DK155739B - Analogifremgangsmaade til fremstilling af bicyclomycinderivater - Google Patents

Description

1 DK 155 739 B

Den foreliggende opfindelse angår en analogifremgangsmåde til fremstilling af bicyclomycinderivater med den almene formel I

CH0 OH

II 2 I

G - C- CO

/ \ H2C |H i

Ho0 CO

0 - C- BH

I 2 hc-oit i HO-C-CH-, I \

ΠΗ-OR

2 DK 155739B

hvor 1) betegner en acylgruppe udvalgt blandt alkanoyl med 2 - 17 carbonatomer; alkanoyl med 3-8 carbonatomer, hvor der i carbon-kæden er indskudt et svovlatom; alkenoyl med 3-7 carbonatomer; benzoyl, der eventuelt er substitueret med én substituent udvalgt blandt halogen, nitro, alkyl med 1-3 carbonatomer og alk- oxy med 1-3 carbonatomer; 3,4-dimethylbenzoyl; C2_5-alkanoyl eller Cg^-alkenoyl, der hver er substitueret med phenyl, som eventuelt er substitueret med halogen, hvorhos der i alkandelens carbonkæde kan være indskudt et oxygenatom; C2_4_alkanoyl substitueret med thienyl; cyclohexylcarbonyl; og en heterocyclylcar-bonyl samt en benzenkondenseret heterocyclylcarbonyl, idet den heterocycliske ring og benzenkondenserede heterocycliske ring udvælges blandt pyridyl, furyl, tetrahydrothienyl, benzopyridyl 2 og benzofuryl; og R betegner hydrogen, eller 1 2 2) R og R er ens og betegner hver C^^-alkanoyl eller furoyl.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved, at en forbindelse med formlen II

CH9 OH

II 2 I

G - C -CO

/ \

H9C HH TT

II 1

H9C CO

0 - C -HH

HC-OH

HO-C-CH3 ch2oh omsættes med en carboxylsyre med den almene formel

R1-OH

hvor R1 har den ovenfor anførte betydning, og reaktive derivater deraf ved carboxylgruppen, og det dannede monoacylderivat med formlen I isoleres, eller, såfremt R^ betegner C3_,-_alkanoyl

3 DK 155739 B

eller furoyl, det dannede diacylderivat med formlen I isoleres.

Som eksempler på alkanoyl med 2-17 carbonatomer kan nævnes acetyl, propionyl, butyryl, isobutyryl, valeryl, isovaleryl, pivaloyl, 2-ethylbutyryl, caproyl eller palmitoyl. Som eksempler på alkenoyl med 3-7 carbonatomer kan nævnes acryloyl, methacryloyl eller crotonoyl.

Som eksempler på alkanoyl med 3-8 carbonatomer, hvor der i carbonkæden er indskudt et svovlatom, kan nævnes methylthio-acetyl og butylthioacetyl.

Som eksempler på de øvrige betydninger af substituenten kan nævnes benzoyl, toluoyl, phenylacety1, phenylpropionyl, hydra-tropoyl, cinnamoyl, phenoxyacetyl, nicotinoyl, isonicotinoyl, 2-furuoyl, benzofuroyl og thienylacetyl.

Eksempler på halogener er chlor, brom og fluor.

Eksempler på alkoxy med 1-3 carbonatomer er methoxy og ethoxy.

Som eksempler på syrer med den almene formel R^-OH kan nævnes brombenzoesyre, chlorbenzoesyre, nitrobenzoesyre, methoxybenzoe-syre, 3,4-dimethylbenzoesyre, 4-chlorkanelsyre, chlorphenylpro-pionsyre og chlorphenoxyeddikesyre.

Eksempler på de reaktive derivater af carboxylsyrerne med den almen formel III er syrehalogenider, f.eks. syrechlorider og syrebromider syreanhydrider, f.eks. syreanhydrider med alkylsvovlsyre, alkyl= phosphorsyre eller en aliphatisk eller aromatisk carboxylsyre, syre amider, f.eks. syreamider med imidazol eller syreamider med 4-sub= stitueret imidazol, syreestere, f.eks. methylestere, ethylestere, cyanmethylestere, p-nitrophenylestere osv., og syreazider. Mr man anvender carboxylsyren som den er eller i form af et salt, f.eks. natriumsaltet eller kaliumsaltet, foretrækkes det sædvanligvis at anvende et kondenseringsmiddel ved reaktionen. Eksempler på kon= denseringsmidler er NjN’-dicyclohexylcarbodiimid., polyphosphorsyre, ethylpolyphosphat og isopropylphosphat.

4 DK 155739 B

Omsætningen udføres sædvanligvis i et inert opløsningsmiddel såsom vand, acetone, dioxan, acetonitril, pyridin, chloroform, ethylaoe= tat, tetrahydrofuran, ethylendichlorid, dimethylsulfoxid, dimethyl= formamid eller dimethylacetamid. Om nødvendigt kan der være et basisk stof, f.eks. et alkalimetalcarbonat, et alkalimetalhydrogen= carbonat, en trialkylamin eller pyridin, til stede under omsætnin= gen. Reaktionstemperaturen er ikke særlig kritisk, men omsætningen udføres sædvanligvis under afkøling eller ved stuetemperatur. De acylerede forbindelser kan isoleres og renses på konventionel måde.

Ved den ifølge opfindelsen foretagne acylering kan dannes monoacyl= derivater eller diacylderivater af antibiotikum WS-4545 eller blan= dinger deraf, alt efter den mængde acyleringsmiddel, der anvendes ved reaktionen.

Ved acylering af antibiotikum WS-4545 med.ét mol acyleringsmiddel pr. mol antibiotikum dannes overvejende monoacylderivater af anti= biotikum WS-4545. Ved acylering af ét mol antibiotikum WS-4545 med omtrent to mol acyleringsmiddel dannes overvejende diacylderi= vater af antibiotikum WS-4545. I de tilfælde, hvor der fremstilles en blanding af mono-, di- og triacylderivater af antibiotikum WS-4545, kan hvert af acylderivaterne isoleres fra reaktionsblan= dingen på konventionel måde, f.eks. chromatografisk eller ved udkrystallisation.

Acyleringsreaktionen fremgår af følgende reaktionsskema:

5 DK 155739B

9¾ 9H CH? 0H

II I II I ' J - c -— co J - c --co

H9C UH H0C UH

I I _r^oh , 2| .· | H?cv m 7 h9c .co

o- C-UH - ^ 0 - C--UH

I I 2

H^-OH HC-OIT

HO-C-CH* HO-C-CH* I 3 .i 3 CH2OH CH^R1

II I

1 2 I reaktionsskemaet har R og R den ovenfor angivne betydning.

Den almene formel I angiver monoacylderivaterne af antibiotikum el 2 WS-4545, når R har den ovenfor anførte betydning, og R beteg- 1 2 ner hydrogen og diacylderivaterne, når R og R hver betegner C-j.^-alkanoyl eller furoyl.

Antibiotikum WS-4545 kan fremstilles ved en fermentationsproce= dure under kontrollerede betingelser under anvendelse af en ny art af Streptomyces, som betegnes Streptomyces sapporonensis.

Mikroorganismen.

Den mikroorganisme, som kan anvendes til fremstilling af det hidti] ukendte antibiotikum WS-4545, er en art af Streptomyces, som for nj lig er opdaget og isoleret fra en jordprøve, som blev fundet i byei Sapporo i Japan. En kultur.af den levende organisme er deponeret hos the American Type Culture Collection under betegnelsen A.ICC 21552; og kulturen betegnes nedenfor Streptomyces sapporonensis.

Streptomyces sapporonensis ATCC 21552 udviser de morfologiske, mak: skopiske, mikroskopiske og biokemiske egenskaber, som angives i de· følgende:

Mikroskopisk morfologi:

6 DK 155739 B

Morfologien af Streptomyces sapporonensis ÅTCC 21532, når denne vok= ser på saccharose/nitratagar og stivelse/ammoniumagar ved 50°C i 10 - 14 døgn, angives i det følgende. Lufthyferne er lange og lige og har en snoning. Konidierne er kædelignende.

Kulturmæssig og fysiologisk karakteristik:

Le kulturmæssige og fysiologiske egenskaber af den hidtil ukendte stamme - Streptomyces sapporonensis - i forskellige medier angives nedenfor. Bedømmelserne er foretaget efter inkubering i 10 - 14 døgn ved 50°C. Lenne temperatur og denne inkubationstid er anvendt i det følgende, medmindre andet er angivet.

Czapek’s agar: Hvid, svag vækst; intet luftmycelium; intet opløseligt pigment·.

Stivelse/ammoniumagar: Svag orange vækst i små kolonier med svag orange overflade; intet luftmycelium; intet opløseligt pigment. Len diastatiske virkning er svag.

Glucose/asparaginagar: Brun vækst i små kolonier; tyndt og hvidt pulveragtigt luftmycelium; intet opløseligt pigment.

Calcium/malatagar: Hvid vækst; tyndt og svagt hvidbrunt pulveragtigt luftmycelium, intet opløseligt pigment.

Tyrosinagar: Mørk brun vækst i små kolonier; intet luftmycelium; intet opløseligt pigment.

Bouillonagar: Svag gul koloniagtig vækst; hvidt pulveragtigt luft= mycelium; intet opløseligt pigment.

Bennett’s agar: Brun koloniagtig vækst, med flad og rynket overflade; tyndt og hvidt pulveragtigt luftmycelium; intet opløseligt pigment. Kulturen vokser godt såvel ved 37 som ved 30° C.·

Glucose/bouillon; Hvid klumpet vækst, bundfælder; intet luftmycelium;· intet opløseligt pigment.

7 DK 155739 B

Glueose/Czapek1s-opløsning: Hvid koloniagtig vækst, bundfælder; intet luftmycelium; intet opløseligt pigment.

Lakmusmælk: Svag vækst; intet luftmycelium; intet opløseligt pigmenl Her er svag peptondannelse og negativ koagulering.

Gelatinestik: (15 - 20°C, 20 døgns inkubation) Svag vækst; intet luftmycelium; intet opløseligt pigment. Her iagttages svag positiv forflydelse.

Kartoffelstykker: Svag brun koloniagtig vækst med rynket overflade; svagt brunt pulveragtigt luftmycelium; intet opløseligt pigment.

Cellulose: Ingen vækst.

Optimale betingelser for væksten: Temperatur: 25 - 37°C; pH-værdi: 6-8.

Udnyttelse af carbonkilder: Bedømmelsen af udnyttelsen af carbon= kilder udføres ifølge Pridham-Got'tlieb-metoden. Bedømmelsen fore= tages efter inkubering ved 30°C i 7 døgn.

Carbonkilde Vækst.

Xylose

Arabinose

Mannose

Fructose

Glucose +-

Rhamnose

Saccharose

Lactose

Trehalose +-

Raffinose

Mannitol

Inositol +-

Salicin

Kontrol -

Angivelsen "+" betegner udnyttelse, angivelsen betegner ingen

8 DK 155739B

*

Antibiotiket.

Det hidtil ukendte antibiotikum WS-4545 dannes, når Streptomyces sapporonensis, som angivet ovenfor, dyrkes i -et næringsmedium under kontrollerede submerse aerobe betingelser. Der kan anvendes en lang række forskellige næringsmedier i fermentationsprocessens vækstfase.

Det er konstateret, at' der opnås bedre resultater, når der anvendes et vandigt medium indeholdende en assimilerbar carbonkilde og en assimilerbar nitrogenkilde eller et proteinholdigt materiale.

Assimilerbare carbonkilder er f.eks. polyvalente alkoholer, mono-, di- og polysaccharider såsom glucose, fructose, maltose, lactose, saccharose, sukker·, stivelse, majsstivelse, dextrin, melasse, glycerol, osv.

Anvendelige assimilerbare nitrogenkilder og proteinstoffer er f.eks. naturlige nitrogenkilder såsom majsstøbevand, sojabønnemel, sojabønneolie, bomuldsfrømel, glutenmel, majsmel, tørret gær, gær= ·= ekstrakt,' pepton, flydende animalske peptoner, kødekstrakt, casein= hydrolysat, osv. samt uorganiske og organiske nitrogenkilder såsom ammoniumsalte, f.eks. ammoniumnitrat, ammoniumsulfat, ammoniumphos= phat, urinstof og lignende.

Carbonkilderne og nitrogenkilderne kan med fordel anvendes i sammen= sætninger, og behøver ikke anvendes i ren form, idet de mindre rene materialer, som indeholder spor af vækstfremmende stoffer og betyde= lige mængder af næringsmineraler, også kan anvendes med fordel. Om ønsket, kan der til mediet sættes mineralsalte såsom calciumcarbonat, natrium- eller kaliumphosphat, natrium- eller kaliumchlorid, magne= siumsalte, kobbersalte og lignende. Om nødvendigt sættes, især når der er en kraftig skumning af mediet, et skumdæmpningsmiddel såsom flydende paraffin, fede olier, planteolier, mineralolier, silico= ner, osv. til fermentationsmediet.

ligesom det foretrækkes ved de sædvanlige fremstillinger af andre anti-, biotika, foretrækkes det også ved fremstillingen af det her omhandle= de antibiotikum at anvende submerse aerobe betingelser. Til fremstil=

9 DK 155739 B

ling af mindre mængder antibiotikum kan den submerse dyrkning udfør( i små kolber eller flasker, som omrystes eller omrøres af dertil an= vendelige mekaniske midler. Større rumfang af det inokulerede nærin< medium kan fermenteres i store tanke eller beholdere, som sædvan= ligvis anvendes i fermentationsindustrien. Til fremstilling af stor< rumfang antibiotikum foretrækkes det at anvende den vegetative form af mikroorganismen til inokulering i tankene eller beholderen til undgåelse af vækstforsinkelse ved fremstillingen af antibiotike· I overensstemmelse hermed foretrækkes det først at fremstille et vegetativt inokulum af mikroorganismen ved at inokulere en relativt ringe mængde af dyrkningsmediet med sporer eller mycelium fra mi= kroorganismen og derefter at overføre dette vegetative inokulum aseptisk til store tanke eller beholdere. Mediet, i hvilket det vegetative inokulum fremstilles, kan være det samme som eller for= skelligt fra det medium, der anvendes til fremstilling af antibio= tiket.

Omrøring og luftning af dyrkningsblandingen kan udføres på forskel= lige måder. Omrøringen kan udføres med propeller eller mekaniske omrøringsapparaturer, ved rotering eller rystning af fermentoren, ved hjælp af forskellige pumper eller ved at presse steril luft gennem fermentoren. Luftningen kan udføres ved at presse steril luf' gennem fermentationsblandingen. · Sædvanligvis udføres fermentationen ved temperaturen ca. 25 - ca.

37°C, fortrinsvis ca. 30°C, i løbet af 30 - 50 timer. Ved periodens afslutning er der dannet en væsentlig mængde antibiotikum.

Til isolering af antibiotikum WS-4545 kan myceliet separeres fra dyrkningsvæsken på konventionel måde, f.eks. centrifugering eller filtrering. Den overvejende del af antibiotiket findes i filtratet. Antibiotiket kan udvindes fra filtratet på konventionel måde, f.eks, ved hjælp af en sådan ekstraktions- eller adsorptionsteknik, som sædvanligvis anvendes til udvinding af tilsvarende antibiotika.

Ekstraktionen kan udføres ved behandling af filtratet med et organii opløsningsmiddel, feks. pyridin, alkoholer såsom methanol, ethanol, butanol, eller vandige opløsninger af vandblandbare organiske op= løsningsmidler, f.eks. vandige alkoholer såsom vandigt methanol,

10 DK 155739 B

vandigt ethanol og vandigt butanol. Der kan også anvendes blandinger af alkoholer og andre organiske opløsningsmidler såsom ketoner, f.eks. acetone, halogenerede hydrocarboner, f.eks. chloroform, alkylestere af fedtsyrer, f.eks. ethylacetat, benzen, pyridin og lignende.

Alternativt kan antibiotiket udvindes af filtratet med et adsorp= tionsmiddel såsom diatoméjord, aktivt aluminium, silicagel, aktivt kul, kiselsyre og lignende. Det på adsorptionsmidlet adsorberede antibiotikum elueres let fra adsorptionsmidlet ved anvendelse af et egnet organisk opløsningsmiddel, i hvilket antibiotiket er oplø= seligt, f.eks. pyridin^ alkoholer, vandige alkoholer og blandinger af alkoholer og andre organiske opløsningsmidler.

En velegnet metode til isolering af antibiotiket fra ekstrakten eller eluatet er at fordampe opløsningsmidlet til opnåelse af et re= lativt lille rumfang og fælde antibiotiket ved tilsætning af et anvendeligt opløsningsmiddel, i hvilket antibiotiket er uopløseligt.

Antibiotiket renses ved omkrystallisation eller chromatografering. Opløsningsmidler, som kan anvendes til omkrystallisation, er f.eks. acetone, vandigt acetone, alkoholer såsom methanol og ethanol, van= dige alkoholer og ethylacetat. De som adsorptionsmidler til ud= vinding af antibiotiket angivne opløsningsmidler*, kan også med godt resultat anvendes til chromatografisk rensning. Som eluerings= midler kan anvendes de opløsningsmidler, som også kan anvendes ved udvinding af antibiotiket.

Egenskaber af antibiotikum WS-4-545, som er isoleret på den ovenfor angivne måde, angives i det følgende:

Antibiotikum WS-4545 udviser de følgende fysiske og kemiske egen= skaber:

Antibiotikum WS-4545 krystalliserer i basiske og hvide krystaller.

Det er opløseligt i vand, methanol, ethanol.og pyridin, tungtoplø= seligt i acetone og ethylacetat og uopløseligt i ether, chloroform, benzen og n-hexan.

Molekylvægten viser sig at være 302 i henhold til massespektrogra= fiske data.

11 DK 155739 B

Den specifikke drejning er [ctj^ = 63,5° (c = 1,00$ (vægt/rumfang) i methanol).

Elementaranalyse giver følgende værdier: Carbon = 47,44$; hydrogen 6,16$; nitrogen = '9,36$ og oxygen (ved differense) = 37,04$.

Under anvendelse af de ovenfor angivne værdier kan den empiriske formel af antibiotikum WS-4545 beregnes til W2°r

Antibiotikum WS-4545’s' farvereaktioner angives i det følgende: Positiv Eehling’s og Molisch’s prøve; affarvning af kaliumperman= ganatopløsning; svag positiv reaktion med ferrichlorid; negativ ninhydrinreaktion og negativ folien’s og Ehrlich’s prøve.

Med antibiotikum WS-4545 udføres tyndtlagschromatografi på sili= cagel (-Kieselgel G, Merck), idet der anvendes forskellige opløsnings middelblandinger til udviklingen. Som farvedannende middel anvendes l$’s kaliumpermanganatopløsning indeholdende 2$ natriumcarbonat.

R^-Værdierne er angivet nedenfor.

Rf-Værdier for antibiotikum WS-4545.

Opløsningsmiddelblanding Blandingsforhold R^-Yærdi n-butano1/e ddike syr e/vand (topfase) 4:1:5 0,41 n-butanol/pyridin/vand 4:1:1 0,55 chloroform/methanol 5:1 0,39 ethylacetat/methanol 1:1 0,63 benzen/methanol/chloroform 1:1:1 0,41

Antibiotikum WS-4545 krystalliserer i forskellige krystalmodifika= tioner afhængigt af de betingelser, der anvendes ved krystallisatio nen. Det har på grundlag af mikroskopisk analyse vist sig, at der ved fremgangsmåden ifølge eksempel 40 fremstilles rhombiske krystals ler og ved fremgangsmåden ifølge eksempel 41 monocliniske krystallen Krystallerne giver ved røntgendiffraktionsanalyse de. følgende resul tater:

12 DK 155739 B

Krystaller fremstillet Krystaller frem= ifølge eksempel 25 stillet ifølge eksempel 26

Krystalmodifikation rhombiske monocliniske

Rumgitter a = 11,7 1 . a = 10,1 i β = 101° b = 12,7 Å b = 10,9 Λ c = 8,8 Å c = 6,6 Å

Massefylde 1,54 g/cm5' 1,46 g/cm5

De rhombiske krystaller smelter ved 187 - 189°0 (under sønderdeling). UV-spektret er angivet· i fig. 1 og udviser ingen specifikke absorp= tionsmaksima. IR-spektret af en suspension i nujol er angivet i fig. 2 og har toppe ved følgende frekvenser, som er angivet i cm“^; 3400, 3300, 5160, 2900, 2840, 1703, 1670, 1450, 1390, 1370, 1295, 1260, 1220, 1195, 1140, 1120, 1080, 1030, 970, 960, 935, 895,· 870, 820, 785, 725, 680.

De monocliniske krystaller smelter ved 188 - 191°C (under sønder= deling). UV-spektret er angivet i fig. 3 og viser ingen specifikke absorptionsmaksima. IR-spektret i nujol er angivet i fig. 4 og har toppe ved følgende frekvenser angivet i cnf^: 5500, 5400, 5270, 2900, 2840, 1685, 1640, 1455, 1417, 1375, 1330, 1500, 1260, 1245, 1210, 1160, 1135, 1125, 1105, 1085, 1050, 1010, 995, 980, 940, 920, 900, 885, 870, 840, 805, 795, 760, 725, 690, 675.

Krystaller af disse forskellige krystalmodifikationer kan let omdan= nes gensidigt ved, at der sættes en ringe mængde af den ene krystal= modifikation til en opløsning af den anden krystalmodifikation, lige før der dannes krystaller. Får således rhombiske krystaller omkry= stalliseres af et opløsningsmiddel, f.eks. varmt vand, varmt vandigt ethanol, varmt acetone, varmt methanol ellep varmt ethanol, vil en tilsætning af en ringe mængde monocliniske krystaller til opløsnin= gen før dannelsen af en fældning i opløsningen medføre dannelse af

13 DK 155739B

monocliniske krystaller. På den anden side vil, når-monocliniske krystaller omkrystalliseres af et opløsningsmiddel, f.eks. varmt vand, varmt vandigt ethanol eller varmt acetone, en tilsætning af en ringe mængde rhombiske krystaller til opløsningen før dannelsen af en fældning iopløsningen medføre dannelse af rhombiske krystal= ler. På grundlag af det ovenfor angivne kan det konkluderes, at de rhombiske krystaller og de. monocliniske krystaller er i polymorf relation til hinanden.

MR-Spektret af antibiotikum WS-4545 udviser de følgende signaler (iT(ppm) i PMSO - d6-opløsning, IMS som intern standard) : 8,81 : 3H singlet 7,45 - 7,67' : 2H multiplet 6,30-6,87 : 2H multiplet 6,10-6,40 : 2H multiplet 6,09 : IH doublet 5,58 : IH triplet * · 4,95 · : IH multiplet 4,93 : IH singlet 4,87 : IH doublet 4,63 : IH multiplet 3,27 : IH singlet 1,38 : IH singlet 1,05 : IH singlet

Ved hjælp af røntgendiffraktion og fortolkning af de ovenfor angivn* fysiske og kemiske egenskaber er den kemiske struktur af antibiotiku

WS-4545 tilskrevet formel II

CH9 OH

ir C-Cx--7C0 / C f. N, <

HqC4 5 b 10ΗΉ

I I

H„C3 900 ^ \ 2 1/ 8

N 0-C--NH II

- I

HC-OH

14 DK 155739 B

svarende til den kemiske betegnelse l-(l,2,3-trihydroxy-2-methyl)= -propyl-5-methylen-6-hydroxy-7,9-dioxo-2-oxa-8,10-diazabicyclo= [4,2,2]decan.

Antibiotikum WS-4545 udviser et specifikt antibiotikumspektrum med særlig stor aktivitet mod gramnegative bakterier, herunder arter af Escherichia, Salmonella og Shigella. Yed indgivelse af antibioti= ket ved injektion indføres antibiotiket i serum i en relativ høj koncentration og udskilles i urinen i stor koncentration. Derfor kan dette antibiotikum anvendes ved behandling af infektionssygdom= me forårsaget af sådanne bakterier i mennesker eller dyr, især ved indgivelse af injektioner. Antibakterielle egenskaber, serumværdier og urinudskillelse angives i det følgende:

Minimal inhiberende koncentration (MIC).

Bestemmelse af MIC-værdierne udføres ved serievis fortynding ved hjælp af agarmetoden under anvendelse af hjerteinfusionsagar til bakterier, et glucose/bouillonmedium til Mycobacterium og et maltekstraktmedium til svampe og gærarter; der inkuberes ved 30°C . i 24 - 72 timer. MIC-værdierne udtrykkes som den minimale koncen= tration af antibiotikum WS-4545 (mikrogram/ml), som hæmmer væksten af mikroorganismerne. Resultaterne er følgende:

Testorganisme MIC-værdi (mikrogram/ml)

Escherichia coli 25 - 50

Salmonella typhosa 25 - 50

Shigella flexneri 12,5 - 25

Staphylococcus aureus >200

Bacillus subtilis , >200

Sarcina lutea >200

Proteus vulgaris >200

Mycobacterium phlei >200

Candida albicans >200

Penicillium ehrysogenum >200

Beskyttende effekt ved forsøg med museinfektioner.

Aktiviteten in vivo af antibiotikum WS-4545 over for Escherichia coli, som er resisténte over for andre antibiotika, bestemmes under

15 DK 155739 B

anvendelse af hanmus (ICR-stamme), som hver vejer 27.- 30 g. Hver gruppe, som undersøges, består af 10 mus. Infektionsorganismerne dyrkes natten over i BHI-dyrkningsvæske ved 37°C. Der inficeres med 0,5 ml af kulturen interperitonealt, og der foretages behandling ved subcutan indgivelse én gang 1 time efter infektionen. Inficerede ubehandlede kontroldyr dør inden for 48 timer under disse betingel= ser. Forsøgsdyrene observeres i 10 døgn med hensyn til overlevelse eller dødsfald, og resultatet beregnes som medianen af de effektive doser (ED^0). Resultaterne fremgår af følgende tabel:

Stamme Antibiotikum ED^q (ms/mils)

Escherichia coli 312 . antibiotikum WS-4545 3,05 chloramphenicol . >28

Escherichia coli 320 antibiotikum WS-4545 . 0,87 streptomycin 17,09

Escherichia coli 323 antibiotikum WS-4545 4,05 kanamycin > 28

Escherichia coli 324 antibiotikum WS-4545 0,69 tetracyclin >28

Escherichia coli 335 antibiotikum WS-4545 0,88 nalidixihsyre 0,54.

Serumniveau og urinudskillelse hos raske frivillige forsøgsperso= ner efter intramuskulær indgivelse.

Serumniveauet og urinudskillelsen bestemmes på 5 raske frivillige forsøgspersoner. Fem voksne'mandlige frivillige forsøgspersoner, som hver vejer 60,0 - 75,0 kg, indgives hver intramuskulært antibiotikum WS-4545 i en enkelt dosis på 500 henholdsvis 1000 mg. Blodprøver udtages efter 0,5, 1, 2, 3 og 5 timer efter indgivelsen. Der opsamles urinprøver i perioderne O'-l, 1-3, 3-6, 6-8, 8 - 10 og 10 - 24 timer efter indgivelsen. Koncentrationen af an= tibiotikum WS-4545 i serum og urin bestemmes ved hjælp af ,,cup"-me= toden. Resultaterne er følgende:

Urinkoncentration, øverst angivet i mikrogram/ml, nederst angivet i procent, det angivne antal timer efter indgivelsen.

t

16 DK 155739 B

.Indgivelse 0-1 1-3 3-6 6-8 8 - 10 10 - 24 I alt

Antibiotic time timer timer timer timer timer ($) kum WS-4545 500 mg 620 1256 459 221 97 54 94,0 (18$) (38$) (22$) (8$) (4$) (5$) 1000 mg '1501 2266 1256 726 393 73 94,8 (17$) (38$) (20$) (11$) (4$) (5$)

Serumkoncentration, angivet i mikrogram/mi; det angivne antal timer efter indgivelsen.

Indgivelse 0,5 time 1 time 2 timer 3 timer 5 timer

Antibiotikum WS-4545 500 mg 1477 1377 1576 <1570 ?15,0 1000 mg 31,1 31,9 21,6 18,8 * 15,0

En anden yderst vigtig egenskab ved antibiotikum WS-4545 er, at det har yderst lav toxicitet, således som det fremgår af det følgende:

Akut toxicitet (ved én indgivelse'af antibiotikum WS-4545).

Art Køn IH50 (mg/kg)* intravenøst intraperitonealt subcutant peroralt mus han >2000 >4000 >4000 >4000 mus hun >2000 >4000 >4000 >4000 rotte han >2000 >4000 ' >4000 >4000 rotte hun >2000 >4000 >4000 >4000 x Dyrene blev observeret i 7 døgn efter indgivelsen.

Acylderivater af antibiotikum WS-4545 (dvs. carboxylsyreestere af antibiotikum WS-4545), som fremstilles ifølge de nedenfor anførte udførelseseksempler, er angivet i følgende tabel: 17 DK 155739! 1 2

Eksem= Betydning af symbolerne R og R i den almene formel I

pel nr. -=i-s—- ----- IT Ir

1 acetyl H

2 propionyi H

3 palmitoyl H

4 crotonoyl H

5 cyclohexylcarbonyl H

6 acetyl acetyl

7(A) ' butyryl H

7(B) butyryl * butyryl

8 benzoyl H

9 p-chlorbenzoyl H

10 m-brombenzoyl H

11 p-brombenzoyl H

12 3,4-dimethylbenzoyi H

13 p-acetoxybenzoyl H

14 p~chlorphenoxyacetyl H

15 cinnamoyl H

16 β-phenylpropionyl H

17 nicotinoyl H

18 2-thenoyl . H

19(A) 2-furoyl H

19(B) 2-furoyl 2-furoyl

De således fremstillede acylderivater af antibiotikum WS-4545 absorberes ved oral indgivelse i væsentlig større koncentration end ved oral indgivelse af antibiotikum WS-4545 og kan omdannes til antibiotikum WS-4545, som er aktivt mod patogene bakterier. Acylderivaterne af antibiotikum WS-4545 er derfor anvendelige som antibiotika, som ved oral indgivelse er aktive til behandling af infektionssygdomme hos mennesker og dyr. Dette fremgår af de følgende farmakologiske forsøg.

Urinudskillelse efter oral indgivelse af acyldérivater af antibioti= kum WS-4545 til rotter: 18

DK 155739 B

in oo O N ΙΛ ll\ (Λ H „ ~ ~ ~ - · O C\) H- KV OQ H· O ^ g

^ CO C"- C5V H OV O O ^ R

Η Η Ηi +3 +3 H HO^-^VOCMH-CvIg

Cg in H O IA t- D*· VO C"” ·Η H UO intoiAcninvDtr- ^ d ΘΗΗΗΗΗΗΗ ^ tg m- vo kv i> o t\i tn <8 * C j λ λ *\ f\ n rs r. Λ *r^ ω csj^cMvooiooc^ ^ g ^ a HHHHHCM gg i § i Ή cg CM 0\ 00 VO VO O CM O H CM ? -g H 8 H W O -Φ ώ O H 5 _§ g i ,¾ cg i> i> m co m ^t· vt +; " •h h h g y vo a w) g ^

S O o m Μ H

H t- 1Λ 1> CO O Ift CO •'y H [OiKVOCOVOlOCri ^ οΛ, ω v#l H W « H en h uom H an.

£ ω ii a ° t* vo o\ σν o ov’cm tn- vo co cn O ri Ha vo in kv in ·ψ C0 in 5T\ Η ω i ,ycg lAtncotuovvotn ^ £

η η kv oo σν vo H m <3- H ·· R

KV a uo HH ® ® •ri

CQ H o ω fi H R

• R

-Φ KV -M" CM CO VO ^ tø .

£j V9 ·>·>·*·«·. <t ·· ^ H

ω h'tHCOwmH ® o P.

a lcv κν vo t- «Φ κν c— cj h +3 H i "m

ii a . 1 S

KV 0\ . _. V

Ha CM O O KV VO H KV fr O J

I ,y cg HCVJVDO-VDKVO crv c-_ •HH HKVVOCMH-Kvtn-O H ft ·.

0 auo C— E— CD OV KV KV CO H . P

-* H S “ •Γ3 h _i ω h 1 § o O o ra O H S -Ω _g 01 g P bL o h +3 a

+5 oh cg S R ~ S

NbjORO^^

2 S ,cj Η (U-P

? Η φ .p h t>3 Hv—* -P CQ

2 ί>5 i <D !v H jf *? g B HoHHaom OUV o ,ω d ^a^O-H-P^-H^; u , OcgHHHHOrgf^ I« a Tri Nfl^tfiaH-g^fi©

g K. dfJ-PO-^HO-g l ω S

(1) *ri ^ i ~ C\3 |>J Pj 2 m er! ^ .QOrQftKVftocg^. ran Ό r^j

S d H

θ ω i> lcv ω -P H rr+- 3« ίί ~ « $ S II 3 a i g 1 □ -Ρω go kv m- σν cm κν kv h; iii .3 (ni m ra i—i h

* 19 , DK 155739 B

** ; H co ro cn h rN cn n> ro <n Tf cn in h \n ra * * * » *» v .. s.

in Tf m σι cn co vo h -n· -n· σι co ri

H in co h Tf ττ h co ro σι σι m vo r- S

h cn o η· co m cn cn cn I ΟΙ I** 00 H » ^ «. k. ·.».*.«. » *» u\ «. » κ < co vo r·* cn Tf m m σι m oo

g S CO CO CO f'' HH

B & 0 0\° «# m co cn in r- h p« ιπ ττ cn Η o ττ (N h cn 44 ·«· ττ σι h ro tj* cn η ro σι Η σι oo co r» 1]j'Srj3incNtNr~coro vo m cn co cn ττ cn tt p* o N* m o ν' σι σ> J ^ ·> s «. s ^ t,^· co cn σι co Tf co r> cn gigTf h ooininmcoin -P g o\“ to co m Tf h Tj< oo co vn □ * co h o co vo cn vo in IHHOT Ρ» cn r» oo in H <n 0 a g Tf VO CN CN Tf .Tf in I τι* co co

"N. **«·» CO VO

jH i Tf Tf oo σι - 1 R H Tf r> .5 & « P o o\° H co in Γ' cn σι ττ h o r~ o Λ '3 Ή p~ in cn σι σι r> KH CN h cn co H o

Tf CN

*1 η h cn in co rn g ft co r' ro co m h

.5 Hl H CN CN CN H

+3 0 o\o roS * Γ" r>- h f" in oo I -dd H o cn co σι oo °BK Tf CO H H σι

Tf Η H co CO

8 CN o S 3 X* [^Sd

Si S3 gCn « S3 Ed S3 33 U^/ Ed Ed 33 S3 33 33

O

0 O u

O U CN

1 CN EC

O 33 U O O O O

O O O cn U O U U O

U cn I Π O 33 Tf in CO oo U O

CJ O i Jk O CN CN CN CN U CN

II CN o ku o o O 33 EC EC 33 /1 33

33 33 oi l] I ϋ O U O O O / \ O

o ο o /=\ i i t_. w '-g / 'in m co ro co T Z /) r^c r^i\ ro ro ro ro fO EC ro rH| EC 33 33 H ❖ J/ O Γ O 3! 3! 33 Ed Ed CN Ed

Oil CJ O CJ O '”y U^/ O CJ O U O U CJ

%

H

& . '-T C 3) ηΓ O H CN (O in co

20 .DK 155739 B

co μ· cm σ> r~ ιο σι in m σι m« cm ο *. > κ κ ^ ^ Κ k · κ *.

ομ Γ—ι ο ο ιη μ> σ» Γ' cn η ^ in cm ιοιο μ< t" in m co m m in ιο ιο ρ- p· oo cm μ· oo σι cm co *3· o σν oo o

*· ^ ^ K S ^ ^ K k, S ^ K

vo Γ" m oo m oo id oo oo in in in

O i—1 O ΟΊ Μ1 H CO P* Cl O HP1' H

OCM ΙΟ Η P· CO P· 00 'tf h cm in 'i* co n n 31 n 31 cm *3* m1 roen cm ioh oiooop'oo i—i o in M' o

^ K » >· s >. >k k,k. ^ V V

m *3* voiniooH ^ co oo σι r- m in co io *a< co ro ^j< m· in in io P* 00 >3« CM P- 00 CM in CM i—I M* <31 o in rHinior^o hh p* cm oo co iH p- in σι p~ σι cm H p- io in rH co i—i cm cm cm cm ^ co in i—1 in · (—t o

rH

-a· i—1 t*

lO

CO

P' o

CM

in

SS 33 S S S S S S S SS S

O o Λ o o o

cm O CM O O O

S OM O OOO CM O co O

O 33 O O O O O cm SSSU

en n cm I O cm cm S U 0—0 ro

SO II S CM S S O W W

CJUcouOrHSO OS O O CM

CM s S cm X UJj o O is* ^ co CO s “*00 co”° 'To V fA] rA O O Ti n — S s” g a" o" U M W" <P r\ S S a S “ ° ~ 9 B ° l> ~ °

S

Ά

rH

$ cT»(NHcn^Lnr^oocn'X) λ3 Γη. ΓΠ O Pvl ro ro ro n*\ ro nn ro ro ro

21 DK 155739 B

Serumniveau og urinudskillelse efter oral indgivelse af acylderi= vater af antibiotikum WS-4545 til raske frivillige forsøgspersoner:

Serumniveauet og urinudskillelsen bestemmes hos.tre raske frivilli= ge forsøgspersoner. Til tre raske frivillige forsøgspersoner, vægt 60,0 - 75,0 kg, indgives oralt én dosis på 500 henholdsvis 1000 mg. Der udtages blodprøver 1, 2, 3, 5 og 8 timer .efter indgivelsen.

Der opsamles urinprøver i perioderne 0-1, 1- 3» 3- 6, 6- 9 og 9-24 timer efter indgivelsen. Koncentrationen af antibiotikum WS-4545 .i serum og urin bestemmes ved "cup"-metoden. Der udføres et analogt forsøg med anvendelse af antibiotikum WS-4545. Resultatet fremgår af følgende tabeller:

Forbindelse med den almene formel I

r2=h 0-11- 3 3-6 6-99 - 24 I alt - time timer timer timer, timer $

Fremstil= Ί let i ek= R sempel nr.

1 acetyl 292 540 141 64 19,6 5,2 8 2,8 . 3,6 8 benzoyl 608 1199 930 389 64 74,3 10,6 30,3 20,0 8,5 4,7 2 propionyl 285 1380 1385 717 170 43,8 2,8 11,7 14,3 7,3 . 7,7 7(A) butyryl 401 2770 1386 458 77 69,6 . 5,9 34,0 19,1 5,3 . 5,4 3 palmitoy1 216 .1353 1239 549 82 57,5 ...... ________..r_2, 3.. ...17,3______ 21,8 10,2________5,8 _ Ϊ tabellen er urinudskillelseiT’i mikrogram/ml'angivet''øverst',’'og udskillelsen i procent er angivet nederst-. .

Urinudskillelsen efter indgivelse af antibiotikum WS-4545 fremgår af følgende tabel, hvo-r udskillelsen i mikrogram/ml er angivet øverst, og udskillelsen i procent er angivet nederst.

DK 155739B

22

......... 0-2 2-4' ' 4-6 6-8 8 - 10 10-24 I

timer timer. timer timer timer timer alt _ i antibiotikum 35,0 58,0 56,5 50,0 23,5 9,5 2,9 WS-4545 0,6 0,8 1,1 0,5 0,4 0,3

Serumkoncentrationen i mikrogram/ml er angivet i den følgende tabel:

Forbindelse med den almene formel I, R2 = Η 1 time 2 timer 3 timer 5 timer 8 timer

Premstil= R1 let i ek= sempel nr.

8 benzoyl 25,2 25,8 20,1 14,0 {14,0 .7(A) butyryl 16,9 20,7 15,7 *10,0 <10,0 3 palmitoyl 12,4 16,-6 15,1 11,9 <10,0

De ifølge opfindelsen fremstillede forbindelser kan til indgivelse, formuleres på en hvilken som helst konventionel måde i analogi med andre antibiotika.

Således kan de ifølge opfindelsen fremstillede forbindelser med den almene formel I anvendes i form af farmaceutiske præparater, f.eks. i fast, i halvfast eller i flydende form, som indeholder den aktive bestanddel i blanding med en organisk eller uorganisk farmaceutisk bærer eller excipiens, som er anvendelig til udvortes peroral eller parenteral indgivelse. Det aktive stof kan f.eks. sammen med de sædvanlige bærestoffer formuleres i tabletter, piller, kapsler, suppositorier, opløsninger, emulsioner, vandige suspensioner eller andre anvendelsesformer. Anvendelige bærestoffer er glucose, lactose, acacia gummi, gelatine, mannitol, stivelsespasta, magnesiumtrisili* cat, talkum, majsstivelse, ceratin, kolloidt siliciumdioxid, kar= toffelstivelse, urinstof og andre bærestoffer, som er anvendelige til fremstilling af præparater i fast, halvfast eller flydende form, og der kan tilsættes hjælpestoffer, stabiliseringsmidler, fortykkel= sesmidler, farvestoffer og parfumer. Præparaterne kan også indeholde konserveringsmidler eller bakteriostatiske midler, som holder de

23 DK 155739 B

aktive forbindelser i et foreliggende præparat i aktiv tilstand. Forbindelser med den almene formel I anvendes i præparaterne i en mængde, som er tilstrækkelig til at frembringe den ønskede terapeu= tiske virkning på af bakteriel infektion betingede proces eller tilstand. Dosis eller den terapeutiske effektive mængde af forbin= delserne afhænger af alderen og af tilstanden hos hver enkel patien som skal behandles, men der indgives sædvanligvis en daglig dosis på 0,5 - 5 g, fortrinsvis 1 - 2 g, af den aktive bestanddel til be= handling af sygdomme, mod hvilke forbindelser med den almene forme! I kan anvendes.

Opfindelsen belyses nærmere ved de følgende eksempler:

Acylderivater af antibiotikum WS-4545 kan fremstilles på følgende måder:

Eksempel 1. ·

Til en opløsning af 100 mg antibiotikum WS-4545 i 0,5 ml pyridin sættes dråbevis 0,5 ml eddikesyreanhydrid under afkøling til -10°C, og blandingen omrøres i 3 timer. Til reaktionsblandingen sættes isvand, og opløsningen lyofiliserer. Det lyofiliserede stof krystal· liseres af en blanding af acetone og ether, hvorved fås krystaller, som omkrystalliseres af acetone, hvilket giver 50 mg eddikesyreestej af antibiotikum WS-4545 i form af prismatiske krystaller med smp.

213 - 215°C.

Analyse:

Beregnet for ^41¾¾¾: C 48,S3 H 5,86 N 8,14 Fundet: C 48,91 H 5,81 Ή 8,08.

Eksempel 2.

Til en opløsning af 12,08 g antibiotikum WS-4545 i 48 ml pyridin sættes dråbevis 7,8 g propionsyreanhydrid under omrøring og afkøling til -5 --10°C i løbet af 1.,5 timer. Til reaktionsblandingen sættes, efter at denne har.stået natten over, 100 ml vand, og.opløsningen

24 DK 155739 B

«f koncentreres under reduceret tryk. Remanensen opløses i 100 ml vand, og opløsningen vaskes med ethylacetat og koncentreres derefter under reduceret tryk. Remanensen omkrystalliseres af ethylacetat, hvor= ved der fås 4-,S g propionsyreester af antibiotikum WS-4545 som far= veløse krystaller med smp. 178 - 179°C.

Analyse:

Beregnet for C 50,27 H 6,19 R 7,82

Pundet: C 50,18 H 6,25 , R 7,51.

Eksempel 5.

Til en opløsning af 6,04 g antibiotikum WS-4545 i 30 ml pyridin sættes i løbet af 1 time dråbevis 5,81 g palmitoylchlorid under omrøring og afkøling i isvandbad. Blandingen omrøres i 1 time ved den samme temperatur og derefter i 1 time ved stuetemperatur. Til reaktionsblandingen sættes 60 ml koldt vand, og opløsningen koncen= treres under reduceret tryk. Remanensen opløses i ethylacetat, og opløsningen vaskes med vand, 2,5$*s saltsyre, vandig natriumbicar= bonatopløsning og vand i den angivne rækkefølge, og derefter tørres opløsningen over magnesiumsulfat. Opløsningsmidlet afdestilleres, og remanensen omkrystalliseres.to gange af en blanding af acetoni= tril og isopropylether, hvorved der fås 5,0 g palmitinsyreestør af antibiotikum WS-4545 som farveløse krystaller med smp. 156 - 157°C·

Analyse:

Beregnet for c28^48^2¾: 0 62,20 Ξ 8,95 R 5,18 Pundet:' C 62,14 H 9,17 R 5,05.

Under anvendelse af den i eksemplerne 1-3 angivne fremgangsmåde med den undtagelse, at der anvendes de i eksemplerne 4 og 5 angivne udgangsmaterialer og opløsningsmidler til omkrystallisation, vindes de i eksemplerné 4 og 5 angivne acylderivater (carboxylsyreestere) af antibiotikum WS-4545. . ·

25 DK 155739 B

Eksempel 4·

Udgangsmaterialer: 3,02 g antibiotikum WS-4545 og 3,02 g croton= syreanhydrid.

Opløsningsmiddel til omkrystallisation: En blanding af acetonitril og isopropylether.

Der vindes 1,0 g crotonsyreester af antibiotikum WS-4545 i form af farveløse krystalnåle med smp. 148 - 150°C.

Analyse:

Beregnet for C16H22ir208: C 51,88 h 5,99 F 7,56

Eundet: C 51,92 H 6,09 1 7,40.

Eksempel 5.

Udgangsmaterialer: 3,0 g antibiotikum WS-4545 og 1,6 g cyclohexan= carbonylehlorid.

Opløsningsmiddel til omkrystallisation: Ethylacetat.

Der vindes 1,5 g cyclohexancarboxylsyreester af antibiotikum WS-4545 som farveløse prismatiske krystaller med smp. 183 - 185°C (under sønderdeling).

Analyse:

Beregnet for ci9H28Ii2°8: c 55,33 H 6,84 F 6,79

Eundet: C 55,07 H 6,86 F 6,60.

Eksempel 6.

!il en opløsning af 500 mg antibiotikum WS-4545 i 2 ml pyridin sættes dråbevis ved stuetemperatur 2 ml eddikesyreanhydrid, og blandingen omrøres i 5 timer. Krystallerne udskilles ved, at reak= tionsblandingen anbringes i isvand. Krystallerne fraskilles ved filtrering og vaskes med vand, hvorefter de omkrystalliseres af

DK 155739 B

26 methanol, hvorved vindes 600 mg tri-eddikesyreester af antibioti= kum WS-4545 som farveløse prismatiske krystaller med smp. 247 -250°C (under sønderdeling).

Analyse:

Beregnet for : c 50,46 H 5,65 R 6,54

Bundet: C 50,42 H 5,55 JST 6,73.

Eksempel 7.

(A) Til en opløsning af 30,2 g antibiotikum WS-4545 i 90 ml pyri= din sættes dråbevis ved stuetemperatur under omrøring 17,4 g smør= syreanhydrid i løbet af 1 time, hvorefter blandingen omrøres i 1 time. Til reaktionsblandingen sættes vand, og opløsningen koneen= treres under reduceret tryk. Remanensen opløses i ethylacetat, og opløsningen vaskes med vandig natriumbicarbonatopløsning og derefter med vand, hvorefter opløsningen tørres over magnesiumsulfat. Opløs= ningsmidlet afdestilleres under reduceret tryk, og remanensen vaskes * med isopropylether, hvilket giver rå krystaller. Krystallerne om= krystalliseres af en blanding.af ethylacetat og.benzen, hvilket giver krystaller, som - efter vask med isopropylether og tørring -giver 24,3 g smørsyreester af antibiotikum WS-4545 som farveløse krystaller med smp. 159 - 140°C.

Analyse:

Beregnet for ^6^24¾¾1 0 51,60 H 6,50 K 7,52

Bundet: C 51,53 H 6,58 N 7,34.

(B) Den ved den ovenfor angivne omkrystallisation vundne moderlud koncentreres under reduceret tryk. Remanensen chromatograferes under anvendelse af en kolonne, som er pakket med silieagel, og kolonnen elueres med en'blanding af chloroform og methanol (15:1). Eluatet koncentreres under reduceret tryk, og remanensen omkrystalliseres af en blanding af ethylacetat og benzen, hvilket giver 2,0 g di= -smørsyreester af antibiotikum WS-4545 i form af farveløse kry= staller med smp. 160,5 - 162,5°C.

Analyse:

Beregnet for C20H30R20g: C 54,29 H 6,85 Έ 6,33

Bundet: C 54,10 H 6,84 H 6,16.

27 OK1S5739B

Eksempel 8.

Til en opløsning af 12,08 g antibiotikum WS-4545 i 36 ml pyridin sættes dråbevis ved stuetemperatur under omrøring 6,7 g benzoyl= cblorid i løbet af 1 time. Reaktionsblandingen omrøres i 1 time, hvorefter der tilsættes vand. Opløsningen koncentreres under redu= ceret tryk, og remanensen opløses i ethylacetat. Opløsningen vaskes med vand,, vandig natriumbicarbonatopløsning og vand i den angivne rækkefølge, hvorefter opløsningen tørres over magnesiumsulfat. Opløsningsmidlet afdeetilleres under reduceret tryk, og remanensen omkrystalliseres af en blanding af ethylacetat og ether, hvilket giver 12,0 g benzoesyreester af antibiotikum WS-4545 i form af farveløse krystaller med smp. 135°0.

Analyse:

Beregnet for ^19^22^2^8: C 56,15 H 5,46 N 6,89 Fundet: 0 55,92 H 5,42 JST 6,69.

Eksempel 9.

Til en opløsning af 2,0 g antibiotikum WS-4545 i 6 ml pyridin sæt= tes dråbevis under afkøling i et isvandbad i løbet af 30 minutter 1,4 g p-chlorbenzoylchlorid. Blandingen lades henstå ved denne tem= peratur i 1 time, hvorefter badet fjernes, og reaktionen lades løbe videre i 3 timer. Der sættes 50 ml isvand til reaktionsblan= dingen, hvorefter opløsningen ekstraheres med ethylacetat. Ethyl= acetatfasen vaskes med vand, 2$!s vandig natriumbicarbonatopløsning og vand i den angivne rækkefølge, hvorefter ethylacetatfasen tør= res over magnesiumsulfat. Ethylaeetatet afdestilleres, og remanensen omkrystalliseres tb gange af ethylacetat, hvilket giver 0,9 g p-chlor= benzoesyreester af antibiotikum WS-4545 som farveløse krystaller med smp. 135 - 137°C.

Analyse:

Beregnet for (¾¾011½¾1 0 51,84 H 4,79 N 6,34 Cl 8,03

Eundet: · " C 51,67 H 4,75 N 6,23 01 8,30.

* ^ ’

DK'155739 B

28

Under anvendelse af den i.eksemplerne 8 og 9 angivne fremgangsmåde"’ med den undtagelse, at der anvendes de i eksemplerne 10 - 16 angiv= ne udgangsmaterialer og opløsningsmidler til omkrystallisation, vindes de i eksemplerne 10-16 angivne acylderivater (carboxylsyreestere) af antibiotikum WS-4545.

Eksempel 10.

Udgangsmaterialer: 6,04 g antibiotikum WS-4545 og 4,8 g m-brom= benzoylchlorid.

Opløsningsmiddel til omkrystallisation: Ethylacetat;

Der vindes 6,0 g m-brombenzoesyreester af antibiotikum WS-4545 som farveløse krystalnåle med smp. 138°C.

Analyse:

Beregnet for : C·47,02 H 4,36 Ή 5,77

Pundet: C 46,96 H 4,35 U 6,04-

Eksempel 11.

Udgangsmaterialer: 6,04 g antibiotikum WS-4545 og 4,8 g p-brom= benzoyl chlorid.

Opløsningsmiddel til omkrystallisation: Ethylacetat.

Der vindes 6,8 g p-brombenzoesyreester af antibiotikum WS-4545 i form af farveløse krystalnåle med smp. 144 - 145°C. BMR-spektrum: 7(ppm) = 1,96 - 2,33 (triplet).

Eksempel 12.

Udgangsmaterialer: 3,0 g antibiotikum WS-4545 og 1,85 g 3,4-dime= thylbenzoylchlorid.

Opløsningsmiddel til omkrystallisation: Ethylacetat.

29 . DK 155739 B '

Der vindes 1,8 g 3,4-dimethylbenzoesyrcester af antibiotikum WS-4545 som farveløse krystaller med smp. 128 - 13jO°C.

Analyse:

Beregnet for ^21®·26^2°8: C 58,06 H 6,03 E 6,45 Bundet: C 58,30 H 6,26 IT 6,32.

Eksempel 13.

Udgangsmaterialer: 2,0 g antibiotikum WS-4545 og 1,6 g p~acetoxy= benzoylchlorid.

Opløsningsmiddel til omkrystallisation: En blanding af ethylaeetat og benzen.

Der vindes 0,5 g p-acetoxybenzoesyreester af antibiotikum WS-4545 som farveløse krystaller med smp. 130 - 132°0. EME-spektrum: .^(ppm) = 7j 68 (singlet 3H), 2,69 (dublet 2H) og 1,94 (dublet 211). IR-Spektrum: 1760 cnT^.

Eksempel 14.

Udgangsmaterialer: 2,4 g antibiotikum WS-4545 og 2,6 g p-ehlorphen= oxyacetylchlorid.

Opløsningsmiddel til omkrystallisation: Ethylaeetat.

Der vindes 1,3 g p-chlorphenoxyeddikesyreester af antibiotikum WS-4545 som farveløse silkeagtige krystalnåle med smp. 128 - 131°0=

Analysé:

Beregnet for C2oH23C1E2°9: C 51,02 H 4,92 E 5,95 01 7,53 Pundet: C 50,78 H 4,88 E 5,97 Cl 7,60.

Eksempel 15.

Udgangsmateriale; S.O s- antibiotikum WS-4545 oe1 1.9 s? ninnamnvl =

.30 DK 155739 B

Opløsningsmiddel til omkrystallisationen: En blanding af chloroform og ether (1:1).

Der vindes 1,5 g kanelsyreester af antibiotikum WS-4545 som far= veløse prismatiske krystaller med smp. 150°C (under sønderdeling).

Analyse:

Beregnet for ^^21^24^2^^81 C 58,33 H 5,59 R 6,48

Pundet: C 58,16 H 5,62 Έ 6,20.

Eksempel 16.

Udgangsmaterialer: 3,0 g antibiotikum WS-4545 og 1,7 g P-phenylpro= pionylchlorid.

Opløsningsmiddel til omkrystallisation: Acetonitril.

Der. vindes 1,6 g β-phenylpropionsyreester af antibiotikum WS-4545 som farveløse krjrstalnåle med smp. 153°C (under sønderdeling).

Analyse:

Beregnet for ^21^26^2^81 C 58,06 H 6,03 I 6,45

Pundet: C 57,95 H 6,18 Ή 6,31.

Eksempel 17.

Til en opløsning af 2,0 g antibiotikum WS-4545 i 12 ml pyridin sættes under afkøling i et isvandbad 0,8 g nicotinsyreanhydrid, og blandingen omrøres i 1,5 timer. Derefter fjernes kølebadet, og reaktionsblandingen omrøres i 5 timer. Til reaktionsblandingen sættes vand, og opløsningen koncentreres under reduceret tryk. Remanensen ekstraheres med ethylacetat, og ethylacetatfasen vaskes med vandig natriumbicarbonatopløsning, hvorefter ethylacetatfasen tørres over magnesiumsulfat. Ethylacetatet afdestilleres, og re= manensen omkrystalliseres af ethylacetat, hvorved der fås 0,8 g nicotinsyreester af antibiotikum WS-4545 som svagt gule krystaller med smp. 143°C.

31 DK 155739 B

Analyse:

Beregnet for O^H^F^Og: C 53,07 H 5,20 ~F 10,32 Pundet: C 52,79 H 5,33 F 10,09.

Under anvendelse af den i eksempel 17 anvendte fremgangsmåde med den undtagelse, at der anvendes det i eksempel 18 angivne udgangsmateriale og opløsningsmiddel til omkrystallisation, vindes det i eksempel 18 angivne acylderivat (carboxylsyreester) af antibiotikum WS-4545.

Eksempel 18.

Udgangsmaterialer: 3,02 g antibiotikum WS-4545 og 1,57 g 2-thenoyl= chlorid.

Opløsningsmiddel til omkrystallisation: En blanding af ethylaeetat og benzen.

Der vindes 2,27 g 2-thiophencarboxylsyreester af antibiotikum WS-4545 i form af krystaller med smp. 125°0.

Analyse:

Beregnet for C17H2()F208S: C 49,51 H 4,89 F 6,79 ·

Pundet: C 49,45 H 4,70 F 6,57.

Eksempel 19.

(A) Til en opløsning af 3,02 g antibiotikum WS-4545 i 18 ml pyridin sættes dråbevis under afkøling til mellem -5 og -10°C under omrø= ring i løbet af 30 minutter 1,43 g 2-furoylchlorid. Blandingen omrøres i 2 timer ved den ovenfor angivne temperatur, og derefter tilsættes 40 ml vand. Opløsningsmidlet afdestilleres under reduce= ret tryk, og remanensen opløses i vand. Opløsningen vaskes med ethylaeetat og mættes derefter med natriumchlorid. Opløsningen ekstraheres med ethylaeetat, og ethylacetatfasen vaskes med vandig natriumbicarbonatopløsning, hvorefter ethylacetatfasen tørres over magnesiumsulfat. Opløsningsmidlet afdestilléres .under reduceret

DK 155739B

32 tryk, og remanensen omkrystalliseres af en blanding af ethylacetat og benzen, hvorved der fås 0,93 g 2-furanearboxylsyreester af antibiotikum WS-4545 i form af farveløse krystaller med smp. 125°C.

Analyse:

Beregnet for C 51,51 H 5,09 N 7,07

Bundet: C 51,32 H 5,03 N 7,11.

(B) Ben ved den ovenfor angivne omkrystallisation vundne moderlud koncentreres under reduceret tryk, og remanensen adsorberes på silicagel i en'kplonne, hvorefter eluering foretages med en blan= ding af chloroform og methanol (15:1)· Eluatet koncentreres under reduceret tryk, og remanensen omkrystalliseres af en blanding af chloroform og methanol, hvorved der fås 0,6 g bis-(2-furancarbo= xylsyreester) af antibiotikum WS-4545 i form af farveløse krystal= ler med smp. 183 - 184°C.

Analyse:

Beregnet for ^22ΕΖΖΉΖ°11: C 53,88 H 4,52 I 5,71

Bundet: * C 53,66 H 4,33 E 5,53-

Eksempel 20.

Til en opløsning af 3,02 g antibiotikum WS-4545 i 12 ml af en blan= ding af pyridin og acetone (9:3) sættes dråbevis under omrøring og afkøling ved 0 - 5°C i et isvandbad i løbet af 1 time en opløsning af 3,02 g hexanoylchlorid i 3 ml acetone. Reaktionsblandingen om= røres ved den samme temperatur i 1 time. Til reaktionsblandingen sættes 3 rumfang koldt vand, hvorefter opløsningen koncentreres under reduceret tryk. Remanensen opløses i ethylacetat, og opløs= ningen vaskes med vand, vandig natriumbicarbonatopløsning og vand i den angivne rækkefølge og tørres derefter over magnesiumsulfat. Opløsningen koncentreres under reduceret tryk, og remanensen krystal= liseres af en blanding af benzen og n-hexan, hvorved fås 2,3 g rå krystaller. Be rå krystaller omkrystalliseres af acetonitril, hvor= ved fås 1,8 g hexansyreester af antibiotikum WS-4545 i form af farveløse krystaller med smeltepunkt 144 - 145°0.

33

DK 155739 B

Analyse:

Beregnet for C-^gi^gl^Og: 0 54>00 H 7,04 N 6,99 Bundet: 0 54,11 H 7,18 ΪΓ 7,00.

Eksempel 21.

Udgangsmaterialer: 12,08 g antibiotikum WS-4545 og 5,92 g b.epta= noylciilorid.

Opløsningsmiddel til omkrystallisationen: Acetonitril.

Acylderivat: 5.5 g heptansyreester af antibiotikum WS-4545 i form af farveløse krystaller med smeltepunkt 139 - 141°C.

Analyse:

Beregnet for C-^H^qE^Oq: 0 55,05 H 7,30 0 6,76

Bundet: 0 54,60 H 7,42 0 6,86.

Eksempel 22.

Udgangsmaterialer: 9.06 g antibiotikum WS-4545 og 4,88 g octanoylchlorid.

Opløsningsmiddel til omkrystallisationen:

Acetonitril.

Acylderivat: 5,15 g octansyreester af antibiotikum WS-4545 i form af farveløse krystaller med smeltepunkt 140 - 142°C.

Analyse:

Beregnet for ^2^"52^2^Ql ^ 56,07 H 7,52 IT 6,54

Bundet: C 55,77 H 7,69 F 6,53.

34

DK 155739 B

Eksempel 23.

Udgangsmaterialer: 9>06 g antibiotikum WS-4545 og 5,7 g decanoylchlorid.

Opløsningsmiddel til omkrystallisation:

Acetonitril.

Acylderivat: 6,0 g decansyreester af antibiotikum WS-4545 i form af farveløse krystaller med smeltepunkt 146 - 147°0.

Analyse:

Beregnet for 022H56E208: C 57,88 H 7,95 N 6,14

Fundet: C 57,79 H 8,07 U 6,24.

Eksempel 24.

Udgangsmaterialer: 5.02 g antibiotikum WS-4545 og 1,52 g pivaloylcblorid.

Opløsningsmiddel til omkrystallisation:

Acetonitril.

Acylderivat: 1,5 g pivalinsyreester af antibiotikum WS-4545 i form af farveløse krystaller med smeltepunkt 200 - 201°C (sønderdeling).

Analyse:

Beregnet for 017H26U208: C 52,85 H 6,78 Έ 7,25

Fundet: C 52,54 H 6,92 Ή 7,19.

Eksempel 25.

Udgangsmaterialer: 50.2 g antibiotikum WS-4545 og 14,8 g 2-meth.ylbutyrylch.lorid, Opløsningsmiddel til omkrystallisation: "Rfin izfin .

35 DK 155739 B

Acylderivat: 5,4 g 2-methylsmørsyreester af antibiotikum WS-4545 i form af farveløse krystaller med smeltepunkt 157 - 159°C (sønderdeling).

Analyse:

Beregnet for C 52,84 H 6,78 1ST 7,25

Bundet: C 52,64 Ξ 6,90 IT 7,14.

Eksempel 26.

Udgangsmaterialer: 3,02 g antibiotikum WS-4545 og 2,23 g methyl· thioeddikesyreanhydrid.

Opløsningsmiddel til omkrystallisation: En blanding af benzen og ethylacetat.

Acylderivat: 2,15 g methylthioeddikesyreester af antibiotikum WS-4545 i form af farveløse krystalnåle med smeltepunkt 79 - 84°C.

Analyse:

Beregnet for C15H2508U2S: C 46,15 H 5,68 ET 7,18 S 8,21

Eundet: C 46,32 H 5,90 N 7,26 S 8,20.

Eksempel 27.

Udgangsmaterialer: 27,2 g antibiotikum WS-4545 og 22,5 g isopropyl= thioeddikesyreanhydrid.

Opløsningsmiddel til omkrystallisation: En blanding af ethylacetat og isopropylether.

Acylderivat: 16,6 g isopropylthioeddikesyreester af antibiotikum WS-4545 i form af farveløse krystalprismer med smeltepunkt 89 -92°C.

Analyse:

Beregnet for C^H^OgE^S: G 48,80 H 6,26 ET 6,70

Eundet: 0 48,38 H 6,15 N 6,48.

36 DK 15 5 7 3 9 B

Eksempel 28.

Udgangsmaterialer: 30,2 g antibiotikum WS-4545 og 15>3 g 2-methyl-thiopropionylchlorid.

Opløsningsmiddel til omkrystallisation: Benzen.

Acylderivat: 13,7 g 2-methylthiopropionsyreester af antibiotikum WS-4545 i form af farveløse krystaller med smeltepunkt 90 - 95°C.

Analyse:

Beregnet for 0l6H2408IT2S. 1/6 H20: 0 47,17 H 6,02 tf 6,88 S 7,87 Eundet: 0 46,97 H 6,05 tf 6,65 S 8,02.

Eksempel 29.

Til en opløsning af 10,9 g antibiotikum WS-4545 i 60 ml pyridin sættes dråbevis under omrøring ved 3°C i løbet af 25 minutter 6,6 g 3-vinylpropionsyreanhydrid. Reaktionsblandingen omrøres ved 3°C i 30 minutter og ved 3 - 17°C i 14 timer. Efter at omsætningen er afsluttet,fjernes pyridinet fra reaktionsblandingen under redu= ceret tryk. Til remanensen sættes isvand, og derefter vaskes opløs= ningen med ether. Opløsningen mættes med natriumchlorid og ekstra= heres derefter med ethylaeetat. Ethylacetatfasen vaskes med en mættet vandig natriumehloridopløsning og tørres derefter over mag= nesiumsulfat, hvorved fås 9,0 g amorft pulver. Det amorfe pulver opløses i benzen. Benzenopløsningen lades henstå natten over, hvor= ved fås 7,1 g rå krystaller. Be rå krystaller omkrystalliseres af en blanding af ethylaeetat og diisopropylether, hvorved fås 6,1 g 3-vinylpropionsyreester af antibiotikum WS-4545 i form af farve= løse krystaller med smeltepunkt 170 - 172°C.

Analyse:

Beregnet for C 53,12 H 6,29 tf 7,29

Eundet: C 53,14 H 6,41 tf 7,18.

Eksempel 30.

37 DK 155739 B

Udgangsmaterialer: 30,2 g antibiotikum WS-4545 og 20,0 g 3-methyl= crotonsyreanhydrid.

Opløsningsmiddel til omkrystallisation: En blanding af isopropyl= ether og ethylacetat.

Anylderivat: 5,9 g 3-methylcrotonsyreester af antibiotikum WS-4545 i form af farveløse krystaller med smeltepunkt 132 - 135°0.

Analyse:

Beregnet for Ο-^^Ϊ^Ο^ΐ/β H20: C 52,71 H 6,33 U 7,23 Fundet: C 52,61 Ξ 6,31 U 7,00.

t

Eksempel 31.

Udgangsmaterialer: 30,2 g antibiotikum WS-4545 og 27,9 g phenyl= eddikesyreanhydrid.

Opløsningsmiddel til omkrystallisation: En blanding af ethylacetat og isopropylether.

Aeylderivat: 6,6 g phenyleddikesyreester af antibiotikum WS-4545 i form af farveløse krystaller med smeltepunkt 96 - 100°0 (sønder= deling).

Analyse:

Beregnet for C19H24N208.2/3 CH^COOC^: C 55,70 H 6,33 Έ 6,00 Fundet: C 55,94 H 5,73 F 6,10.

Eksempel 32.

Udgangsmaterialer: 30,2 g antibiotikum WS-4545 og 34,8 g p-nitro= benzoesyreanhydrid.

Opløsningsmiddel til omkrystallisation: En blanding af ethylacetat og ethylether.

DK 155739 B

OO

Acylderivat: 28,5 g p-nitrobenzoesyreester af antibiotikum WS-4545 i form af farveløse krystaller med smeltepunkt 135 - 137°C.

Analyse:

Beregnet for ^9^21^3^10: ® 50,56 H 4>69 F 9>31 Bundet: C 50,19 H 4>50 F 9>20.

Eksempel 33.

Udgangsmaterialer: 20,0 g antibiotikum WS-4545 og 20,8 g phenoxy= eddikesyreanhydrid.

Opløsningsmiddel til omkrystallisation: Ethanol.

Acylderivat: 12,5 g phenoxyeddikesyreester af antibiotikum WS-4545 i form af farveløse prismer med smeltepunkt 105 - 109° 0.

Analyse:

Beregnet for σ20Η32^209*2//^ CgH^OH: C 54>85 H 6,04 F 6,00 Bundet: C 54>86 H 6,11 F 5>96.

Eksempel 34.

Til en opløsning af 20 g antibiotikum WS-4545 i 150 ml pyridin sæt= tes dråbevis under afkøling 19>43 g tMenyleddikesyreanhydrid, og blandingen omrøres i 5 timer. Til reaktionsblandingen sættes vand, og opløsningen koncentreres under reduceret tryk. Remanensen opløses i ethylaeetat, og opløsningen vaskes med vand, vandig natriumbi= carbonatopløsning og vand i den angivne rækkefølge og tørres der= efter over magnesiumsulfat. Opløsningsmidlet afdestilleres, og remanensen behandles med aktivt kul, hvorefter remanensen omkry= stalliseres af en blanding af ethylacetat og isopropylether, hvor= ved fås krystaller, som omkrystalliseres af en blanding af ethyl= acetat og isopropylether, hvorved fås 13>5 g thienyl eddikesyreester af antibiotikum WS-4545 i form af farveløse prismatiske krystaller med smeltepunkt 171 - 172°C.

Analyse:

•Rar»oo-ne4: -Por» Π TT Π TCT S. Π RH 7Π TT R _ PD W 6 . R7 S 7.W

39 ’ DK 155739 B

Eksempel 35.

Til en opløsning af 24,2 g antibiotikum WS-4545 i 70 ml pyridin sæt= tes dråbevis under omrøring og afkøling ved en temperatur mellem -5 og 0°C i løbet af 1 time 19,7 g ethylthioeddikesyreanhydrid. Reaktionsblandingen omrøres ved den samme temperatur i 1 time og lades derefter henstå natten over ved stuetemperatur. Til reaktions= blandingen sættes 3 rumfang vand, og .derefter koncentreres opløs= ningen under reduceret tryk ved 50°C, hvorved fås en gul olieagtig remanens. Remanensen opløses i 200 ml ethylacetat, og opløsningen vaskes flere gange med en kold 10$'s vandig saltsyreopløsning, ind= til den vandige fase er sur, til fjernelse af pyridin. Den pågælden= de forbindelse ekstraheres to gange fra den udsaltede vandige fase med 50 ml ethylacetat. De samlede ekstrakter vaskes to gange med en mættet vandig natriumhydrogencarbonatopløsning, og den vandige fase ber-handles under anvendelse af en udsaltningsfremgangsmåde og ekstraheres med ethylacetat. Ethylacetatfasen vaskes tre gange med en mættet vandig natriumchloridopløsning, tørres over magnesiumsulfat og kon= centreres under reduceret tryk, hvorved fås 26 g af et råt pulver. Pulveret krystalliseres af 200 ml af en blanding af benzen og ethyl= acetat (1:1), hvorved fås 24,76 g farveløse krystalnåle. Krystalnåle= ne omkrystalliseres af 200 ml ethylacetat, hvorved fås 9,95 g ethyl= thioeddikesyreester af antibiotikum WS-4545 i form af farveløse nålekrystaller, som sønderdeles ved 142 - 145°C.

Analyse:

Beregnet for Ci6H240qN2S.1/4 H20: C 46,99 H 6,04 N 6,85 S 7,83

Fundet: C 46,90 H 5,95 N 6,83 S 7,77.

Under anvendelse af i det væsentlige den i eksempel 35 beskrevne fremgangsmåde fås de i eksemplerne 36 - 39 angivne acylderivater af antibiotikum WS-4545.

Eksempel 36.

Udgangsmaterialer: 36,5 g antibiotikum WS-4545 og 33,5 g valerianesyreanhydrid.

40 DK 155739 B

Opløsningsmiddel til omkrystallisation:-Ethylacetat.

Acylderivat: 11,8 g valerianesyreester af antibiotikum WS-4545 i form af farvelø= se nålekrystaller med smeltepunkt 146 - 148°C (sønderdeling).

Analyse:

Beregnet for c17H2608N2.1/2 H20: C 51,67 H 6,76 N 7,09 Fundet: C 51,82 H 6,71 N 7,15.

Eksempel 37.

Udgangsmaterialer: 55 g antibiotikum WS-4545 og 22,5 g tetrahydro-2-thenoylchlorid.

Opløsningsmiddel til omkrystallisation: Éthylacetat.

Acylderivat: 14,5 g tetrahydro-2-thenoinsyreester af antibiotikum WS-4545 i form af farTeløse nålekrystaller med smeltepunkt 146 - 148°C (sønderde= ling).

Analyse:

Beregnet for C^H^OgNgS.78/100 HgO: C 48,66 H 5,85 N 6,68 S 7,64 Fundet: C 48,56 H 5,89 N 6,58 S 7,44

Eksempel 38.

Udgangsmaterialer: 24,2 g antibiotikum WS-4545 og 24,15 g tert.butylthioeddikesyrean= hydrid.

Opløsningsmiddel til omkrystallisation: Éthylacetat.

41

DK 155739 B

Acylderivat: 10.5 g tert.butylthioeddikesyreester af antibiotikum WS-4545 i form af farveløse nålekrystaller med smeltepunkt 139 - 140°C (sønder= deling).

Analyse:

Beregnet for C]_8H28°8N2S: C 49,20 H 6,52

Fundet: C 49,18 H 6,49.

Eksempel 39.

Udgangsmaterialer: 35 g antibiotikum WS-4545 og 30 g 2-tert.butylthiopropionsyreanhydrid.

Opløsningsmiddel til omkrystallisation:

Acetonitril.

Acylderivat; 6.5 g 2-tert.butylthiopropionsyreester af antibiotikum WS-4545 i form af farveløse nålekrystaller med smeltepunkt 152 - 154°C (sønder= deling).

Analyse:

Beregnet for CigH300gN2S.l/8 H20: C 50,85 H 6,74 N 6,24

Fundet: C 50,80 H 6,77 N 6,33.

Fremstilling af udgangsforbinåelsen,- antibiotikum WS-4545.

Eksempel 40.

I 500 ml’s kolber hældes 100 ml af følgende dyrkningsmedium: 2$ stivelse, 1$ tørret gær,l$ bomuldsfrømel, 1$ glutenmel, 1 <f0 jord= nøddemel, 2,18$ KHgPO^ og 1,43$ WagHPO^.^HgO i ledningsvand. Der anvendes seks kolber.

Mediet'steriliseres ved opvarmning til ca. 120°0 i ca. 30 minutter i en autoklav og afkøles derefterHver kolbe inokuleres med sporer

42 DK 155739 B

og mycelium af Streptomyces sapporonensis ATCC 21532 fra et agar= skråglas. Organismen dyrkes i mediet ved ca. 30°C i en periode på 48 timer under omrystning.

I en 30 liters rustfri ståltank hældes 20 liter·fermentationsmedium indeholdende de ovenfor angivne bestanddele i de· angivne proeent= mængder. Mediet steriliseres ved opvarmning til ca. 120°C i ea. 30 minutter under tryk. Det afkølede fermentationsmedium inokuleres under aseptiske betingelser med den ovenfor angivne vegetative ino= kulationskultur i en mængde på 3$ af mediets rumfang, og derefter lades organismen vokse ved 30°G. i 48 timer. Under væksten omrøres fermentationsvæsken med en propel med 300 omdrejninger pr. minut, og der blæses steril luft gennem fermentationsvæsken i en mængde på ea. 20 liter luft pr. minut.

Efter at fermentationen er tilendebragt, filtreres fermentationsvæs= ken til fjernelse af myceliet, idet der til fementationsvæsken sæt= tes 1 fo "Radiolite" (varemærke for filtermateriale, som sælges af Showa Chemical Company). Eiltratet indstilles på en pH-værdi på 7>0, og der tilsættes 500 g aktivt kul. Blandingen omrøres i 5 minutter, og derefter fraskilles den aktive kulkage ved filtrering. Der sæt= tes 10 liter vand til denne kage, og blandingen omrøres, hvorefter den aktive kulkage fraskilles ved filtrering. Derefter ekstraheres den aktive kulkage, som indeholder antibiotikum, med 5 liter 50$'s vandigt acetone', og der omrøres i 5 minutter. Ekstraktionen fore= tages to gange. De samlede vandige acetoneekstrakter koncentreres, hvorved der fås en sirupagtig remanens.

Den resulterende remanens sættes på en kolonne af cellulose, og elue= ring udføres med vandigt butanol. Der udtages successivt fraktio= ner til styrkebestemmelse. De fraktioner,' som har antimikrobiel akti= vitet, samles og koncentreres, hvilket giver en gul olieagtig rema= . nens. Denne remanens sættes på en kolonne, som er pakket med kisel= syre. Efter vask af kolonnen med chloroform elueres med en blanding af chloroform og methanol (5:1). Der udtages successivt fraktioner, til styrkebestemmelse. De fraktioner, som har antimikrobiel aktivitet samles og koncentreres. Remanensen frysetørres, hvilket giver 350 mg hvidt pulver. Pulveret opløses i 20 ml varmt acetone. Aeetoneop= løsningen holdes i køleskab, hvorved der fås 300 mg antibiotikum WS-4545 i form af rhombiske krystaller..

Eksempel 41.

« DK 155739 B

Til en fermentationsvæske fremstillet på den i eksempel 40 beskrevne måde sættes 1 $ "Radiolite", og der filtreres. Der sættes 400 g aktivt kul til 14 liter filtrat, som indstilles på en pH-værdi på 7,0, og blandingen omrøres i 20 minutter. Efter filtrering af blandingen vaskes den aktive kulkage med 5 liter vand og ekstraheres derefter med 3 liter af en blanding af ethylacetat og methanol (5:1). Den angivne ekstraktionsprocedure udføres to gange. Ekstrakterne samles og koncentreres til ca. 50 ml under reduceret tryk. Til det sirup= agtige koncentrat sættes 20 ml acetone, og acetoneopløsningen filtre= res til fjernelse af urenheder. Piltratet koncentreres. Kemanensen tørres og sættes derefter på en kolonne, som er pakket med silica= gel og fyldt med chloroform, og chloroform lades løbe gennem kolon= nen til fjernelse af urenheder. Der foretages eluering med acetone. Der udtages successivt fraktioner til styrkebestemmelse. De frak= tioner, som har antimikrobiel aktivitet, samles og koncentreres, hvilket giver 1,25 g hvide krystaller. Krystallerne pulveriseres ved tilsætning af en ringe mængde methanol, og derefter omkrystal= liseres pulveret af acetone, hvilket giver 1,0 g antibiotikum WS-4545 som hvide monocliniske krystalnåle.

Eksempel 42.

I seks 500 ml’s kolber hældes 100 ml af følgende dyrkningsmedium: 2$ stivelse, 1$ bomuldsfrømel, 1$ glutenmel, 1$ MgCl2.6H20, 2,18$ KH2P0^ og 1,45$ Ha2HP0^.12H20 i ledningsvand.

Dette medium steriliseres på konventionel· måde, og hver kolbe ino= kuleres med sporer og mycelium af Streptomyces sapporonensis ATCC 21552. Organismen lades vokse i mediet ved ca. 30°C i en periode på 48 timer under omrystning.

I en 30 liters rustfri ståltank hældes 20 liter fermentationsmedium, som indeholder de ovenfor angivne bestanddele i de angivne procent= vise mængder. Dyrkningsmediet steriliseres ved opvarmning til ca.

120°C under tryk i ca. 30 minutter og derefter afkøles. Mediet inokuleres aseptisk med den ovenfor.angivne vegetative inokulations= kultur i en mængde på 3$ af mediets rumfang, og derefter lades

Claims (8)

1. R1 betegner en acylgruppe udvalgt blandt alkanoyl med 2-17 car-bonatomer? alkanoyl med 3-8 carbonatomer, hvor der i carbonkæden er indskudt et svovlatom; alkenoyl med 3-7 carbonatomer; benzoyl, der eventuelt er substitueret med én substituent udvalgt blandt halogen, nitro, alkyl med 1-3 carbonatomer og alkoxy med 1-3 carbonatomer; 3,4-dimethylbenzoyl; C2_^“alkanoyl eller C^_^-alkenoyl, der hver er substitueret med phenyl, som eventuelt er substitueret med halogen, hvorhos der i alkandelens carbonkæde kan være indskudt et oxygenatom; C2_^-alkanoyl substitueret med thienyl; cyclohexylcar-bonyl; og en heterocyclylcarbonyl samt en benzenkondenseret hete-rocyclylcarbonyl, idet den heterocycliske ring og benzenkondenserede heterocycliske ring udvælges blandt pyridyl, furyl, tetrahy- 2 drothienyl, benzopyridyl og benzofuryl; og R betegner hydrogen, eller 1 2

1. Analogifremgangsmåde til fremstilling af bicyclomycinderivater med den almene formel I

45 DK 155739 B CH, OH n 2 1 C - C ,-00 / \ h9c m I . I Η2οχ co i 0 _ 0-m - I 2 HC-oir HO-C-CH* I \ CHgOE1 hvor

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at R^ er palmitoyl.

2. R og R er ens og betegner hver C3_,.-alkanoyl eller furoyl, kendetegnet ved, at en forbindelse med formlen II CH9 OH I! ά ! C - C- 00 / \ h9c m ί I h9c CO \ - c -— m τ1 HC-OH HO-C-CH- i 3 DK 15 5 7 β omsættes med en carboxylsyre med formlen R^-OH hvor R"*· har den ovenfor angivne betydning, eller et reaktivt derivat deraf ved carboxygruppen, og det dannede monoacylderivat med formlen I isoleres, eller, såfremt R^ betegner C^^-alkanoyl eller furoyl, det dannede diacylderivat med formlen I isoleres.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at R^ er benzoyl.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at R^ er cyclohexylcarbonyl.

5. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at R^ er butyryl.

6. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at R"*" er p-chlorbenzoyl.

7. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at R^" er 3,4-dimethylbenzoyl.

8. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at R·*· er cinnamoyl.