SE412588B - Forfarande for framstellning av acylderivat av antibiotikumet ws-4545 - Google Patents

Description

71r12218*5 CO NH II //CO 0 - C --- NH HC-OH l HO-T-CH3 cnzoa 10 15 20 25 omsättes med ett acyleringsmedel.

Som acyleringsmedel kan enligt föreliggande uppfinning an- vändas en karboxylsyra, som kan anges med formeln: B-OH IEI, vari R betecknar en karboxylsyraacylgrupp, och dess reaktiva de- rivat vid karboxylgruppen, innefattande alifatisk karboxylsyra, aromatisk karboxylsyra, heterocyklisk karboxylsyra och dessas reaktiva derivat vid karboxylgruppen.

Mera speciellt gäller, att bland alifatiska karboxylsyror med formeln III kan nämnas sådana, vari R är en mättad eller omät- tad, alifatisk kolvätekarbonylgrupp, såsom alkanoyl (t.ex. acetyl, propionyl, butyryl, isobutyryl, valeryl, isovaleryl, pivaloyl, 2-etylbutyryl, kaproyl, palmitoyl, stearoyl, etc.) med 2-20 kol- atomer samt alkenoyl (t.ex. akryloyl, metaakryloyl, krotonoyl, oleoyl, linoleoyl, linolenoyl etc.) med 2-20 kolatomer; eller en mättad eller omättad, alifatisk cyklokolvätekarbonylgrupp. såsom cykloalkankarbonyl (t.ex. cyklohexylkarbonyl) och cykloalken- karbonyl (t.ex. cyklohexenylkarbonyl); eller en alifatisk cyklo- kolvätesubstituerad alifatisk kolvätekarbonylgrupp, såsom cyklo- alkanalkanoyl (t.ex. cyklohexylacetyl, cyklohexylpropionyl, etc.) med 7-15 kolatomer. Vidare kan den alifatiska kolväteenheten i nämnda alifatiska karboxylsyra vara rak eller grenad och avbruten av en heteroatom, såsom syre eller svavel. Ex. härpå är metoxi- acetyl, metyltioacetyl, butyltioacetyl, metoxikarbonyl, etoxikar- bonyl, cyklohexyltioacetyl, etc.

Bland aromatiska karboxylsyror med formeln III kan nämnas sådana, vari R är aryloyl (t.ex. bensoyl, toluoyl, xyloyl, 10 15 20 25 }O 35 40 1412218-s 5 naftoyl, etc.) eller arylsubstituerad, alifatisk kolvätekarbonyl, såsom aralkanoyl (t.ex. fenylacetyl, fenylpropionyl, hydratro- poyl, etc.) och aralkenoyl (t.ex. cinnamoyl, etc.). Den alifa- tiska kolväteenheten (t.ex. alkan eller alken) med 1-6 kolatomer i nämnda arylsubstituerade alifatiska kolvätekarbonyl (dvs. aralkanoyl och aralkenoyl) kan vara avbruten av en heteroatom, såsom syre och svavel, och ex. härpå är fenoxiacetyl, fenyltio- acetyl, etc.

Som exempel på heterocykliska karboxylsyror med formeln III kan nämnas sådana, vari R är en heterocyklisk ringkarbonylgrupp, vari innefattas monoheterocykliska och diheterocykliska ringar, eller bensen"sammansmält" heterocyklisk ringkarbonylgrupp, varvid nämnda heterocykliska ring är 5- till 6~ledd och innehåller minst en heteroatom vald bland kväve, syre och svavel, såsom nikotinoyl, isonikotinoyl, 2-furoyl, 2-tenoyl, bensofuroyl, bensotenoyl, etc.; eller en alifatisk kolvätekarbonylgrupp (t.ex. alkanoyl eller alkenoyl) substituerad med nämnda heterocykliska ring eller ben- sen"sammansmälta" heterocykliska ring, såsom lH (eller EH) tetra- zolylacetyl, tienylacetyl, furylacetyl, 3-bensotiazolylacetyl, 2-oxo-3-bensotiazolylacetyl, 3-indolylacetyl, morfolinoacetyl, etc. och nämnda alifatiska kolväteenhet (dvs. alkan eller alken) kan vara avbruten av en heteroatom, såsom syre och svavel samt ha 1-6 kolatomer.

I ovannämnda alifatiska karboxylsyra, aromatiska karboxyl- syra och heterocykliska karboxylsyra kan den alifatiska kolväte- enheten (dvs. t.ex. alken, alkan, cykloalkan och cykloalken), den aromatiska ringen (dvs. t.ex. aryl) och den heterocykliska ringen vara substituerade med en eller flera möjliga substituenter, så- som halogen (t.ex. klor, brom, fluor, etc.), alkoxi (t.ex. metoxi, etoxi, etc.), amino, acylamino (t.ex. acetylamino), acyloxi (t.ex. acetoxi), nitro, hydroxi, etc.

Exempel på sådana syror är följande: Klorättiksyra, triklor- ättiksyra, triklorpropionsyra, bensolylglycin, brombensoesyra, klorbensoesyra, nitrobensoesyra, metoxibensoesyra, 5,4-dimetoxi- bensoesyra, 3,4-dimetylbensoesyra, 3,4,5-trimetoxibensoesyra, 3,4-dimetoxikanelsyra, 4-klorkanelsyra, klorfenylpropionsyra, klorfenoxiättiksyra, 5-nitrofuran-2-karboxylsyra, 5-klorbenso- furan-2-karboxylsyra, 5-klor-2-oxo-3-bensotiazolylättiksyra, etc.

Exempel på reaktiva derivat av karboxylsyran med formeln III är syrahalogenider (t.ex. syraklorid, syrabromid, etc.), syra- 10 15 20 25 30 35 7412218-5 anhydrider (t.ex. syraanhydriden med alkylsvavelsyra, alkylfos- forsyra, alifatisk eller aromatisk karboxylsyra, etc.); syraami- der (t.ex. syraamiden med imidazol, syraamiden med 4-substituerad imidazol, eto.), syraestrar (t.ex. metylester, etylester, cyano- metylester, p-nitrofenylester, etc.) och syraazid. I det fall man använder karboxylsyran som sådan eller i form av ett salt (t.ex. natriumsalt, kaliumsalt, eto.), kan det vara lämpligt att använda ett kondensationsmedel vid reaktionen. Ex. på kondensationsmedel är N,N'-dicyklohexylkarbodiimid, polyfosforsyra, etylpolyfosfat, isopropylfosfat, etc.

Omsättningen utföres vanligen i ett inert lösningsmedel, såsom vatten, aceton, dioxan, acetonitril, pyridin, kloroform, etylacetat, tetrahydrofuran, etylendiklorid, dimetylsulfoxid, dimetylformamid, dimetylaoetamid, etc. Om detta är nödvändigt kan ett basiskt ämne (t.ex. alkalimetallkarbonat, alkalimetall- vätekarbonat, trialkylamin, pyridin, etc.) vara närvarande vid reaktionen. Reaktionstemperaturen är ej begränsad till något spe- ciellt intervall, men reaktionen utföres vanligen under avkyl- ning eller vid rumstemperatur. Den acylerade föreningen kan iso- leras och renas på konventionellt sätt.

Vid acyleringsreaktionen enligt föreliggande uppfinning gäller att man kan framställa monoacylderivatet, diacylderivatet eller triacylderivatet av antibiotikumet WS-4545 eller en bland- ning av dessa allt efter den mängd acyleringsmedel som användes vid reaktionen.

Detta innebär att WS-4545 acyleras med ett acyleringsmedell i en mängd av en molekvivalent av nämnda utgångsmaterial För att man i huvudsak skall erhålla monoacylderivatet därav. AcyLer1ng av WS-4545 under användning av i det närmaste två molekvivalenter av ett acyleringsmedel ger i huvudsak diacylderivatet därav. Då WS-4545 behandlas med mera än tre molekvivalenter av ett acyle- ringsmedel, erhålles i huvudsak triacylderivatet därav. I det fall man erhåller en blandning av mono-, di- och triacylderiva- ten vid reaktionen, kan vart och ett av acylderivaten isoleras från reaktionsblandningen på konventionellt sätt, t.ex. medelst kromatografi eller kristallisation. Vidare kan monoacylderivat acyleras med åtminstone en molekvivalent av ett acyleringsmedel, som har en annan acylradikal än den hos monoacylderivatet, för framställning av di- eller triacylderivatet. 10 15 20 25 5 fiHz (lm :H2 (f) /c - c\--co /C “ °\ CO H20 NH w H2? NH H g »leo JO 2 \o _ c-_NH 0 _ NH H-å-on Hfififiz Ho-cll-oæiö H0~f~cH3l CHZOH cnzon II I __” g I reaktionsschemat betecknar Bl en acylgrupp och.R2 och H5 vardera väte eller en acylgrupp, medan R har ovan angiven betydel- se. i Den allmänna formeln I anger monoacylderivaten av antibio- tikumet WS 4545, när Bl betecknar en acylgrupp, och H2 och H3 var- dera betecknar väte, diacylderivaten, när Bl och R vardera beteck- nar en acylgrupp, och RB betecknar väte, och triacylderivaten när R1, H2 och H3 vardera betecknar en acylgrupp.

Antibiotikumet WS-4545 kan framställas genom en odlingspro- cedur under kontrollerade betingelser under användning av en ny art av Streptomyces, som betecknas Streptomyces sapporonensis.

Den mikroorganism som är användbar för framställning av det nya antibiotikumet WS-4545 är en nyligen upptäckt art av Streptomyces isolerad från ett jordprov taget i staden Sapporo i Japan. En kultur av den levande organismen har deponerats och satts till en permanent stamkultursamling hos American Type Culture Collection och därvid givits numret ATCC 21532 och kommer härefter att kallas Streptomyces sapporonensis.

Streptomyces sapporonensis ATCC 21532 uppvisar följande morfologiska, makroskopiska, mikroskopiska och biokemiska egenska- per.

Mikroskopisk morfologi: Morfologin för Streptomyces sappo- ronensis ATCC 21532, då denna har fått tillväxa på sukros-nitrat- agar och stärkelseammoniumagar vid 30°C under 10-14 dagar, anges nedan. Lufthyfern är lång och rak samt har en virvel. Konidiumet är kedjeliknande. 10 15 20 25 }O 35 40 7412218-5 Kultur- och fysiologiska egenskaper: Kulturegenskaperna och de fysiologiska egenskaperna för den nya stammen Strepto- myces sapporonensis ATCC 21532 i ett antal media anges nedan.

Observationen gjordes efter inkubation vid 5000 under 10-14 da- gar. Inkubationstiden och -temperaturen är desamma som de som anges häri, såvida inget annat anges.

Czapeks agar: Vit, svag tillväxt; inget luftmycelium; inget lösligt pigment.

Stärkelse-ammoniumagarz Blekorange tillväxt 1 små kolonier med blekorange yta; inget luftmyeelium; inget lösligt pigment.

Den diastatiska verkan är svag.

Glykol-asparaginagar; Brun tillväxt i små kolonier; tunt och vitt pulverliknande luftmycelium; inget lösligt pigment.

Kalcium-malatagar: Vit tillväxt; tunt och blekt brunvitt pulverliknande luftmycelium; inget lösligt pigment.

Tyrosinagar: Mörkbrun tillväxt i små kolonier; inget luft- mycelium; inget lösligt pigment.

Buljongagar: Blekgul, koloniliknande tillväxt; vitt pulver- liknande luftmycelium; inget lösligt pigment.

Bennetts agar: Brun koloniliknande tillväxt med slät och skrynklad yta; tunt och vitt pulverliknande luftmycelium; inget lösligt pigment. Denna kultur växer bra vid 37°C liksom även vid 3o°c. ~ i Glukosbuljong: Tillväxt i en vit klump som utfällesg inget luftmycelium; inget lösligt pigment.

Glukos-Czapeks lösning: Vit koloniliknande tillväxt som ut- fälles; inget luftmycelium; inget lösligt pigment.

Lackmusmjölk: Svag tillväxt; inget luftmycelium; inget lös- ligt pigment. Det förekommer en lätt peptonisering och negativ koagulering.

Gelatin-"stab"; (15-20°C, 20 dagars inkubation). Svag till- växt; inget luftmycelium; inget lösligt pigment. Svag positiv smältning observerad.

Potatis: Svagt brun, koloniliknande tillväxt med skrynklad yta; svagt brunt pulverliknande luftmycelium; inget lösligt pig- ment.

Cellulosa: Ingen tillväxt.

Optimala betingelser för tillväxt: Temperatur: 25-57°C, pH: 6-8.

Användning av kolkällor: Användningen av kolkällor utfördes 10 15 20 25 7412219-s medelst Pridham-Gottlieb-metoden. Observationen gjordes efter in- kubation vid 3000 under 7 dagar.

Kolkälla Xylos Arabinos Mannos Fruktos .filalsqë _ Ramnos Sukros Laktos Trehalos Raffinos Mannitol Inositol Salicin Kontroll Tillväxt lll-I-III-I-llll-I-llll Symbolen "+" betyder användning, "É" och "-" ingen användning. sannolik användning Det nya antibiotikumet WS-4545 framställes då Streptomyces sapporonensis såsom omtalats ovan får tillväxa i ett närings- medium under kontrollerade submersa aeroba betingelser. Ett stort antal näringsmedia kan användas i tillväxtstegen vid odlingsför- farandet.

Det har visat sig att bättre resultat erhålles då ett vat- tenmedium innehållande en assimilerbar kolkälla och en assimiler- bar kvävekälla eller ett proteinhaltigt material användes.

Assimilerbara källor kan innefatta flervärda alkoholer och mono-, di- och polysackarider, såsom glukos, fruktos, maltos, laktos, sukros, socker, stärkelse, majsstärkelse, dextrin, melass, glycerol och liknande.

För de lämpliga assimilerbara kvävekällorna och protein- haltiga materialen är det underförstått att dessa innefattar na- turliga sådana innehållande kväve, såsom majsstöpvätska, soja- bönmjöl, sojabönolja, bomullsfrömjöl,glutenmjöl, majsmjöl, torkad jäst, Jästextrakt, pepton, peptonvätska från djur, köttextrakt, kaseinhydrolysat, etc. liksom även oorganiska och organiska kväveföreningar, såsom ammoniumsalter (t.ex. ammoniumnitrat, ammoniumsulfat, ammoniumfosfat, etc.), karbamid och liknande.

Kolkällor och kvävekällor behöver ej, även om de lämpligen användes i kombination, användas i ren form emedan de mindre rena materialen, som innehåller spår av tillväxtfaktorer och av- 10 15 20 25 }O 55 40 71+12218-5 sevärda mängder mineralnäringsmedel, även är lämpliga att använda.

Om så önskas, kan till mediumet sättas mineralsalter, såsom kal- ciumkarbonat, natrium- eller kaliumfosfat, natrium- eller kalium- klorid, magnesiumsalt, kopparsalt och liknande. Om detta är nöd- vändigt, speciellt 1 det fen då store mängder skum bildas 1 od- lingsmediumet, kan ett antiskumningsmedel såsom flytande paraffin, fettolja, växtolja, mineralolja, silikoner, etc. sättas till od- lingsmediumet. 5 Såsom är föredraget vid konventionell framställning av andra antibiotika är, submersa aeroba betingelser föredragna för fram- ställning av det nya antibiotikumet. För framställning av mindre mängder av antibiotikumet kan odlingsförfarandet utföras i små kolvar eller flaskor, som omskakas eller omrörs med hjälp av lämp- liga mekaniska anordningar. Stora volymer av det ympade närings- mediumet kan emellertid jäsas i stora tankar eller kar, som van- ligtvis användes inom jäsningsindustrin. För framställning av stora mängder av antibiotikumet är det lämpligt att använda den vegetativa formen av mikroorganismen för ympning i tankarna eller karen för att man skall undvika en tillväxtförsening vid förfa- randet för framställning av antibiotikumet. Sålunda är det lämp- ligt att först framställa ett vegetativt ympmaterial av mikro- organismen genom att ympa en relativt liten mängd av odlings- mediumet med spor- eller mycelieformen av mikroorganismen och sedan överföra det vegetativa ympmaterialet aseptiskt till stora tankar eller kar. Det medium i vilket det vegetativa ympmateria- let framställes kan vara detsamma som eller något annat än det medium som användes för framställning av antibiotikumet.

Omröring och luftning av odlingsblandningen kan åstadkommas på en mångfald olika sätt. Omröring kan åstadkommas medelst en propeller eller någon liknande mekanisk omröringsutrustning, med- elst rotation eller skakning av odlingsanordningen medelst olika pumpningsutrustning eller medelst passage av steril luft genom mediumet. Luftning kan åstadkommas genom att man leder steril luft genom odlingsblandningen.

Vanligen utföres odlingen vid en temperatur av ca 25°C-3?°C, företrädesvis ca 50°C under en tidsperiod av 30-50 timmar. Vid slutet av denna tidsperiod har en väsentlig mängd av antibioti- kumet bildats.

I avsikt att isolera antibiotikumet WS-4545 kan myceliumet skiljas från odlingsmediumet på konventionellt sätt, t.ex. medelst 10 15 20 25 }O 35 40 7-412218-5 oentrifugering eller filtrering. Största delen av antibiotikumet återfinns i filtratet.Antibiotikumet kan utvinnas ur filtratet medelst någon konventionell metod, t.ex. extraktions- eller adsorptionsteknik, som vanligen användes för utvinning av andra antibiotika.

Extraktion kan utföras genom att man behandlar filtratet med ett organiskt lösningsmedel för antibiotikumet, t.ex. pyridin, alkohol såsom metanol, etanol, butanol, etc. eller vattenlösningar av vattenblandbara organiska lösningsmedel, t.ex. vattenhaltig alkohol såsom vattenhaltig metanol, etanol och butanol. Man kan även använda blandningar av alkohol och de andra organiska lös- ningsmedlen, såsom en keton (t.ex. aoeton), ett halogenerat kol- väte (t.ex. kloroform), alkylester av fettsyra (t.ex. etylacetat), bensen, pyridin ooh liknande.

Alternativt antibiotikumet utvinnas ur filtratet med ett adsorptionsmedel, såsom diatomacêjord, aktiverad aluminiumoxid, silikagel, aktiverat kol, kiselsyra och liknande. Det antibioti- kum som adsorberas i nämnda adsorptionsmedel elueras lätt från adsorptionsmedlet under användning av ett lämpligt organiskt lös- ningsmedel, i vilket det är lösligt, t.ex. pyridin, alkohol, vat- tenhaltig alkohol och en blandning av alkohol och ett annat or- ganiskt lösningsmedel.

Ett lämpligt sätt att isolera antibiotikumet från extraktet eller eluatet innefattar indunstning av lösningsmedlet till en relativt liten volym samt utfällning av antibiotikumet genom till- sats av ett lämpligt lösningsmedel, i vilket antibiotikumet är olösligt.

Antibiotikumet renas genom omkristallisation eller kremato- grafi. Lösningsmedel som kan användas för omkristallisation är t.ex. aoeton, vattenhaltig aceton, alkohol (t.ex. metanol, eta- nol), vattenhaltig alkohol, etylacetat och liknande. Adsorptions- medel som användes för utvinning av antibiotikumet kan även an- vändas effektivt för kromatografisk rening. Som elueringsmedel kan man använda sådana medel, som även kan användas för utvin- ning av antibiotikumet.

Egenskaperna hos antibiotikumet WS-4545 som isoleras på detta sätt anges nedan.

Antibiotikumet WS-4545 har följande fysikaliska och ke- miska egenskaper.

WS-4545 kristalliserar i basiska och vita kristaller. Det 10 15 i2o 25 jO '7412218-5 10 är lösligt i vatten, metanol, etanol och pyridin, svårlösligt i aceton och etylacetat samt olösligt i eter, kloroform, bensen och n-hexan.

Molekylvikten bestämd ur masspektrumdata är 302. _ Den specifika vridningsförmågan är följande: ja/ šj= 63,5° (C=l,O0% (vikt-volym) i metanol).

Elementaranalys ger följande värden: kol = 47,44%; väte = 6,16; kväve = 9,36; syre (genom subtraktion) = 57,04.

Ovanstående värden ger, då de användes för beräkning av den empiriska formeln för WS-45Ä5, den empiriska formeln C12Hl8N207.

Färgreaktionen för WS-4545 kan anges på följande sätt: positiv vid Fehlings och Molischs tester; avfärgning av kalium- permanganatlösning; svagt positiv vid reaktion med ferriklorid; negativ i ninhydrin, Tollens och Ehrlichs tester.

Antibiotikumet WS-4545 utsattes för tunnskiktskromatografi på silikagel (under användning av "Kieselgel G" tillverkat av Merck, varumärke) med skilda framkallande lösningsmedelssystem.

Som färgagens användes 1% kaliumpermanganatlösning innehållande 2% natriumkarbonat, och Rf-värdena bestämdes på följande sätt: Tabell: Rf-värden för WS-4545 Lösningsmedelssystem Rf n-butanol:ättiksyrazvattenx (4:1:5) 0,41 n-butanol:pyridin:vatten (4=1=1) 0,55 kloroformzmetanol (5=l) 0,39 etylacetat:metanol (l:l) O,6§ bensen:metanol:kloroform (1=1=1) 0,41 *Det övre skinnet av nämnda blandning användas.

Antibiotikumet WS-4545 kristalliserar 1 olika kristall- former allt efter de betingelser som användes vid kristallisa- * tionen. Det har fastställts mikroskopiskt att den kristall som erhålles i Ex. 25 är ett rombiskt system och den kristall som erhålles i Ex. 26 är ett monoklint system. Kristaller enligt dessa system uppvisar följande egenskaper. Röntgendiffraktion- analys ger följande resultat: 10 15 20 30 35 40 1412213-5 ll Kristall bildad ägistall bildad i Exempel 1 i Exempel 2 Kristallsystem rombiskt monoklint Rymaavstàna a=11,7 Å a=1o,1 Å, ß=1o1° b=12,7 Å b=1o,9 Å c= 8,8 Å c= 6,6 Å Densitet 1,54 g/cm; 1,46 g/cm; Kristallerna 1 det rombiska systemet smälter vid 187-18900 (sönderdelning). Ultraviolettspektrumet visar ej någon specifik absorption. Infrarödspektrumet suspenderat i Nujol-nollprov visar toppar vid följande frekvenser (cm'1): 3400, 3300, 3160, 2900, 2840, 1703, 1670, 1450, 1390, 1370, 1295, 1260, 1220, 1195, 1140, 1120, 1080, 1030, 970, 960, 955, 895, 870, 820, 785, 725, 680- Kristallen i det monoklina systemet smälter vid 188-191°C (sönderdelning). Ultraviolettspektrumet visar ej någon specifik absorption. Infrarödspektrumet suspenderat i Nujol-nollprov ger toppar vid följande frekvenser (cm_l): 3500, 3400, 3270, 2900, 2840, 1685, 1640, 1455, 1417, 1375, 1330, 1300, 1260, 1245, 1210, 1160, 1135, 1125, 1105, 1085, 1050, 1010, 995, 980, 940, 920, 900, 885, 870, 840, 805, 795, 760, 725, 690, 675- Kristaller med sådana olika kristallsystem kan lätt överfö- ras inbördes genom att man tillsätter°en liten bit.av den ena kri- stallen till lösningen av den andra kristallen omedelbart innan kristaller bildas vid kristallisationsprocessen. Detta betyder att, då kristaller ur det rombiska systemet omkristalliseras ur något lösningsmedel, t.ex. varmt vatten, varm vattenhaltig etanol, varmt aceton, varm metanol eller varm etanol, tillsats av ett litet stycke av kristaller ur det monoklina systemet till lösningen före bildandet av fällning 1 lösningen ger kristaller ur det monoklina systemet. Å andra sidan ger, då kristaller ur det monoklina sy- stemet omkristalliseras ur ett lösningsmedel, t.ex. varmvatten, varm vattenhaltig etanol eller varmt aceton, tillsats av ett litet stycke av kristaller ur det rombiska systemet till lösningen före bildandet av fällning i lösningen kristaller ur det rombiska sy- stemet. Av ovannämnda faktum kan man dra den slutsatsen, att kri- staller ur det rombiska systemet och det monoklina systemet före- ligger 1 ett förhållande av polymorfism.

Ett kärnmagnetiskt resonansspektrum för antibiotikumet 'M12218-5 12 ws-4545 visar följande signaler (f(ppm): 1 DMso-d6-1ösnins- TMS som inre standard). 8,81 _ = :H singlett 7,45-7,67 : 2H multiplett 5 6,50-6,87 : 2H multiplett 6,10-6,40 : 2H multiplefit 6,09 : lH dublett 5,58 : lH triplett 4,95 : lH multiplett 10 4,95 : 1H singlett §,8T : 1H dübblebb 4,65 : lH multiplett 3,27 : IH singlett 1,38 = ln ainglatt 15 1,05 : lH singlett Medelst röntgendiffraktion och även tolkning av ovannämnda fysikaliska och kemiska egenskaper tillskrivs antibiotíkumet WS-4545 formeln: EHZ TH Hzïïßf 5 GÉNH I H20; /gco * “ 2 l 8 \o--c NH ' II HC-OH I H0~C-CH5 CHzOïí _Kemisk benämning: 20 5 1-(1,2,3-trihydroxi-2-metyl)propyl-5-mety1en-6-hydroxi- -7, 9-dioxo-2-oxa-8, lo-aiazabieyklofl, 2, zjdekan.

Antibiotikumet WS-4545 har visat sig äga ett specifikt antibiotiskt spektrum uppvisande ytterst användbar aktivitet mot gramnegativa bakterier, av vilka kan nämnas Escherichia-, 10 15 20 25 50 55 7412218-5 13 Salmonella- och Shigellaarter. Vidare torde observeras att detta antibiotikum administreras medelst injektion, införes i serum i relativt hög halt och avsöndras i urin i hög koncentration. Följ- aktligen kan detta antibiotikum vara användbart vid behandling av infektionssjukdomar förorsakade av sådana bakterier hos människor och djur, speciellt medelst injiceringsanvändning. Antibakterie-, serumnivå- och urinavsöndringstesterna beskrivs enligt följande.

Minsta inhibitoriska koncentration (M.I.C.): M.I.C.-testet utfördes medelst den vanliga i serie utförda agarut- spädningsmetoden under användning av ett hjärtinfusionsagar för bakterier, ett glukos-buljongmedium för Mycobakterier samt ett maltextraktmedium för svamp och jäst, som inkuberas vid 5000 under 24-72 timmar. M.I.C.-värdet uttrycks som den minsta koncentration av WS-4545 (meg/ml) som inhiberar tillväxt av mikroorganismerna.

Resultaten är följande: Testmikroorganism M.I.C. (mg/ml) Escherichia coli 25 - 50 Salmonella typhosa 25 - 50 Shigella flexneri 12,5 f 25 Staphylococcus aureus >20O Bacillus subtilis >2OO Sarcina lutea >2OO Proteus vulgaris >200 Mycobaoterium phlei >20O Candida albicans >20O Penicillium chrysogenum >200 Skyddande effekt vid experimentella infektioner hos möss.

Aktiviteten in vivo för WS-4545 mot E.coli, som är bestän- dig mot andra antibiotika, undersöktes under användning av en ICR-stam av möss av hankön, vilka möss var och en vägde 27-30 g.

Varje experimentell grupp bestod av 10 djur. De infekterande m1k~ roorganismerna odlades under natten i BHI-spad vid 5700. 0,5 ml av odlingen inympades den intraperitoneala vägen, och behandlingen administrerades subkutant en gång l timme efter det att försöket påbörjats. Infekterade, obehandlade kontrolldjur dog inom 48 tim- mar under dessa betingelser. Experimentdjuren stod under observa- tion under 10 dagar huruvida de skulle överleva eller ej, och resultaten beräknades som medianeffektdoser (ED5O).

Resultaten är följande: 10 15 29 25 71412218-5 14 gggg Ancibiouikum Enso (mg/mus) E. coli 312 WS-4545 5,05 5 Kloramfenikol > 28 E. coli 520 WS-4545 0,87 Streptomycin 17,09 E. coli 523 WS-4545 4,05 Kanamycin >28 E. coli 324 WS-4545 0,69 Tetracyklin > 28 E. coli 535 WS-4545 0,88 Nalidixinsyra 0,54 Serumnivåer och urinavsöndring hos friska försökspersoner efter intramuskulär administrering: Serum- och urinnivåerna bestämdes hos 5 friska försöksper- soner. 5 vuxna, manliga försökspersoner, som vägde mellan 60,0 och 75,0 kg, administrerades var och en intramuskulärt WS-4545 i en enda dos om 1000 mg och 500 mg. Blodprov togs 0,5, 1, P, 3 och 5 timmar efter administreringen. Urinprov togs under perio- derna 0-l, l-5, 5-6, 6-8, 8-10 och 10-24 timmar efter administre- ringen. Koncentrationerna av WS-4545 i serumet och urinen bestäm- des medelst koppmetoden. Resultaten är följande.

Urin 0-1 ' 1-5 3-6 6-8 8-10 10-24 Total §mg¿ml) tim. tim. tim. tim. tim. tim. 500 mg 620 1256 459 221 97 54 (18%) (58%) (22%) (m) (m) (sz) 94” 1000 mg 1501 2266 1256 726 593 75 (17%) (38%) (20%) (11) (41%) (5911) 9433 Serum (mg¿ml) l¿2 tim. l tim. 2 tim. 5 tim. 5 tim. 500 mg 14,7 15,7 15,6 <15,0 <15,o 1000 mg 51,1 51,9 21,6 18,8 15,0 En annan och ytterst viktig egenskap hos WS-4545 är att det uppvisar ytterst låg giftighet enligt följande.

Akut giftighet (en enda administration) 15 Art §§g_ i.v.

Mus Hankön >2000 Honkön >2000 Råtta Hankön _ >2000 Honkön >2000 goawai 2:2; sis; >4ooo >4ooo >4000 >4000 >4ooo >4ooo >4ooo >4ooo 741221a~5 Q-O. >4ooo _ >40oo >4ooo >4ooo xDjuren observerades under 7 dagar efter administrationen.

Vidare kan acylderivat av antibiotikumet WS~45U5 (dvs. kar- boxylsyraestern av WS-4545) framställda i enlighet med efterföl- jande ex. också illustreras under användning av den kemiska struk- turformeln I enligt följande.

Exempel nr (hUl-F-'DJNI-J 7(A) WB? 10 ll 12 13 14 15 16 l7(A) l7(B) 18 19 Förening med formeln l Bl acetyl propionyl palmitoyl krotonoyl cyklohexyl- karbonyl acetyl butyryl butyryl bensoyl p-klorbensoyl m-brombensoyl p-brombensoyl 3,4-dimetyl- bensoyl p-acetoxi- bensoyl p~klorfenoxi- acetyl cinnamoyl B-fenylpropionyl bensoyl bensoyl nikotinoyl 2-tenoyl H H bensoyl bensoyl H H EEHIZIEDIII_ .l"' acetyl II! m-'IEÅEIIZEEIIDI H H bensoyl H H H forts. 7412218-5 16 forts. Förening med formeln I Exemgel nr Bl R2 H3 20 5-klor-2-oxo- H H -3-benso- tiazolinyl- acetyl 21(A) 2-furoyl H H 2l(B) 2-furoyl e2-furoyl H 22 p-brombensoyl acetyl acetyl 25 p-brombensoyl bensoyl bensoyl 24 m-brombensoyl acetyl . aeetyl Sålunda framställda acylderivat av WS-4545 absorberas genom oral administration i mycket högre koncentration än för WS-4545 ooh kan omvandlas till WS-4545, som är aktivt mot pato- gena bakterier. Följaktligen är acylderivaten användbara som antibiotika, vilka är effektiva genom oral administration vid be- handling av infektionssjukdomar hos människor och djur. Detta av- slöjas av följande farmakologiska försök. 7412218-5 .fifloo mfißofifiwflomü >m wQfiGUfim>dw hmucß GmUoßwEQm0& uwawømä mwuëmßmmn flflhü fl màmànmš >m Qmfloflumnuflwuflow mmhHdfi< m mx\ws oofi “won w oom|o>H «»»«»-nm mfiøfin "sq< H.#m m>.# >.m mv: w.m mmwfl m.æ wmofl ^m#m:|msv H H OMQQOM Wu m.ooH >w.>H m.m HH: m.mH mmm: w.H> mowwfl Hhnonnwx _ |H»xwaoHx»o m W m.#oH w>.wH m~wm ooàfl ø.m: mwwmfi :.mm Hmmm Hhopfisflmm m H m.wm w>.mH o.mH mmm w.wm ßwmflfl w.m: mwxm Hæownwn |H>»weHu|:.m mfl >.mH~ :m.mH ».wH oáw >.wH mmmw m.æ> mwmm HhømnwpnoHx|n m ø.:m :o.mH m.mH won m.om mmwm :.H@ _ owwwfi Hhfihpzm ^ w.w> oH.mH m.:H mm» >.mm ommw m.:m ommw Hhoaßqsflo mfl m.oæ Hm.mH >.mH wHß\ H.mH mwwm w.>m mfiww Hæownwm w R we w Hs\ws\ R Hs\ws\ R* Hs\ws\ Hm , mmnaww »Hanna .eflp :N | w .aflp w 1 m .afip m - o m H U Nm MMmmMmH1mm H Qflwëhow mflflmâfiflm 1 zum; Eßxflßofinflvflm >m ud>wnmøH om >æ flofinænpmflnflëøß ammo smpmø wQfihwflwm>mflflnD Bmw Umë mfififlwnmm 10 7#12218-5 18 Serumnivà och urinavsöndring efter oral administration av acylderivat av WS-4545 hos friska försökspersoner: Serum- och urinnivåerna bestämdes hos 5 friska försïksper- soner. På 5 vuxna, manliga försökspersoner, som vägde från 60,0- -75,0 kg, administrerades oralt ett prov i en enda dos om 1000 mg och 500 mg. Blodprov togs l, 2, 3, 5 och 8 timmar efter administra- tionen. Urinprov togs under tidsperioderna O-1, l-5, 3-6, 6-9 och 9-24 timmar efter administrationen. Koncentrationerna av WS-4545 i serumet och urinen bestämdes medelst koppmetoden. Ett analogt urinavsöndringsförsök utfördes på antibiotikumet WS-4545. Resul- taten blev följande.

Förening med formeln I R2 = H3 = H Ex. nl o - 1 1 - 3 3 - 6 6 - 9 9 - au Totalt nr_ tim. tim. tim. tim. tim. % 1 A@ety1 2922 540 1u1 8 su (5,2%) (8%) (2,3%) (3,6%) 19,6 8 Bensoyl 608 1199 930 389 63 (10,6%) (30,3%) (20,0%) (8,5%) (4,7%) 7U,3 2 Propionyl 285 1380 1385 717 170 (2,8%) (l1,7%) (l4,3%) (7,3%) (7,7%) U3,3 7(A) Butyry1 H01 2770 1386 458 77 (5,9%) (3Ä,0%) (19,l%) (5,3%) (5,4%) 69,6 3 Palmitoyl 216 1353 1239 i 5149 82 (2,3%) (l7,3%) (2l,8%) (l0,2%) (5,8%) 57,5 I tabellen anges urinavsöndringen i /ug/ml överst och i procent nederst.

Urinavsöndríngen efter administration av WS-U5U5 framgår av följande tabell, vari avsöndringen anges i /ug/ml överst och i procent nederst. 0 - 2 2 - U U - 6 6 - 8 8 ~ 10 10 - 2Ü TOtalt tim. tim. tim. tim. tim. tim. % WS-U5Ä5 35,0 53,0 55,5 50,0 23,5 9,5 2,9 (0,5%) (0,3%) (1,l%) (0,5%) (0,4%) (0,5%) Serumkoncetrationen i /ug/ml anges i följande tabell: Ex. Förening med formeln I nr R2 = RB = H nl 1 tim. 2 tim. 3 tim. 5 tim. 8 tim. 8 Bensoyl 25,2 25,8 20,1 lH,O <1U,O 7(A) Butyryl 16,9 20,7 15,7 3 Palmitoyi 12,M 16,8 15,1 11,9 <10,o 10 20 25 71412218-5 19 Föreningen framställd enligt uppfinningen kan beredas för administration på något lämpligt sätt analogt med andra antibiotiska ämnen.

Sålunda kan föreningarna I framställda enligt föreliggande uppfinning användas i form av farmaceutiska preparat, t.ex. i fast, halvfast eller flytande form, som innehåller den aktiva beståndsdelen i blandning med en farmaceutisk, organisk eller oorganisk bärare eller annan inert substans lämpad för yttre eller parenteral applicering.

Den aktiva komponenten kan ex.vis blandas med de vanliga bärarna för tabletter, piller, kapslar, suppositorier, lösningar, emulsioner, vattensuspensioner eller någon annan form som är lämplig att använda.

De bärare som kan användas är glukos, laktos, akaciaklister, gelatin, mannitol, stärkelsepasta, magnesiumtrisilikat, talk, majsstärkelse, kreatin, kolloidal kiseldioxid, potatisstärkelse, karbamid och andra bärare, som är lämpade för användning vid framställning av preparat i fast, halvfast eller f1ytande form, och dessutom förekommer hjälp-, stabiliserings- och förtjockningsmedel samt färgämnen och parfymer.

Preparaten kan även innehålla preservativa eller bakteriostatiska medel, varigenom den aktiva komponenten i de önskade preparaten hålles stabil ifråga om aktivitet. Föreningar med formeln I införlivas i preparaten i en mängd som är tillräcklig för åstadkommandr av önskad terapeutisk effekt på den bakteriellt infekterade processen. Även om dosen eller den terapeutiskt effektiva kvantiteten av föreningen är beroende av varje enskild patients ålder och hälsotillstånd, gäller generellt en daglig dos av ca 0,5-5 g, företrädesvis l-2 g/dag av den aktiva komponenten för behandling av sjukdomar, mot vilka föreningar med formeln I är användbara.

Uppfinningen belyses närmare genom följande exempel: W_h Framställning av acylderivat av antibiotikumet WS-U5U5. *_ 10 15 20 25 30 55 40 71112218-5 20 Exempel 1 Till en lösning av WS-4545-substans (100 mg) i pyridin (0,5 ml) sattes droppvis ättiksyraanhydrid (0,5 ml) under kyl- ning vid -lO°C och blandningen omrördes under 5 timmar. Till reak- tionsblandningen sattes isvatten och lösningen utsattes för lyo- filisering. Den lyofiliserade substansen kristalliserades ur en blandning av aceton och eter för framställning av kristaller, som omkristalliserades ur aceton, varvid erhölls 50 mg ättiksyra- ester av WS-4545-substans i form av prismor smältande vid 215-215°c.

A 1 = c H o N na Vs 14 20 8 2 C H N Beräknat: 48,83 5,86 8,14 runner: 48,91 5,81 8,08 (Exempel 2 “ Till en lösning av WS-4545-substans (l2,08 g) i pyridin (48 ml) sattes droppvis propionsyraanhydrid (7,8 g) med omröring under kylning vid -5 c111 -1o°c, vilket nog 1,5 timmar. T111 reak- tionsblandningen sattes, sedan denna fått stå under natten, vatten (100 ml) och lösningen koncentrerades under reducerat tryck. Åter- stoden löstes 1 vatten (l00 ml) och lösningen tvättades med etyl- acetat och koncentrerades därefter under reducerat tryck. Åter- stoden omkristalliserades ur etylacetat, varvid erhölls 4,6 g propionsyraester av WS-4545-substans som färglösa kristaller smältande vid 178-l79°C.

Analys: Cl5H22N208 _ C H N Beräknat: 50,27 6,19 7,82 Funnet: 50,18 6,25 7,51 Exempel 1 Till en lösning av WS-4545-substans (6,04 g) i pyridin (30 ml) sattes droppvis palmitoylklorid (5,8l g) under omröring och under kylning i isvattenbad, vilket tog l timme. Blandningen omrördes vid samma temperatur under l timme och dessutom vid rums- temperatur under ytterligare l timme. Till reaktionsblandningen sattes kallt vatten (60 ml) och lösningen koncentrerades under reducerat tryck. Återstoden löstes i etylacetat, och lösningen tvättades med vatten, 2,5% saltsyra, en vattenlösning av natrium- bikarbonat och vatten resp. i tur och ordning och torkades sedan över magnesiumsulfat. Lösningsmedlet avdestillerades och återsto- 10 15 20 25 50 35 71112218-5 21 den omkristalliserades två gånger ur en blandning av acetonitril och isopropyleter, varvid erhölls 5,0 g av palmitinsyraestern av WS-45U5-substansen som färglösa kristaller smältande vií 156-157°C.

Analys: C28H¿8N2O8 C H N Beräknat: 62,20 8,95 5,18 Funnet: 62,lü 9,17 5,05 Under användning av det i exempel l-3 angivna förfarandet med det undantaget, att man använde de i exempel 4 och 5 angivna utgångsmaterialen och lösningsmedlen för omkrístallísation, utvanns de i exempel H och 5 angivna acylderivaten (karboxylsyraestrar) av antibíotikumet WS-H5H5.

Exempel U Utgångsmateríal WS-HSU5-substans: 3,02 g_ Krotonsyraanhydrid:3,02 g Lösningsmedel för omkrístallisation Blandning av açetonitril och isopropyleter Acylderivat Krotonsyraester av WS-ü545-substans, färglösa nålar, utbyte: 1,0 g, smp.: lU8-l50°C.

Analys: Cl6H22N2O8 C H Beräknat: 51,88 5,99 7,56 Funnet: 51,92 6,09 7,U0 Exempel 5 Utgångsmaterial WS-H5M5-substans: 3,02 g Cyklohexankarbonylklorid: 1,6 g Lösningsmedel för omkrístallisatíon Etylacetat Acylderivat Cyklohexankarboxylsyraester, färglösa prísmor, utbyte 1,5 g,' smp.: 183-18500 (sönderdelning), Analys: Cl9H28N2O8 C H N Beräknat: 55,53 6,8Ä 6,79 _§unnet: 55,07 5,86 6,60 10 15 20 25 50 35 7412218-5 22 Exempel 6 Till en lösning av WS-4545-substans (500 mg) i pyridin (2 ml) sattes droppvis ättiksyraanhydrid (2 ml) vid rumstemperatur och bland- Kristaller bildades då reaktionsbland- Kristallerna uppsamlades medelst filtre- ningen omrördes under 5 timmar. ningen placerades i isvatten. ring och tvättades med vatten, varefter de omkristallíserades ur meta- nol,_varvid erhölls 600 mg av triättiksyraestern av WS-4545-substansen, som färglösa prismor smältande vid §4§-ë5ÖbC (sönderdelning). “ W Analys: Cl8H24OlON2 Ö H N Beräknat: 50,46 5,65 6,54 Funnet: 50,42 5,55 6,73 Exemgel 1 (A) Till en lösning av WS-4545-substans (30,2 g) i pyridin (90 ml) sattes droppvis n-smörsyraanhydrid (l7,4 g) vid rumstempera- tur under omröring, vilket tog l timme, och blandningen omrördes un- der l timme. Vatten sattes till reaktionsblandningen och lösningen koncentrerades under reducerat tryck. Återstoden löstes i etylacetat och lösningen tvättades med en vattenlösning av natriumbikarbonat och därefter med vatten samt torkades över magnesiumsulfat. Lösnings- medlet avdestillerades under reducerat tryck och återstoden tvätta- des med isopropyleter, varvid erhölls obearbetade kristaller. Kri- stallerna omkristalliserades ur en blandning av etylacetat och bensen för erhållande av kristaller, som tvättades med isopropyleter och torkades, varvid erhölls 24,3 g av n-smörsyraestern av WS-4545-sub- stansen som färglösa kristaller smältande vid l39-l40°C.

Analys: Cl6H24N2O8 C H N Beräknat: 51,60 6,50 7,52 Funnet: 51,53 6,58 7,34 (B) Den modervätska som erhölls vid ovannämnda omkristal- lisationsoperation kondenserades under reducerat tryck. Återstoden utsattes för kromatografi under användning av en kolonn packad med silikagel, i vilken kolonn eluering utfördes med en blandning av kloroform och metanol (l5:l); Eluatet koncentrerades under reduce- rat tryck och återstoden omkristalliserades ur en blandning av etylacetat och bensen, varvid erhölls 2,0 g av di-n-smörsyraestern av WS-4545-substansen i form av färglösa kristaller smältande vid 1605-162, 5°c. 10 15 20 §Q 55 7412218-5 23 A 1 = c H N o na VS 20 50 2 9 C H N Beräknat: 54,29 6,85 6,53 Funnet= 54,10 6,84 6,16 Exempel 8 Till en lösning av WS-4545-substans (l2,08 g) i pyridin (36 ml) sattes droppvis bensoylklorid (6,7 g) vid rumstemperatur under omröring vilket tog 1 timme. Blandningen omrördes under yt- terligare l timme följt av tillsats av vatten. Lösningen koncentre- rades under reducerat tryck och återstoden löstes i etylacetat.

Lösningen tvättades med vatten, en vattenlösning av natriumbikarbo- nat samt vatten resp. i tur och ordning samt torkades över magne- siumsulfat. Lösningsmedlet destillerades av under reducerat tryck och återstoden omkristalliserades ur en blandning av etylacetat och eter, varvid erhölls 12,0 g av bensoesyraestern av WS-4545- -substansen i form av färglösa kristaller smältande vid l35°C.

Analys: Cl9H22N2O8 A C 6 H N Beräknat: 56,15 5,46 6,89 Funnet: 55,92 5,42 6,69 Exemgel Q Till en lösning av WS-4545-substans (2,0 g) i pyridin (6 ml) sattes droppvis p-klorbensoylklorid (1,4 g) under kylning 1 isvattenbad, vilket tog ca 30 min. Blandningen fick stå vid samma temperatur under l timme, varefter badet togs bort och reaktionen fick fortsätta under 3 timmar. Isvatten (50 ml) sattes till reak- tionsblandningen och lösningen utsattes för extraktion med ety1~ acetat. Etylacetatskiktet tvättades med vatten, 2% vattenlösning av natriumbikarbonat samt vatten resp. i tur och ordning och tor- kades över magnesiumsulfat. Etylacetatet avdestillerades och åter- stoden omkristalliserades ur etylacetat, vilken omkristallisation utfördes två gånger, varvid erhölls 0,9 g av p-klorbensoesyraestern av WS~4545-substansen i form av färglösa kristaller smältande vid 135~1§7°c.

Analys: Cl9HèlClNéO8 c H N cl Beräknat: 51,84 4,79 6,34 8,03 Funnet: 51,67 4,75 6,23 8,30 7412218-5 24 På samma sätt som beskrivits 1 ovanstående Ex. 8 och 9 framställdes acylderivaten (dvs. karboxylsyraestrar) av WS-4545- -substansen, såsom illustreras 1 nedanstående Ex. 10-16.

Exemgel 10 5 Utgångsmaterial WS-4545-substans: 6,04 g m-brombensoylklorid: 4,8 g.

Lösningsmedel för omkristallisation Etylacetat 10 Acylderivat m-brombensoesyraester av WS-4545-substans, färglösa nålar, utbyte: 6,0 g, smp: l38°C.

Analys: Cl9HÉlN2BrO8 ' C H N 15 Beräknat: 47,02 4,36 5,77 Funnet= 46,96 4,35 6,04 Exemgel 11 Utgångsmaterial WS-4545-substans: 6,04 g 20 p-brombensoylklorid: 4,8 g Lösningsmedel för omkristallisation Etylacetat Acylderivat p-brombensoesyraester av WS-4545-substans, 25 färglösa nålar, utbyte: 6,8 g, smp: 144-l45°C, NMR-spektrumzr (ppm) = 1,96-2,53 (triplett).

Exemgel 12 Utgångsmaterial WS-4545-substans: 3,0 g _ 30 5,4-dimetylbensoylkloridz 1,85 g Lösningsmedel för omkristallisation Etylacetat 'Acylderivat 5,4-dimetylbensoesyraester av WS~4545, 35 färglösa kristaller, utbyte 1,8 g, smp= 128-13o°c, Analys: C21H26N2°8 C H N Beräknat: 58,06 6,05 6,45 Funnet: 58,50 6,26 6,52 ?412218~5 25 Exempel lå Utgångsmaterial WS-4545-substans: 2,0 g p-acetoxibensoylkloridz 1,6 g 5 Lösningsmedel för omkristallisation Blandning av etylacetat och bensen Acylderivat p-aeetoxibensoesyraester av WS-4545-substans, färglösa kristaller, ucbyce= 0,5 g, amp: 130-132°c, 10 NMR-spektrum: T(ppm) 7,68 (singlett BH) 2,69 (mnfinetb 2H) 1,94 (duuflett 2H) IR-spektrum: 1760 @m'1. 15 Exemgel 14 Utgångsmaterial WS-4545-substans: 2,4 g p-klorfenoxíaêetylkloridz 2,6 g Lösningsmedel för omkristallisation 20 Etylacetat Acylderivat p-klorfenoxiättiksyraester av WS-4545~substans, färglösa silkesliknande nålar, utbyte: 1,3 g, smpz 128-131°c. ~ 25 Analys: C2OH23ClN2O9 C H N Cl Beräknat: 51,02 4,92 5,95 7,55 Funnet= 50,78 4,88 5,97 7,60 Exemgel 15 30 Utgångsmaterial WS-4545-substans: 3,0 g Cinnamoylkloridz 1,9 g Lösningsmedel för omkristallisation Blandning av kloroform och eter (lzl) 55 Acylderivat Kanelsyraester av WS-4545-substans, färglösa prismor, utbyte: 1,5 g, smp. 150°C (sönaerdelnins), 1 10 15 20 25 35 40 7412218-5 26 Analys: C21H24N2O8 C H N Beräknat: 58,35 5,59 6,48 Funnet: 58,16 5,62 6,20 Exemgel 16 Utgångsmaterial WS-4545-substans: 3,0 g ß-fenylpropionylkloridz 1,7 g Lösningsmedel för omkristallisation Acetonitril Acylderivat ß-fenylpropionsyraester av WS-4545-substans, färglösa nålar, utbyte: 1,6 g, smp. l53°C (sönderdelning), Analys: C2lHé6N2O8 C H N Beräknat: 58,06 6,05 6,45 Funnet= 57,95 6,18 6,53 Exempel 11 (A) Till en lösning av WS-4545-substans (6,04 g) 1 pyridin (18 ml) sattes droppvis bensoylklorid (7,0 g) vid rums- temperatur under omröring, vilket tog 1 timme. Blandningen omrör- des under ytterligare 1 timme och fick stå under natten. Vatten sattes till reaktionsblandningen och lösningsmedlet avdestillera- des under reducerat tryck. Återstoden löstes 1 etylacetat. Lös- ningen tvättades med vatten, en vattenlösning av natriumbikarbo- nat och vatten resp. i tur och ordning samt torkades över magne- siumsulfat. Lösningsmedlet avdestillerades under reducerat tryck och återstoden adsorberades på silikagel 1 en kolonn. Den önskade föreningen, som adsorberades på silikagelen i kolonnen, eluera- des med en blandning av kloroform och etylacetat (9:l). Eluatet koncentrerades under reducerat tryck och återstoden omkristallise- rades ur bensen, varvid erhölls 1,02 g av tribensoesyraestern av WS-4545-substansen i form av färglösa kristaller smältande vid 165°c.

Analys: C33H3ON2Olo C H N Beräknat: 64,Ä9 4,92 4,56 Funnet: 64,19 4,88 4,56 10 15 20 25 50 35 7412218-5 27 (B) Sedan tribensoesyraestern av WS-4545 hade eluerats på ovan angivet sätt, eluerades silikagelkolonnen ytterligare med en blandning av kloroform och metanol (19:l). Eluatet kon- centrerades och återstoden omkristalliserades ur Kloroform, var- vid erhölls 2,0l g av dibensoesyraestern av WS-4545-substansen 1 form av färglösa kristaller smältanae vid 2o9°c.

Analys: C26H26N2O9 C H N Beräknat: 61,17 5,15 5,49 Funnet: 61,50 5,12 5,45 Exemgel 18 Till en lösning av WS-4545-substans (2,0 g) i pyrídin (12 ml) sattes nikotinsyraanhydrid (0,8 g) under avkylning i is- vattenbad och blandningen omrördes under l,5 timmar. Därefter av- lägsnades kylbadet och reaktionsblandningen omrördes under ytter- ligare 5 timmar. Vatten sattes till reaktionsblandningen och lös- ningen koncentrerades under reducerat tryck. Återstoden utsattes för extraktion med etylacetat och etylacetatskiktet tvättades med en vattenlösning av natriumbikarbonat samt torkades över magne- siumsulfat. Etylacetatet avdestillerades och återstoden omkristal- liserades ur etylacetat, varvid erhölls 0,8 g av nikotinsyraestern av WS-4545-substansen i form av svagt gula kristaller smältande vid 143°c.

Analys: C18H2108N3 C H N Beräknat: 53,07 5,20 10,32 Funnebå 52:79 10:09 På samma sätt som beskrivits i ovanstående Ex. 18 fram- ställdes acylderivaten (dvs. karboxylsyraestrar) av WS-4545- -substans såsom illustreras i nedanstående Ex. 19 och 20.

Exem el 1 Utgångsmaterial WS-4545-substans: 3,02 g 2-tenoylklorid: 1,57 g Lösningsmedel för omkristallisation Blandning av etylacetat och bensen Acylderivat 2-tiofenkarboxylsyraester av WS-4545-substans, kristaller, utbyte: 2,27 g, smp: l25°C 10 15 20 25 50 35 71r112218~5 28 Analys: Cl7H2ON2SO8 " C H N Beräknat: 49,51 4,89 6,79 Funnet: 49,45 4,70 6,57 Exemgel 20 Utgångsmateríal WS-4545-substans: 1,0 g 5-klor-2-bensotiazolinon-5-acetylklorid: 0,75 g Lösningsmedel för omkristallisation Blandning av acetonitril och etylacetat Acylderivat 5-klor-2-bensotiazolinon-3-ättiksyraester av wS-4545- substans, färglösa skivor, utbyte: 0,7 g, smp: 159-160°C (sönderdelning) Analys: C21H22O9N3SCl C H N S Cl Beräknat: 47,77 4,20 7,96 6,07 6,72 Furmet: 47,84 4,34 8,04 6,33 6,79 Exempelíâl (A) Till en lösning av WS-4545-substans (5,02 g) i pyridin (18 ml) sattes droppvis 2-furoylklorid (l,45 g) under kylning vid -5 till -lO°C under omröring, vilket tog 50 min.

Blandningen omrördes vid samma temperatur under 2 timmar följt av en tillsats av vatten (40 ml). Lösningsmedlet avdestillerades under reducerat tryck och återstoden löstes i vatten. Lösningen tvättades med etylacetat och mättades sedan med natriumklorid.

Lösningen utsattes för extraktion med etylacetat, och etylacetat- skiktet tvättades med en vattenlösning av natriumbikarbonat samt torkades över magnesiumsulfat. Lösningsmedlet avdestillerades under reducerat tryck och återstoden omkristalliserades ur en blandning av etylacetat och bensen, varvid erhölls 0,95 g av 2-furansyraestern av WS-4545-substansen 1 form av färglösa kri- staller smältande vid l25°C. ' Analys: Cl7H2oN209 4 C H N Beräknat: 51,51 5,09 7,07 Funnet: 51,52 5,05 7,11 10 15 20 25 50 35 40 ?412218~5 29 (B) Den modervätska som erhölls vid ovannämnda om- kristallisationsoperation koncentrerades under reducerat tryck och återstoden adsorberades på silikagel i en kolonn, varefter eluering utfördes med en blandning av kloroform och metanol (l5:l). Eluatet koncentrerades under reducerat tryck och åter- stoden omkristalliserades ur en blandning av kloroform och meta- nol, varvid erhölls 0,6 g av di-2-furansyraestern av wS-4545- -substansen, i form av färglösa kristaller smältande vid 185- -184°c.

Analys: C H N O 22 22 2 11 c H N Beräknat: 55,88 4,52 5,71 Funnet; 2 55,66 4,55 5,55 Exemgel 22 Till en lösning av p-brombensoesyraester av WS-4545- -substans (1,0 g), som erhölls i Ex. ll, i pyridin (5 ml) sattes droppvis ättiksyraanhydrid (5,0 ml) vid rumstemperatur under om- röring, vilket tog 20 min. Blandningen omrördes under ytterligare 4 timmar vid rumstemperatur följt av tillsats av vatten. Lös- ningen konoentrerades under reducerat tryck och återstoden lös- tes i vatten. Lösningen tvättades med vatten, en vattenlösning av natriumbikarbonat och vatten resp. i tur och ordning samt torkades över magnesiumsulfat. Lösningsmedlet avdestillerades under reducerat tryck och återstoden adsorberades på silikagel i en kolonn, varefter eluering utfördes med en blandning av klo- roform och etylacetat (8:2). Eluatet koncentrerades under reduce- rat tryck, varvid erhölls obehandlade kristaller. Dessa omkristal- liserades ur en blandning av etylacetat och bensen, varvid er- hölls 0,5 g av diacetyl-p-brombensoylderivatet av WS-4545~substan- san 1 form av färglösa kristaller smäitanae vid 21o°c.

Analys: C H N Br0lo 25 25 2 C H N Beräknat: 48,52 4,45 4,92 Funnet: 48,56 4,78 4,47 Exemgel 21 Till en lösning av p-brombensoesyraester av WS-45Ä5- -substans (2,0 g) i pyridin (6 ml) sattes droppvis bensoyl- klorid (1,45 E) vid rumstemperatur under omröring, vilket tog 30 min. Blandningen omrördes under ytterligare 5 timmar vid rums- temperatur och fick stå under natten. Vatten sattes till reak- 10 15 20 25 }O 55 40 71|12218~5 §O tionsblandningen, som koncentrerades under reducerat tryck. Återstoden löstes i etylacetat och tvättades med vatten, en vat- tenlösning av natriumbikarbonat samt vatten. Sedan lösningen hade torkats, avdestillerades lösningsmedlet under reducerat tryck. Återstoden adsorberades på silikagel i en kolonn och eluering ut- fördes med kloroform, varefter eluatet koncentrerades under redu- cerat tryck, varvid erhölls obearbetade kristaller. Dessa om- kristalliserades ur etylacetat, varvid erhölls 1,51 g av dibensoyl- -p-brombensoylderivatet av WS-4545-substansen i form av nålar smäl- tanae vid 177-178°c.

Exemgel 24 Till en lösning av m-brombensoesyraester av WS-4545-sub- stans (2,0 g), som erhölls i Ex. 10, i pyridin (6 ml) sattes droppvis ättiksyraanhydrid (40 ml) under avkylning och omröring, vilket tog 30 min. Blandningen omrördes under ytterligare 3 timmar och fick stå i ett kylskåp under natten. Vatten sattes till reak- tionsblandningen och lösningen koncentrerades under reducerat tryck. Återstoden tvättades med vatten och torkades, varvid er- hölls obehandlade kristaller (2,2 g). Dessa omkristalliserades ur aceton för framställning av diacetyl-m-brombensoylderivatet av WS-4545-substansen i form av kristaller smältande vid 217-2l8°C.

Exemgel 25 _ Till en lösning av 3,02 g antibiotikum WS-4545 i 12 ml av en blandning av pyridin och aceton (9:5) sättes droppvis under omröring och avkylning vid O-5°C i ett isvattenbad under loppet av l timme en lösning av 3,02 g hexanoylklorid i 3 ml aceton. Reak- tionsblandningen omrördes vid samma temperatur i l timme. Till reaktionsblandningen sättes 3 volymer kallt vatten, varefter lös- ningen koncentreras under reducerat tryck. Återstoden löses i etylacetat och lösningen tvättas med vatten, vattenlösning av natriumbikarbonat och vatten i den angivna ordningsföljden och torkas därefter över magnesiumsulfat. Lösningen koncentreras under reducerat tryck, och återstoden kristalliseras ur en bland- ning av bensen och n-hexan, varvid fås 2,3 g råkristaller. Rå- kristallerna omkristalliseras ur acetonitril, varvid fås 1,8 g hexansyraester av antibiotikum WS-4545 i form av färglösa kri- staller med smäitpunxt 144-145°c.

Analys: Beräknat för Cl8H28N2O8: C 54,00 H 7,04 N 6,99 Funnet: C 54,11 H 7,18 N 7,00 10 15 20 25 50 55 7412218-5 51 Exemgel 26 Utgångsmaterial: 12,08 g antibiotikum WS-4545 och 5,92 g heptanoylklorid.

Lösningsmedel för omkristallisationen: Acetonitril.

Acylderivatz 5,5 g heptansyraester av antibiotikum WS-4545 i form av färglösa kristaller med amalnpunkr 139-141°c.

Analys: Beräknat för CIQHBONQO8: C 55,05 H 7,50 O 6,76 Funnet: C 54,60 H 7,42 O 6,86.

Exem el 2 Utgångsmaterialz 9,06 g antibiotikum WS-4545 och 4,88 g oktanoyl- klorid.

Lösningsmedel för omkristallisationenz Acetonitr1l.5 Acylderivat: 5,15 g oktansyraester av antibiotikum WS-4545 i form av färglösa kristaller med smältpunkt 140-142°C.

Analys: Beräknat för C2OH32N2O8: C 56,07 H 7,52 N 6,54 Funnet: C 55,77 H 7,69 N 6,55.

Exempel 28 Utgångsmaterial: 9,06 g antibiotikum WS-4545 och 5,7 E dekanoyl- klorid.

Lösningsmedel för omkristallisationz Acetonitril.

Acylderivatz 6,0 g dekansyraester av antibiotikum WS-4545 1 form av färglösa kristaller med smältpunkt 146-147°C.

Analys: Beräknat för C22H56N2O8: C 57,88 H 7,95 N 6,14 runner: c 57,79 H 8,07 N 6,24.

Exemgel 29 Utgångsmaterial: 5,02 g antibiotikum WS-4545 och 1,52 g pivaloyl- klorid. 5 Lösningsmedel för omkristallisationz Acetonitril.

Acylderivat: 1,5 g pivalinsyraester av antíbiotikum WS-4545 1 form av färglösa kristaller med smältpunkt 200-20100 (sönder- delning).

Analys: Baraknat för cl7H26N2o8= c 52,83 H 6,78 N 7,25 Funnet: C 52,54 H 6,92 N 7,19 10 15 20 25 50 55 '71612218-5 32 Exempel 20 Utgångsmaterial: 30,2 g antibiotikum WS-4545 och 14,8 g 2~mety1- butyrylklorid.

Lösningsmedel för omkristallisationz Bensen.

Acylderivat: 5,4 g 2-metylsmörsyraester av antibiotikum WS-4545 i form av färglösa kristaller med smältpunkt 157-15900 (sönder- delning).

Analys: Beräknat för Cl7Hè6O8N2: Funnet: Exemgel 51 Utgångsmaterial; 5,02 g antibiotikum WS-4545 och 2,23 g metyl- H 6,78 H 6,90 C 52,84 C 52,64 N 7,25 N 7,14.

A nioactiksyraannyaria.

Lösningsmedel för omkristallísation: En blandning av bensen och etylacetat.

Acylderivat: 2,15 g metyltíoättiksyraester av antibiotikum WS-4545 i form av färglösa kristallnålar med smä1tpunkt*79-8400.

Analys: A H 5,68 N 7,18 Beräknat för c15H23o8N2s= c 46,15 s 8,21 runner: c 46,32 H 5,90 N,7,26 s 8,20.

Exempel 52 Utgångsmaterialz 27,2 g antibiotikum WS-4545 och 22,5 g isopro~ pyltioättiksyraanhydrid.

Lösningsmedel för omkristallísation: En blandning av etylacetat och isopropyleter.

Acylderivatz 16,6 g isopropyltioättiksyraester av antibiotikum WS-4545 i form av färglösa kristallprismor med smältpunkt 89-92°C.

Analys: Beräknat för Cl7HÉ6O8N2S: C 48,80 H 6,26 N 6,70 Funnet: C 48,58 H 6,15 N 6,48.

Exemgel 22 Utgångsmaterial: 30,2 g antibiotikum WS-4545 och 15,5 g 2-metyl- tiopropionylklorid.

Lösningsmedel för omkristallisationz Bensen.

Acylderivatz 15,7 g 2-metyltiopropionsyraester av antibiotikum WS-4545 1 form av färglösa kristaller med smältpunkt 90-95°C.

Analys: Beräknat för Cl6H24O8N2S.l/6 H20: C 47,17 H 6,02 N 6,88 S 7,87 Funnet= c 46,97 H 6,05 N 6,65 s 8,02. 7412218-5 55 Exempel 24 Till en lösning av 10,9 g antibiotikum WS-4545 1 60 ml pyridin sättes droppvis under omröring vid 3°C under loppet av 25 minu- ter 6,6 g 5-vinylpropionsyraanhydrid. Reaktionsblandningen om- 5 röres vid 500 i 50 minuter och vid 5-l7°C i 14 timmar. Sedan om- sättningen är avslutad, avlägsnas pyridinen från reaktionsbland- ningen under reducerat tryck. Till återstoden sättes isvatten, och därefter tvättas lösningen med eter. Lösningen mättas med natriumklorid och extraheras därefter med etylacetat. Etylacetat- 10 fasen tvättas med en mättad vattenlösning av natriumklorid och torkas därefter över magnesiumsulfat, varvid fås 9,0 g amorft pulver. Det amorfa pulvret löses i bensen. Bensenlösningen till- låtes stå över natten, varvid fås 7,1 g råkristaller. Råkristal- lerna omkristalliseras ur en blandning av etylacetat och diiso- l5 propyleter, varvid fås 6,1 g 5-vinylpropionsyraester av anti- biotikum WS-4545 i form av färglösa kristaller med smältpunkt 170-172°c.

Analys: Beräknat för Cl7H2uN208: C 55,12 H 6,29 N 7,29 20 Funnet: C 55,14 H 6,41 N 7,18.

Exempel fifi Utgångsmaterial: 50,2 g antibiotikum WS-4545 och 20,0 g 3-metyl- krotonsyraanhydrid.

Lösningsmedel för omkristallisation: En blandning av isopropyl- 25 eter och etylacetat.

Acylderivat: 5,9 g 5-metylkrotonsyraester av antibiotikum WS-4545 i form av färglösa kristaller med smältpunkt l52-15500.

Analys: Beräknat för cl7H28N2o8.1/6 H20: c 52,71 H 6,53 N 7,23 50 Funnet: C 52,61 H 6,51 N 7,00.

Exempel 56 Till en lösning av 9,7 g antibiotikum WS-4545 i 50 ml pyridin sättes droppvis vid 5qC under omröring under loppet av 50 minu- ter 16,76 g 2-(5,4,5-trimetoxi)fenylättiksyraanhydrid. Reuktions- 55 blandningen omröres ytterligare över natten. Till reaktionsbland- ningen sättes den tredubbla volymen vatten, varefter koncentre- ring utföres. Ãterstoden löses i etylacetat. Till etylacetatlös- ningen sättes vid en temperatur under 5°C en mättad vattenlösning av natriumbikarbonat, och kraftig omröring utföres. Till den mät- 4O tade vattenlösningen av natriumbikarbonat sättes en ringa mängd 7412218-5 54 natriumklorid, och omröring utföres. Etylacetatfasen tvättas med vatten och torkas därefter över magnesiumsulfat, varvid fås ett gult råpulver. Pulvret tritureras med etylacetat, varvid fås 4,83 g 2-(3,4,5-trimetoxi)fenylättiksyraester av antibiotikum 5 WS-4545 i form av färglösa kristaller med smältpunkt 147-l50°C.

Analys: Beräknat för c23H3oN2511= c 54,11 H 5,92 N 5,49 Funnet: C 53,82 H 5,91 N 5,20.

Exemgel 22 10 Utgångsmaterial: 20 g antibiotikum WS-4545 och 18,59 g 3,4,5- -trimetoxibensoylklorid.

Lösningsmedel för omkristallisation: Etylacetat.

Acylderivat: 22,64 g 3,4,5-trimetoxibensoesyraester av antibioti- kum WS-4545 i form av färglösa prismatiska kristaller med smält- 15 punkt 161-162°c.

Analys: Beräknat för C22H28N20ll.l/3 HÉO: C 52,63 H 5,74 N 5,58 Funnet: C 52,48 H 5,65 N 5,67.

Exemgel 38 20 Utgångsmaterial: 30,2 g antibiotikum WS-4545 och 27,9 g fenyl- ättiksyraanhydrid. 6 Lösningsmedel för omkristallisation: En blandning av etylacetat och isopropyleter.

A6y1aer1vat= 6,6 g fenylatcixsyraester av anfiiobiofiikum ws-4545 25 1 form av färglösa kristaller med smältpunkt 96-l0O°C (sönderdel- ning).

Analys: 'Beräknat för Cl9H24N208.2/3 CH3COOC2H5: C 55,70 H 6,33 N 6,00 Funnet= 4 C 55,94 H 5,73 N 6,10. 30 Exempel 32 I Utgångsmaterial: 30,2 g antibiotikum WS-4545 och 34,8 g p~nitro- bensoesyraanhydrid. Å Lösningsmedel för omkristallisation: En blandning av etylacetat | och etyleter. 1 35 Acylderivat: 28,5 g p-nitrobensoesyraester av antibiotikum WS-4545 * i form av färglösa kristaller med smältpunkt 135-13700.

Analys: Beräknat för cl9H2lN5o1O= c 50,56 H 4,69 N 9,51 Funnet: C 50,19 H 4,50 N 9,20. 10 15 20 25 30 35 71012218-5 35 Exempel 40 Utgångsmaterial: 20,0 g antibiotikum WS-4545 och 20,8 g fenoxif ättiksyraanhydrid.

Lösningsmedel för omkristallisation: Etanol.

Acylderivat: 12,5 g fenoxiättiksyraester av antibiotikum WS-4545 1 form av färglösa priemer med emäitpunkfi 105-1o9°c.

Analys: Beräknat för c2GH52N2o9.2/3 c2H5oH= c 54,85 H 6,04 N 6,oo Funnet= o 54,86 H 6,11 N 5,96.

ExemQel_4l Till en lösning av 20 g antibiotikum WS-4545 1 150 ml pyridin sättes droppvis under avkvlning 19,45 g tienylättiksyraanhydrid, och blandningen omröres 1 5 timmar. Till reaktionsblandningen sattes vatten, och lösningen koncentreras under reducerat tryck. Återstoden löses 1 etylacetat, och lösningen tvättas med vatten, en vattenlösning av natriumbikarbonat och vatten i den angivna ordningsföljden och torkas därefter över magnesiumsulfat. Lös- ningsmedlet avdestilleras, och återstoden behandlas med aktivt kol, varefter återstoden omkristalliseras ur en blandning av etylacetat och isopropyleter, varvid fås kristaller, som om- kristalliseras ur en blandning av etylaoetat och isopropyleter, varvid fås 15,5 g tienylättiksyraester av antibiotikum WS-4545 i form av färglösa prismatiska kristaller med smältpunkt 171-172°c.

Analys: Beräknat för Cl8H22O8N2S: Funnet: Exemgel 42 Utgångsmaterial: 12 g antibiotikum WS-4545 och 9,0 g 3-metox1- karbonylpropionylklorid.

Acylderivat: 1,5 g 3-metoxikarbonylpropionsyraester av antibio- tixum ws-4545 1 form ev ett pulver med emaitpunxt zoo-2o1°c (sönderdelning).

NMR-spektrum: Lösningsmedel: D20.

Inre standard: DSS N 6,57 N 6,49 S 7,52 S 7,25.

C 50,70 c 50,61 H 5,20 H 5,26 10 15 20 25 50 35 7412218-5 36 5 gggml 1,57 (3H, singiett) ca 2,50 (2H,mu1t1p1ett) 2,70 (4H, singlett) 3,66 (3H, singiets) ca 5,5 - 5,9 (2H, multiplett) 4,05 (lH, singlett) ca 4,05 (lH) (AB, kvartett J = 10 Hz) 4,24 (1H) 5,20 (IH, singlett 5,46 (IH, singlett) Exempel 42 Till en lösning av 24,2 g antibiotikum WS-4545 i 70 ml pyridin sättes droppvis under omröring och avkylning vid en tema peratur mellan minus 5 och OOC under loppet av l timme 19,7 g etyltioättiksyraanhydrid. Reaktionsblandningen omröres vid samma temperatur i l timme och lämnas därefter att stå över natten vid rumstemperatur. Till reaktionsblandningen sättes 5 volymer vat- ten, och därefter koncentreras lösningen under reducerat tryck vid 50°C, varvid fås en gul oljeliknande återstod. Återstoden löses i 200 ml etylacetat, och lösningen tvättas flera gånger med en kall 10%-ig vattenlösning av saltsyra, till dess att vat- tenfasen är sur, för avlägsnande av pyridin. Ifrågavarande före- ning extraheras två gånger från den utsaltade vattenfasen med 50 ml etylacetat. De förenade extrakten tvättas två gånger med en mättad vattenlösning av natriumvätekarbonat, och vattenfasen behandlas under användning av ett utsaltningsförfarande och extra- heras med etylacetat. Etylacetatfasen tvättas tre gånger med en mättad vattenlösning av natriumklorid, torkas över magnesiumsul- fat och koncentreras under reducerat tryck, varvid fås 26 g av ett råpulver. Pulvret kristalliseras ur 200 ml av en blandning av bensen och etylacetat (lzl), varvid fås 24,76 g färglösa kri- stallnâlar. Kristallnålarna omkristalliseras ur 200 ml etylacetat, varvid fås 9,95 g etyltioättiksyraester av antibiotikum WS-4545 i form av färglösa nålkristaller, som sönderdelas vid lÄ2-l45°C.

Analys: Beräknat för cl6H24o8N2s.1/4 H20: c 46,99 H 6,04 N 6,85 s 7,85 C 46,90 H 5,95 N 6,85 s 7,77.

Funnet: 10 15 20 25 30 35 40 'llr12218-5 57 Under användning av i huvudsak det förfarande som beskrivits i exempel 43 fås de i exemplen ÄH-H7 angivna acylderivaten av anti- biotikum WS-H5U5.

Exempel ÄH Utgångsmaterial: 36,5 g antibiotikum WS-USUS och 33,5 g Valeriansyraanhydrid.

Lösningsmedel för omkristallísationz Etylacetat.

Acylderivat: 11,8 g valeriansyraester av antibiotikum WS-4555 i form av färglösa nålkristaller med smältpunkt 146-lH8°C (sönderdelning).

Analys: Beräknat för Cl7H2608N2.l/2 H20: C 51,67 H 6,76 N 7,09 Funnet: C 51,82 H 6,71 NV 7,15.

Exempel H5 Utgångsmaterial: 35 g antibiotikum WS-H5H5 och 22,3 g tetrahydro-2-tenoylklorid.

Lösningsmedel för omkrisballisationz Etylacetat.

Acylderivat: lN,5 g tetrahydro-2-tenoinsyraester av antibíotikum WS-ü5H5 i form av färglösa nålkristaller med småltpunkt 146-lN8°C (sönderdelning).

Analys: Beräknat för Cl7H2uO8N2S.78/100 H20: C U8,66 H 5,85 N h,68 S T,6U 0 u8,56 H 5,89 N ø,58 s 7,4M.

Exempel H6 Utgångsmaterial: 2Ä,2_5Aantibiotikum WS-H5H5 och 2U,l5 g tert.butyltioättiksyraanhydrid:_ Lösningsmedel före omkristallisationz Etylaeetan.

Acylderivat: 10,5 g tert.butyltioättiksyraester av antibiotíkum WS-U545 i form av färglösa nålkristaller med smältpunkt 139-lU0°C (sönderdelníng). 5 10 15 20 25 }O 35 40 7412218-5 za Analys: C H9,20 H 6,52 C 49,18 H 6,H9.

Beräknat för cl8H28o8N2s= Funnet: Exempel 47 Utgångsmaterial: 35 g antíbíotíkum WS-HEH5 och 30 g 2 tert.butyltíopropíonsyraanhydrid.

Lösningsmedel för omkristallisation: Acetonitril.

Acylderívat: 6,5 g 2-tert.butyltiopropionsyraester av antibiotikum WS-H5H5 i form av färglösa nålkrístaller med smältpunkt 152-l5U°C (sönderdelning).

Analys: Beräknat för Cl9H3OO8N2S.1/8 H20: C 50,85 H 6,7H N 6,2U 5 ~ G 50,89" H 6,7ï_____1¶_¿,3_ß-___ Framställning av utgångsföreningen antibiotikum WS-4545.

Exempel 48 500 ml kolvar, som var och en innehöll 100 ml av följande vegetativa medium, iordningställdes, stärkelse 2% Torkad jäst 1% Bomullsfrömjöl 1% Glutenmjöi - 1% Jordnötsmjöl 1% KHQPO4 2,18% Na2HPo4.12H2o 1,45% i vattenledningsvatten. Sex kolvar användes.

Detta medium steriliscrades därigenom att det upphettades till ca l20°C under ca 30 min. i en autoklav, varefter det avkyl- des. Varje kolv ympades med sporer och mycelium av Streptomyces sapporonensis ATCC 21532, som odlades på ett agarmedium ("slant").

Organismen fick tillväxa i mediet vid ca 30°C under en period av 48 timmar på en skakanordning. Å andra sidan placerades i en 30 l rostfri tank 20 1 av ett odlingsmedium innehållande samma komponent som ovan. Mediet steriliserades därigenom att det upphettades till ca l20°C under ca 50 min. och under tryck. Det kylda jäsningsmediet ympades under aseptiska betingelser med den ovan beskrivna vegetativa 10 15 20 25 50 55 40 7412218-5 39 ympningskulturen i en mängd av 5 volymprocent av mediet och därefter fick organismen tillväxa vid 50°C under 48 timmar.

Under tillväxtperioden omrördes vätskan med en propeller av ett varvtal av 500 varv/min. och steril luft leddes genom vätskan med en hastighet av ca 20 l luft/min.

Efter det att odlingen var avslutad filtrerades odlings- vätskan för avlägsnande av mycelium, varvid filtreringen åstad- koms genom att man tillsatte en procent "Radiolite" (varumärke, ett filterhjälpmedel salufört av Showa Chemical Company) till vätskan. Filtratet justerades till pH 7,0 och 500 g aktivt kol tillsattes. Blandningen omrördes under 5 min. och därefter upp- samlades kakan av aktivt kol medelst filtrering. 10 1 vatten sat- tes till denna kaka och blandningen omrördes, varefter kakan av aktivt kol uppsamlades medelst filtrering. Kakan av aktivt kol innehållande effektivt antibiotikum utsattes sedan för extraktion med 5 1 50% vattenhaltig aceton med omröring under 5 min. Denna extraktionsoperation utfördes två gånger. Det kombinerade vatten- haltiga acetonskiktet koncentrerades, varvid erhölls en siraps- liknande substans.

Nämnda substans fick passera genom en kolonn packad med cellulosa och eluering utfördes med vattenhaltig butanol.

Successiva fraktioner uppsamlades för analys. De fraktioner som uppvisade antimikrobiell aktivitet sammanfördes och koncentrera- des, varvid erhölls en gul och oljeliknande substans. Nämnda oljeliknande substans fick passera genom en kolonn packad med kiselsyra. Sedan kolonnen hade tvättats med kloroform, utfördes eluering under användning av en blandning av kloroform och meta- nol (5:l). Successiva fraktioner uppsamlades för analys. De fraktioner som uppvisade antimikrobiell aktivitet förenades och koncentrerades. Ãterstoden frystorkades, varvid erhölls 550 mg av ett vitt pulver. Pulvret löstes i 20 ml het aceton. Acetonlös- ningen placerades i ett kylskåp varvid erhölls 500 mg av anti- biotikumet WS-4545 i form av kristaller (rombiskt system).

Exempel 42 Till en odlingsvätska erhållen enligt Ex. 48 sattes l% "Radiolite" varefter filtrering utfördes. 400 g aktivt kol sattes till 14 1 av filtratet, som justerades till pH 7,0, varefter blandningen omrördes under 20 min. Sedan blandningen hade filtre- rats tvättades kakan av aktivt kol med 5 1 vatten och utsattes sedan för extraktion med 5 l av en blandning av etylacetat och 10 15 20 25 BO 35 40 7412218-5 40 metanol (5:l). Nämnda extraktionsoperation utfördes två gånger.

Extrakten sammanfördes och koncentrerades under reducerat tryck till en mängd av ca 50 ml. Till koncentratet (en sirapsliknande substans) sattes 20 ml aceton och acetonlösningen filtrerades för avlägsnande av föroreningar. Filtratet koncentrerades. Åter- stoden torkades och fick därefter passera genom en kolonn packad med silikagel och fylld med kloroform, varefter kloroform leddes genom kolonnen för avlägsnande av föroreningar. Eluering utfördes under användning av aceton. Successiva fraktioner uppsamlades för analys. De fraktioner som uppvisade antimikrobiell aktivitet sam- manfördes och koncentrerades varvid erhölls 1,25 g av vitu kri- staller. Kristallerna pulvriserades genom tillsats av en liten mängd metanol, varefter pulvret omkristalliserades ur aceuon för framställning av 1,0 g av antibiotikumet WS-4545 i form av vita nålar (monoklint system).

Exempel §0 Sex 500 ml kolvar, som var och en innehöll 100 ml av föl- jande vegetativa medium, iordningställdes, Stärkelse 2%' Bomullsfrömjöl 1% Glutenmjöl 1% Mgcla . 61120 1% KHÉPO4 2,18% Na2HP04.l2H20 1,43% i vattenledningsvatten.

Detta medium steriliserades på konventionellt sätt och varje kolv ympades med sporer och mycelium av Streptomyces sapporonensis ATCC-21532. Organismen fick tillväxa i mediet vid ca 50°C under en period av 48 timmar på en skakanordning.

I en 30 1 rostfri tank placerades 20 l av ett odlingsmedium innehållande samma komponent som ovan. Odlingsmediet sterilise- rades därigenom att det upphettades under tryck till ca 12000 under ca 30 min., varefter det avkyldes. Medlet ympades asep- tiskt med den ovan beskrivna vegetativa ympkulturen i en mängd av 5 volymprocent av mediet, varefter organismen fick tillväxa vid 3000 under 48 timmar. Under tillväxtperioden omrördes vätskan med en propeller, som drevs med ett varvtal av 500 varv/min., och steril luft leddes genom vätskan med en hastighet av ca 20 l steril luft/min.

Sedan odlingen var avslutad filtrerades odlingsvätskan för 10 15 20 25 7412218-5 41 avlägsnande av mycelium, varvid vid filtreringen tillsattes 1% "Radiolite". Till filtratet sattes ca 200 g aktivt kol och bland- ningen omrördes under 10 min. Sedan blandningen hade filtrerats, sattes 10 1 vatten till kakan av aktivt kol, och blandningen om- rördes varefter den filtrerades. En blandning av 4 1 etylacetat och 2 1 etanol sattes till den uppsamlade kakan av aktivt kol, och blandningen omrördes under 10 min. varefter den filtrerades, varvid erhölls ett filtrat och en kaka av aktivt kol. Denna kaka behandlades därefter med en blandning av 2 1 etylacetat och 1 1 metanol på samma sätt för åstadkommande av ett filtrat. De båda filtraten förenades och koncentrerades, varvid erhölls en siraps- liknande substans. Till sirapen sattes 100 g "Radiolite" och blandningen torkades under reducerat tryck vid 3000. Den torkade substansen utsattes för extraktion med en blandning av 300 ml aceton och 100 ml metanol. Denna extraktionsoperation utfördes två gånger. De sålunda erhållna extrakten sammanfördes och kon~ centrerades, varvid erhölls en gul, oljeliknande återstod. Denna oljeliknande substans fick passera genom en kolonn packad med kiselsyra, varefter kloroform leddes genom kolonnen för avlägs- nande av föroreningar. Eluering utfördes med en blandning av kloroform och metanol (5:l). De fraktioner som uppvisade anti- mikrobiell aktivitet uppsamlades och koncentrerades. Koncentra- tet tilläts stå under en viss tid, varvid erhölls 900 mg vita prismakristaller. Nämnda kristaller omkristalliserades ur en blandning av metanol och aceton, varvid erhölls 800 mg av anti- biotikumet WS-4545 i form av kristaller, som identifierades på samma sätt som i Ex. 48.

Exemgel 51 En föredragen sammansättning för en tablett är följande: Delar l Bensoesyraester av WS-4545-substans 2 2 Mannitol 90 3 Stärkelse 6 4 Magnesiumstearat 2 Exem el 2 En föredragen sammansättning för ett stolpiller är följande: _ Delar gig Attiksyraester av ws-uslæs-substarls 2500 2 Etylendiamintetraättiksyradinatrium- saltdihydrat 900 (3) Witepsol H 12 124000

Claims (3)

1. 7412218-5 U2i PATENTKRAV. l. Förfarande för framställning av föreningar med den allmänna formeln (IF i” C ~----43------CO 1/ \\\ NH | 2 //,co I \\o c NH Hc-oR2 Ho-ï-cs; 1 CHQOR '31 II! O-O 3 vari Rl betecknar en.acylgrupp, och R2 och R är desamma eller olika och vardera betecknar väte eller en acylgrupp, k ä n n e t e c k- n a t därav, att en förening med formeln II CH OH H21 //C - -C----CO H2? 'ïfl H C CO II 2 ,/” \\\O - C -NH HC-OH HO-C-CH3 CHZOH omsättes med ett acyleringsmedel.

2. Förfarande enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a t därav, att Bl är palmitoyl och att R2 och R3 vardera är väte.

3. Förfarande enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a t l 2 därav, att R är Peneoyl och att R och R3 vardera är väte. »nv-:w-fl-.w *ler-v -f-m v- därav, därav, därav, därav, därav, U. att Rl är 5. att nl är _§f att RL är 7. att Bl är 8. att Rl är 7412218-5 43 Förfarande enligt krav l, att R l, k ä n n e t e R3 vardera är vä1e. cyklohexylkarbonyl och 2 Förfarande enligt krav butyryl och att R2 och Förfarande enligt krav 1, p-klorbensoyl och att R2 Förfarande enligt krav l, Förfarande enligt krav 1, cinnamoyl men att R2 ANFÖRDA PUBLIKATIONER: k ä n n e t e c k n a t c k n a t k ä n n e t e c k n a t och R3 vardera är väte. k ä n n e t e c k n a t 3,ü-dimetylbensoyl och att RE och H3 vardera är väte. k ä n n e t e c k n a t och RB vardera är väte. och R3 vardera är väte.