NO164904B

NO164904B - Analogifremgangsmaate til fremstilling av terapeutisk aktive griseolsyrederivater.

Info

Publication number: NO164904B
Application number: NO844291A
Authority: NO
Inventors: Masakatsu Kaneko; Misako Kimura; Yoshinobu Murofushi; Mitsuo Yamazaki; Nobuyoshi Iwata; Fumio Nakagawa
Original assignee: Sankyo Co
Priority date: 1983-10-28
Filing date: 1984-10-29
Publication date: 1990-08-20
Also published as: FI81357B; EP0143557B1; CA1267408A; SU1600632A3; EP0143557A2; ES547292A0; FI844225L; SU1604158A3; DK513384A; DE3475714D1; ATE39357T1; DK166323B; ES8700673A1; ES8701193A1; FI844225A0; ES547291A0; EP0143557A3; KR930000165B1; SU1468421A3; US4634706A

Abstract

Griseolsyrederivater med formelen (I). har enzyminhiberende virkning, særlig mot cyklisk adenosinmonofosfat-diesterase (cAMP PDE). I preparater sammen med passende bærere eller spedningsmidler kan de anvendes ved behandling av forskjellige organiske sykdomstilstander og har lavere toksisitet enn griseolsyre selv.

Description

Den foreliggende oppfinnelse vedrører en analogifremgangsmåte til fremstilling av terapeutisk aktive griseolsyrederivater med den generelle formel (I)

hvor

5 9

R er et hydrogenatom eller en gruppe med formelen -OR ,

-NR10Rn eller -SR9, hvor

R9 er hydrogen eller en C^-Cg-alkylgruppe, og R10 og R11 er like eller forskjellige og er hver hydrogen, en C^-Cg-alkyl-

gruppe, en C^-Cg-hydroksyalkylgruppe, en C^-Cg-aminoalkylgruppe,

en fenylgruppe, en naftylgruppe, en benzylgruppe, en aminogruppe eller en C^-Cg-alkoksygruppe, eller R<10> og R<11> danner sammen med nitrogenatomet som de er bundet til en piperidin- eller morfolin-ring,

12 13

og R og R er hydrogen, lavere alkyl som eventuelt er substituert med én eller flere fenylgrupper,

samt farmasøytisk akseptable salter derav, men med unn-

tagelse av 7 *(R)-griseolsyre selv og salter derav.

Griseolsyre er en forbindelse av nukleosidsyre-type, som inneholder en adeninbase og to karboksylsyregrupper. Den ble først beskrevet i blant annet europeisk patentsøknad 29.329A, men dens struktur var på det tidspunkt ikke kjent. Dens struktur ble først beskrevet i US-patentskrift 4.460.765.

Strukturen til griseolsyre kan angis med formelen

Det bør bemerkes at naturlig griseolsyre, som er et produkt av naturlig biosyntese, syntetiseres stereospesifikt• Faktisk er den både i 2'- og 7<*->stillingene i R-konfigurasjon.

I overensstemmelse med anbefalingene fra International Union of Pure and Applied Chemistry (I.U.P.A.C.) betegnes disse forbindelsene som derivater av griseolsyre, hvorved griseolsyre benyttes som grunnstruktur. Nummereringssystemet som benyttes her er det som er vist i griseolsyreformelen ovenfor.

Ved benevning av spesifikke forbindelser antas i overensstemmelse med denne konvensjon substituenter i 2'- og 7'-stil-lingene å være i.R-konfigurasjon (som i naturlig griseolsyre) med mindre noe annet er angitt.

Griseolsyre og dens derivater har evnen til å inhibere aktiviteten til cyklisk adenosinmonofosfat (cAMP) fosfordiesterase (PDE) og kan derved øke konsentrasjonen av cAMP i cellene til en pasient som behandles med den.

Det er velkjent at cAMP, som er fordelt i meget stor ut-strekning i dyrevev, funksjonerer som en sekundær budbringer for og formidler.virkningen av et stort antall hormoner. Som resultat spiller cAMP mange forskjellige meget viktige fysiologiske og biokjemiske roller. Dessuten er det kjent at det har en virkning på eller deltar i deling, vekst og differensiering av celler, systole, bloddannelse, forskjellige aktiviteter i sentralnerve-systemet, immunreaksjoner samt frigjøring av insulin og histamin. Dets konsentrasjon i vev, og derved dets effekt på disse forskjellige funksjoner, avhenger av balansen mellom enzymet som danner cAMP (adenylatcyklase) og enzymet som dekomponerer cAMP PDE. En inhibitor mot cAMP PDE vil øke konsentrasjonen av cAMP i cellene og ville således være et verdifullt angiokardiokinetisk middel, et antiastmatisk middel, et avslappende middel for glatte muskler, et psykotropisk eller neurotropisk middel, et antiin-flammatorisk middel, et middel mot kreft og et middel for behandling av sukkersyke.

Griseolsyre har vist seg å danne en rekke av de biokjemiske virkninger som er beskrevet i avsnittet ovenfor, og ved den foreliggende oppfinnelse tas det sikte på å frembringe en rekke derivater av griseolsyre, som likeledes har disse virkninger, men som også har lav toksisitet, som kan forsterke virkningen av kjente midler mot kreft og å forsterke virkningen av insulin, og som kan bedre blodets viskositet.

Et formål med oppfinnelsen er følgelig å frembringe en

analogifremgangsmåte for fremstilling av forbindelser som har en inhiberende virkning mot cAMP PDE og lav toksisitet, dvs. som kan avhjelpe organiske forstyrrelser som skyldes utilstrekkelig konsentrasjon av cAMP i vevene.

Analogifremgangsmåten til fremstilling av terapeutisk aktive griseolsyrederivater er kjennetegnet ved at en forbindelse med formelen (II)

12 13

hvor R og R har de ovenfor angitte betydninger, og

Z er et halogenatom

a) omsettes med et passende amin, eller

b) et alkoksid, eller

c) natriumhydrogensulfid,, eller

c) hydrazin, eller

d) Zn/eddiksyre, og

at om ønsket nåo r R 12 og R 13 ikke er hydrogen, den oppnåodde

forbindelse hydrolyseres.

Nå• r R 5 er en gruppe med formelen -OR 9, er denne en hydroksy-, C^-Cg-alkoksygruppe. Alkoksygruppen kan være en ufor-grenet eller forgrenet gruppe, og eksempler er. metoksy, etoksy, propoksy, isopropoksy, butoksy, isobutoksy, sek-butoksy, tert-butoksy, pentyloksy og heksyloksy.

De eventuelt substituerte merkaptogrupper med formelen -SR 9 , som kan være representert i R 5, kan være tioanalogene til de ovennevnte substituerte hydroksygrupper med formelen -OR 9. Men foretrukne slike grupper er merkaptogruppene, C^-Cg-alkyltio-grupper, særlig metyltio-, etyltio-,■propyltio-, isopropyltio-, butyltio-, isobutyltio-, sek-butyltio-, tert-butyltio-, pentyl-tio- og heksyltiogrupper.

Når R~\er en amino- eller substituert aminogruppe med formelen -NR^R*1, kan R^° og R^ være like eller forskjellige og hver være et hydrogenatom; en hydroksygruppe, en C^-Cg-amino-alkylgrupDe, en aralkylgruppe, en arylgruppe, en C.-C,-alkoksy-10 11 lo

gruppe, en aminogruppe eller R og R kan sammen danne en cyklisk aminogruppe. Bortsett fra når noe annet er angitt foretrekkes det at R er hydrogen og R^ er hydrogen eller en av de ovenfor angitte grupper.

Når R og/eller R1^" er en alkylgruppe kan gruppen -NR1<^R"1""1' være en mono- eller dialkylaminogruppe, særlig metylamino-, di-metylamino-, etylamino-, dietylamino-, propylamino-, dipropyl-amino-, butylamino-, isobutylamino-, sek-butylamino-, tert-butyl-araino-, pentylamino- og heksylaminogruppene. Når R er en hydroksyalkylgruppe er foretrukne eksempler på grupper -NR^R^ 2-hydroksyetylamino- og 3-hydroksypropylaminogruppene. Når R^ er en aminoalkylgruppe er foretrukne eksempler på gruppene -NR^R^ 2-aminoetylamino- og 3-aminopropylaminogruppene. Når R er en aralkylgruppe er benzylaminogruppen et foretrukket eksempel på gruppen representert ved -NR^R^. Når R^ er en arylgruppe er foretrukne eksempler på grupper representert ved -NR^R*^ anilino-, o-naftylamino- samt B-naftylaminogruppene. Når R^ er en alkoksygruppe er foretrukne eksempler på grupper representert ved -NR^R^ metoksyamino-, etoksyamino- samt propoksyamino-gruppene. Når R^ er en aminogruppe er gruppen -NR^R^ fortrinnsvis hydrazingruppen. Når R^ og R^ sammen med nitrogen-atomer som de er bundet til danner en cyklisk aminogruppe kan denne eventuelt inneholde minst ett annet heteroatom valgt blant oksygen-, nitrogen- og svovelatomer og inneholder fortrinnsvis enten intet annet heteroatom eller ett annet heteroatom valgt blant oksygen og nitrogen. Foretrukne slike cykliske aminogrupper som kan være representert ved -NR^R^ er 1-pyrrolidinyl-, 2-piperazinyl-, morfolino- samt 4-metyl-l-piperazinylgruppene.

Z er et halogenatom, hensiktsmessig et fluor-, klor-, brom-eller jodatom.

Forbindelsene med formelen (I) inneholder to karboksy-grupper og kan således danne mono- eller disalter og mono- eller diestrer. I disaltene og diestrene kan kationene i saltene eller alkoholdelene i estrene være like eller forskjellige. Men i praksis er det lettere å fremstille disalter eller diestrer, særlig de hvor de to kationiske enheter eller de to alkoholiske enheter er like.

Det er ingen spesiell begrensning til typen alkoholenhet i esteren under forutsetning av at den ikke, eller ikke i en uakseptabel grad, nedsetter forbindelsens aktivitet eller øker dens toksisitet, og alle estrer som vanligvis dannes for forbindelser av denne type kan fremstilles med forbindelsene ifølge oppfinnelsen.

Eksempler på estrer omfatter: C^-Cg-alkylestrer, særlig metyl-, etyl-, propyl- og butylestrene, aralkylestrer> særlig benzyl- og benzhydrylestrene.

Der er ingen spesiell begrensning til naturen til kationet som anvendes for å danne salter av forbindelsene ifølge oppfinnelsen under forutsetning av at de ikke, eller ikke i en uakseptabel grad, nedsetter aktiviteten eller øker toksisiteten til forbindelsene. Foretrukne salter er salter av alkalimetaller, såsom natrium eller kalium, eller av jordalkalimetaller, såsom kalsium.

Når R er en aminogruppe vil forbindelsene ifølge oppfinnelsen også danne syreaddisjonssalter. Typen syre som anvendes for å fremstille slike salter er ikke kritisk under forutsetning av at den ikke, eller ikke i en uakseptabel grad, nedsetter forbindelsenes aktivitet eller øker deres toksisitet. Eksempler på slike syrer er uorganiske syrer som saltsyre, svovelsyre og fos-forsyre, organiske karboksylsyrer som eddiksyre, oksalsyre, male-insyre, ravsyre, sitronsyre, vinsyre, fumarsyre, laurinsyre, stearinsyre og palmitinsyre, samt slike organiske sulfonsyrer som metansulfonsyre, benzensulfonsyre og p-toluensulfonsyre.

Forbindelser av denne art inneholder et antall asymmetriske karbonatomer i deres molekyler og kan av den grunn foreligge i form av forskjellige stereoisomerer. Ved fremgangsmåten fremstilles det således forbindelser med både de individuelle, iso-lerte isomerer og blandinger av disse isomerer. Griseolsyre, som er et naturprodukt, er én eneste isomer hvori både 2'- og 7'-kar-bonatomene er i R-konfigurasjon. Forbindelser fremstilt av griseolsyre kan bibeholde samme konfigurasjon eller kan ha den om-vendte konfigurasjon i ett eller flere av de asymmetriske karbonatomer. Nåo r R 12 er en annen gruppe eller et annet atom enn hydrogen kan f.eks. forbindelsenes konfigurasjon i 2'-stillingen være a eller 6 . Nåo r R <12> er en annen gruppe eller et annet atom enn hydrogen kan konfigurasjonen i 7'-stillingen være RS, R eller S.

Eksempler på forbindelsene som fremstilles ved analogifremgangsmåten ifølge den foreliggende oppfinnelse er angitt i den etterfølgende liste. Forbindelsene vil heretter når det er hensiktsmessig bli identifisert med numrene de har i denne liste.

1. 6-desamino-6-metoksygriseolsyre

2. 6-desamino-6-merkaptogriseolsyre

3. 6-desamino-6-hydrazinogriseolsyre

4. N^-metylgriseolsyre

5. N** ,N6-dimetylgriseolsyre

6. N^-benzylgriseolsyre

7. N^-fenetylgriseolsyre

8. N^-a-naftylmetylgriseolsyre

9. 6-desamino-6-piperadinogriseolsyre

10. 6-desamino-6-morfolinogriseolsyre

11. N^-fenylgriseolsyre

12. N^-(2-hydroksyetyl)griseolsyre

13. N^-(2-aminoetyl)griseolsyre

14. 6-desamino-6-hydrogriseolsyre

15. N^-metoksygriseolsyre.

Av disse foretrekkes forbindelse nr. 4, N^-metylgriseolsyre.

Forbindelsene kan fremstilles som angitt i det etter-følgende reaksjonsskjema som reaksjonstrinnene 1-6 gjennomføres etter. Trinn 1-4 representerer således fremstilling av startmaterialer med formelen (II), mens trinn 5 og 6 angir fremstillingen av produktene med formelen (I) hhv (III) ifølge den foreliggende analogifremgangsmåte.

5 12 13

I formlene ovenfor er R , R , R og Z som definert foran. R 12 kan imidlertid, nå»r det gjelder utgangsmaterialene i trinn 3

O €.13

og 4, være en alkanoylgruppe (såsom en acetylgruppe). Når R er en karboksybeskyttende gruppe kan denne omfatte en av de esterdannende grupper som angitt ovenfor. Når to eller flere

12 13

grupper R og R foreligger i en forbindelse, kan disse være like eller forskjellige, men er hensiktsmessig like.

Trinnene 1-6 som utføres ifølge det ovennevnte reaksjons-.skjema kan oppsummeres som følger: I trinn 1 omdannes aminogruppen i 6-stillingen til en hydroksygruppe. Reaktanten er et nitritt såsom Na-nitritt, og anvendes under sure betingelser såsom med eddiksyre.

I trinn 2 forestres utgangsmaterialet som inneholder frie karboksylsyregrupper, med difenyldiazometan i aceton når det skal dannes en benzhydrylester, med et diazometan når det skal dannes en metylester, og med et blandet syreanhydrid når det skal dannes en lavere alkylester.

I trinn 3 acyleres alle stillinger hvor acylering er mulig, såsom med et egnet acyleringsmiddel, f.eks. acetylklorid.

I trinn 4 halogeneres hydroksygruppen i utgangsmaterialets 6-stilling med et egnet halogeneringsmiddel såsom fosforoksyklorid eller -oksybromid. Det kan også anvendes et syrebindende middel som kan ha en katalytisk virkning.

I trinn 5 fremstilles ved analogifremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, et griseolsyrederivat som har den ønskede substituent R 5 i 6-stillingen. Et tilsvarende derivat med halogen i 6-stillingen omsettes med et passende amin, eller et alkoksid, eller natriumhydrogensulfid, eller hydrazin, eller zink/eddiksyre.

I trinn 6 hydrolyseres de lavere alkylestrer hvor den lavere alkylgruppen fungerer som en karboksybeskyttelsesgruppe, under basiske betingelser. Reaksjonen utføres fortrinnsvis i en vandig løsning av et alkali såsom natriumhydroksyd. Når utgangsmaterialet inneholder en acetylgruppe, dvs. fra trinn 3-4, hydrolyseres også denne til en fri hydroksygruppe.

Etter at reaksjonene ovenfor er fullført kan den ønskete forbindelse fraskilles fra reaksjonsblandingen på vanlig måte. F.eks. omfatter en vanlig utvinningsmåte: om nødvendig vasking av reaksjonsbladingen med vann, avdestillering av løsningsmidlet under senket trykk, og deretter rensing av produktet ved hjelp av forskjellige konvensjonelle fremgangsmåter, såsom rekrystalli-sasjon, søylekromatografi eller preparativ tynnsjiktskromatografi.

7<1->deoksygriseolsyre kan også fremstilles ved dyrking av en 7<1->deoksygriseolsyre-dannende mikroorganisme av slekten Streptomyces, særlig S.griseoaurantiacus nr. 43894 (FERM P-5223), i et næringsmedium for denne og deretter utvinning av 7'-deoksygriseolsyre fra dyrkingsmediet.

S-griseoaurantiacus nr. 43894 er den stamme av mikroorganismen som er identifisert i europeisk patentskrift 29.329 og US-patentskrift 4.460.765 som SANK 63479 og som ble deponert den 9. oktober 1979 hos Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Japan, tilgjengelig under deponeringsbetegnelsen FERM P-5223.

Som kjent er egenskapene ti Actinomycetes-stammer, inklu-sivt Streptomyces-stammer, ikke uforanderlige, og de undergår lett mutasjon både av naturlige årsaker og som et resultat av kunstig mutasjon. Selv om fremstillingen av 7'-deoksygriseolsyre er beskrevet særlig ved dyrking av den ovenfor angitte stamme STreptoimyces griseoaurantiacus, er også anvendelsen av mutanter av denne organisme og generelt av enhver Streptomyces-stamme som er i stand til å danne 7'-deoksygriseolsyre mulig.

Dyrkingen av den 7'-deoksygriseolsyre-dannende mikroorganisme ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan utføres under de betigelser som vanligvis anvendes for dyrkingen av Actinomycetes-stammer, f.eks. slik som generelt beskrevet i ovennevnte US-patentskrift 4.460.765. Rystet kultur i et væskeformet medium eller dyrking i fast tilstand foretrekkes. Men detaljerte variasjoner i de betingelser som er grovt beskrevet nedenfor er mulig for å favorisere dannelsen av griseolsyre i forhold til 7•-deoksygriseolsyre eller omvendt.

Næringsmediet som anvendes for dyrkingen kan være et materiale som vanligvis anvendes for dyrkingen av Actinomycetes. Således vil det inneholde en assimilerbar karbonkilde og en assimilerbar nitrogenkilde. Egnete assimilerbare karbonkilder omfatter: en konsentrert løsning av et sukker, f.eks. sukrose og/eller invertsukker eiler en blanding av sukrose og et annet sukker som glukose eller kornsirup, stivelse, dekstrose, mannitol, fruktose, galaktose eller ramnose eller en blanding av to eller flere av disse. Nitrogenkilden kan være en organisk eller uorganisk forbindelse, f.eks. ammoniumklorid, ammonium-sulfat, urea, ammoniumnitrat eller natriumnitrat, eller nøytrale produkter som pepton, kjøttekstrakt, gjærekstrakt, tørrgjær, levende gjær, kornstøpevæske, soyamel, kasaminosyre eller løselige vegetabilske proteiner. En eneste slik nitrogenkilde eller en blanding av to eller flere kan anvendes. Dessuten kan næringsmediet også inneholde uorganiske salter, såsom kalium-klorid, kalsiumkarbonat eller fosforsyresalter, eventuelt sammen med andre organiske eller uorganiske substanser for å fremme veksten av mikroorganismen eller dens produksjon av 7<*->deoksygriseolsyre .

Dyrkingsmetoden kan være dyrking med væskeformet medium, med frem- og tilbakegående eller roterende rysting, eller dyrking med fast medium, hvorved en metode med dyrking under dyp omrøring er særlig foretrukket. Selv om mikroorganismen vil vokse i et bredt temperaturområde foretrekkes det særlig å utføre dyrkingen ved en temperatur på fra 20 til 35°C og ved en stort sett nøytral pH-verdi. Når det utføres dyrking i et væskeformet medium utføres dyrkingen vanligvis i et tidsrom på fra 48 timer til 120 timer, hvorved 7'-deoksygriseolsyren dannes og konsentreres i dyrkingsmediet. Fremskridelsen av dyrkingen kan overvåkes og innholdet av 7 *-deoksygriseolsyre i mediet estimeres ved bestemmelse av mediets enzyminhiberende aktivitet. Etter fullføring av dyrking i dyp væske vil dyrkingsmediet generelt oppvise en inhiberende aktivitet på fra 70 til 85%.

Forbindelsene fremstilt ved analogifremgangsmåten ifølge oppfinnelsen har forskjellige verdifulle farmakologiske virkninger. Således oppviser de lavere toksisitet, en markert evne til å inhibere virkningen av PDE, både cAMP PDE og cGMP (cyklisk guanosinmonofosfat) PDE, de øker blodviskositeten, og kombinert med midler mot kreft eller insulin øker de disses virkning. Nevnte virkninger er illustrert nedenfor.

Forbindelsene ifølge oppfinnelsen identifiseres med numrene de har i den ovenfor angitte liste.

Ved testing av toksisitet var de testede forbindelser griseolsyre og forbindelse nr. 4 i listen av forbindelser ifølge oppfinnelsen angitt ovenfor. Testdyrene var hannrotter av Fisher-stammen. Rottene ble anvendt i grupper på fem i hver test.

De testede forbindelser ble administrert i en eneste daglig dose på 50 mg/kg eller 100 mg/kg de fire dagene testen varte. I en dose på 50 mg/kg oppviste den testede forbindelse en dødelig-het på 0/5 ved slutten av testen, dvs. at av fem rotter i hver testgruppe døde ingen. Ved en dose på 100 mg/kg var dødeligheten forårsaket av griseolsyre 3/5 (0/5 de første to dager og 3/5 etter dag 3). Dødeligheten for forbindelse nr. 4 ved 100 mg/kg var 0/5 ved slutten av testen, dvs. ingen dødelighet.

Disse resultater antyder at forbindelsen ifølge oppfinnelsen sannsynligvis er mindre toksiske enn griseolsyre.

For testing av fosfordiesterase (PDE) inhiberende virkning ble forbindelsene nr. 1-6 og 14 i den ovennevnte liste testet, sammen med teofyllin som en sammenlikning.

Testen ble utført stort sett ved metoden til A.L. Pichard og Y.U. Chung (Journal of Biological Chemistry, Vol. 251, 1976, p. 5726-5737). En ubearbeidet enzymatisk løsning fra rottehjerner ble anvendt som kilde for cAMP PDE.

14

C-merket cAMP ble anvendt som substrat. Dette ble anvendt i en 0,2 M tris-saltsyrebufferløsning (pH 8,0) i en mengde som var tilstrekkelig til å frembringe en sluttkonsentrasjon på 0,14 Hm. "Tris" er tri(hydroksymetyl)aminometan. Substratløsningen ble blandet med en egnet mengde av forbindelsen som skulle testes

løst i 2-5 (il dimetylsulfoksyd og med 20 ul slangegiftløsning og 40 ul ubehandlet enzymløsning. Tilstrekkelig tris-saltsyrebuffer ble tilsatt for å danne et totalvolum på 100 ul. Blandingen fikk reagere ved 30°C i 20 minutter. Ved slutten av dette tidsrom ble reaksjonsblandingen behandlet med en "Amberlite" IRP-58 harpiks, og graden av gjenværende adenosin-radioaktivitet i produktet ble bestemt. Forsøket ble utført ved forskjellige konsentrasjons-nivåer av hver aktiv forbindelse, og ut fra dette ble verdiene for 50% inhibering (Igg) beregnet.

Forsøket ble gjentatt med unntagelse av at cyklisk guanosinmonofosfat (cGMP) ble anvendt som substrat istendenfor cAMP. I (.Q-verdien mot cGMP PDE ble også beregnet.

Resultatene er vist i tabell I, hvor Ij-g-verdiene er angitt i umol.

Den kjente forbindelse som ble anvendt som sammenlikning var teofyllin, som er kjent for å inhibere både cAMP PDE og cGMP PDE og som anvendes terapeutisk for dette formål. Den minst effektive av forbindelsene fremstilt ved analogifremgangsmåten ifølge oppfinnelsen som ble testet hadde en I^Q-verdi som var ca. en størrelsesorden mindre enn den tilsvarende verdi for teofyllin, mens den mest effektive av de forbindelser som er blitt testet hadde en I^Q-verdi på 2-3 størrelsesordener lavere, noe som indikerer at virkningene til forbindelsene som PDE-inhibi-torer er særlig sterke.

Ved undersøkelse av bedring av blodviskositeten var testdyrene Wistar-hannrotter. De ble anvendt i grupper på fem i hver test. Rottene ble bedøvet med pentobartibal, og samtidig ble testforbindelsen administrert oralt i den dose som er angitt i tabell 5 i karboksymetylcellulosesuspensjon. Det ble umiddelbart gjort et innsnitt i nakken, og en 0,5 ml blodprøve ble oppsamlet fra halsblodåren. Viskositeten til denne prøve ble bestemt ved hjelp av et rotasjonsviskosimeter. 30 minutter etter oral administrering ble en felles hals-pulsåre underbundet tosidig. En time deretter (dvs. 90 minutter etter den orale administrering), ble en ytterligere 0,5 ml blod-prøve oppsamlet fra halsblodåren, og dets viskositet ble bestemt på samme måte.

Den gjennomsnittlige blodviskositet hos hvert testdyr og dens standard avvikelse ble beregnet for hver av fire skjærhastigheter (37,5, 75, 150 og 375 s"<1>) for rotasjonsviskosi-meteret. Verdiene i hver gruppe før og etter underbinding (dvs. forandringen over et tidsrom på 60 minutter) ble analysert ved hjelp av den statistiske t-test. Resultatene er angitt i tabell 5 på følgende måte: For hver skjærhastighet hvor det ikke ble iakttatt noen vesentlig økning i blodtrykket (P<0,05) mellom verdiene før og etter underbinding er det anført et eneste plusstegn (+). Dersom det således ikke var noen vesentlig forskjell i visositeten mellom verdiene før og etter under-bindingen ved noen av de fire skjærhastigheter, vil resultatene være ++++. Parallelt med disse forsøk ble det utført et identisk forsøk med unntagelse av at det til testdyrene ble administrert en karboksymetylcelluloseløsning som ikke inneholdt noen aktiv forbindelse. Resultatene for denne testgruppe viste en vesentlig økning i blodviskositeten ved hver av de fire skjærhastigheter.

Som det kan sees i tabell 5 ble det oppnådd en vesentlig bedring (dvs. stabilisering) i blodvisositeten, og med forbindelse nr. 2 i doser på ikke under 50 mg/kg.

Forbindelsene ifølge oppfinnelsen kan følgelig anvendes som terapeutiske midler til forskjellige sirkulasjonsforstyrrelser i hjernen, såsom følgesykdommer av hjerneblødning og hjerneinfarkt. Forbindelsene ifølge oppfinnelsen kan administreres oralt eller ikke-oralt (f.eks. ved subkutan eller intramuskulær injeksjon).

Forbindelsene ifølge oppfinnelsen kan administreres oralt i form av faste preparater som om nødvendig inneholder forskjellige konvensjonelle tilsetningsmidler. Slike tilsetningsmidler omfatter spedningsmidler som sukker og cellulosepreparater, binde-midler som stivelse, gummi og metylcellulose, samt desintegre-rende midler. Doseringen vil avhenge av symptomene, alderen og kroppsvekten til pasienten. F.eks. vil for en voksen human pasient en egnet daglig dose være fra 0,1 til 100 mg aktiv forbindelse, som kan administreres i en eneste dose eller i delte doser.

Fremstillingen av de forskjellige forbindelser som anvendes som startmaterialer (eks. 1-11) og forbindelsene (eks. 12-26) fremstilt ved analogifremgangsmåten ifølge oppfinnelsen vil bli belyst i de etterfølgende eksempler.

Eks. 1- 11. Startmaterialer.

Eksempel 1

Dibenzhydrylgriseolat

10 g griseolsyre ble suspendert i en blanding av 400 ml aceton og 50 ml vann. Til denne blanding ble det tilsatt en løsning av 15,4 g difenyldiazometan i 100 ml aceton, og blandingen ble omrørt i 16 timer ved romtemperatur. Reaksjonsproduktet ble deretter dråpevis tilsatt til 2 1 heksan. Den resulterende pulveraktige substans ble oppsamlet ved filtrering og deretter vasket med 500 ml heksan og tørket ved 55-56°C i 10 timer under et trykk på 1-2 mm Hg (100-250 Pa), noe som ga 17,95 g (utbytte 95,6%) av tittelforbindelsen som et hvitt pulver.

UV-spektrum (metanol)

x , nm (c): 258 (11200).

maks

NMR-spektrum (heksadeuterert dimetylsulfoksyd) ppm:

4,68 (1H, dublett, J=6, 0Hz),

4,93 (1H, singlett),

5,27 (1H, dublett, J=3, 0Hz),

6,35 (1H, dublett av dubletter, J=3,0 & 6,0Hz),

6,58 (1H, singlett),

8,18 (1H, singlett),

8,37 (1H, singlett).

Eksempel 2

Dimetylgriseolat

(a) Under anvendelse av diazometan

700 mg griseolsyre ble lost i 100 ml iskjølt dimetyl-formamid. En løsning av 1,0-1,2 mmol diazometan i 1 ml dietyleter ble deretter tilsatt til den resulterende løsning under omrøring inntil blandingen antok en gulaktig farge. Blandingen fikk deretter reagere i 10 minutter. Etter fullføring av reaksjonen ble eddiksyre tilsatt til reaksjonsproduktet inntil dette hadde mistet sin farge. Blandingen ble deretter inndampet til tørr tilstand under senket trykk. Det tørkete produkt ble løst i metanol, og den resulterende løsning ble filtrert. Filtratet ble inndampet til tørr tilstand under senket trykk. Det tørkete produkt ble rekrystallisert fra vann, hvorved det ble oppnådd et utbytte på 540 mg av tittelforbindelsen.

(b) Via blandete syreanhydrider

1,14 g griseolsyre ble suspendert i 20 ml metanol. 1,39 ml benzoylklorid ble tilsatt under kjøling med is til løsningen, som ble hensatt ved romtemperatur i 16 timer. Løsningsmidlet ble deretter avdampet under senket trykk, og den resulterende test ble behandlet med dietyleter, hvorved det ble dannet et hvitt, fast materiale som ble oppsamlet ved filtrering og løst i litt vann. pH i denne blanding ble regulert til en verdi på 7. Den resulterende blanding ble oppbevart i et kjøleskap natten over. De utfelte krystaller ble oppsamlet ved filtrering i et utbytte på 1,0 8 g av den ønskete forbindelse.

UV-spektrum (metanol)

<x>maks nm (f); 258 (15600}-

NMR-spektrum (heksadeuterert dimetylsulfoksyd) ppm:

4,60 (1H, dublett, J=6, 0Hz),

4,66 (1H, singlett),

5,12 (1H, dublett, J=3, 0Hz),

6,06 (1H, dublett av dubletter, J=3, 0Hz),

6,53 (1H, singlett),

8,33 (1H, singlett),

8,37 (1H, singlett).

Eksempel 3

Dimetyl- 0 , 0 - diacetylgriseolat

Dimetylgriseolat (fremstilt som beskrevet i eksempel 2) løst i vannfri pyridin ble omsatt med et egnet syreanhydrid som acetyleringsmiddel, ble hensatt ved romtemperatur og beskyttet mot fuktighet. Reaksjonsproduktet ble avkjølt, tilsatt vann og omrørt ved romtemperatur, hvoretter løsningsmidlet ble avdestillert. Resten ble løst i etylacetat/vann hvoretter etylacetatsjiktet ble fraskilt og vasket i fortynnet saltsyre, vann vann-løsning av natriumhydrogenkarbonat samt en mettet vannløsning av NaCl. Den organiske løsning ble fraskilt og tørket over vannfri MgSO^. Løsningsmidlet ble avdestillert for dannelse av en rest som så ble løst i en liten mengde metylenklorid + etanol. Løsningsmidlet ble deretter avdestillert for dannelse av en pulveraktig substans som så ble oppsamlet til dannelse av tittelforbindelsen. En prøve for analyse ble oppnådd ved lyofilisering med benzen og rensing med silikagel-søylekroma-tografi under eluering med en 10 volumprosentlig løsning av aceton i benzen.

UV-spektrum (metanol) \ maks nm (e): 257 (17100). NMR-spektrum (heksadeuterert dimetylsulfoksyd) ppm:

5,17 (1H, dublett, J=3, 0Hz),

5,66 (1H, dublett, J=6, 0Hz),

5,73 (1H, singlett),

6,31 (1H, dublett av dubletter, J=3,0 & 6,0 Hz),

6,89 (1H, singlett),

8,23 (1H, singlett),

8.36 (1H, singlett).

Eksempel 4

~*~~——2' 7'

Dibenzhydryl- 0 , 0 - diacetylgriseolat

1.37 g dibenzhydrylgriseolat (fremstilt som beskrevet i eksempel 1) ble suspendert i 20 ml pyridin. 0,94 ml eddiksyre-anhydrid ble tilsatt under kjøling med is, og blandingen ble omrørt mens den ble beskyttet mot fuktighet. Etanol ble tilsatt til reaksjonsproduktet under kjøling med is, og blandingen ble omrørt i 30 minutter. Resten som ble oppnådd ved destillasjon av løsningsmidlet fra reaksjonsproduktet under senket trykk ble løst i 30 ml kloroform, og løsningen ble vasket med vann. Det orga-

niske sjikt ble fraskilt, og løsningsmidlet ble avdestillert under senket trykk. Den resulterende rest ble deretter renset ved preparativ tynnsjiktskromatografi under anvendelse av benzen som inneholdt 10 volumprosent metanol som fremkallingsløsningsmiddel, og deretter lyofilisert fra benzen, hvorved det ble oppnådd 936 mg av tittelforbindelsen i form av et hvitt fast stoff.

UV-spektrum (metanol) xmaks nm (e): 257 (15400). NMR-spektrum (heksadeuterert dimetylsulfoksyd) ppm:

5.28 (1H, dublett, J=3, 0Hz),

5,70 (1H, dublett, J=6, 0Hz),

5,98 (1H, singlett),

6,60 (1H, dublett av dubletter, J=3,0 & 6,0Hz),

6,92 (1H, singlett),

8,13 (1H, singlett),

8,35 (1H, singlett).

Eksempel 5

2 • 7 •

Dibenzhydryl- 0 , 0 - diacetyl- 6- desamino- 6- hydroksygriseolat

Debenzhydryl-0 ,0 -diacetylgriseolat (fremstilt som beskrevet i eksempel 4 ble med litt oppvarming løst i eddiksyre, og deretter ble det tilsatt vann. Oksygenet i reaksjonsbeholderen ble erstattet med nitrogen under kjøling med, og natriumnitritt ble deretter tilsatt litt etter litt uten omrøring. Blandingen ble hensatt natten over med beholderen godt lukket. Vann ble deretter tilsatt til reaksjonsproduktet, og løsningsmidlet ble avdestillert. Dette ble gjentatt, og bunnfallet ble oppsamlet ved filtrering og grundig vasket med vann til dannelse av tittelforbindelsen.

UV-spektrum (metanol) xmaks nm (e): 242 (12300), 250

(11100), 270 skulder (4000).

NMR-spektrum (heksadeuterert dimetylsulfoksyd) ppm:

5,35 (1H, dublett, J=3, 0Hz),

5,66 (1H, dublett, J=6, 0Hz),

5,97 (1H, singlett),

6,32 (1H, dublett av dubletter, J=3,0 & 6,0 Hz),

6,79 (1H, singlett),

8,00 (1H, singlett),

8.29 (1H, singlett).

Eksempel 6

—————- _ i 71

Dimetyl- 0 , 0 - diacetyl- 6- desamino- 6- hydroksygriseolat

1,82 g dimetyl-0 2 • ,0 7'-diacetylgriseolat (fremstilt som beskrevet i eksempel 3) ble løst i en 80 prosentig vekt/volum vandig løsning av eddiksyre. 2,55 g natriumnitritt ble tilsatt til den resulterende løsning under kjøling med is, og blandingen ble hensatt i 16 timer i en tett lukket beholder. På dette stadium viste det seg ved tynnsjiktskromatografi at noe utgangs-materiale fremdeles var til stede, og av den grunn ble det tilsatt ytterligere 1 g natriumnitritt, og løsningen fikk stå i 3 timer. Resten som ble oppnådd ved avdestillering av løsnings-midlet under senket trykk ble løst i aceton, hvortil det først ble tilsatt toluen som deretter ble avdestillert. Denne fremgangsmåte ble gjentatt tre ganger.

Resten ble løst i en blanding av vann og kloroform. Det

organiske sjikt ble vasket med en vandig løsning av natriumhydrogenkarbonat og deretter med en mettet vandig løsning av natriumklorid, og tørket over vannfritt magnesiumsulfat. Løsningsmidlet ble avdestillert, hvorved det dannet seg en lysebrun, glassaktig substans. Denne substans ble renset ved silikagelsøylekromato-grafi og deretter løst i litt aceton hvortil det deretter ble tilsatt benzen, og blandingen fikk stå. De resulterende hvite krystaller ble oppsamlet ved filtrering til dannelse av 1,28 g av tittelforbindelsen i form av hvite krystaller.

UV-spektrum (50 volumprosentig vandig metanol) x maks nm

243 (12700), 248 (skulder 812500), 275 skulder (4300). NMR-spektrum (heksadeuterert dimetylsulfoksyd) ppm:

5,22 (1H, dublett, J=3, 0Hz),

5,62 (1H, dublett, J=6, 0Hz),

5,73 (1H, singlett),

6,13 (1H, dublett av dubletter, J=3,0 & 6,0Hz),

6,88 (1H, singlett),

8,18 (1H, singlett),

8,34 (1H, singlett).

Eksempel 7

2' 7 •

Dimetyl-0 ,0 -diacetyl-6-klor-6-desaminogriseolat

a ——

492 mg dimetyl-0 ,0 -diacetyl-6-desamino-6-hydroksygriseolat (fremstilt som beskrevet i eksempel 6) ble suspendert i 10 ml etylacetat. 10 ml fosforoksyklorid ble tilsatt til suspensjonen, etterfulgt av 0,24 ml N,N-dietylanilin. Blandingen ble kokt med tilbakeløp under beskyttelse mot fuktighet. Løsnings-midlet ble avdestillert under senket trykk, og etylacetat ble tilsatt til resten og deretter avdestillert. Denne fremgangsmåte ble gjentatt tre ganger. Resten ble løst i 20 ml etylacetat, og løsningen ble vasket med en mettet vandig løsning av natriumhydrogenkarbonat og deretter med en mettet vandig løsning av natriumklorid. Det organiske sjikt ble tørket over vannfritt magnesiumsulfat, og løsningsmidlet ble avdestillert. Den resulterende rest ble renset ved silikagel-kromatografi. Toppene som inneholdt tittelsubstansen ble oppsamlet og konsentrert. Resten ble lyofilisert fra benzen, hvorved det ble oppnådd 482 mg av tittelforbindelsen.

UV-spektrum (metanol) >>maks ™ (O: 247 (7500), 262 (8700). NMR-spektrum (heksadeuterert dimetylsulfoksyd) ppm:

5,28 (1H, dublett, J=3, 0Hz),

5,73 (1H, dublett, J=6, 0Hz),

5,76 (1H, singlett),

6,21 (1H, dublett av dubletter, J=3,0 & 6,0Hz),

7,06 (1H, singlett),

8,92 (2H, singlett).

Eksempel 8

2' 7'

Dibenzhydryl- 0 , 0 - diacetyl- 6- klor- 6- desaminogriseolat 120 ml etylacetat (tørket med en molekylsikt) ble tilsatt 2' 7'

til 12,2 g dibenzhydryl-0 ,0 -diacetyl-6-desamino-6-hydroksygriseolat (fremstilt som beskrevet i eksempel 5), etterfulgt av 120 ml fosforoksyklorid og 3,66 ml N,N-dietylanilin, og blandingen ble kokt med tilbakeløp i 3 timer med oppvarming. Løsnings-midlet ble avdestillert, og resten ble løst i en blanding av etylacetat og vann. Etylacetatsjiktet ble fraskilt og vasket først med fortynnet saltsyre og deretter med en mettet vandig løsning av natriumklorid. Løsningen ble deretter tørket over

vannfritt magnesiumsulfat. Løsningsmidlet ble avdestillert, og resten ble renset ved silikagel-søylekromatografi, hvorved det ble oppnådd et utbytte på 10,2 g av tittelforbindelsen.

UV-spektrum (metanol) xmaks nm (e): 247 (7700), 258 skulder

(8400), 263 (9000).

NMR-spektrum (heksadeuterert dimetylsulfoksyd) ppm:

5.40 (1H, dublett, J=3, OHz),

5,76 (1H, dublett, J=6, OHz),

6,01 (1H, singlett),

6.41 (1H, dublett av dubletter, J=3,0 & 6,OHz),

7.07 (1H, singlett),

8,72 (1H, singlett),

8,87 (1H, singlett).

Eksempel 9

2"1 7'

0 , 0 - diacetyl- 6- klor- 6- desaminogriseolsyre 1.8 ml etylacetat, 180 ml fosforoksyklorid og 5,4 ml

2' 7' N,N-dietylanilin ble tilsatt til 18 g dibenzhydryl-0 ,0 diacetyl-6-desamino-6-hydroksygriseolat (fremstilt som beskrevet i eksempel 5), og blandingen ble kokt med tilbakeløp i 20 minutter ved oppvarming. Løsningsmidlet ble deretter avdestillert, og etylacetat og vann ble tilsatt til resten. Etylacetatsjiktet ble fraskilt og ekstrahert to ganger, hver gang med en 20 prosentig vekt/volum vandig løsning av natriumhydrogenkarbonat. Det vandige sjikts pH ble regulert til en verdi på 2, og det resulterende bunnfall ble oppsamlet ved filtrering, hvorved det ble oppnådd 6,9 g av tittelforbindelsen (utbytte 63%). Natriumklorid ble tilsatt til filtratet inntil løsningen var mettet, og filtratet ble deretter ekstrahert to ganger med etylacetat, hvorved det ble oppnådd ytterligere 2,4 g av tittelforbindelsen.

UV-spektrum (50 volumprosentig vandig metanol) x maks nm (e): 246,5 (7400), 262 (8700).

NMR-spektrum (heksadeuterert dimetylsulfoksyd) ppm:

5,23 (1H, dublett, J=3, OHz),

5,68 (1H, singlett),

5,72 (1H, dublett, J=6, OHz),

6,17 (1H, dublett av dubletter, J=3,0 & 6,OHz),

7,01 (1H, singlett),

8,91 (2H, singlett).

Eksempel 10

Dibenzhydryl- 6- klor- 6- desaminogriseolat

150 ml av en 20 prosentig vekt/volum metanolisk løsning av 21 71

ammoniakk ble tilsatt til 5 g dibenzhydryl-0 ,0 -diacetyl-6-klor-6-desaminogriseolat (fremstilt som beskrevet i eksempel 8), og blandingen ble omrørt i 50 minutter. Løsningsmidlet ble deretter avdestillert ved en meget lav temperatur, og resten ble renset ved søylekromatografi, hvorved det ble oppnådd 3,7 g av tittelforbindelsen.

UV-spektrum (metanol) x ma. ksnm (e): 247 skulder (9100), 258 skulder (9300), 263 (9800).

NMR-spektrum (heksadeuterert dimetylsulfoksyd) ppm:

4,72 (1H, bred triplett),

4,94 (1H, dublett, J=9, 9Hz),

5,38 (1H, dublett, J=3, OHz),

6,17 (1H, dublett av dubletter, J=3,0 & 6,OHz),

6,81 (1H, singlett),

8,79 (1H, singlett),

8,91 (1H, singlett).

Eksempel 11

6- klor- 6- desaminogriseolsyre

3,7 g dibenzhydryl-6-klor-6-desaminogriseolat (fremstilt som beskrevet i eksempel 10) ble løst i 25 ml anisol, og deretter ble det tilsatt 25 ml trifluoreddiksyre under kjøling med is. Blandingen ble deretter hensatt ved romtemperatur. Løsningsmidlet ble avdestillert. En blanding av aceton og toluen ble tilsatt til resten og avdestillert. Dette ble gjentatt. Resten ble løst i

litt aceton, og denne løsning ble helt i 300 ml heksan til dannelse av en pulveraktig substans. Denne substans ble løst i en 20 prosentig vekt/volum vandig løsning av natriumhydrogenkarbonat, og den resulterende løsnings pH ble regulert til 2 med 3N saltsyre. Løsningen ble renset ved kromatografi ved omvendt fase under anvendelse av en Merck Rp-8 forhåndspakket søyle, hvorved det ble oppnådd 1,46 g av tittelforbindelsen.

UV-spektrum (H20) xmaks ™ (e): 250 skulder (7200), 263

(9200) .

NMR-spektrum (heksadeuterert dimetylsulfoksyd) ppm:

4,21 (1H, singlett),

4.59 (1H, dublett, 3=6, OHz),

4,96 (1H, dublett, J=3, OHz),

5.87 (1H, dublett av dubletter, J=3,0 & 6,OHz),

6,58 (1H, singlett),

8.88 (2H, singlett).

Eks. 12- 26. Forbindelsene fremstilt ved analogifremgangsmåten ifølge oppfinnelsen.

Eksempel 12

6- desamino-6-metoksygriseolsyre (forbindelse nr. 1)

ST

408 g dimetyl-0 ,0 -diacetyl-6-klor-6-desaminogriseolat (fremstilt som beskrevet i eksempel 7) ble suspendert i 16 ml vannfri metanol, og blandingen ble avkjølt til en temperatur på mellom -20 og -10°C. En IN metanolisk løsning av natriummetoksyd ble deretter tilsatt, og blandingen ble omrørt i 2-2% time mens temperatur ble holdt under 0°C. Løsningsmidlet ble deretter avdestillert, og 4 ml vann ble tilsatt. Blandingen ble omrørt i 3 timer ved romtemperatur, og dens pH ble regulert til 2 med 3N saltsyre. De utfelte krystaller ble oppsamlet ved filtrering, hvorved det ble oppnådd 251 mg (79,7%) av tittelforbindelsen.

UV-spektrum (H20) Xmaks nm (e): 246 (12700).

NMR-spektrum (heksadeuterert dimetylsulfoksyd) ppm:

4,53 (1H, singlett),

4,63 (1H, dublett, J=6, OHz),

5,13 (1H, dublett, J=3, OHz),

6,03 (1H, dublett av dubletter, J=3,0 & 6,OHz),

6.60 (1H, singlett),

8.61 (1H, singlett),

8,63 (1H, singlett).

Eksempel 13

6-desamino-6-merkaptogriseolsyre (forbindelse nr. 2)

, jT E

1,0 g O ,0 -diacetyl-6-klor-desaminogriseolsyre (fremstilt som beskrevet i eksempel 9) ble løst i 30 ml dimetylforma-mid. Luften i reaksjonsbeholderen ble erstattet med nitrogen, og deretter ble 1,5 g natriumhydrogensulfid tilsatt til løsningen. Blandingen ble omrørt natten over ved romtemperatur. Blandingen, under en strøm av nitrogengass, ble surgjort med konsentrert

saltsyre, deretter ble løsningsmidlet avdestillert. 20 ml av en IN vandig løsning av natriumhydroksyd ble tilsatt til resten, og blandingen fikk stå natten over ved romtemperatur. Løsningens pH ble deretter regulert til en verdi på 2 med konsentrert saltsyre, hvoretter blandingen ble renset ved kromatografi med omvendt fase gjennom en Rp-8 forhåndspakket søyle (Merck), hvorved det ble oppnådd 0,44 g av tittelforbindelsen.

UV-spektrum (H20) x makg nm (c): 321 (20300).

NMR-spektrum (heksadeuterert dimetylsulfoksyd) ppm:

4,51 (1H, singlett),

4.58 (1H, dublett, J=6, OHz),

5,14 (1H, dublett, J=3, OHz),

5,81 (1H, dublett av dubletter, J=3,0 & 6,OHz),

6.51 (1H, singlett),

8,30 (1H, singlett),

8,50 (1H, singlett).

Eksempel 14

6- desamino- 6- hydrazinogriseolsyre ( forbindelse nr. 3)

1,0 g 6-klor-desaminogriseolsyre (fremstilt som beskrevet i eksempel 11) ble løst i 120 ml metanol. 1,85 ml hydrazinhydrat ble tilsatt til løsningen, og blandingen bie omrørt ved romtemperatur i 15-20 timer. Løsningsmidlet ble deretter avdestillert, og pH i resten ble regulert til en verdi på 2 med 3N saltsyre. Løsningen ble renset ved kromatografi med omvendt fase gjennom en Rp-8 forhåndspakket søyle (Merck), hvorved det ble oppnådd 0,5 g av tittelforbindelsen (utbytte 50,7%).

UV-spektrum (H20) xmaks nm (e): 265 (15500).

4,50 (1H, singlett),

4.59 (1H, dublett, J=6, OHz),

5,09 (1H, dublett, J=3, OHz),

6,05 (1H, dublett av dubletter, J=3,0 & 6,OHz),

6.52 (1H, singlett),

8,34 (1H, singlett),

8,37 (1H, singlett).

Eksempel 15

N - metylgriseolsyre ( forbindelse nr. 4)

2,5 g 02',07'-diacetyl-6-klor-6-desaminogriseolsyre (fremstilt som beskrevet i eksempel 9) ble løst i 20 ml metanol. 4 ml av en 40 prosentig vekt/volum metanolisk løsning av metyl-amin ble tilsatt til den resulterende løsning, og blandingen ble omrørt i 5 timer ved romtemperatur. Løsningsmidlet ble deretter avdestillert, og 20 ml av en IN vandig løsning av natriumhydroksyd ble tilsatt til resten. Blandingen ble hensatt natten over ved romtemperatur. Blandingens pH ble regulert til 2 med konsentrert saltsyre, og blandingen fikk stå natten over på et kaldt sted. De utfelte krystaller ble oppsamlet ved filtrering, hvorved det ble oppnådd 1,45 g av tittelforbindelsen.

UV-spektrum (H20) amak nm (e): 265 (17200).

NMR-spektrum (heksadeuterert dimetylsulfoksyd) ppm:

4.52 (1H, singlett),

4,60 (1H, dublett, J=6, OHz),

5.10 (1H, dublett, J=3, OHz),

6,08 (1H, dublett av dubletter, J=3,0 & 6,OHz),

6.53 (1H, singlett),

8,31 (1H, singlett),

8,35 (1H, singlett).

Fremgangsmåten som er beskrevet i eksempel 15 ble gjentatt med unntagelse av at metylaminet ble erstattet med andre aminer til fremstilling av forbindelsene ifølge eksemplene 16-24.

Eksempel 16

N , N - dimetylgriseolsyre ( forbindelse nr. 5)

UV-spektrum (H.,0) x maks nm (e): 273 (19800).

NMR-spektrum (heksadeuterert dimetylsulfoksyd) ppm:

4.52 (1H, singlett),

4,58 (1H, dublett, J=6, OHz),

5.11 (1H, dublett, J=3, OHz),

6,02 (1H, dublett av dubletter, J=3,0 & 6,OHz),

6.53 (1H, singlett),

8,30 (1H, singlett),

8,38 (1H, singlett).

Eksempel 17

N - benzylgriseolsyre ( forbindelse nr. 6)

UV-spektrum (50 volumprosentig vandig metanol)\ ma^ s nm (e): 267 (22000).

NMR-spektrum (heksadeuterert dimetylsulfoksyd) ppm:

4.53 (1H, singlett),

4,61 (1H, dublett, J=6, OHz),

5,10 (1H, dublett, J=3, OHz),

6,07 (1H, dublett av dubletter, J=3,0 & 6,OHz), 6.54 (1H, singlett),

8,30 (1H, singlett),

8,40 (1H, singlett).

Eksempel 18

N - fenetylgriseolsyre ( forbindelse nr. 7) UV-spektrum (50 volumprosentig vandig metanol) xmaks nm (e): 268 (18400).

NMR-spektrum (heksadeuterert dimetylsulfoksyd) ppm:

4.55 (1H, singlett),

4,59 (1H, dublett, J=6, OHz),

5,10 (1H, dublett, J=3, OHz),

6.04 (1H, dublett av dubletter, J=3,0 & 6,OHz), 6.50 (1H, singlett),

8.29 (1H, singlett),

8,33 (1H, singlett).

Eksempel 19

N - a- naftylmetylgriseolsyre ( forbindelse nr. 8) UV-spektrum (50 volumprosentig vandig metanol) x _v nm

mc* jc s (e): 271 (23200), 280 (22600), 293 skulder (12500). NMR-spektrum (heksadeuterert dimetylsulfoksyd) ppm:

4,44 (1H, singlett),

4,59 (1H, dublett, J=6, OHz),

5.05 (1H, dublett, J=3, OHz),

6,03 (1H, dublett av dubletter, J=3,0 & 6,OHz), 6.51 (1H, singlett),

8.30 (1H, singlett),

8,38 (1H, singlett).

Eksempel 20

6- desamino- 6- piperidinogriseolsyre ( forbindelse nr. 9) UV-spektrum (H20) Xmaks nm (e): 280 (21100). NMR-spektrum (heksadeuterert dimetylsulfoksyd) ppm:

4,52 (1H, singlett),

4.58 (1H, dublett, J=6, OHz),

5,11 (1H, dublett, J=3, OHz),

6,02 (1H, dublett av dubletter, J=3,0 & 6,OHz), 6.52 (1H, singlett),

8,29 (1H, singlett),

8,36 (1H, singlett).

Eksempel 21

6- desamino- 6- morfolinogriseolsyre ( forbindelse nr. 10) UV-spektrum, (H2<0>) <x>maks nm (e): 279.(21900). NMR-spektrum (heksadeuterert dimetylsulfoksyd) ppm:

4,51 (1H, singlett),

4,57 (1H, dublett, J=6, OHz),

5,11 (1H, dublett, J=3, OHz),

6,01 (1H, dublett av dubletter, J=3,0 & 6,OHz), 6.53 (1H, singlett),

8,33 (1H, singlett),

8,40 (1H, singlett).

Eksempel 22

N - fenylgriseolsyre ( forbindelse nr. 11) UV-spektrum (50 volumprosentig vandig metanol) x maks nm (e): 291 (21700).

NMR-spektrum (heksadeuterert dimetylsulfoksyd) ppm:

4.54 (1H, singlett),

4,66 (1H, dublett, J=6, OHz),

5,14 (1H, dublett, J=3, OHz),

6,10 (1H, dublett av dubletter, J=3,0 & 6,OHz), 6.59 (1H, singlett),

8,46 (1H, singlett),

8,56 (1H, singlett).

Eksempel 23

N -( 2- hydroksyetyl) griseolsyre ( forbindelse nr. 12) UV-spektrum (H20) xmaks nm (e): 265 (18400).

NMR-spektrum (heksadeuterert dimetylsulfoksyd) ppm:

4,48 (1H, singlett),

4,57 (1H, dublett, J=6,0Hz),

5,08 (1H, dublett, J=3,0Hz),

6,04 (1H, dublett av dubletter, J=3,0 & 6,OHz),

6,51 (1H, singlett),

8,28 (1H, singlett),

8,36 (1H, singlett).

Eksempel 24

—

N -( 2- aminoetyl) griseolsyre ( forbindelse nr. 13) UV-spektrum (H2<0>) <x>maks nm (e): 264 (18700).

NMR-spektrum (heksadeuterert dimetylsulfoksyd) ppm:

4,15 (1H, singlett),

4,48 (1H, dublett, J=6,0Hz),

4,86 (1H, dublett, J=3,0Hz),

5,89 (1H, dublett av dubletter, J=3,0 & 6,OHz),

6,45 (1H, singlett),

8,32 (1H, singlett),

8,39 (1H, singlett).

Eksempel 2 5

6- desamino- 6- hydrogriseolsyre ( forbindelse nr. 14)

1,83 g dibenzhydryl-6-klor-6-desaminogriseolat (fremstilt som beskrevet i eksempel 10) ble løst i en 80 prosentig vekt/- volum vandig løsning av eddiksyre, og 5 g sinkpulver ble tilsatt til løsningen. Blandingen ble omrørt ved romtemperatur i 3-4 timer. Løsningsmidlet ble deretter avdestillert, og resten ble løst i en blanding av etylacetat og vann. Etylacetatsjiktet ble fraskilt og vasket med en 20 prosentig vekt/volum vandig løsning av natriumhydrogenkarbonat og deretter med en mettet vandig løsning av natriumklorid, hvoretter det ble tørket over vannfritt magnesiumsulfat. Løsningen ble filtrert og løsningsmidler ble avdestillert. Resten ble løst i en blanding av etylacetat og vann. Etylacetatsjiktet ble fraskilt og vasket med en 20 prosentig vekt/volum vandig løsning av natriumhydrogenkarbonat og der-

etter med en mettet vandig løsning av natriumklorid, hvoretter den ble tørket over vannfritt magnesiumsulfat. Løsningen ble filtrert <p>g løsningsmidlet avdestillert. Resten ble renset ved silikagelkromatografi, hvorved det ble oppnådd et utbytte på 1,9 g av dibenzhydrylesteren av tittelforbindelsen.

1,2 g av denne dibenzhydrylester ble løst i 6 ml anisol, og 6 ml trifluoreddiksyre ble tilsatt til løsning under kjøling med is. Denne blanding ble hensatt i 15 minutter, og deretter ble løsningsmidlet avdestillert. En blanding av aceton og toluen ble tilsatt til resten, og deretter ble disse løsningsmidler avdestillert. Dette ble gjentatt, og deretter ble det tilsatt litt benzen til løsningen som deretter under omrøring ble tilsatt til 200 ml heksan for å felle ut et pulver. Pulveret ble oppsamlet ved filtrering og løst i en vandig løsning av natriumhydrogenkarbonat. Den resulterende løsnings pH ble regulert til 2, hvoretter løsningen ble renset ved kromatografi med omvendt fase gjennom en Rp~8 forhåndspakket søyle (Merck), hvorved det ble oppnådd 0,5 g av tittelforbindelsen.

UV-spektrum (H20) xmaks nm (e): 262 (7300).

NMR-spektrum (heksadeuterert dimetylsulfoksyd) ppm:

4,52 (1H, singlett),

4,72 (1H, dublett, J=6,0Hz),

5,15 (1H, dublett, J=3,0Hz),

5,89 (1H, dublett av dubletter, J=3,0 & 6,OHz),

6,45 (1H, singlett),

8,32 (1H, singlett),

8,39 (1H, singlett).

Eksempel 26

—3

N - metoksygriseolsyre ( forbindelse nr. 15)

1,0 g 6-klor-6-desaminogriseolsyre (fremstilt som beskrevet i eksempel 11) ble suspendert i metanol, og deretter ble luften i reaksjonsbeholderen som inneholdt suspensjonen erstattet med

nitrogen. 2,3 g metoksyamin ble tilsatt til denne suspensjon, og blandingen fikk reagere ved 60°C i 7 timer hvoretter ytterligere 1,8 g metoksyamin ble tilsatt til blandingen, og blandingen fikk reagere ved 80°C i ytterligere 15 timer. Løsningsmidlet ble deretter avdestillert, og pH i en vandig løsning av resten ble

regulert til en verdi på 3,0. Løsningen ble deretter renset ved kromatografi med omvendt fase gjennom en Rp-8 forhåndspakket søyle, hvorved det ble oppnådd 0,28 g av tittelforbindelsen.

UV-spektrum (<H>2<<D>) <x>maks nm (e): 267 (13300). NMR-spektrum (heksadeuterert dimetylsulfoksyd) ppm:

4,25 (1H, singlett),

4,46 (1H, dublett, J=6,0Hz),

4,92 (1H, dublett, J=3,0Hz),

5,79 (1H, dublett av dubletter, J==3,0 & 6,OHz),

6,37 (1H, singlett),

7,71 (1H, singlett),

8,13 (1H, singlett).

Claims

1. Analogifremgangsmåte til fremstilling av terapeutisk aktive griseolsyrederivater med den generelle formel (I)

hvor

R <5> er et hydrogenatom eller en gruppe med formelen -OR 9, -NR10R1]- eller -SR<9>, hvor

R9 er hydrogen eller en C^-Cg-alkylgruppe, og R^° og R* er like eller forskjellige og er hver hydrogen, en C^-Cg-alkylgruppe, en C^-Cg-hydroksyalkylgruppe, en C^-Cg-aminoalkylgruppe, en fenylgruppe, en naftylgruppe, en benzylgruppe, en aminogruppe eller en C^-Cg-alkoksygruppe, eller R^ og R^ danner sammen med nitrogenatomet som de er bundet til en piperidin- eller morfolin-ring, 12 13

samt farmasøytisk akseptable salter derav, men med unntagelse av 7'(R)-griseolsyre selv og salter derav, karakterisert ved at en forbindelse med formelen (II) 12 13

hvor R og R har de ovenfor angitte betydninger, og

Z er et halogenatom a) omsettes med et passende amin, eller b) et alkoksid, eller c) natriumhydrogensulfid, eller c) hydrazin, eller d) Zn/eddiksyre, og

at om ønsket na«. r R <12> og R 1J 3ikke er hydrogen, den oppnådde forbindelse hydrolyseres.;2. Analogifremgangsmåte i samsvar med krav 1 til fremstilling av forbindelsen N^-metylgriseolsyre, karakterisert ved at det anvendes passende substituerte utgangsforbin-delser.*