pentobarbital Chemical compound CCCC(C)C1(CC)C(=O)NC(=O)NC1=O WEXRUCMBJFQVBZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 claims description 5
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims description 5
- 230000001603 reducing effect Effects 0.000 claims description 5
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 claims description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 3
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 claims description 3
- 241000187389 Streptomyces lavendulae Species 0.000 claims description 3
- 238000000921 elemental analysis Methods 0.000 claims description 3
- 238000002329 infrared spectrum Methods 0.000 claims description 3
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 claims description 3
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 claims description 3
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims description 3
- 229960001412 pentobarbital Drugs 0.000 claims description 3
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 238000002211 ultraviolet spectrum Methods 0.000 claims description 3
- 238000001429 visible spectrum Methods 0.000 claims description 3
- 208000007093 Leukemia L1210 Diseases 0.000 claims description 2
- 208000008342 Leukemia P388 Diseases 0.000 claims description 2
- 229960003874 butobarbital Drugs 0.000 claims description 2
- STDBAQMTJLUMFW-UHFFFAOYSA-N butobarbital Chemical compound CCCCC1(CC)C(=O)NC(=O)NC1=O STDBAQMTJLUMFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 2
- 229960002695 phenobarbital Drugs 0.000 claims description 2
- DDBREPKUVSBGFI-UHFFFAOYSA-N phenobarbital Chemical compound C=1C=CC=CC=1C1(CC)C(=O)NC(=O)NC1=O DDBREPKUVSBGFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 2
- 125000001935 tetracenyl group Chemical class C1(=CC=CC2=CC3=CC4=CC=CC=C4C=C3C=C12)* 0.000 claims description 2
- UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N Benzene Chemical compound C1=CC=CC=C1 UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 3
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 claims 2
- PTTPXKJBFFKCEK-UHFFFAOYSA-N 2-Methyl-4-heptanone Chemical compound CC(C)CC(=O)CC(C)C PTTPXKJBFFKCEK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 238000012435 analytical chromatography Methods 0.000 claims 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims 1
- 239000012458 free base Substances 0.000 claims 1
- 239000000155 melt Substances 0.000 claims 1
- 238000007790 scraping Methods 0.000 claims 1
- APSBXTVYXVQYAB-UHFFFAOYSA-M sodium docusate Chemical compound [Na+].CCCCC(CC)COC(=O)CC(S([O-])(=O)=O)C(=O)OCC(CC)CCCC APSBXTVYXVQYAB-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 111
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 72
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 30
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 25
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 25
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 20
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 17
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 16
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 15
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 14
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 14
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 13
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 12
- 229960001031 glucose Drugs 0.000 description 12
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 12
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 11
- 235000010633 broth Nutrition 0.000 description 11
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 11
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 11
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 10
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 10
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 10
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 10
- MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N Oxalic acid Chemical compound OC(=O)C(O)=O MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 9
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 9
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 9
- RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 1,4-Dioxane Chemical compound C1COCCO1 RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- WYVYEIZFAUXWKW-SHUUXQFMSA-N [(2s,3s,4s,6r)-6-[[(1s,3s)-3-acetyl-3,5,10,12-tetrahydroxy-6,11-dioxo-2,4-dihydro-1h-tetracen-1-yl]oxy]-3-hydroxy-2-methyloxan-4-yl]azanium;chloride Chemical compound Cl.C1[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1C2=C(O)C(C(=O)C3=C(O)C=CC=C3C3=O)=C3C(O)=C2C[C@@](O)(C(C)=O)C1 WYVYEIZFAUXWKW-SHUUXQFMSA-N 0.000 description 8
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 8
- 150000001340 alkali metals Chemical class 0.000 description 7
- 235000013312 flour Nutrition 0.000 description 7
- 241000894007 species Species 0.000 description 7
- GHOKWGTUZJEAQD-ZETCQYMHSA-N (D)-(+)-Pantothenic acid Chemical compound OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(O)=O GHOKWGTUZJEAQD-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 6
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- XUMBMVFBXHLACL-UHFFFAOYSA-N Melanin Chemical compound O=C1C(=O)C(C2=CNC3=C(C(C(=O)C4=C32)=O)C)=C2C4=CNC2=C1C XUMBMVFBXHLACL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N Riboflavin Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N 0.000 description 6
- 241000970854 Streptomyces violaceusniger Species 0.000 description 6
- 244000172533 Viola sororia Species 0.000 description 6
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 6
- 229910052783 alkali metal Inorganic materials 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L calcium carbonate Substances [Ca+2].[O-]C([O-])=O VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 6
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 6
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 6
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 6
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 6
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 6
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 6
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 5
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 5
- 230000005587 bubbling Effects 0.000 description 5
- 150000001805 chlorine compounds Chemical class 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- 239000006916 nutrient agar Substances 0.000 description 5
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 5
- 239000012429 reaction media Substances 0.000 description 5
- 241000186361 Actinobacteria <class> Species 0.000 description 4
- TWCMVXMQHSVIOJ-UHFFFAOYSA-N Aglycone of yadanzioside D Natural products COC(=O)C12OCC34C(CC5C(=CC(O)C(O)C5(C)C3C(O)C1O)C)OC(=O)C(OC(=O)C)C24 TWCMVXMQHSVIOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- PLMKQQMDOMTZGG-UHFFFAOYSA-N Astrantiagenin E-methylester Natural products CC12CCC(O)C(C)(CO)C1CCC1(C)C2CC=C2C3CC(C)(C)CCC3(C(=O)OC)CCC21C PLMKQQMDOMTZGG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 4
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 4
- 235000010216 calcium carbonate Nutrition 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 4
- OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N folic acid Chemical compound C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 4
- PFOARMALXZGCHY-UHFFFAOYSA-N homoegonol Natural products C1=C(OC)C(OC)=CC=C1C1=CC2=CC(CCCO)=CC(OC)=C2O1 PFOARMALXZGCHY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 4
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 4
- 235000012424 soybean oil Nutrition 0.000 description 4
- -1 sulphapyridazine Chemical compound 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- NPRYCHLHHVWLQZ-TURQNECASA-N 2-amino-9-[(2R,3S,4S,5R)-4-fluoro-3-hydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-7-prop-2-ynylpurin-8-one Chemical compound NC1=NC=C2N(C(N(C2=N1)[C@@H]1O[C@@H]([C@H]([C@H]1O)F)CO)=O)CC#C NPRYCHLHHVWLQZ-TURQNECASA-N 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 244000105624 Arachis hypogaea Species 0.000 description 3
- 235000010777 Arachis hypogaea Nutrition 0.000 description 3
- GHOKWGTUZJEAQD-UHFFFAOYSA-N Chick antidermatitis factor Natural products OCC(C)(C)C(O)C(=O)NCCC(O)=O GHOKWGTUZJEAQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- AUNGANRZJHBGPY-UHFFFAOYSA-N D-Lyxoflavin Natural products OCC(O)C(O)C(O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O AUNGANRZJHBGPY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000019733 Fish meal Nutrition 0.000 description 3
- 108010068370 Glutens Proteins 0.000 description 3
- 102000004407 Lactalbumin Human genes 0.000 description 3
- 108090000942 Lactalbumin Proteins 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 240000006394 Sorghum bicolor Species 0.000 description 3
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 3
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 3
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 description 3
- 239000010775 animal oil Substances 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 230000003139 buffering effect Effects 0.000 description 3
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 3
- 229940077731 carbohydrate nutrients Drugs 0.000 description 3
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 3
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 3
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 3
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 3
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 239000004467 fishmeal Substances 0.000 description 3
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 3
- 235000021312 gluten Nutrition 0.000 description 3
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 3
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 3
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 3
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 3
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 3
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 description 3
- 235000006408 oxalic acid Nutrition 0.000 description 3
- 235000019161 pantothenic acid Nutrition 0.000 description 3
- 229940055726 pantothenic acid Drugs 0.000 description 3
- 239000011713 pantothenic acid Substances 0.000 description 3
- 239000013587 production medium Substances 0.000 description 3
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 235000019192 riboflavin Nutrition 0.000 description 3
- 239000002151 riboflavin Substances 0.000 description 3
- 229960002477 riboflavin Drugs 0.000 description 3
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 3
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 3
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 3
- 150000005846 sugar alcohols Chemical class 0.000 description 3
- 150000003467 sulfuric acid derivatives Chemical class 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 3
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 3
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 3
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 3
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 3
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 3
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 description 3
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 3
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 2
- 235000003276 Apios tuberosa Nutrition 0.000 description 2
- 235000010744 Arachis villosulicarpa Nutrition 0.000 description 2
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 2
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010076119 Caseins Proteins 0.000 description 2
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical class [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 description 2
- 239000004375 Dextrin Substances 0.000 description 2
- 229920001353 Dextrin Polymers 0.000 description 2
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 2
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 2
- 102100033468 Lysozyme C Human genes 0.000 description 2
- PWHULOQIROXLJO-UHFFFAOYSA-N Manganese Chemical class [Mn] PWHULOQIROXLJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 2
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 2
- OVBPIULPVIDEAO-UHFFFAOYSA-N N-Pteroyl-L-glutaminsaeure Natural products C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 241000364057 Peoria Species 0.000 description 2
- 244000046052 Phaseolus vulgaris Species 0.000 description 2
- 235000010627 Phaseolus vulgaris Nutrition 0.000 description 2
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 2
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 2
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 2
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 2
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 2
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 2
- 229910000318 alkali metal phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 229910052784 alkaline earth metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 150000001342 alkaline earth metals Chemical class 0.000 description 2
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 2
- 229910000019 calcium carbonate Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 2
- 235000013877 carbamide Nutrition 0.000 description 2
- 150000004649 carbonic acid derivatives Chemical class 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 2
- 239000000460 chlorine Substances 0.000 description 2
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 2
- 238000004040 coloring Methods 0.000 description 2
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000010949 copper Chemical class 0.000 description 2
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 2
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 2
- 238000000151 deposition Methods 0.000 description 2
- 235000019425 dextrin Nutrition 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 235000021186 dishes Nutrition 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 235000019152 folic acid Nutrition 0.000 description 2
- 229960000304 folic acid Drugs 0.000 description 2
- 239000011724 folic acid Substances 0.000 description 2
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 2
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 2
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 2
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 2
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 2
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 description 2
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 2
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 2
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 2
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 2
- ZLNQQNXFFQJAID-UHFFFAOYSA-L magnesium carbonate Chemical class [Mg+2].[O-]C([O-])=O ZLNQQNXFFQJAID-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000001095 magnesium carbonate Substances 0.000 description 2
- 235000011160 magnesium carbonates Nutrition 0.000 description 2
- 229910052748 manganese Chemical class 0.000 description 2
- 239000011572 manganese Chemical class 0.000 description 2
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 2
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 2
- 238000006241 metabolic reaction Methods 0.000 description 2
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 2
- APVPOHHVBBYQAV-UHFFFAOYSA-N n-(4-aminophenyl)sulfonyloctadecanamide Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)NS(=O)(=O)C1=CC=C(N)C=C1 APVPOHHVBBYQAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 2
- BWHMMNNQKKPAPP-UHFFFAOYSA-L potassium carbonate Chemical compound [K+].[K+].[O-]C([O-])=O BWHMMNNQKKPAPP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 235000012015 potatoes Nutrition 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 description 2
- 239000011877 solvent mixture Substances 0.000 description 2
- 239000008174 sterile solution Substances 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 239000008399 tap water Substances 0.000 description 2
- 235000020679 tap water Nutrition 0.000 description 2
- 238000009210 therapy by ultrasound Methods 0.000 description 2
- 238000004804 winding Methods 0.000 description 2
- DPEYHNFHDIXMNV-UHFFFAOYSA-N (9-amino-3-bicyclo[3.3.1]nonanyl)-(4-benzyl-5-methyl-1,4-diazepan-1-yl)methanone dihydrochloride Chemical compound Cl.Cl.CC1CCN(CCN1Cc1ccccc1)C(=O)C1CC2CCCC(C1)C2N DPEYHNFHDIXMNV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DNIAPMSPPWPWGF-GSVOUGTGSA-N (R)-(-)-Propylene glycol Chemical compound C[C@@H](O)CO DNIAPMSPPWPWGF-GSVOUGTGSA-N 0.000 description 1
- RVBUGGBMJDPOST-UHFFFAOYSA-N 2-thiobarbituric acid Chemical compound O=C1CC(=O)NC(=S)N1 RVBUGGBMJDPOST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000017060 Arachis glabrata Nutrition 0.000 description 1
- 235000018262 Arachis monticola Nutrition 0.000 description 1
- 241000974482 Aricia saepiolus Species 0.000 description 1
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M Cetrimonium bromide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)C LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N Chlorine atom Chemical compound [Cl] ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 231100000111 LD50 Toxicity 0.000 description 1
- UIHCLUNTQKBZGK-UHFFFAOYSA-N Methyl isobutyl ketone Natural products CCC(C)C(C)=O UIHCLUNTQKBZGK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910002651 NO3 Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 108010009736 Protein Hydrolysates Proteins 0.000 description 1
- 241000187391 Streptomyces hygroscopicus Species 0.000 description 1
- JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N Thiamine Natural products CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical group CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000005811 Viola adunca Nutrition 0.000 description 1
- 240000009038 Viola odorata Species 0.000 description 1
- 235000013487 Viola odorata Nutrition 0.000 description 1
- 235000002254 Viola papilionacea Nutrition 0.000 description 1
- 239000005862 Whey Substances 0.000 description 1
- 102000007544 Whey Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010046377 Whey Proteins Proteins 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical class [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002250 absorbent Substances 0.000 description 1
- 230000002745 absorbent Effects 0.000 description 1
- 238000005903 acid hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 229910000316 alkaline earth metal phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003042 antagnostic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000007514 bases Chemical class 0.000 description 1
- 235000013361 beverage Nutrition 0.000 description 1
- 238000002306 biochemical method Methods 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 239000002021 butanolic extract Substances 0.000 description 1
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 1
- 239000003575 carbonaceous material Substances 0.000 description 1
- 238000005266 casting Methods 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 229920001429 chelating resin Polymers 0.000 description 1
- 229910052801 chlorine Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 229910017052 cobalt Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010941 cobalt Chemical class 0.000 description 1
- GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N cobalt atom Chemical class [Co] GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GVPFVAHMJGGAJG-UHFFFAOYSA-L cobalt dichloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Co+2] GVPFVAHMJGGAJG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000012364 cultivation method Methods 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000010908 decantation Methods 0.000 description 1
- 239000012065 filter cake Substances 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000004435 hydrogen atom Chemical class [H]* 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000010699 lard oil Substances 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 238000000465 moulding Methods 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000020232 peanut Nutrition 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- WRLGYAWRGXKSKG-UHFFFAOYSA-M phenobarbital sodium Chemical compound [Na+].C=1C=CC=CC=1C1(CC)C(=O)NC([O-])=NC1=O WRLGYAWRGXKSKG-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229960002511 phenobarbital sodium Drugs 0.000 description 1
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 238000000053 physical method Methods 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 229910000027 potassium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 239000012925 reference material Substances 0.000 description 1
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 1
- QTNNCMYRNIXYPH-UHFFFAOYSA-M sodium;5-butyl-5-ethylpyrimidin-3-ide-2,4,6-trione Chemical compound [Na+].CCCCC1(CC)C(=O)NC([O-])=NC1=O QTNNCMYRNIXYPH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000003549 soybean oil Substances 0.000 description 1
- 235000019157 thiamine Nutrition 0.000 description 1
- KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N thiamine Chemical compound CC1=C(CCO)SCN1CC1=CN=C(C)N=C1N KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003495 thiamine Drugs 0.000 description 1
- 239000011721 thiamine Substances 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004584 weight gain Effects 0.000 description 1
- 235000019786 weight gain Nutrition 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H15/00—Compounds containing hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
- C07H15/20—Carbocyclic rings
- C07H15/24—Condensed ring systems having three or more rings
- C07H15/252—Naphthacene radicals, e.g. daunomycins, adriamycins
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Description
Foreliggende oppfinnelse angår fremgangsmåter for fremstilling'av et nytt naftacenderivat med formelen;
samt salter derav.
Forbindelsen med formel I som betegnes- med .nr.
32 999 RP, er av meget stor interesse•på grunn av sin virkning mot tumorer.
Forbindelsen 32 999 RP er en mørkerød basisk forbindelse som salter med syrer.
Hydrokloridet av 32 999 RP er oppløselig i metanol, pyridin, dimetylformamid og vann i en mengde på ca. 100'mg/cm-<5>, oppløselig i n-butanol, mettet med vann ved 20°C, i en mengde på ca. 10 mg/cm^, uoppløselig i metanol i en mengde på 5 rhg/cm^ og praktisk talt uoppløselig (oppløselighet mindre enn 0,1 mg/crr.^) i aceton, kloroform, metylenklorid, etylacetat, benzen, metyl-isobutylketon, dioksan og heksar..
Hydrokloridet av 32 999 RP inneholder karbon, hydrogen, oksygen, nitrogen og klor og har følgende elementanalyse : C% = 56,6 E% = 5,7 0% = 29,41 Mf, = 2,39 Cl% = 6,0
Hydrokloridet har dessuten følgende fysikalsk-kjemiske egenskaper:
Utseende: oransjerødt, mikrokrystallinsk pulver.
Smeltepunkt: ca. 200°C (spalting).
Spesifikk vridingsevne (bestemt i en 0, 09%- ±g etanoloppløshing
inneholdende 0, 1%- 1 N HC1):
UV-spektrum (bestemt i en konsentrasjon av 10365 mg/l i etanol inneholdende 0, 1% 1 N HC1): Dette spektrum gjengis i fig. 1 i de ledsagende tegninger og absorbsjonsmaksima angis i nedenfor følgende tabell. Synlig spektrum (bestemt i en konsentrasjon av 10,65 mg/l i
etanol inneholdende 0, 1% 1 N HC1): Dette spektrum gjengis i fig. 2 i de ledsagende tegninger og absorbsjonsmaksima angis i nedenfor følgende tabell.
IR-spektrum (bestemt i blanding m.ed KEr) : dette spektrum gj engis i fig. 3 i de ledsagende tegninger, der det på abscissen angis bølgelengden i ym (den øvre skala) og
bølgetallet i cm ^ (den nedre skala) og på ordinaten den optiske tetthet.
I'nedenfor følgende tabell angis de viktigste ab-sorbs j onssignaler (sifferverdiene angår bølgetallet i cm 1).
Ved'tynnsjiktskromatografi på silikagel oppviser hydrokloridet av 32 999 RP en Rf-verdi på ca. 0,2 når man ved 24°C som fremkallende oppløsningsmiddel anvender'en blanding av metylenklorid, maursyre og metanol i et volumforhold på 80:17:'3-Ved sur hydrolyse av 32 999 RP eller av et av dettes salter oppnås en forbindelse med formelen:
som er aglykorte av 32 999 RP..
.Aglykonet av 32 999 RP er oppløselig i pyridin i
en mengde på 20 mg/cm^, oppløselig i metanol, dioksan, kloroform og metylenklorid i en mengde på 5 mg/cm^ og oppløselig i aceton, etylacetat, heksan og vann i en mengde på under. 0,1 mg/cm'<5>.
'Denne forbindelse oppviser dessuten følgende fysi-■kalsk-kj emiske egenskaper.
Utseende: oransjerødt, mikrokrystallinsk pulver.
Smeltepunkt: ca. l85°C (spalting)-.
Elementanalyse:' C% - 6l,37 M 5,31' 0% = 30,16.
Spesifikk vridningsevne (bestemt i en 0,1%-ig dioksanoppløsning):
UV-spektrum (bestemt i konsentrasjonene 50 henholdsvis 5 mg/l i
•etanol inneholdende 0, 1% 1 N HC1):
Dette spektrum' gjengis i fig. 4 i de ledsagende tegninger der kurvene I og II tilsvarer.konsentrasjonene 50 henholdsvis 5 mg/r. Absorbsjonsmaksima angis i nedenfor følgende tabell.
Synlig spektrum (bestemt i en konsentrasjon på 10 mg/l i etanol inneholdende 0,1% 1 M HC1): dette spektrum gjengis i fig. 5 i de ledsagende tegninger og absorbsjonsmaksima angis i nedenfor følgende tabell.
IR-spektrum (bestemt i blanding med KBr): dette spektrum gjengis i'fig. 6 i de ledsagende tegninger der'det på abscissen er angitt bølgelengden i ym (den øvre skala) og bølgetallet i cm 1 (den nedre skala) og på ordi-' naten den optiske tetthet.
I nedenfor følgende tabell angis'de viktigste ab-sorbs j onssignaler (sifferverdiene angir, bølgetallet i cm 1),
Ved tynnsjiktkromatografi på silikagel oppviser aglykonen av 32 999 RP en Rf-verdi på ca. 0,7 når man ved 24°C som fremkallende oppløsningsmiddel anvender en blanding av metylenklorid, maursyre og metanol i et volumforhold på 80:17:3-Den nye forbindelse 32 999 RP med formelen I kan ifølge oppfinnelsen fremstilles ifølge en hvilken som helst av de følgende fremgangsmåter..
(1) Gjennom mikrobiologisk reduksjon av antibiotikumet karminomycin med formelen:
Karminomycin og dettes fremstilling ved dyrking av Actionomadura carminata Sp..nov. er beskrevet i den franske patentsøknad nr. 74.00349, som er publisert under nr. 2.235-700. Strukturen av karminomycin er angitt av M.G. Brazhnikova et al., "J. of Antibiotics", XXVII, nr. 4, 254-259 (1974)..
Den mikrobiologiske reduksjon av karminomycin gjen-nomføres vanligvis i vannholdig medium, enten.ved hjelp av mikro- organismekulturer som har nådd et egnet utviklingsstadium, eller ved hjelp av celler som er isolert fra den slags kulturer, eller ved hjelp av .enzymatiske ekstrakter oppnådd fra disse mikroorganismer.
De mikroorganismer som kan anvendes ved' fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse kan tilhøre slektene Streptomyces eller Bacterium. Som eksempel på spesielt egnede mikroorganismer skal nevnes Streptomyces lavendulae (ATCC 8664), Streptomyces roseochromogenes (ATCC 13.400), Corynebacterium simplex (ATCC 6946) og Bacterium cykloxydans (ATCC 12.673-)..De beste resultater oppnås ved hjelp av Corynebacterium-simplex (ATCC 6946).
Dyrkingen'av den mikroorganisme■som produserer det enzymatiske systen som kan redusere karminomycin til 32 999 RP, kan skje ifølge enhver fremgangsmåte for aerob dyrking på. overflaten eller i.dypet, men det sistnevnte er å foretrekke, av bekvemlighetsgrunner. Man anvender for dette formål de podings-og gjæringsmetoder og de forskjellige typer apparater som generelt er i bruk innen gjærindustrien.
Dyrkingsmediet bør i -hovedsaken inneholde kiler for assimilerbart karbon og assimilerbart nitrogen, uorganiske stoffer og tilvektsfaktorer. Alle disse stoffer kan anvendes i form av veldefinerte forbindelser eller i form av komplekse blandinger slik som man støter på i biologiske produkter av forskjellig opprinnelse.
Som kilder for assimilerbart karbon kan man anvende karbohydrater slik som glukose eller andre karbonholdige forbindelser slik som sukkeralkoholer eller visse organiske syrer.
Visse animalske eller vegetabilske oljer slik som spekkolje eller-soyaolje kan med fordel erstatte disse forskj.ellige karbonholdige forbindelser eller anvendes som tilsetning til dem.
De egnede kilder for assimilerbart nitrogen er ytterst vekslende. De kan være meget enkle kjemiske forbindelser slik som uorganiske eller organiske ammoniumsalter, karbamid, visse, aminosyrer. De kan også utgjøres av komplekse stoffer som hovedsakelig inneholder nitrogen i proteinform slik som kasein, laktalbumin,. gluten og hydrolysat derav, soyamel, jordnøttmel, fiskemel, pepton, kjøttekstrakt, jernekstrakt, drank, maisstøpevæske.
Blant de tilsatte uorganiske stoffer kan visse ha en pufrende eller nøytraliserende virkning slik som alkalimetall-eller joralkalimetallfosfater. Andre uorganiske stoffer gir den nødvendige ionelikevekt for utviklingen av mikroorganismen, slik som klorider og sulfater av alkalimetaller og alkaliske 'j-ord-'alkalimetaller.
Tilvektsfaktorene er stoffer av vitaminnatur slik
. som riboflavin, folinsyre og pantotensyre.
p.H-verdien. i gjæringsmediet bør ved dyrkingens begynnelse ligge mellom 6,0 og 7,8, fortrinnsvis mellom 6,5 og 7,5'. Den for gjæring opptimale temperatur er 29-31°C, men en tilfredsstillende utvikling oppnås ved temperaturer mellom. 26 og .37°C.
Lufttilførselen ved gjæringen kan variere innen ganske vide grenser. Man har imidlertid funnet at en.lufttil^førsel på 0,3-3 1/1 dyrkingsbuljong og .minutt er spesielt-egnet. For å oppnå en kultur med god reduserende virkning er det dessuten egnet å omrøre dyrkingsmediet, f.eks. ved hjelp av et røre-verk hvis rotasjonshastighet kan variere mellom 100 .og 250 omdreininger pr. minutt.
Mikrodrganismekulturen oppnår vanligvis en tilfredsstillende utviklingsgrad etter et tidsrom på 24-48 timer.
Den reduserende virkning beror hovedsakelig på den mengde celler som dannes under dyrkingen.- Når man anvender iso-lerte celler, f.eks. oppnådd ved sentrifugering av dyrkingsmediet, står den dannede mengde 32 999 R? i direkte forhold til konsentrasjonen av celler i reaksjonsmediet. Reaksjonsmedier med et høyt innhold av.celler har en utmerket reduksjonsevne.
Reduksjonen av karminomycin til 32 999 RP skjer ved at en vannoppløsning av karminomycin eller av et salt derav bringes i kontakt med en mikroorganismekultur som har oppnådd-tilfredsstillende utviklingsgrad og tilfredsstillende reaksjons-.evne, eller med celler isolert fra en slik kultur, eller med enzymatiske ekstrakter oppnådd fra slike celler.
Enzymatiske celleékstrakter kan oppnås etter øde-leggelse av celleveggene, enten ved kjemiske eller biokjemiske metoder eller ved fysikalske metoder.- ødeleggelsen av celleveggene skjer fortrinnsvis ved at en vannsuspensjon-av en mikroorganismekultur eller av celler ioslert fra en slik kultur behandles med et enzym som kan lysere celleveggen, slik som lyso zym, eller ved at suspensjonen underkastes ultralydbehandling. Den etter sentrifugering oppnådde overstående væske, inneholder de enzymatiske ekstrakter i oppløsning. Oppløsningen av de enzymatiske.ekstrakter anvendes vanligvis i 'reduks j onstrinnet uten ytterligere behandling.
Reduksjonen gjennomføres vanligvis under omrøring ved en temperatur mellom 32 og 37°C, fortrinnsvis mellom 2'6 og 30°C, og reduksjonen er vanligvis avsluttet etter 1-4 døgn.
Reduksjonen kan gjennomføres ved en pH-verdi mellom 5 og 10, men man foretrekker å arbeide ved en pH-verdi mellom 7 og 8.
Reaksjonsmediet kan omrøres.f.eks. ved hjelp av
et røreverk hvis rotasjonshastighet kan variere mellom 1.00 og 250 omdreininger/minutt.
Man kan redusere enten rent karminomycin eller et'
av disses rene salter, eller et urent produkt, eller det .sure filtrat som oppnås fra et dyrkingsmedium i hvilket karmino-
mycin er fremstilt ved dyrking. Por at man skal oppnå gode utbytter bør konsentrasjonen av karminomycin i reaksjonsmediet hensiktsmessig være mellom 0,1 og 1 g/l -ved reduksjonens begynnelse. (2) Ved,aerob dyrking av mikroorganismer tilhørene slekten Streptomyces, nærmere bestemt noen av de følgende mikroorganismer: Streptomyces coeruleorubidus .DS 8899 (NRRL 3046), Streptomyces coeruleorubidus DS 31- 723 (NRRL 3045), Streptomyces coeruleorubidus DS 7126 (NRRL 8090), .Streptomyces bifurcus DS 23. 219 (NRRL 3539)•
Dyrkingen gjennomføres i for Streptomyces-stammer egnede næringsmedier i nærvær av tilsetningsstoffer valgt blant følgende: ametopterin, sulfanilamid, sulfatiazol, sulfapyridazin, barbital, fenobarbital, butobarbital og pentiobarbital.
Den mengde antibiotikum 32 999 RP som dannes under' dyrkingen, varierer med dyrkingsmediets sammensetning, med mengden tilsatt tilsetningsstoff og med tidspunktet for til-setningen av dette, slik det skal' vises senere.
Mikroorganismene Streptomyces- coeruleorubidus DS 8899 (NRRL 3046) og Streptomyces coeruleorubidus DS 31.723
(NRRL 3045) .er beskrevet i fransk patent nr. I.38O.8IO, og Streptomyces bifurcus DS 23 219 (NRRL 3539) er beskrevet i det franske patent nr. 1.593-235.
Streptomyces coeruleorubidus DS 7126 er en ny stamme som er isolert fra en jordprøve'. En prøve av denne organisme er deponert hos Norther Regional Research Laboratory, U.S. Department of Agriculture, Peoria, Illinoi (USA), der den er registrert under betegnelsen NR 8098 . Prøver av mikroorganismen kan oppnås fra dette laboratorium.
Isoleringen av denne stamme har skjedd ifølge en vanlig fremgangsmåte hvorved man suspenderer en liten mengde jord i sterilt destillert vann, fortynner suspensjonen til,forskjellige konsentrasjoner og utbrer et lite volum av hver fortynning på flaten av Petriskåler inneholdene et næringsagarmedium. Etter inkubering i noen døgn ved 26°C, hvorved mikroorganismen .utvikles, tas de koloiner ut som man ønsker å isloere for fortsatt studium og disse omplanteres på snedkulturer av næringsagar for'at man
skal oppnå mer rikelige kulturer.
Stammen Streptomyces coeruleorubidus DS 7126 til-hører arten Streptomyces coeruleorubidus, som er beskrevet av G.F. Gauze et al. (Problems in the classif ication of.'Antagon-istic Actinomycetes - The American Institute of -Biological Scien-ces, Washington, 1959, s. 100) etter som den oppviser de samme-hovedegenskaper som denne art. Den nye stamme oppviser et blått til lyst grønn-blått spordannende luftmycelium, og på uorganisk medium nr. 1 ifølge Gauze utvikler den et vegetativt mycelium som har en rødaktig farge og som gir et oppløselig pigment av samme farge, hvilket pigment diffunderer inn i agaren. Alle disse egenskaper er karakteristiske for arten Streptomyces coeruleorubidus. Den nye stamme er derfor kalt Streptomyces ceoruleo-rubidus, stamme DS 7126.
Streptomyces coeruleorubidus DS 7126 danner korte, sfæriske til ovale sporer rned målene 0,7-0,9 ym/0,8-1,1 ym. Stammen utvikler enkle eller i form av knipper foreliggende sporoforer.. Sporekjeder som er ganske lange og som kan omfatte ■ opptil flere titals sporer, rulles sammen under dannelse av mer eller mindre åpne spiraler som oftps inneholder 2-5 eller 6 spiralviklinger. På grunn av sin spcredannelsesmåte klassifiseres Streptomyces coeruleorubidus DS 7126 i Section Spira i Pridhams klassifikasjonssystem.
Streptomyces coeruleorubidus DS 7126 utvikles godt ved 25°C, noe mindre godt ved 57UC, og ikke i det hele tatt ved 50°C. Ved dyrkinger gjennomført ved 26°C oppviser stammen følg-ende biokjemiske egenskaper:
I nedenfor angitte tabell angis .dyrkingskjennetegn for Streptomyces coeruleorubidus DS 7126 på .et antall medier hvilke vanligvis anvendes for å bestemme de morfologiske egenskaper hos Streptomyces-stammer. Dyrkinger på agarmedier er gjennomført på snedkulturer. De angitte data er oppnådd ved studium av kulturer som har oppnådd et godt utviklingsstadium, dvs. etter dyrking i ca. 3 uker ved 26°C hvis ikke annet er angitt . De i tabellen angitte referanser er.følgende.
Gjennom den blå til grønnaktig blå fargingen av
det spordannende luftmycelium tilfhører stammen Streptomyces coeruleorubidus DS 7126 til serien "Coerulescens", som er beskrevet av Gauze et al. På samme måte. som de i denne- serie be-' skrevne stammene S. coeruleorubidus og S. bicolor oppviser' stammen DS 7126 et rødfarget vegetativt mycelium. Stammen DS
7126 skiller seg imidlertid fra S. bicolor ved at den i motset-ning til S. bicolor utnytter cellulose og ikke koagulerer melk og fremfor alt ved at den på syntetiske- medier kan danne et rødt oppløselig pigment som diffunderer inn i agaren, en egenskap som stammen DS 7126 deler kun med arten S. coeruleorubidus. Den sistnevnte egenskap i kombinasjon med de andre egenskaper viser at stammen DS 7126 tilhører arten S. coeruleorubidus.
Evnen hos Streptomyces coeruleorubidus DS 7126 til
å utnytte ulike karbonkilder o.g nitrogenkilder for å sikre sin utvikling, er bestemt ifølge den fremgangsmåte som er beskrevet av Pridham og Gottlieb i ('J. of Bact", 56, 107-114, 1948).
Graden av utvikling er iakttatt på det av forfatterne angitte basismedium hvorved man enten har erstattet glukosen med forskjellige undersøkte karbonkilder eller erstattet (NH^)2 SO^med forskjellige undersøkte nitrogenkilder. Resultatene er angitt i nedenfor følgende tabell.
Fremgangsmåten for fremstilling av 32 999 R? består i det vesentlige i at man dyrker den ovenfor angitte Streptomyces-stammer på et dyrkingsmedium under egnede betingelser i' .nærvær av en tilstrekkelig, mengde tilsetningsmidler og at man deretter separerer det under dyrkingen dannede produkt.
Dyrkingen av mikroorganismene kan skje ifølge en hvilken som helst fremgangsmåte for aerob dyrking på overflaten eller på dypet, men den sistnevnte er å foretrekke av bekvemlig-hetshensyn. Man anvender for dette formål forskjellige typer apparaturer som er i vanlig bruk innen gjærindustrien.
Man kan spesielt anvende følgende oppdeling av arbeidstrinnene:
Gjærmediet bør i det hovedsakelige inneholde en kilde for assimilerbart karbon og en kilde for assimilerbart nitrogen, uorganiske stoffer, spesielt klorider eller karbona-ter, og eventuelt tilvektsfaktorer. Alle disse stoffer kan anvendes i form av godt definerte forbindelser eller i form av komplekse blandinger,'slike som man støter på i biologiske produkter av forskjellig opprinnelse.
Som kilder for assimilerbart karbon kari man anvende karbohydrater slik som glukose, laktose, dextriner og stivelse,-eller andre karbonhodlige stoffer slik som sukkeralkoholer (gly-serol) eller visse organiske syrer, f.eks. melkesyre eller sitronsyre. Visse animalske eller vegetabilske oljer slik som spekkolje eller soyaolje kan med fordel erstatte disse forskjellige karbonholdige forbindelser eller anvendes som tilsetning til dem.
.-De egnede kilder for assimilerbart nitrogen er
ytterst vekselende'. De kan være meget enkle kjemiske forbindelser slik som uorganiske eller organiske ammoniumsalter, karbamid
■og visse aminosyrer. De kan også utgjøres av komplekse stoffer som hovedsakelig inneholder nitrogen i proteinform, slik som
kasein, laktalbumin, gluten og hydrolysat derav, soyamel, jord-nøttmel, fiskemel, kjøttekstrakt, gjærekstrakt, drank og mais-støpevæske.
Blant de -tilsatte uorganiske stoffer kan enkelte ha en puffrende eller nøytraliserende virkning slik.som alkali-metall- eller j ordalkalirnetallf osfater, eller kalsium- .og magnesiumkarbonater. Andre uorganiske stoffer gir den nødvendige ionelikevekt for utvikling av mikroorganismene og dannelsen av 32 999 RP, slik som klorider og sulfater av alkalimetaller og alkaliske j ordartsm.etaller. Til slutt virker visse stoffer mere spesielt som aktivatorer for de metabolske reaksjoner av mikroorganismene, slik som salter av sink, kobolt, jern, kobber og mangan.
Tilvekstfatorene er vanligvis stoffer av vitaminna--tur slik som' tiamiri, riboflavin og pantotensyre.
Tilsetnings.midlene kan tilsettes under forskjellige stadier av dyrkingen., f.-eks. under podningsdyrkingen i ■omrystet kolbe' eller under produksjonsdyrkingen. ' De beste resultater oppnås imidlertid når tilsetningsmidlene tilsettes enten ved begynnelsen av produksjonsdyrkingen eller i løpet av denne.
De aller beste tilsetningsmidler er sulfanilamid, sulfatiazol og sulfapyridazin.
Konsentras j onen' av tilsetningsmidlet i gjørm.ediet
kan variere innen frie grenser avhengig av dyrkingsmediets sammensetning og tilsetningsmidlets natur. Konsentrasjoner på mellom 0,01 og 1 g/l dyrkingsmedium er vanligvis mest hensiktsmessig;
pH-verdien i gjæringsmeddet bør ved dyrkingens be-' gynnelse være mellom 5,6 og 7,4, fortrinnsvis mellom 5,8 og 7,2. Den for gjæringen optimale temperatur er mellom 25 og 30°C, men
en tilfredsstillende produksjon oppnås ved temperaturer mellom. 23 og 33°C. Lufttilførslen ved gjæringen kan variere innen vide grenser. Man har imidlertid funnet at eh lufttilførsel på 0,3-3 1/1 dyrkingsbuljong og minutt er spesielt egnet. Det maksimale utbytte av 32 999 RP oppnås etter 2-10 døgns dyrking, hvorved tiden i det vesentlige beror- på det anvendte medium.
Av det ovenfor angitte fremgår det at. de generelle betingelser for dyrking av de angitte mikroorganismer i nærvær av de angitte tilsetningsmidler kan variere innen vide grenser og tilpasses til spesielle krav. (3) Ved'dyrking av en ny mikroorganisme som tilhører slekten Streptomyces og som er gitt.betegnelsen Streptomyces atroviolaceus DS 8938. En prøve av denne organisme er deponert hos United States Department of Agriculture, Peoria, 111., der den er registrert under betegnelsen NRRL 314 8. Prøver av mikroorganismer kan oppnås fra dette laboratorium.
Denne mikroorganisme som-er isolert fra en jord-prøve oppviser slike egenskaper at den ikke kan■identifiseres med noen tidligere beskreven art. Den bør altså betraktes som
en ny art.
Isoleringen av denne mikroorganisme har skjedd ifølge en vanlig metode hvor man suspenderer en liten mengde jord i sterilt destillert vann, fortynner suspensjonen til ulike konsentrasjoner og sprer ut et lite volum av hver' fortynnelse på. flaten av Petri-skåler inneholdende et næringsagarmedium. Etter inkubering i noen døgn ved 26°C hvorved mikroorganismen utvikles, tas de kolonier ut som man ønsker å isolere for fortsatt studium, og disse omplanteres på snedkulturer av næringsågar for at man
skal oppnå mere rikelige kulturer.
Streptomyces atroviolaceus DS 8938 danner ovale sporer med målene 0,4-0,6 ym/0,6-0,9 yrn. Mikroorganismen utvikler ikke forgrende sporoforer på luftmyceliet-. Disse sporekjeder som er lange og vanligvis inneholder flere titall sporer .rulles sammen i flere, vanligvis tette spiralviklinger. -På grunn av sin måte å danne sporer på, klassifiseres stammen i Section Spira i Pridhams klassifiseringssystem.
Streptomyces atroviolaceus DS 8938 'utvikles godt ved 25°C' og ved 30°C, mindre godt ved 37°C og ikke i det hele tatt ved 50°C. På flertallet dyrkingsmedier danner'mikroorganismen et vegetativt 'mycelium som først er brungult til brunrødt og som hurtig antar en mørk farge, en farge som går fra meget mørkebrunt til b.runfiolett eller svartbrunt. Sporedannelsen • skjer kun på et begrenset antall medier og da kun langsomt., hvorved det dannes et meget lyst grått luftmycelium. På den armen side.kan man legge merke til. at luftmyceliet på et visst antall dyrkingsmedier kan farges lyst rosa eller lyst fiolett når kulturen danner rikelig med mørkt fiolett oppløselig pigment.
Streptomyces atroviolaceus DS 8938 produserer ikke svart, oppløselig melaninpigment på tyrosin-gjærekstrakt-agarmedium ifølge Waksman (melanindannelsesmedium). Mikroorganismen kan imidlertid på tallrike medier, såvel syntetiske som organiske, danne oppløselig pigment som farger agaren mørk og som farger den samme fiolettbrun,' fiolettsvart, svartbrun eller svart..
Ved dyrkinger gjennomført•ved 26°C oppviser mikroorganismen følgende biokjemiske egenskaper.
Dyrkingskjennetegnene for Streptomyces atroviolaceus DS 8938 er satt sammen i nedenfor følgende tabell.'De angitte data er oppnådd ved studium av kulturer som har oppnådd et godt utviklingsstadium, dvs. etter dyrking i ca. 3 uker ved 26°C hvis intet annet er angitt. Egenskapene er observert på slike nær-ingsagarmedier og buljonger som vanligvis anvendes for å bestemme 'de morfologiske egenskaper hos Streptomyces-stammer. Dyrkingen på agarmedier er gjennomført på snedkulturer. Et visst antall av de anvendte dyrkingsmedier er fremstilt ifølge de formler som er angitt i "The Actinomycetes", S.A. Waksman, s. 193-197, Chronica Botanica Company, Waltham, Mass., USA, 1950. I disse tilfeller betegnes mediene med bokstaven W fulgt av det nummer som mediene er tildelt i "The Actinomycetes". De andre dyrkingsmedier har følgende referanser eller sammensetninger.
Streptomyces. atroviolaceus DS '8938 oppviser et antall egenskaper som ikke nøyaktig stemmer overens med'de hos. tidligere beskrevne stammer,, og mikroorganismen bør derfor ansees å være'en ny art.
Med hensyn til de arter som er beskrevet 'i "The Actinomycetes" (vol. 2, S.A. Waksman, The Williams and Wilkins Company, Baltimore 1961) og i Bergey's "Manual- of Determinative Bacteriology" (7- opplag, The Williams and Wlikins Company, Baltimore, 1957), så bør man nærmest jevnføre den nye- mikroorganismen med Streptomyces-violaceoniger, ettersom den.nye mikroorganismen på samme måte som Streptomyces violaceoniger ikke
■ produserer svart, oppløselig melaninpigment, men derimot-på syntetisk agar ifølge Czapék med sakkarose (sakkarose-nit.rat-agar) produserer et brunfiolett oppløselig pigment' som meget hurtig blir sort. S. atroviolaceus DS 8938 gir dessuten -på tallrike medier brunfiolette til svartfiolette oppløselige pigmenter, i visse tilfelle til og med svarte pigmenter. På samme måte som S. -violaceoniger oppviser dessuten S. atroviolaceus DS 8938 et sporedannende luftmycelium som er gråfarget, og dettes sporkjeder rulles sammen til spiraler. S. atrioviolaceus DS 8938 og ,S. violaceoniger bør imidlertid ansees som to forskjellige arter. På tross av de ovenfor angitte likheter kan man nemlig bemerke at S. violaceoniger ikke gir noe oppløselig pigment på poteter, utvikler et grått vegetativt mycelium på gelatin og .fremfor alt ved aldring oppviser en svartfarging av luf tmyceliet-, noe som gjør at denne art inngår, i gruppen av S. hygroscopicus. Stammen av S. atroviolaceus DS 8938 gir derimot et brunt til mørkt brunfiolett oppløselig pigment på poteter og utvikler et brunaktig til fiolett vegetativit mycelium på gelatin, og heller ikke meget gamle kulturer oppviser noen gang noen svartfarging av luftmyceliet. Det kan også bemerkes at,, spesielt på syntetisk agar ifølge Czapek med sakkarose (sakkarose-nitratagar), det av S. violaceoniger dannede opp-løselige pigment ved begynnelsen av dyrkingen har en blåaktig fargetone, -noe som aldri er tilfelle med de av S.'atroviolaceus DS 8938 dannede oppløselige pigment som før formørkningen oppviser, en purpurfiolett farge og ikke en blåfiolett farge.
Evnen.hos Streptomyces atroviolaceus DS 8938 til
å .utnytte forskjellige karbonkilder og nitrogenkildér for å
sikre sin utvikling er bestemt ifølge den fremgangsmåte som er beskrevet av Pridham og Gottlieb (' U. of. Bact.", 56., 107-114, 1948). Graden'av utvikling er iakttatt på det av forfatterne angitte basismedium, hvorved man.enten har erstattet glukosen med forskjellige undersøkte karbonkilder eller erstattet ■(NH^^ SO^med forskjellige undersøkte nitrogenkilder. Resultatene er sammenstilt.i nedenfor følgende tabell.
Fremgangsmåten for fremstilling av 32 999 RP består i det vesentlige at man dyrker Streptomyces atroviolaceus DS 8938 eller dennes mutanter på et dyrkingsmedium under egnende betingelser.og at man deretter separerer det under dyrkingen dannede produkt.
Dyrkingen av Streptomyces atrovilaceus DS 8938 kan skje ifølge enhver fremgangsmåte for aerob dyrking på overflaten eller på dypet, men den sistnevnte er å foretrekke av bekvemlighetsgrunner. Man anvender for dette formål forskjellige typer apparaturer som vanligvis er i bruk innen gjærindustrien.
Man kan spesielt anvende følgende oppdeling av arbeidstrinnene:
Gjærmediet bør i hovedsaken.inneholde en kilde for assimilerbart karbon og en kilde for assimilerbart' nitrogen, uorganiske stoffer, spesielt klorider eller karbonater,'og eventuelt tilvekstfaktorer. Alle disse stoffer kan anvendes i form av godt definerte forbindelser eller i form av komplekse blandinger, slik som de som man støter på i biologiske produkter av forskjellig opprinnelse.
Som kilder for assimilerbart karbon kan man anvende karbohydrater slik som glukose, laktose, dextriner og stivelse, eller andre karbonholdige forbindelser slik som sukkeralkoholer.
(glycerol) eller visse organiske syrer, f.eks. melkesyre eller sitronsyre. Visse animalske eller vegetabilske oljer, slik som spekkolje eller soyaolje kan med fordel erstatte disse forskjellige karbonholdige forbindelser eller anvendes som tilsetning til disse.
De. egnede kilder for assimilerbart nitrogen er ytterst vekslende. De kan være meget enkle kjemiske forbind- eiser slik som uorganiske eller organiske ammoniumsalter, kar-,
■bamid og visse-aminosyrer. De kan også' utgj øres av komplekse substanser som i hovedsaken inneholder nitrogen i proteinform, slik som ka'sein, laktalbumin, gluten og hydrolysat derav, soyamel, jordnøttmel, fiskemel, kjøttekstrakt,'gjærekstrakt, drank og maisstøpevæske-.
Blant de- tilsatte uorganiske stoffer kan disse ha en puffrende eller nøytraliserende virkning, slik som alkali-metall- eller jordalkalimetallfosfater eller,kalsium- eller magnesiumkarbonater. Andre uorganiske stoffer i den nødvendige' ionelikevekt for utviklingen av Streptomyces atroviolaceus DS 8938 og dannelsen av 32 999.RP, slik som klorider -og sulfater av alkalimetaller og alkaliske j ordartsmetaller." Til slutt virker visse stoffer mere spesielt som aktivatorer for de metabolske reaksjoner av Streptomyces atroviolaceus DS 8938, 'slik som salter av sink^kobolt, jern, kobber og mangan."
Tilvekstfaktorene er stoffer av vitaminnatur slik som riboflavin, folinsyre, pantotensyre og tiamin. ■
pH-verdien i gjæringsmediet bør ved dyrkingens begynnelse være -mellom 5,8 og 7,3.- Den for gjæringen optimale temperatur er mellom 25°C og 30°C, men en tilfredsstillende produksjon er oppnådd ved temperaturer mellom 23 og 33°C.' Luft-tilførslen ved■gjæringen kan variere innen ganske vide grenser. .Man har imidlertid funnet at en lufttilførsel på 0,3-3 1/1 dyrkingsbuljong og minutt er spesielt egnet.- Det maksimale utbytte av 32 999 RP oppnås etter 2-8 døgns dyrking,- hvorved tiden i det vesentlige- avhenger av det anvendte medium.
Av det ovenfor angitte fremgår det at"de generelle betingelser for .dyrking av Streptomyces atroviolaceus DS -8938 i den hensikt å fremstille forbindelsen 32 999 RP kan variere innen vide grenser og tilpasses til spesielle krav.
Forbindelsen 32 999 RP kan separeres fra frernstil-lingsmediet ifølge fremgangsmåter som er vanlige ved isolering av antibiotika av denne type.
Forbindelsen 32 999 RP kan f.eks. ekstraheres fra reaksjonsmediet eller gjæringsmediet ved en .pH-verdi nær 9 ved hj.elp av et organisk oppløsningsmiddel slik som kloroform, metylenklorid, n-butanol eller en blanding av disse oppløsni-ngs-midler i egnet forhold.
Gjæringsmediet kan også filtreres i nærvær av et filtreringshjelpemiddel ved en pH-verdi på -mellom 1,5 og 9- Det er hensiktsmessig å gjennomføre denne operasjon i surt medium, spesielt et medium som er surgjort til en pH-verdi mél-lom ,1,5 og 2 ved hjelp av pksalsyre. Det er- også mulig å gjennomføre filtreringen ved en pH-verdi på mellom 2 og 8 i nærvær av en alifatisk alkohol inneholdende 1-3 karbonatomer. 32 999 RP kan ekstraheres fra filtratet, etter konsentrering, ved hjelp av et organisk oppløsningsmiddel slik som kloroform, metylenklorid, n-butanol eller en blanding av disse oppløsningsmidler i egnede forhold. -32 999 RP. kan isoleres fra de organiske ekstrakter etter suksésive vaskinger og ekstraksjoner, ved utfelling etter konsentrering av ekstraktene til et lite.volum eller ved tilsetning av et blandbart oppløsningsmiddel i hvilket 32 999 RP praktisk talt er uoppløslig, slik som heksan, eventuelt etter omdanning av antibiotikumet til et syreaddisjonssalt , f.eks. hydrokloridet.
Forbindelsen 32 999 R? kan eventuelt renses ved en tillemping av forskjellige klassiske rensemetoder slik som krystallisering eller kromatografi på forskjellige absorbsjons-midler.
Forbindelsen 32 999 RP og dennes ugiftige, dvs. farmasøytisk akseptable, salter har vist seg meget virksomme mot tumorer. Forbindelsen og dennes salter har således hos mus vist seg virksomme mot leukemi' L 1210, leukemi P 388 og leukosearkomatose ved' intraperitoneal inngivelse i- doser på mellom 0,125 og 0,250 mg/kg.
Giftigheten av hydokloridet av 32 999 RP er studert i det vesentlige på mus. Den letale dose 50% (LD^Q)
eir nær 0,4 mg/kg ved intraperitoneal inngivelse i fire på hverandre følgende døgn.
Oppfinnelsen skal illustreres ved følgende ikke begrensende eksempler. I eksemplene er forbindelsen, 32 999
RP identifisert ved.hjelp av tynnsjiktskromatografi pa silikagel, hvorved man har sammenlignet Rf-verdiene for de oppnådde produkter med Rf-verdiene for karminomycin eller 32 999 RP i samme oppløsningsmiddelsysten. Produktene av 32 999 RP er bestemt ved hjelp av tynnsjiktskromatografi, enten ved sammen ligning av .entensiteten av den flekk som er oppnådd med ekstratet med den flekk som er oppnådd med ren 32 999 RP, eller ved sammenligning av .flatene av de t.opper som registreres ved hjelp av en Chromoscan-plate, eller ved kolorimetrisk bestemmelse av forbindelsen 32 999 RP, eluert fra produktflekken på den kroma-tografiske bærer.
pH-verdien hos en oppløsning av de tre første bestanddeler i 1000 cm^ destillert vann innstilles til 6,9 ved tilsetning av IN natriumhydroksydoppløsriing, hvoretter oppløs-ningen fordeles i kolber på 300 cm 3 i en mengde pa .50 cm 3/kolbe. Disse kolber steriliseres ved 122 C i løpet av 20 minutter og avkjøles deretter. Man fullfører deretter dyrkingsmediet ved
at det til hver kolbe sterilt settes 1,5 cm^ av en steril glu-koseoppløsning inneholdende 500 g glukose pr. liter. Mediet har deretter en pH-verdi på 7,05.
Man poder 80 av disse kolber ved til hver kolbe å sette 2,5 cm^ av en ppdingskultur av en stammen Corynebacterium'. simplex (ATCC 6946). Kulturen utvikles på'et bord som roterer med 220 omdreininger/minutt i et rom med temperaturen 30°C. Etter'48 timer er kulturen godt utviklet og pH-verdien er. 7,70. -Til hver kolbe setter man deretter 2,5 cm^ av en vannoppløsning inneholdende 10 mg karminomycinnydroklorid pr; cm^. Reduksjonen gjennomføres under de samme rotasjonsbetingelser ved 26°C.
Etter 48 timer er reduksjonen avsluttet og dyrkingsmediets pH-verdi er 8,5- Innholdet i de -80 kolbene forenes. Man tar ut en homogen prøve på 50 cm<J>dyrkingsmedium og denne prøve behandles med 25 cmJ av en boratpuffer slik at pH-verdien forhøyes til 9,0. Man ekstraherer deretter med 2 x 50 cm<J>av en blanding av metylenklorid og n-butanol i volumforholdet 70:30. De organiske ekstrakter tørkes over vannfri- natriumsulfat. Produksjonen av 32 999 RP bestemmes ved tynnsjikts kromatografi av ekstrakten på s-ilikagel. De avsatte ekstraktvolumer er 10-20 yl. Man fremkaller med en blanding av metylenklorid, maursyre og metanol i volumforholdet 80:17:3 for å
kunne oppnå en god spearasjon av karminomycin og '32 999 RP. Rf-.verdiene for de oppnådde produkter sammenlignes med Rf-verdiene for referanseforbindelser under samme betingelser.
Den kvantitative bestemmelse av fremstillingen av 32 999 RP viser at kulturen av Corynebacterium simplez (ATCC 6946) reduserer karminomycinet til'32 999 RP i et utbytte på 80%, beregnet på mengden.av tilsatt karminomycin. Eksempel 2
Man fremstiller et dyrkingsmedium A og fordeler dette i kolber på 300-cm^ på.samme måte som i eksempel 1.
Man fremstiller dessuten er dyrkingsmedium B og fordeler dette også i 300 cm kolber. Dyrkingsmediet B har følg-ende sammensetning:
Mediets pH-verdi innstilles på 7,2 ved tilsetning av IN natriumhydroksydoppløsning, hvoretter mediet sterili-' seres ved 122°C i 20 minutter.
Man poder en kolbe inneholdende 50 cm^ medium A med pH-verdi 7,05 og en kolbe inneholdende 50 cm^ medium'B med pH 6,5 med hver 2,5 cm^ av én podingskultur av stammen Corynebacterium simplex (ATCC 6946).
Kulturene utvikles på et bord som roterer med 220 omdreininger/minutt i et rom med temperaturen 30°C. Etter en egnet dyrkingstid (48 timer for medium A og 72 timer for medium B) setter man til hver kolbe 2,5 cm^ av en vannoppløsning inneholdende 10 mg karminomycinhydrokiorid pr. cm'). Derved oppnår man en karminomycinkonsentrasjon på 0,5 g/l.
Etter disse tilsetninger inkuberes mediene A og B i to respektive fire døgn på et bord som roterer med 220 omdreininger/minutt i et rom med en temperatur på 26°C.
Innholdet i kolbene behandles deretter på samme måte s.om i eksempel 1.
I nedenfor angitte tabell angis utbyttene av 32 999 RP, beregnet på mengden av tilsatt karminomycin.
Eksempel 3
I 300 cm^ kolber fremstilles kulturer av Corynebacterium simplex (ATCC 6946) i dyrkingsmedium A på samme måte' som i eksempel -1. Kulturene utvikles på et-bord som roterer med 220 omdreininger/minutt i et rom med temperaturen 30°C.
Etter 30 timers' inkubering forenes innholdet i 5 kolber (250 cm^ dyrkingsmedium), og de tilstedeværende celler separeres ved sentrifugering. Den oppnådde cellemengde suspenderes deretter-i en 300 cm^ kolbe inneholdende 50 c.m^ av en M/15 fosfatpuffer med pH 8,0. På samme måte fremstilles også en annen cellesuspensjon ved' suspensjon av cellene i 50. cm^ av en m/15 fosfatpuffer med pH 5,0. Til hver kolbe, setter man deretter 2,5 cm^ av en vannoppløsning inneholdende 4 mg karminomycinhydroklorid pr. cm'<1>. Karminomycinkonsentrasjonen blir. herved 0,2 g/l.
Kolbene inkuberes i 48 timer -under de i eksempel 1 angitte betingelser, og inneholdet i kolbene behandles deretter på samme måte som i eksempel 1.
I nedenfor følgende tabell angis utbyttene av antibiotikumet 32 999 RP, beregnet på mengden tilsatt karminomycin.
Eksempel 4
. Man fremstiller et dyrkingsmedium A med pH-verd'ien 6,8 og fordeler- dette i 300 cm 3 kolber i en mengde på 50 cm -z pr.
kolbe på samme måte som i eksempel 1.
Til flere kolber setter man'2,5 cm^ av en podingskultur av stammen Bacillus cyciooxydans (ATCC 12.673)- -Kulturen utvikles i 48 timer på et bord som roterer med 220 'omdreininger/ minutt i et rom med temperaturen 30°C.
Reduksjonen av- karminomycin gjennomføres deretter enten ved anvendelse av hele dyrkingsmediet hvis pH-verdi er 7,65- eller ved anvendelse av en cellesuspensjon i en puffer med pH 8,0, fremstilt på samme måte som i eksempel 3-
Til hver kolbe setter man 1 cm 3 av en- vannoppløsning - inneholdende 10 mg karminomycin pr. cm^. Herved oppnås en karminomycinkonsentrasjon på 0,2 g/l.
Reduksjonen av karminomycinet gjennomføres i løpet av fire døgn-på et bord som roterer med 220 omdreininger/minutt i et rom med temperaturen 26°C. Innholdet i kolbene behandles deretter på samme måte som i'eksempel 1. T nedenfor følgende tabell angis de oppnådde utbytter av 32 999 RP, beregnet på mengden tilsatt karminomycin.
Eksempel 5
På samme måte -som i eksempel 4, fremstiller man kulturerav Bacillus cyciooxydans (ATCC 12.673) i dyrkingsmedium .A. Etter inkubering av kulturene i 48 timer setter man -karminomycin til dyrkingsmediene hvis pH-verdi er 7,65- Til hver kolbe setter man enten 1 cm^ av en vannoppløsning inneholdende 10 mg ren forbindelse/cm^(0,2 g karminomycin/1) eller 4 cm^ av en vannoppløsning inneholdende ' 10 mg/cm"<3>av et urent produkt inneholdende ±6% karminomycin' (0y13 g karmiriomycin/1)■
Kolbene inkuberes deretter i fire døgn under de i eksempel 1 beskrevne betingelser, og innholdet i kolbene behandles deretter på samme måte som. i eksempel 1. I nedenfor følg-ende tabell angis utbyttene av 32 999 RP, beregnet på mengden av tilsatt karminomycin.
Eksempel 6
Man fremstiller et dyrkingsmedium C med -følgende sammensetning:
De ovenfor angitte bestanddeler bortsett fra glukosen oppløses eller suspenderes i 900 cm^ destillert vann.
Etter innstilling av pH-verdien til 7,20 ved tilsetning av IN natriumhydroksydoppløsning fordeles oppløsningen i 300 cm^ kolber i en mengde på 45 cm^/kolbe. Kolbene steriliseres ved 122°C i 20 min. og avkjøles deretter. Man gjør dyrkingsmediet ferdig ved til hver kolbe sterilt å sette 5 cm^ av-en steril glukoseoppløsning inneholdende 500 g glukose/l. Det for poding ferdige medium har en pH-verdi på 7,0.
En 300 cm^ koble inneholdende 50 cm') av det ovenfor beskrevne dyrkingsmedium .med pH 7,0 podes med 2,5 cm<J>av en podingskultur av stammen Streptomyces roseochrompgenes.(ATCC 13-400). Kulturen utvikles i 48 timer på et bord som roterer med 220 omdr./min. i et rom med temperaturen 30°C. De ved dyrkingen frem-stile celler samles deretter. Reduksjonen av karminomycin til antibiotikumet 32 999 RP gjennomføres med- en suspensjon av cellene i- 50-cm;> av en M/15 fosfatpuffer med pH 8,0 inneholdende 1 cm^ av en .vannoppløsning■inneholdende 10 mg karminomycinhydroklorid pr. cm^. Den opprinnelige karminomycinkonsentrasjon er altså 0,2 g/l. Reduksjonen gjennomføres i 48 timer på ét bord som roterer med 220- omdr./min. i et rom med temperaturen 26°C. Suspensjonen behandles på samme måte som beskrevet i eksempel 1. Utbyttet av 32 999 RP er 57%, beregnet.på mengden tilsatt karminomycin .
Eksempel 7'
Et dyrkingsmedium C fremstilt på samme måte som- i eksempel 6 fordeles i 300 cm^ kolber.
Kolber inneholdende 50 cm'' av dette medium med en pH-verdi på 6,90 podes med 2,5 cm"<5>av en podingskultur'av' : stammen Streptomyces lavendulae (ATCC 8664). Kulturen utvikles i 40 timer på et bord som roterer med 220 omdr.Vmin. i et rom med temperaturen 26°C. Til hver kolbes dyrkingsmedium, hvis pH-'. verdi er 7,50, setter man deretter 1 cm"' av en ■ vannoppløsning inneholdende 10 mg karminomycinhydroklorid pr. cm^. Man oppnår-herved en karminomycinkonsent-ras j on på 0,2 g/l. KarminomyCinet reduseres deretter i fire timer under de samme omrørings.betingelser og ved samme temperatur som angitt, ovenfor. Innholdet i kolbene behandles deretter på samme måte- som i eks. 1. Utbyttet av 32 999 RP er 6l%, beregnet på mengden av tilsatt karminomycin.
Eksempel 8 (A) Gjæring.
I en gjæringsbeholder med volumet 170 liter tilsettes følgende stoffer:
Etter innstilling av pH-verdien på 6,8 med 40 cm^ 10N natriumhydroksydoppløsning tilsetter man 300 g kalsiumkarbonat.
Mediets pH-verdi er deretter ca. 6,8. Man steriliserer mediet ved gjennombobling av vanndamp ved 122°C i 40 min..Etter avkjøling er buljongens volum 120 1 og pH-verdien 8,3 som følge av kondensasjon av vanndamp under steriliseringen'.
Man poder med 250 cm" av en podingskultur'av stammen Corynebacterium simplex (ATCC 6946), hvilken podingskultur er fremstilt ved dyrking i en rystet kolbe. Kulturen • utvikles i 32 timer ved 30°C under omrøring dg under lufting med steril luft. Den er deretter egnet til å anvendes for poding av produksjonsmediet.
Produksjonsdyrkingen gjennomføres i en gjæringsbe holder med volumet 800 1 hvortil følgende stoffer settes:
Etter innstilling av -pH-verdien-til 7, 0 ved tilsetning av 460 cm ION -natriumhydroksydoppløsning steriliseres mediet ved gj ennomb.obling av vanndamp ved 122°C i 40 min. Etter avkjøling har bulj ongen- et- volum på 385 1 som følge av kondensasjon av vanndamp under steriliseringen. Mediets volum innstilles deretter til 400 1 ved tilsetning av 15 1 av en steril vannopp-løsning inneholdende 6 kg glukosemonohydrat.
Mediets pH-verdi er 6,8. Man poder-med. 40 1 podingskultur fra den ovenfor beskrevne dyrking i gjæringsbeholderen med volumet 170<*>1. Kulturen utvikles ved 30°C under om-røring med et røreverk som roterer med loO omdr./min., og under lufting med 20 cm^ steril luft pr. time. Etter 30 timer er kulturen ferdig til anvendelse for den biokjemiske omdanning av karminomycin til 32 999 RP. ;I dyrkingsmediet innføres fire 1 av en vannoppløs-ning inneholdende 40 g karminomycinhydroklorid. ;Inkuberingen fortsettes i 17 timer ved 26°C under samme omrøring og lufting som beskrevet ovenfor. Karminomycinet reduseres til 32 999 RP i. et utbytte på nær 100%. ;(B) Utvinning. ;Til .420 1 av den ovenfor oppnådde reaksjonsoppløs-ning setter man 42 1 n-butanol og- 2,9 1 6N natriumhydroksydopp-løsning- den virksomme bestanddel ekstraheres i motstrøm med en butanol (60 volum-%) under anvendelse av to motstrømssentrifug-er. Ekstraktet som har et volum på 330 1 konsentreres under et redusert trykk på 5-10 mm Hg ved 40°C til et volum på 20 1. ;Til det konsentrerte ekstraktet settes 20 1 metylenklorid, og den oppnådde blanding vaskes med 10 1 vann hvis pH-verdi er innstilt på 10 ved tilsetning av natriumhydroksyd-oppløsning. Vaskevannet som inneholder 32 999 RP ekstraheres 2 ganger' med 10 1 av en blanding av metylenklorid og n-butanol i et volumforhold på 80:20. ;De'tre organiske ekstraktene forenes og konsentre res deretter under et redusert trykk på 5-10 mm Hg til et volum på 15 1. Man tilsetter deretter under omrøring 0,2 1 av en blanding av n-butanol og 11N saltsyre i et ' volumforhold på 9,0:10, hvoretter man konsentrerer under et redusert trykk på 5-10 mm Hg til et volum på 5 1• ;Antibiotikumet 32 999 RP i form av hydrpklorid felles ut ved at konsentratet■tilsettes til 35 1 heksan. Utfel-lingen filtreres av, vaskes og tørkes. Man oppnår herved"52 g urent 'hydroklorid av 3,2 999 RP. ;(C) Rensing. ;(a) 'Til en suspensjon av 50 g av den ovenfor oppnådde urene hydroklorid av 32 999 RP i 130 cm 3 vann setter man 520 cm^ dioksan. Den oppnådde oppløsning filtreres. ;Hydrokloridet av 32 999 RP krystalliseres deretter ved at man til filtratet setter 4 1 dioksan ved en temperatur nær 20°C. De dannede krystaller filtreres av, vaskes med diok- ;san og tørkes. Man oppnår herved 27 g halvrent hydroklorid av 32 999 RP. ;(b) 4,2 g av det ovenfor oppnådde urene hydroklorid ;av 32 999 RP oppløses i" 0,2 1 vann. Den oppnådde'oppløsnings pH-verdi innstilles til 4,5 ved tilsetning av 10N natriumhydrok-sydoppløsning. ;Antibiotikumet i denne oppløsning fikseres på en kolonne av 0,4 1 "Amberlite .IRC 50" i syreform.' Kolonnen vaskes med 1 1 vann, med 2 1 50%-ig metanol, med 2 1 90;?-ig metanol og til slutt med 3 1 90%-ig metanol inneholdende 1% natriumklorid. Eluatet konsentreres under et redusert trykk på 5-10 mm Hg ved 40°C til et volum på 0,5 1.. Konsentratet hvis pH-verdi innstilles til 10 ved tilsetning av 11N natriumhydrok-sydoppløsning ekstraheres med to ganger 0,5 1 kloroform og to ganger 0,5 1 av en" blanding av kloroform og n-butanol i et volumforhold på 80:20. De.organiske ekstrakter forenes og kon-, ;. sentreres 'under et redusert trykk på 5-10 mm Hg ved 40°C. Under konsentrasjonen tilsetter man 10 -cm^ n-butanol inneholdende 1 ;■volum% 11N saltsyre og 5 volurn-% vann. Konsentratet hvis volum innstilles til 30 crrP, settes langsomt til 500 cm^ heksan. -Den oppnådde felling filtreres av, vaskes og tørkes. Man oppnår herved' 1,26 g halvrent hydroklorid av 32 999 RP. ;Det under (a) ovenfor oppnådde halvrene "produktet ;i en mengde på 27 g oppløses i 300 cm"1 vann, og den oppnådde opp-løsning filtreres. ;Hydrokloridet av 32 999 RP krystalliseres ved at man til filtratet- setter 2,7 1 aceton ved en temperatur nær 20°C. De oppnådde krystaller filtreres av, vaskes og tørkes. 'Man-oppnår herved 17 g rent hydroklorid av 32 999 RP• ;Eksempel 9 ;50 cm^ av en kultur av Corynebacterium simplex (ATCC 6'946 ), utviklet i løpet av 30 timer under' de samme betingelser som beskrevet ovenfor i eks. 8 A, sentrifugeres sterilt ved en temperatur nær 0°C. Etter sentrifugeringen suspenderes de oppnådde'celler i 50 cm^ M/15 fosfatpuffer med pH 7,5- Cellene underkastes deretter en ultralydbehandling ved 25 kHz.i . 15 min. ved en temperatur nær 0°C. Etter sentrifugering tilsetter man- til den ovenstående væske 10 mg karminomycinhydroklorid. Den herved oppnådde'oppløsning inkuberes under de samme ;■betingelser som beskrevet i eks. 1. Etter 40 timer er karminomycinet redusert, til 32 999 RP i et utbytte på ca. 60%. ;Eksempel 10 ;50 cm 3 ■av en kultur av Corynebacterium simplex (ATCC 6946), utviklet i løpet'av 30 timer under de betingelser' som er angitt i eks'. 8 A, sentrifugeres sterilt ved en temperatur nær 0°C. Etter sentrifugeringen suspenderes de oppnådde celler i 50 crrr 3 tris (hydroksymetyl )aminometan-M/15 HCl-puffer med en pH på 8,1, hvoretter suspensjonen overføres til en 300 crn^ E-kolbe. Man tilsetter .deretter 25 mg'etylendiamintetra-eddiksyre, 25 mg cetyltrimetylamrnoniumbromid og 200 mg lysozym. Kolben holdes deretter i 1 time ved 37°C på et bord som roterer med 220 omdr./min. Etter sentrifugering tilsetter man til den overstående væske■5 mg karminomycinhydroklorid. Den herved oppnådde oppløsning inkuberes under de samme betingelser som beskrevet i eks. 1. Etter- 40 timer er karminomycinet redusert til 32 999 RP i et utbytte på ca. 30%. ;Eksempel 11 ;0,5 g rent hydroklorid av 32 999 RP hydrolyseres ved at det oppløses i 50 cm<:>>vann inneholdende 10 cnr<3>11N saltsyre. Den oppnådde oppløsning oppvarmes til koking i to timer. En krystallinsk utfelling av aglykonet dannes under denne hydrolyse. Den dannede felling filtreres av, vaskes og tørkes. Man oppnår 0,3 g rent aglykon. ;Eksempel 12 ;Man fremstiller et■dyrkingsmedium A med følgende sammensetning: ;
Den oppnådde suspensjonens pH-verdi innstilles til 6,5 ved tilsetning av 1 cm ION natriumhydroksydoppløsnmg. Man tilsetter deretter 19 g glycerol (d = 1,26), 2 g kaliumkarbonat og destillert vann til tilsammen • 1000 cm^. ;Det oppnådde dyrkingsmedium fordeles i 300 cm^ kolber i en mengde på 50 cm'5 pr. kolbe. Kolbene steriliseres ved 122°C i 20 min. Etter avkjøling er mediets pH-verdi 5,9- Man fremstiller dessuten er steril oppløsning som inneholder 10 mg sulfanilamid pr. cm^ og har en pK-verdi .på 9,0, ved oppløsning av sulfanilamid i en blanding av 5N- natriumhydroksydoppløsning og destillert vann og etterfølgende filtrering gjennom "Milli-pore-membraner" (0,45 ym). ;Kolbene med det -sterile medium A fordeles i seks grupper på to kolber hver. ;Til kolbene i gruooe A-, settes intet sulfanilamid. Til kolbene i ele fem andre grupper settes sulfanilamid i følgende mengder: ;Gruppe A-: 1 cm^ av sulfanilamidoppløsningen (0,2 g/l) ;Gruppe A,: 2 cm av silfanilamidoppløsningen (0,4 g/l)- ;Gruppe A^:3 cm av sulfanilamidoppløsningen (0,6 g/l) ;.Gruppe A,5 -: 4 cm^ v av sulf anilamidoppløsningen (0,8 g/l) ;Gruppe Ag: 1 cm av sulf anilamidoppløsningen (0., 2 g/l) ;Samtlige kolber i de seks grupper podes med 2,5 cm^ av en 72 timer gammel podingskultur av Streptomyces coeruloe-rubidus DS 7126 (NRRL 8098). ;Kulturene utvikles på et bord som roterer med 2.20 omdr./min. i et rom med temperaturen 26 C. Til kolbene i gruppe Ag settes ytterligere 1 cm 3 su"lfanilamidoppløsning etter 48 henholdsvis 72 timers inkubering (den totale sulfanilamidkonsen-trasjon er-altså 0,6-g/l). Etter var og en av disse tilsetninger fortsettes inkuberingen av kolbene under de ovenfor angitte betingelser. ;Etter syv døgns inkubering behandles'samtidig en .kolbe fra hver gruppe for bestemmelse av mengden 32 999 RP. Denne- behandling skjer ved at man til hver kolbe setter 4 g oksalsyre (herved innstilles mediets pH-verdi til 1,5-) og 50 cm absolutt etanol. Kolben lukkes deretter hermetisk og plasseres i en time på et bord som roterer med 220 omdr./min. Blandingen filtreres deretter gjennom filterpapir, og filtratet dampes inn under redusert trykk ved 50°C til halvparten av sitt opprinnelige volum (50 cm ) . Konsentratets pH-verdi innstilles til 4.,5 ved tilsetning av 5N natriumhydroksydoppløsning og deretter tilsetter man i tur'og orden 50 cm^ av en blanding av metylenklorid'og n-butanol'i volumf orholdet 80:20 og 25 cm^ 0,5 M\ b.oratpuf f er med pH 9,0."Etter omrøring i en kolbe samles" ved dekantering den fargede oppløsningsmiddelsfase, og man gjentar behandlingen ved de vannholdige moderlut-ene, som ekstraheres med 50 cm 3 av samme oppløsningsmiddelblanding. De organiske fasene forenes og tørkes over vannfri natriumsulfat. D'en organiske fasens volum innstilles til slutt på 100 cm'' ved tilsetning av samme oppløsningsmiddelblanding. ;Produksjonen av 32 999 RP bestemmes ved tynnsjikts-' kromatografi av disse .ekstrakter: (1) Man foretar en kvalitativ bedømmelse av produksjonen ved på silikagelplater ("Merck 60" - glassunderlag uten fluoressensindikator) og avsette 100 pl ekstrakt og 2,5-10 ug rent 32 999 RP som referansemateriale. Platene fremkalles med en blanding av metylenklorid, etanol, eddiksyre og vann i et volumforhold på 80:20:10:4. Det eventuelle nærvær av 32 999 RP i ekstraktet påvises etter fremkalling ved at kromatogrammet undersøkes enten i dagslys eller i ultrafiolett lys med en bølgelengde på 254 nm. (2) Produksjonen av 32 999 R? måles kvantitativt ved at man på silikagelplater ("Merck 60 F 254" - glassunderlag med fluoressensindikator) avsetter ekstraktvolumer mellom 10 og 100 yl, hvorved det avsatte volum bestemmes på grunnlag av den kvali-tative tynnsjiktskromatografi. På andre slike plater .avsettes også ren 32 999 RP i en skala fra 0,5- 1,5 ug. Platene frem-' kalles med det ovenfor beskrevne oppløsningsmiddelsystem. Etter fremkallingen undersøkes platene ved'hjelp av en "Chromoscan"-plate, som registrerer topper tilsvarende mengden'32 999 RP■ -Man sammenligner flatene' av de topper som tilsvarer mengdene 32 999 ;RP i ekstraktene med flatene av de topper som tilsvarer de avsatte mengder ren 32 999 RP, og på denne måte -kan man bestemme den dannede mengde av 32 999 RP i dyrkingsoppløsningene. De oppnådde resultater er anført i nedenfor følgende tabell. ;
Eksempel 13 ;Et dyrkingsmedium A fordeles- på samme måte som i ;3 3 ;eks. 12 i 300 cm kolber i en mengde av 50 cm pr. kolbe. Man fremstiller også en tilsvarende sulfanilamidoppløsning (10 mg/cm^) som i eksempel 12. ;Kolber inneholdende sterilt medium A fordeles i fire ;■grupper (A-^, A' ^, A^ og A'^) på hver to kolber. Til hver kolbe i gruppene A^ og A'^setter man 4 c'm^ av sulf anilamidoppløsningen (0,8 g sulfanilamid-pr. 1). Til kolbene i'gruppene A-, og A'^settes ingen sulfanilamid. ;3Kolbene i gruppene A1 og Aq podes deretter med 2,5' cm av en 72 timer gammel podingskultur av Streptomyces coeruleo- ■ rubidus DS 8899 (NRRL 3046), og kolbene i gruppene A^ og A'5podes med 2,5 cm^ av en 72 timer gammel podingskultur av Streptomyces coeruleorubidus DS 31-723 (NRRL 3045). ;Kulturene utvikles på et bord som roterer med 220 omdr/min. i et rom med temperaturen 26°C. Etter 7 døgns inkubering under disse betingelser bestemmes mengden av dannet'32 999 RP på samme måte som i eks. 12. De oppnådde resultater er ;
Eksempel 14 ;Et dyrkingsmedium A fordeles på samme måte spiri i ;3 o 3 ;eks. 12 i 300 cm kolber i en mengde pa 50 cm pr. kolbe. ;Man fremstiller også en sulfanilamidoppløsning ;(10 mg/cm 3) på samme måte som i eks. 12. ;Kolber inneholdende sterilt medium A fordeles i- fire grupper på hver to kolber. Til kolbene i'gruppe A^. settes ingen sulfanilamid, men til kolbene i de øvrige grupper settes sulfanilamid i nedenfor angitte mengder: ;Gruppe Ap: 1 cm 3sulfanilamidoppløsning. (0,2 g/l) ;Gruppe A^.: ' 2 cm 3sulf anilamidoppløsning (0,4 g/l) ;Gruppe A^: 3 cm sulfanilamidoppløsning (0,6 g/l) ;Etter disse tilsetninger podes alle kolbene i samtlige grupper A-^-A^ med 2,5 cm."5av en 72 timer gammel podingskultur av Streptomyces bifurcus DS 23.219 (NRRL 3539). ;Kulturene.utvikles på et bord.som roterer med 220 omdr./min. i et rom med temperaturen 26°C. Etter inkubering i 7 døgn under disse betingelser bestemmes de dannede'mengder ;32 999 RP på samme måte som i eks'. 12. De oppnådde resultater er sammenstilt i nedenfor følgende tabell. ;
Eksempel 15 ;Man fremstiller et dyrkingsmedium B med følgende sammensetning: ;
Dette medium hvis pH-verdi innstilles på 7,20 ved tilsetning av IN natriumhydroksydoppløsning, fordeles i' 300 cm^ kolber i en mengde på 50 cm^-pr. kolbe og steriliseres ved 122°C i 20 min. Etter avkjøling har mediet en pH-verdi på 6,60. ;Man fremstiller en tilsvarende vannoppløsning av sulfanilamid som beskrevet i eks.. 12. ;Kolber inneholdende sterilt medium B fordeles' i ;to grupper B^og B~på hver to kolber.'Til hver -kolbe i gruppe B^setter man 2 cm3 av sulfanilamidoppløsningen (0,4 g sulfanilamid pr. liter). Til kolbene i gruppe B^settes ingen 'sulfanilamid . Man poder deretter samtlige kolber i gruppene Bn og B~med 2,5 cm av en 72 timer gammel, podingskultur av Streptomyces coeruleorubidus DS 31-723 (NRRL 3045).'Kulturen utvikles på ;et bord som roterer med 220 omdr./min. i et rom-med temperaturen 26°C. Etter 7 døgns poding under disse betingelser behandles innholdet i kolbene på samme måte som i eks. 12 for bestemmelse av de dannede mengder- 32 999 RP• De oppnådde resultater er sammenstilt i nedenfor følgende tabell. ; ;
Eksempel 16 ;På samme måte som i eks. 12 fordeler man et dyrkingsmedium A i 300 cm 3 kolber i en mengde på 50 cm 3 pr. kolbe. ;Man fremstiller også en sulfatiazoloppløsning (10 mg/cm^)under de samme betingelser som angitt i eks. 12 for ;fremstilling av sulfamilamidoppløsningen. ;Kolber inneholdende sterilt, medium A fordeles i fire grupper på hver to kolber. Til kolbene i gruppe A^ settes ingen sulfatiazol, men til kolbene i de andre gruppene settes sulfatiazol i følgende mengder: ;Gruppe A7: 0,25 ctn^ sulfatiazoloppløsning (0,05 g/l) ;Gruppe Ag: 1 cm sulfatiazoloppløsning (0,2 g/l) ;Gruppe A^: 0,5 cm^ sulfatiazoloppløsning (0,1 g/1) ;Man poder deretter samtlige kolber med -2,5 cm^ av en 73 timer gammel podingskultur av Streptomyces coeruleorubidus ;■DS 7126 (NRRL 8098). Kulturene utvikles på et'-bord som roterer med 220 omdr./min. i et rom med temperaturen'26°C. Til kolbene i gruppe Ag settes ytterligere 0,5 cmJ -sulfatiazoloppløsning etter 48 henholdsvis 72 timers inkubering-(den totale sulfatia-zolkonsentrasjon er altså 0,3 g/D- Etter hver og en av disse tilsetninger fortsettes inkuberingen under de ovenfor angitte betingelser.. ;Etter inkubering i 7 døgn bestemmes de dannede mengder 32 999'RP på samme måte som i eks. 12. De oppnådde resultater er sammenstilt i nedenfor angitte tabell. ;
Eksempel 17 ;På samme måte som i eks. 12 fordeles et dyrkingsmedium A i 300 cm^ kolber i en mengde på 50 cm^ pr. kolbe. ;Man fremstiller også en sulfatiazoloppløsning ;(10 mg/cm^).<p>å samme måte som'i eks. l6. ;Kolber inneholdende sterilt medium A fordeles i fire grupper, på hver to kolber."Til kolbene i gruppe A-^ settes ingen sulfatiazol, men til kolbene i de andre grupper settes sulfatiazol i nedenfor angitte mengder: ;Gruppe A^Q: 0,5 cm^ sulfatiazoloppløsning (0,1 g/l) ;Gruppe A-^: 2 cm^ sulfatiazoloppløsning (0,4 g/l) ;Gruppe A12: 2,5 cm^ sulfatiazoloppløsning (0,5 g/l) ;Samtlige kolber podes deretter med 2,5 cm'1 av en 72 timer gammel podingskultur av Streptomyces coeruleorubidus DS 31.723 (NRRL 3045). Kulturene utvikles på et bord som roterer med 220 omdr./min. i et rom med temperaturen 26°C. ;Etter syv døgns inkubering under disse betingelser bestemmes de dannede mengder 32 999 RP på samme måte som i eks. 12. De oppnådde resultater er sammenstilt i nedenfor følg-ende tabell.1 ; ;
Eksempel 18 ;På samme måte som i eksempel 12- fordeles et dyrkingsmedium A' i 300 cm^ kolber i en mende på 50 cm^ pr. kolbe. ;Man fremstiller også'en sulfatiazoloppløsning ;(10 mg/cm"<1>) på samme måte som i eks. 16'. ;Kolber inneholdende sterilt medium.A ' fordeles i fire grupper på hver to kolber. Til kolbene i gruppe A^settes ingen sulfatiazol, men til kolbene i de andre grupper settes sulfatiazol i nedenfor angitte mengder: ;Gruppe A1Q: 0,5 cm x sulfatiazoloppløsning (0,1 g/l) ;Gruppe Ag : 1 cm'5 sulf atiazoloppløsning- (0,2 g/l) ;Gruppe 2 cm^ sulf atiazoloppløsning (0,4 g/l) ;Samtlige kolber podes deretter med 2,5 cm; av en 72 timer gammel podingskultur av Streptomyces bifurcus DS 23-219 (NRRL 3539). Kulturene utvikles på et bord som roterer med 220 omdr./min. i et rom med temperaturen 26°C. ;Etter syv døgns inkubering under disse betingelser bestemmes de dannede mengder 32 999 RP pa samme måte som i eks. ;12. De oppnådde resultater er sammenstilt i nedenfor følgende tabell. ;
Eksempel 19 ;Man fremstiller et dyrkingsmedium C inneholdende følgende stoffer: ;
Man fremstiller mediet på følgende måte. Man koker først bønnene i en autoklav med 50 cm'' destillert vann i 45 min." ved 122°C, hvoretter man fremstiller'en pure av. bønnene. Man tilsetter deretter dranken, soyaoljen og koboltkloridet samt destillert vann til et totalt volum på 900 cm"<*.>
Blandingens pH-verdi innstilles til 7,2 ved tilsetning av 5N natriumhydroksydoppløsning. Blandingen fordeles i 300 cm"<i>kolber i en mengde på 4 5 cm'' pr., kolbe. Kolbene steriliseres ved 122°C i 20 min. Etter avkjøling tilsetter man sterilt til hver kolbe 5 crn^ av en steril oppløsning inneholdende 15% glukose. Det. oppnådde sterile mediums pH-verdi er 6,70.
Man fremstiller- også en vannoppløsning av sulfatiazol på samme måte som i eks. 16.
Kolber inneholdende sterilt medium C fordeles i
to grupper C^og Cp på hver to kolber. Til kolbene i gruppe C^. settes intet sulfatiazol, men til hver- kolbe i gruppe C0settes 0,5 cm^. sulf atiazoloppløsning (0 ,• 1 g sulfatiazol pr. 1).
Samtlige kolber podes deretter med 2,5 omJ av en
72 timer gammel podingskultur av Streptomyces bifurcus DS 2-3.
219 (NRRL 3539). Kulturene utvikles på et bord som roterer med 220 omdr.Vmin. i et rom med temperaturen 26°C. Etter 10" døgns inkubering under disse betingelser bestemmes de dannede mengder 32 999 RP på samme måte som i eks. 12. De oppnådde resultater
er sammenstilt i nedenfor følgende tabell.
Eksempel 20
På sammé måte som i eks. 12 fordeler man et.dyrkingsmedium A i 300 cm^ kolber i en mengde på 50 cm^ pr. kolbe.
Man fremstiller deretter en sulfapyridazinoppløs-ning (10 mg/cm^) ved a oppløse sulfapyridazin i en blanding av destillert vann og 5N saltsyre. Den oppnådde'oppløsning hvis pH-verdi er 2,0, steriliseres ved filtrering gjennom "Millipore"-membraner (0,45 um).
Kolber inneholdende sterilt medium A fordeles i tre grupper på hver to kolber. Til kolbene i gruppe A^.settes intet sulfapyridazin, men til kolbene i de øvrige grupper settes sterilt sulfapyridazin i følgende mengder:
Gruppe A, • 0,5 cm'' sulfapyridazinoppløsning (0,1 g/l)
Gruppe A-j^: 1 om<3>sulf apyridazinoppløsning (0,2 g/l)
Samtlige kolber podes deret. t• er med 2,5 cm 3av en 72 timer gammel podingskultur av Streptomyces coeruleorubidus DS
7126 (NRRL 8098) .
Kulturene inkuberes i syv døgn under de samme betingelser som er beskrevet i eksempel 12. Man bestemmer deretter de dannede mengder 32 999 RP på samme måte som i eks. 12.
De oppnådde resultater er sammenstilt i nedenfor følgende tabell.
Eksempel 21-
På samme måte som i eksempel 12 fordeler man et dyrkingsmedium A i 300 cm'' kolber i en.mengde på 50 cm^/kolbe.
Man fremstiller dessuten en ametopterinoppløsning (20 mg/cm^) ved å oppløse ametopterin i en blanding av destillert vann og 5N natriumhydroksydoppløsning. Den oppnådde opp-løsning hvis .pH-verdi er 10,0 steriliseres ved filtrering gjennom. "Millipore"-membraner (0o 4 5 ym).
Kolber inneholdende sterilt medium A fordeles i fire grupper (A-^A-^, A-^og A^) på hver to kolber. Til kolbene i gruppe A-^settes intet ametopterin. Til kolbene i de tre andre grupper settes ametopterin i følgende mengder:
Gruppe A,,-: 0,25 cm^ ametopterinoppløsning (0,1 g/l)
Gruppe A-^g: 0,6 cm 3 ametopterinoppløsning (0,24 g/l)
Gruppe A1^: 1 cm^ ametopterino<p>pløsning (0,4 g/l)
3' Samtlige kolber podes deretter med 2,5' cm av en 72 timer gammel podingskultur av Streptomyces coeruleorubidus DS 7126 (NRRL 8098). Kulturene inkuberes .i 7 døgn under omrør-ing på samme måte som i eks. 12. De dannede mengder 32 999 RP bestemmes deretter på samme måte som i eks. 12. De oppnådde resultater er sammenstilt i nedenfor .følgende tabell.
Eksempel 22 .
På samme måte som i eksempel 12, fordeler man et dyrkingsmedium A i 300 cm kolber i en mengde på 50 ■cm"' pr. kolbe. Man fremstiller dessuten en barbitaloppløsning (50 mg/ cm^) ved å oppløse barbital i en blanding av destillert vann
■og 5N natriumhydroksydoppløsning. Den oppnådde oppløsning hvis pH-verdi er 11,0 steriliseres ved filtrering gjennom "Millipore"-membraner (0,45 ym).
Kolber ■ inneholdende sterilt medium A fordeles i fire grupper (A-^, A-^g,A^og A?Q) på hver to kolber. Til kolbene i gruppe A1 settes intet barbital. Til kolbene i gruppene A-j^q og A^ g settes barbital i følgende mengder:
Gruppe A-^g: 0,5 cm^ barbitaloppløsning (0,5'g/l)
Gruppe A-^: 2 cm^ .barbitaloppløsning (2 g/l)
Til kolbene i'gruppe A2q settes barbital under
■dyrkingen slik det angis nedenfor...
Samtilge kolber podes med- 2,5 cm^ av en 72 timer' gammels podingskultur av Streptomyces coeruleorubidus DS 7126
(NRRL 8098)
Kolbene inkuberes i et rom med temperaturen 26°C på' et bord som roterer med 22 omdr./min. Etter.24 timers inkubering setter man til hver kolb.e i gruppe AgQ 1,5 cm^ barbitalopp-løsning (1,5 g/l), hvoretter inkuberingen av disse .kolber fortsettes under de ovenfor angitte betingelser.
Etter syv døgns inkubering behandles innholdet i kolbene på samme måte som i eks. 12 og de dannede mengder 32 999 RP bestemmes. De oppnådde resultater er angitt i nedenfor følgende tabell.
Man arbeider på samme måte som angitt ovenfor og fordeler kolber inneholdende dyrkingsmedium A i fem grupper (A-^,<A>21'<A>225A23°s A24^ P^ hver to k°lber- Til kolbene i' gruppe A-^tilsettes det intet. 'Til kolbene i gruppe A?1settes 0,5 g fenobarbitalnatrium pr. 1, til kolbene, i gruppe A^ settes 0,5 g butobarbitalnatrium (natriumsalt av 5-buty1-5-etylbarbitursyre), og til kolbene i'gruppene A?-, og A'^ h settes 0,5 g' henholdsvis 2 g pentiobarbital[5~etyl-5-(1-metyIbutyl)tiobarbitursyre] pr. 1. Etter poding på samme måte som ovenfor og inkubering i 9 døgn på samme måte som ovenfor, bestemmes de dannede mengder 32 999 RP • De oppnådde resultater er sammenstilt i nedenfor følgende tabell.
Eksempel 23 (a) Gjæring.
Til en gjæringsbeholder med volumet 75 1 settes følgende stoffer:
Soyamel 1500 g
Drank 250 g Delvis hydrolysert stivelse 1750 g
Soyaolje 750 cn<r5>
Natriumklorid 500 g Vanlig ledningsvann til
tilsammen 45 1
pH-verdien innstilles på 7,50 ved tilsetning av ■
"40 cm^ 10N natriumhydroksydoppløsning. Man steriliserer mediet ved gjennombobling av vanndamp ved 122°C i 40 min. Etter av-kjøling er buljongens volum 50 1 som følge av kondensasjon av vanndamp under steriliseringen, og p-H-verdien er 6,70. Man poder deretter med 200 cm"<5->av er. kultur av Streptomyces coerul-erorubidus DS 7126 (NRRL 8098), hvilken kultur er fremstilt ved dyrking i en omrystet kolbe. Kulturen utvikles ved 30°C i 25 timer under omrøring og under lufting ved steril luft. Den' er deretter egnet til anvendelse for poding av produksjonsmediet.
Produksjonsdyrkingen gjennomføres i en gjæringsbeholder med et volum på 800 1, hvortil følgende stoffer settes.:
Etter innstilling av pK-verdien til 6,50 ved -til-setting av 210. cm^' ION natriumhydroksydoppløsning tilsettes. 7.,6 kg glycerol, 0,800 kg kalsiumkarbonat og vanlig ledningsvann til et totaltvolum på 360 1.
Mediets pH-verdi er deretter lik 6,45,. Man steriliserer mediet ved gjennombobling av - vanndamp av 122°C i 40 min.. Etter avkjøling har buljongen et volum på 4 00 1 som 'følge av kondensasjon av vanndamp under steriliseringen, og, pH-verdien er 6,25. ,
Man tilsetter deretter 10 1 av en steril vannoppløs-ning inneholdende 308 g sulfanilamid.
Medeiets pH-verdi er deretter lik 6,80. Man poder med 40 1 podingskultur fra den ovenfor beskrevne dyrking i gjæringsbeholderen med volumet 75 1- Mediets temperatur holdes på 27°C. Mediet omrøres med et røreverk som roterer med 205-omdr./ min., og luftes med 20 m steril luft pr. time. Etter 24 timers dyrking tilsetter man 3 1 av en steril vannoppløsning inneholdende 4 4 g sulfanilamid, hvoretter man fortsetter gjæringen.
Etter 140 timers dyrking har mediet en pH-verdi på 6,75 og volumet er 350 1. Dyrkingsmediet inneholder da 35 mg 32 999 RP pr. 1.
(b) Utvinning.
Til 350 1 av den ovenfor oppnådde dyrkingsbuljong setter man 350 1 metanol og 6N natriumhydroksydoppløsning inntil pH-verdien er 7,5. Det hele omrøres 1 time. Etter tilsetning av 25 kg filtreringshjelpemiddel filtreres suspensjonen i en filterpresse. Man samler opp filtratet. Filterkaken vaskes med 100 1 50$-ig metanol. Filtratet og vaskeoppløsningen forenes og konsentreres under et redusert trykk til et volum på 250 1.
Etter alkalisering ved tilsetning av 220 cm'' oN natriumhydrok-sydoppløsning ekstraheres antibiotikumet i konsentratet med 2 x' 150 1 av en blanding av metylenklorid og butanol i et volumforhold på 80:20. De forende organiske ekstrakter som har et volum på 238 1, konsentreres under redusert trykk til et volum på 30-1. Man tilsetter deretter 100 crP n-butanol mettet med 11N saltsyre. Etter konsentrering til et volum på 3 1 setter man langsomt det oppnådde konsentrat til 21 1 heksan. -Den -oppnådde felling filtreres av, vaskes og tørkes. Man oppnår herved 137 g urent hydroklorid av 32 999 RP.
(c)"Rensing..'■''-
(1) 112 g av det ovenfor oppnådde urene hydroklorid av
32 999 RP oppløses i 1-1- vann ved 50°C. Den oppnådde oppløsning hvis pH-verdi er 2,9, filtreres gjennom frittet glass... De far-, gede forurensninger i det oppnådde filtrat ekstraheres med 2 x 500 cm^ kloroform og deretter en gang med 1 1 kloroform. Etter-tilsetning av 75 g natriumklorid til vannfasen ekstraheres'antibiotikumet med 3 x 0,75 1 n-butanol. Vannfasens pH-verdi innstilles til 9,5 ved tilsetning av konsentrert- natriumhydroksyd-oppløsning, og det gjenværende antibiotikum ekstraheres med 0,5 1 n-butanol.
De oppnådde butanolekstrakter inneholdende antibiotikumet forenes og konsentres under redusert trykk til et volum på 1 1. Man setter deretter 1 1 kloroform til det oppnådde konsentrat. Den oppnåddeOppløsning vaskes med 2 x 500 cm^ vann som er alkalisert til pH 9,5- Vaskeoppløsningene ekstraheres med 2 x 500 cm 3av en blanding av kloroform og- n-butanol i et volumforhold på 80:20 ved pH 9,5. De organiske ekstrakter forenes og konsentreres under, ét redusert trykk.
Under konsentreringen tilsetter man 300 cm^ av en blanding av n-butanol, vann og 11N saltsyre i et volumforhold på 94:5:1-Konsentreringen fortsettes inntil volumet er 150 cm^ hvoretter -
den oppnådde oppløsning langsomt settes til 2 1 heksan. Den oppnådde felling filtreres av, vaskes og tørkes. Herved oppnås 30 g av et produkt som inneholder hydrokloridet av 32 999 RP.-
(2) 13 g.av det. ovenfor oppnådde produkt oppløses i
26 cm^ av en blanding av vann og dioksan i et volumforhold på 20:80 ved 35°C. Antibiotikumet bringes til å krystallisere ved langsom tilsetning av 624 cm-<5>dioksan. Etter 3 timers omrøring filtreres krystallene av hvoretter de vaskes og tørkes. Man oppnår herved 2 g av et krystallisert produkt som inneholder hydrokloridet av '32'999 RP.
(3) - 4,47 g av et krystallisert produkt, oppnådd på
samme måte som beskrevet under (2) ovenfor oppløses i 40 cm^
vann. Den oppnådde oppløsning filtreres. Det i filtratet til-
stedeværende hydroklorid av antibiotikumet 32 999 RP bringes til krystallisering ved tilsetning av 450 cm^ aceton under omrøring. De oppnådde krystallene filtreres av, vaskes og tørkes. Man oppnår herved 2,47 g av et produkt.som inneholder krystallisert hydroklorid av 32 999 RP. (4) 2,84. g av et produkt, oppnådd på samme måte som beskrevet under (3) ovenfor, oppløses i 28,4 cm"5 av. en blanding av like volumdeler metanol og aceton. Til den oppnådde oppløsning settes 16,9 cm^ av en blanding av aceton og vann i et volumforhold på 84:16.- Hydrokloridet av' 3 2 999 RP bringes til krystallisering ved oppvarming til'30°C og.etterfølgende avkjøling. De oppnådde krystaller filtreres av, vaskes og tørkes. Man oppnår herved 2,33 g krystallisert, halvrenset hydroklorid av 32. 999_.._RP... (5) 1,85 g av det ovenfor oppnådde halvrensede hydroklorid oppløses i 400 cm vann'med en pH-verdi på' 5,5- .De fargede forurensninger i den oppnådde oppløsning ekstraheres med 10 x- 400 cm^ av en blanding av n-butanol" og kloroform i et volumforhold på 20:80. Man konsentrerer vannfasen og tilsetter n-butanol under konsentreringen. Herved oppnås det en butanol-fase med et volum på 75 cm"5, hvilken langsomt tilsettes til 1,5 1 heksan-. Den oppnådde felling filtreres av, vaskes og tørkes: Man oppnår herved 1,4 g rent hydroklorid av 32 .999 RP, hvilket, er identisk med det i eksempel 8 beskrevne produkt.
Eksempel 24 (A)' Gjæring.
I en gjæringsbeholder med et .volum på 170 1 tilsettes- følgende stoffer:
Det oppnådde medium hvis pH-verdi er '6,0 steriliseres ved gjennombobling av vanndamp ved 122°C i 40 min. Etter avkjøling er buljongens volum 120 1 som følge av kondensasjon av vanndamp under steriliseringen, og pH-verdien er 6,65. Man
■ poder med 250 cm^ av en kultur av Streptomyces atroviolaceus
DS 8938., hvilken kultur er fremstilt ved dyrking i en rystet E-kolbe. Kulturen utvikles i 35 timer ved 2o°C-under omrøring og under lutfting med steril'luft. Den er deretter egnet til 'an vendelse for poding av produksjonsmediet.
Produksj onsdyrkingen- gjennomføres i en' gj-æringsbe-holder med et volum på 800'1, hvortil følgende stoffer settes.:
Mediets pH-verdi innstilles til 7 ,5 ved tilsetning av 500 cm"' ION' natriumhydroksydoppløsning, hvoretter mediet steriliseres ved gjennombobling av vanndamp ved 122°C i 40 min. Etter avkjøling har■buljongen et volum på 550 1 som følge av kondensasjon av vanndamp under steriliseringen. Mediets pH-verdi er 6,60. Man'poder med 55 1 podingskultur fra, den ovenfor angitte dyrking i gjæringsbeholderen med volumet 170 1. Kulturen utvikles i 117 timer ved 26°C under omrøring med et røreverk som r.oterer 'med 205 omdr./min., og under lufting med 15 m"5 steril luft pr. time. Etter avsluttet dyrking har mediet en pH-verdi på '7,60.
(B) Utvinning.
Til 560 1 av den ovenfor oppnådde dyrkingsoppløs-ning setter man 28 kg oksalsyre. Etter omrøring i en time ved 40°C og tilsetning av 25 kg filtreringshjelpemiddel filtreres oppløsningen i en filterpresse. Myceliekaken vaskes med 120 1 vann, som har en. temperatur på 50°C og som inneholder 3 kg oksalsyre. Filtratet og vaskeoppløsningen forenes til en opp-løsning hvis pH-verdi er lik 1. Denne oppløsning avkjøles til 10°C. pH-verdien- innstilles deretter på 4,5 ved tilsetning av 50 1 6N natriumhydroksydoppløsning. Det i den oppnådde opp-løsning tilstedeværende antibiotikum fikseres på en 'kolonne av 24 1 "Amberlite IRC 50" i H+<->form. lonebytteren vaskes med vann inntil effluatet er fargeløst, deretter med 100 1 av en blanding av like volumdeler metanol og vann og til slutt med 100 1 av en blanding av metanol og vann i et volumforhold på 90:10. Antibiotikumet elueres deretter med 250 1 av en blanding av metanol og vann i et volumforhold på 90:10, hvilken blanding inneholder 1 g natriumklorid pr'. 100 ml. Eluatet konsentreres
under et redusert trykk på. 5-10 mm Hg ved kO°C til et volum på
20 1. Konsentrates pH-verdi innstilles til 9 ved tilsetning av 11N natriumhydroksydoppløsning, hvoretter konsentratet.ekstra
heres en gang med 20 1 kloroform og deretter to ganger med 10 1 kloroform. Man oppnår tilsammen 35 1 ekstrakt som konsentreres under et redusert trykk på 5-10 mm 'Hg ved 40°C til et volum på 2.1. "Den resterende oppløsning gjøres sur ved tilsetning.av 50 c'm^ n-butanol mettet med 11N saltsyre og konsentreres deret- • ter til et volum på 1 1. Den herved oppnådde oppløsning helles . langsomt i 7 1 heksan. Den dannede utfelling filtreres av,-vaskes og tørkes. Man oppnår herved 13 g urent hydroklorid av antibiotikumet 32 999 RP..
(C) Rensing..
(a) Det urene hydrokloridet av 32 999 RP renses ved
motstrømsfordeling i tre kolber, A, B og G med et volum på 2 1.
Man fremstiller en blanding av -metylenklorid, n-butanol og M/15 fosfatpuffer med pH 7,38 i et volumforhold på 8:2:10. Når blandingen er bragt i likevekt separerer man.de to faser.
I kolben A heller man. 500 cm"' av en blanding av fosforsyre (85 vekt-%) og vann i et volumforhold på 1:125 samt 500 cm"<1>, av den ovenfor oppnådde tunge organiske fase. I denne faseblanding oppløser man 13 g av det ovenfor oppnådde urene hydroklorid av antibiotikumet 32 999 RP• Etter 15 minutters omrøring og fjerning av et uoppløselig stoff ved filtrering, innstilles pH-verdien til .7,5 ved tilsetning av IN natriumhyd-roksydoppløsning.
3
I hver av kolbene B og C tilsetter man 5.00 cm av. den ovenfor oppnådde lette væskefase, hvorved pH-verdien i kolbe B innstilles til 7 og pH-verdien i kolbe C innstilles til 6,5 ved hjelp av 85%-ig fosforsyre.
I retning kolbe A-kolbe B-kolbe C gjennomfører man en motstandsfordeling med fem overføringer, hvorved man anvender den tunge fase (oppløsningsmidlet) som bevegelig fase, og de lette fasene (vannfasene) med pH 7,5, 7 og 6,5 som stasjonære faser. Man anvender hver gang 500 cm; bevegelig fase, og man holder pH-vérdien konstant i de stasjonære fasene.
Antibiotikumet i vannfasen i kolbe C ekstraheres
ved pH 9,5 med to ganger 500 cm'5 av en blanding av kloroform og
Claims (2)
- n-butanol i volumforholdet 8; 2. De organiske ekstrakter forenes, og konsentreres.under et redusert trykk på .5-10 mm Hg ved 40°C. Under konsentreringen tilsetter man 300 cm'5 n-butanol innehold- .ende 6 volum-%-2N saltsyre. Konsentratets volum innstilles til. 5 cm'<5>, hvoretter konsentratet langsomt helles i 500 cm'5 heksan. Den dannede felling filtreres av, vaskes og tørkes.. Man oppnår herved 275 mg halvrenset hydroklorid av 32 999 RP. (b) 80 mg av det ovenfor oppnådde halvrensede hydroklorid av 32 999 RP oppløses i en blanding -av 1' cirr5 vann og •1 cm 3 metanol. Den .oppnåo dde oppløsning deles i • fire like deler, hvilke avsettes lineært på fire analytiske kromatografiplater utstyrt med et jevnt sjikt av.silikagel (Merck). Platene fremstilles i en time i en beholder hvis vegger er dekket med filterpapir inneholdende en blanding av metylenklorid, maursyre.og .metanol i et volumforhold på 80:17--3- Sonen inneholdende 32 999 RP fj.ernes etter tørking ved avskraping av silikagelet. Det oppnådde pulver suspenderes i 40 cm'5 vann og antibiotikumet .ekstraheres ved pH 9,5 med to ganger 20 cm"" kloroform. De organiske ekstrakter forenes og konsentreres under et redusert trykk på 5-10 -mm Hg ved 40°C. Under konsentreringen tilsetter man 1 cm-3 n-butanol inneholdende 6 volum-? 2N saltsyre. Konsentrates volum innstilles på 2 cm"<5>, hvoretter konsentratet langsomt helles i 50 cm^ heksan. Den dannede felling filtreres av, vaskes og tørkes. Man oppnår herved' 4 mg rent hydroklorid av 32 999 RP i form av et oransjerødt, mikrokrystallinsk pulver som smelter ved en temperatur opp i mot 200°C under spalting. Det oppnådde produkt er identisk med det i eksempel 8.oppnådde produkt. Patentkrav 1..Fremgangsmåte for fremstilling av et nytt naftacenderivat betegnet med-nr. 32 999 RP og med formelen: enten i form av fri base eller■i form av addisjonssalter med en syre, hvorved forbindelsens hydroklorid har følgende egenskaper: den er et oransjerødt, mikrokrystallinsk pulver som er oppløselig i metanol, pyridin, dimetylformamid og vann i en mengde på ca. 100 mg/cm 3 , oppløselig i butanol mettet m■ e' d ' va■nn ved 20°C i en mengde på 10 mg/cm-<3>, oppløselig i etanol i en mengde på 5 mg/cm^ og oppløselig i aceton, kloroform, metylenklorid, etylacetat, benzen, mentylisobutylketon, dioksan og heksan i en mengde på under 0,1 mg/cm^; den har følgende elementanalyse: C% = 56,6; E% = 5,7; 0% - 29,41; M = 2,39; Cl% = 6,0; den spesifikke dreiningsevne (bestemt i en 0,09%-ig oppløsning i etanol inneholdende 0,1% IN HCI) er:dets UV-spektrum og dets synlige spektrum (bestemt i oppløsninger inneholdende 10,65 mg/l av hydrokloridet i etanol inneholdende 0, 1% IN HCI) oppviser absorbsjonsmaksima ved 233 nm, 254 nm, 292 nm, 493 nm, 512 nm og 527 nm; dets IR-spektrum oppviser absorbsjonssignaler ved 3410, 3250,. 3220, 3050, 2970, 2930, 2900, 2860, 2820, 2680, 2600-, 1980 , 1930, 1900, 1800,- 1735, I690, 1635, 1600, 1580, -1510, 1460, 1440, 1405, 1370, 1315, 1285, 1255, 1235 , 1195, 1165, 1115, 10.62, 1050, 1030, 1010, 985, 960, 930, 915, 885, 875, 845, 840, 820, 810, 780, 762, 750, 725, 708, 695, 665, 640, 625, 600, 580, 565., 540, 530, 485, 475, 465, 450,- 438, 415, 390 og 320 cm<-1>; den oppviser en Rf-verdi på 0,2 ved tynnsjiktskromatografi på silikagel når man som fremkallende oppløsningsmiddel anvender en blanding av metylenklorid, maursyre og 'metanol i et volumforhold på. 80:17:3;. den er hos mus virksom mot leukemi L 1210, leukemi P 388 og leukoseaskromatose i intraperitoneale doser på mellom 0,12,5 og 0,250 mg/kg;karakterisertved at man (a) på mikrobiologisk måte reduserer karminomycin med formelen:eller et salt derav; eller at man ;(b) dyrker en av de følgende mikroorganismer: Streptomyces coeruleorubidus DS 7126 (NRRL 8098) Streptomyces coeruleorubidus DS 31 723 (NRRL 3045) Streptomyces coeruleorubidus DS 8899 (NRRL 3046) Streptomyces bifurcus DS 23 219 (NRRL 3539) i et luftet næringsmedium egnet for Streptomyces-stammer og i nærvær av tilsetningsmidler valgt blant ametopterin, barbital, fenobarbital, butobarbital, pentiobarbital, sulfanilamid, sulfa- pyridazin og sulfatiazol, hvoretter man utvinner det ønskede sluttprodukt fra dyrkingsmediet; eller at .man' (c) dyrker Streptomyces atroviolaceus DS 89.38 (NRRL 8l48) eller dettes produserende mutanter i et luftet næringsmedium som inneholder kilder.for assimilerbart karbon og assimilerbart nitrogen og uorganiske salter ved en opprinnelig pH-verdi på 5,8-7,8 og ved en temperatur .på mellom 23 "til 33°C, hvoretter man utvinner det ønskede sluttprodukt fra dyrkingsmediet .
- 2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, alternativ (a), kar, akte.rterisert ved.at den mikrobiologiske reduksjon gjennomføres ved hjelp av en kultur av en av følgende mikroorganismer: Streptomyces lavendulae (ATCC 8664), , • Streptomyces rosecchromogen.es (ATCC 13.400), Corynebacterium simplex (ATCC 6946), Bacterium cyciooxydans (ATCC 12.673), eller ved hjelp av celler' isolert fra en slik kultur, eller ved hjelp av enzymatiske ekstrakter oppnådd fra celler av disse mikroorganismer.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR7507893A FR2303552A1 (fr) | 1975-03-13 | 1975-03-13 | Nouveau derive du naphtacene, sa preparation et les compositions qui le contiennent |
| FR7520604A FR2315941A2 (fr) | 1975-07-01 | 1975-07-01 | Nouveau derive du naphtagene, sa preparation et les compositions qui le contiennent |
| FR7602912A FR2340096A2 (fr) | 1976-02-03 | 1976-02-03 | Nouveau derive du naphtacene, sa preparation et les compositions qui le contiennent |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NO760873L true NO760873L (no) | 1976-09-14 |
Family
ID=27250421
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NO760873A NO760873L (no) | 1975-03-13 | 1976-03-12 |
Country Status (13)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS51115992A (no) |
| AU (1) | AU1190076A (no) |
| CA (1) | CA1068225A (no) |
| DE (1) | DE2610557A1 (no) |
| DK (1) | DK110176A (no) |
| FI (1) | FI760645A7 (no) |
| GB (1) | GB1510571A (no) |
| HU (1) | HU175158B (no) |
| IL (1) | IL49197A0 (no) |
| LU (1) | LU74541A1 (no) |
| NL (1) | NL7602342A (no) |
| NO (1) | NO760873L (no) |
| NZ (1) | NZ180300A (no) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4096958A (en) * | 1976-03-04 | 1978-06-27 | Stobb, Inc. | Method for handling bundles of sheets |
| IT1155446B (it) * | 1982-12-23 | 1987-01-28 | Erba Farmitalia | Procedimento per la purificazione di glucosidi antraciclinonici mediante adsobimento selettivo su resine |
| JP2779652B2 (ja) * | 1988-12-27 | 1998-07-23 | 武田薬品工業株式会社 | 生理活性物質ｔａｎ―１１２０，その還元体，それらの製造法および用途ならびに微生物 |
-
1976
- 1976-03-05 NL NL7602342A patent/NL7602342A/xx not_active Application Discontinuation
- 1976-03-11 IL IL49197A patent/IL49197A0/xx unknown
- 1976-03-11 AU AU11900/76A patent/AU1190076A/en not_active Expired
- 1976-03-12 HU HU76RO883A patent/HU175158B/hu unknown
- 1976-03-12 CA CA248,335A patent/CA1068225A/fr not_active Expired
- 1976-03-12 NO NO760873A patent/NO760873L/no unknown
- 1976-03-12 GB GB10045/76A patent/GB1510571A/en not_active Expired
- 1976-03-12 NZ NZ180300A patent/NZ180300A/xx unknown
- 1976-03-12 LU LU74541A patent/LU74541A1/xx unknown
- 1976-03-12 DE DE19762610557 patent/DE2610557A1/de not_active Withdrawn
- 1976-03-12 FI FI760645A patent/FI760645A7/fi not_active Application Discontinuation
- 1976-03-12 DK DK110176A patent/DK110176A/da unknown
- 1976-03-12 JP JP51027038A patent/JPS51115992A/ja active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FI760645A7 (no) | 1976-09-14 |
| LU74541A1 (no) | 1977-01-11 |
| NZ180300A (en) | 1978-07-28 |
| GB1510571A (en) | 1978-05-10 |
| AU1190076A (en) | 1977-09-15 |
| DK110176A (da) | 1976-09-14 |
| NL7602342A (nl) | 1976-09-15 |
| JPS51115992A (en) | 1976-10-13 |
| DE2610557A1 (de) | 1976-09-23 |
| IL49197A0 (en) | 1976-05-31 |
| CA1068225A (fr) | 1979-12-18 |
| HU175158B (hu) | 1980-05-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| DK171329B1 (da) | Pseudodisaccharid betegnet salbostatin, fremgangsmåde til dets fremstilling, plantebeskyttelsesmiddel med indhold deraf og fremgangsmåde til beskyttelse af planter mod insekter og/eller skadelige svampe | |
| NO134605B (no) | ||
| JPH03201992A (ja) | 免疫抑制剤の新規な製造方法 | |
| GB2031896A (en) | A process for the optical resolution of D,L-2-amino-4- methylphosphinobutyric acid | |
| JPH0341475B2 (no) | ||
| NO760873L (no) | ||
| EP0073329A1 (en) | Process for producing the antibiotic nosiheptide | |
| US4013515A (en) | Process for the preparation of the antibiotic 20.798 R.P. | |
| US4011140A (en) | Process for producing antitumor compound | |
| JP3107455B2 (ja) | 新規抗生物質ｍｉ４８１−４２ｆ４−ａ及びその製造方法 | |
| US4007090A (en) | Novel fermentation process for the preparation of Sulfomycin | |
| US3901880A (en) | (s)-alanyl-3-(+60 -(s)-chloro-3-(s)-hydroxy-2-oxo-azetidinylmethyl)-(s)-alanine | |
| CH650797A5 (fr) | Procede microbiologique de production de narasine. | |
| EP0284358B1 (en) | Novel anti-tumor compounds, method for the preparation thereof, and pharmaceutical preparations containing them | |
| JP3796540B2 (ja) | 黄色色素の製造方法 | |
| US3734832A (en) | Fermentation process for producing physostigmine | |
| US5137826A (en) | Morchella rotunda sp. useful for producing natural blue pigment | |
| US2996435A (en) | Process for producing azaserine | |
| SU287650A1 (ru) | Патентно-техн^^нескаябиблиотека | |
| US2965547A (en) | Process for the production of l-6-diazo-5-oxonorleucine | |
| US4304861A (en) | Process of producing antibiotic SM-173B with Streptomyces chromofuscus | |
| US3726766A (en) | Process for producing lincomycin | |
| Uchida et al. | METABOLIC PRODUCTS OF MICROORGANISMS 137 RINAMYCIN, A NEW INHIBITOR OF RNA SYNTHESIS | |
| GB2040281A (en) | Preparation of xanthothricin | |
| NL7906140A (nl) | Microbiologische werkwijze voor de bereiding van secun- daire digitalis glycosides. |