DK149003B - Fremgangsmaade til fremstilling af polyhydro-3,7-dimethyl-8-(2-tetrahydro-4-hydroxy-6-oxo-2h-pyran-2-yl)ethyl)-1-naphthyl-1-methylbutyrat-forbindelser eller de tilsvarende hydroxysyrer eller salte eller estere deraf - Google Patents

Description

149003

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af polyhydro-3,7-dimethyl-8-(2-tetrahydro-

4-hydroxy-6-o»o-2H-pyran-2-yl) ethyl) -1-naphthyl-l-iæthylbutyrat-for-birdelser med formlerne I og II eller de tilsvarende hydroxysyrer 5 med formlerne III og IV

1° ch3 ^ ljya3 ts3 ^AJyCH3 CE, CT3

I II

15 HONQCOOH E°V^C0°H

20 CH3 ch3

m IV

såvel som farmaceutisk acceptable salte eller estere 25 deraf. Esterne kan være eventuelt substituerede lavere alkylestere deraf, hvor den eventuelle substituent kan være phenyl, dimethylamino eller acetylamino. Disse forbindelser har udmærkede egenskaber i henseende til inhibering af cholesterol-biosyntese, og de er nyttige ^ mod hypercholesteremia og hyperlipemia.

På grund af den mulige forbindelse mellem højt chole-sterolindhold i blodet og atherosclerosis har der været gjort mange forsøg på at finde måder og stoffer, som t, 5 kan reducere cholesterolindholdet i et pattedyrslegeme.

En af disse måder er at inhibere legemets evne til at syntetisere cholesterol.

2 149003

For nylig har Endo et al. (US-patentskrift nr. 4 049 495 og 3 983 140) beskrevet et fermenteringsprodukt opnået ved dyrkning af en mikroorganisme af slægten Penicillium og isolering deraf fra mediet. De kaldte det ML 236 B 5 og bestemte dets struktur sammen med to dermed beslægtede forbindelser 236 A og 236 C. Dets struktur blev også, under navnet compactin, bestemt af A.G. Brown, T.C. Smale, T.J. King, J. Chem. Soc., (Perkin I) 1165 (1975). Denne forbindelse har vist sig at være .en in 10 vivo inhibitor for biosyntesen af cholesterol.

Det har uventet vist sig, at dyrkningen af mikroorganismer, der er meget forskellig fra den, der blev anvendt af Endo, nemlig mikroorganismer af arten Aspergillus 15 terreus, giver forbindelser, som er langt kraftigere inhibitorer for cholesterolsyntese in vivo end den forbindelse, der.er beskrevet af Endo, ML 236 B. Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er i overensstemmelse hermed ejendommelig ved, at man fermenterer et næringsmedium 20 med en mikroorganisme af arten Aspergillus terreus og isolerer produkterne, hvorefter man om ønsket overfører en fremstillet forbindelse i et farmaceutisk acceptabelt salt eller en ester deraf.

25 Fra beskrivelserne til de danske patentansøgninger nr.

730/80 og 731/80 må det anses for kendt at fremstille en forbindelse med den ovenfor viste formel I, da kaldet monacolin K, ved at dyrke en række stammer af slægten Monascus.

30

De farmaceutisk acceptable salte af de omhandlede forbindelser omfatter salte dannet af kationer, såsom natrium, kalium, aluminium, calcium, lithium, magnesium, zink, ammoniak, ethylendiamin, N-methylglucamin, lysin, 35 arginin, ornithin, cholin, Ν,Ν'-dibenzylethylendiamin, 3 149003 chlorprocain, diethanolamin, procain, N-benzylphenethyl-amin, 1-p-chlorbenzyl-2-pyrrolidin-1'-y1-methylbenzimida-zol, diethylamin, piperazin, tris-(hydroxymethyl)aminome-than og tetramethylammonium.

5

De omhandlede forbindelser er yderst nyttige som anti-hypercholesteremiske midler til behandling af atherosclerosis, hyperlipemia og lignende lidelser hos mennesker. De kan administreres oralt eller parenteralt 10 i form af en kapsel, en tablet, et injicerbart præparat eller lignende. Det er sædvanligvis ønskeligt at anvende den orale vej. Doser kan varieres, afhængigt af alder, alvor, legemsvægt og andre tilstande for de menneskelige patienter, men daglige doser for voksne 15 ligger normalt i området cirka 2 - cirka 2.000 mg (fo-retrukkent 2 - 100 mg), som kan gives i to eller fire opdelte doser. Højere doser kan med fordel anvendes efter behov.

20 De omhandlede forbindelser har også nyttige antifunga- le virkninger. De kan for eksempel anvendes til kontrol med stammer af Penicillium sp., Aspergillus niger, Cladosporium sp., Cochliobolus miyabeorus og Helmintho-sporium cynodnotis. Til disse anvendelser kan de blan-25 des med hensigtsmæssige formuleringsmidler, pulvere, emulgeringsmidler eller opløsningsmidler, såsom vandig ethanol, og sprøjtes eller støves på de planter, der skal beskyttes.

30 Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen anvendes fortrinsvis en af de hidtil ukendte stammer, hvoraf en kultur er blevet deponeret permanent i American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, under henholdsvis accessionsnummer ATCC 20541 og ATCC 35 20542. Sidstnævnte organisme er den, der giver det bedste udbytte. Der kan dog anvendes andre stammer af arten Aspergillus terreus, herunder mutanter af ovennævnte.

4 149003

De morfologiske egenskaber for mikroorganismerne ATCC 20541 og ATCC 20542 har vist sig at være de samme som for andre stammer af slægten Aspergillus. Under anvendelse af de kriterier, der er specificeret i standardværket 5 "Manual of the Aspergilli", Charles Thom og Kenneth B.

Rasper, udgivet af Williams og Wilkins Company, Baltimore, Md., 1945, og ved sammenligning med kendte arter er det blevet bestemt, at begge stammer tilhører arten Aspergillus terreus.

10

Dyrkningen af disse organismer til fremstilling af de omhandlede forbindelser udføres i vandige medier, såsom dem, der anvendes til fremstilling af andre fermenteringsprodukter. Sådanne medier indeholder kilder for carbon, ni-15 trogen og uorganiske salte, der er assimilerbare for mikroorganismen.

Generelt kan kulhydrater, såsom sukkerarter, f.eks. glucose, fructose, maltose, saccharose, xylose og man-20 nitol, og stivelser, såsom kornprodukter, f.eks. havre, rug, majsstivelse og majsmel, anvendes enten alene eller i kombination med andre kilder for assimilerbart carbon i et næringsmedium. Den nøjagtige mængde kulhydratkilde eller -kilder, der anvendes i mediet, af-25 hænger tildels af de andre bestanddele i mediet, men i almindelighed varierer mængden af kulhydrat mellem cirka 1 og cirka 6 vægtprocent af mediet. Disse car-bonkilder kan anvendes individuelt, eller flere sådanne carbonkilder kan kombineres i mediet. Generelt kan 30 mange proteinmaterialer anvendes som nitrogenkilder ved fermenteringsprocessen. Egnede nitrogenkilder omfatter for eksempel gærhydrolysater, primær gær, sojabønnemel, bomuldsfrømel, hydrolysater af casein, majsstøbevæske, distiller's solubles eller tomatpasta.

35 Nitrogenkilderne anvendes enten alene eller i kombination i mængder beliggende fra cirka 0,2 til cirka 6 vægtprocent af det vandige medium.

149003 5

Blandt de uorganiske næringssalte, der kan inkorporeres i dyrkningsmediet, er almindeligvis salte, der er i stand til at give natrium, kalium, ammonium, calcium, phosphat, sulfat, chlorid, carbonat og lignende ioner.

5 Også spormetaller kan være til stede, f.eks. cobolt, mangan, jern og magnesium.

De carbonkilder, der anvendes i dyrkningsmediet , kan specifikt være dextrose, dextrin, havremel, havregryn, melas-10 se, citrat, sojabønneolie, glycerol, maltekstrakt, torskeleverolie (torskelevertran), stivelse, ethanol, figner, natriumascorbat og fedtolie. Blandt nitrogenkilder kan nævnes peptoniseret mælk, autolyseret gær, gær-RNA, tomatpasta, casein, primær gær, jordnøddemel, distiller's so-15 lu bles, majsstøbevæske, sojabønnemel, majsmel, NZ-amin, oksekødekstrakt, asparagin, bomuldsfrømel og ammoniumsulfat. De væsentligste ioniske komponenter er CaCO^, KH^PO^,

MgSO^ ^71^0 og NaCl og små mængder af CaC^^ I^O samt spor af Fe, Μη, Mo, B og Cu.

20

Fermenteringen udføres ved temperaturer beliggende i området fra cirka 20 til cirka 37°C, men til optimale resultater er det at foretrække at udføre fermenteringen ved temperaturer på fra cirka 22 til cirka 30°C.

25 pH for næringsmediet, der er hensigtsmæssigt til dyrkning af Aspergillus-kulturen, kan variere fra cirka 6,0 til cirka 8,0.

Skønt de omhandlede forbindelser fremstilles både 30 ved overfladedyrkning og neddykket dyrkning, foretrækkes det at udføre fermenteringen i neddykket tilstand. En fermentering i lille skala udføres hensigtsmæssigt ved at inokulere et hensigtsmæssigt næringsmedium med Aspergillus-kulturen og, efter overførsel 35 til et produktionsmedium, at lade fermenteringen skride frem ved konstant temperatur på cirka 28°C på en ryster i flere dage.

149003 6

Fermenteringen initieres i en steriliseret beholder med medium via et eller flere trin med udvikling af podestof. Næringsmediet for podetrinnet kan være en vilkårlig kombination af carbon- og nitrogenkilder.

5 Podebeholderen rystes i et kammer ved konstant temperatur på cirka 28°C i 2 dage, eller indtil vasksten er tilfredsstillende, og noget af den resulterende vækst anvendes til at inokulere enten i et andet podetrin eller produktionsmediet. Mellemtrins-podebeholdere 10 udvikles, når de anvendes, i det væsentlige på samme måde, dvs. en del af indholdet fra beholderen fra det sidste podetrin anvendes til at inokulere produktionsmediet. De inokulerede beholdere rystes ved konstant temperatur i flere dage, og ved afslutningen 15 af inkuberingsperioden centrifugeres eller filtreres indholdet af beholderne.

Til arbejde i stor skala er det at foretrække at udføre fermenteringen i egnede beholdere udstyret med 20 en agitator (ryste- eller omrøringsanordning) og et middel til at lufte fermenteringsmediet. Ved denne fremgangsmåde anbringes næringsmediet i beholderen, og det steriliseres ved opvarmning til temperaturer på op til cirka 120°C. Efter afkøling inokuleres det ste-25 riliserede medium med et forud dyrket podemateriale af produktionskulturen, og fermenteringen får lov at skride frem i et tidsrum på for eksempel 3.-5 dage under agitering og/eller luftning af næringsmediet og opretholdelse af temperaturen på cirka 28°C. Denne måde til 30 at fremstille de omhandlede forbindelser på er særlig hensigtsmæssig til fremstilling af store mængder.

Forbindelserne isoleres hensigtsmæssigt fra fermenteringsmediet som lactoner I og II. Alternativt kan de 35 isoleres som salte af forbindelser III og IV.

149003 7

Forbindelserne I og II kan hydrolyseres med baser, såsom NaOH, til opnåelse af salte, såsom natriumsaltene af forbindelserne III og IV. Anvendelsen af baser med andre farmaceutisk acceptable kationer giver salte af 5 disse kationer. Omhyggelig syrning af saltene giver hydroxysyrerne III og IV. Hydroxysyrerne III og IV kan overføres til forbindelserne I og II ved surt pH. Behandling af forbindelserne I og II ved sur eller basisk katalyse med methanol, ethanol, propanol eller butanol 10 eller med phenyl-, dimethylamino- eller acetylamino- alkanoler giver de tilsvarende estere af forbindelserne III og IV .

Forbindelser III og IV, og specielt III, kan hensigts- 15 mæssigt isoleres uden behov for kromatografi, i form af ammoniumsaltene. Denne isolering er hensigtsmæssig og passer meget bedre til kommerciel anvendelse end kromatografi. Endvidere er salte af forbindelserne III og IV meget mere aktive end forbindelser I og II in vi- 20 tro ved inhibering af cholesterol-biosyntese og som fungicide midler. Hydroxysyrerne (og deres salte) synes faktisk at være de aktive former. Derfor er disse salte særligt foretrukne i doseringsformer. Foretrukne salte, foruden ammonium, er tetramethylammonium og salte af ethyl-endiamin, natrium, kalium, calcium, N-methylglucamin, glycin, arginin og ornithin.

De fysisk-kemiske egenskaber af forbindelse I (MSD-803) er summariseret som følger:

1. Smeltepunkt 170-171°C

2. Molekylvægt (massespektrum) 404 35 3. Formel C24H36®5 (Fundet ved spektrometri 404,255

Beregnet) 404,2563 8 149003 4. UV-spektrum (i acetonitril) Maksima: 230/5 nm med E% 505,7 237,5nm med E% 576,6 246 nm med E% 395,2 5- C NMR-Spektrum

Spektret blev optaget i CDCl3-opløsning (20,1 mg i 0,35 ml). Chemical sh.ift-værdier er angivet i forhold til intern tetramethylsilan-standard ved 0 ppm; 10 under forsøgsbetingelserne forekommer signalet af opløsningsmidlet (CDC13) centreret ved 70,2 ppm. I overensstemmelse med massespektraidata observeres der 24 carbonatomer, hvis værdier er: 15 11,5, 13,6, 16,0, 22,6, 24,1, 26,6, 27,2, 30,5, 32,5, 32,8, 35,9, 36,4, 37,1, 38,4, 41,3, 62,4, 67,8, 76,4, 128,4, 129,7, 131,7, 133,2, 170,8 og 177,2 ppm.

20 6. NMR spektrum

Spektret blev optaget i CDCl3~opløsning, og chemical shift-værdier er vist i fig. 1 i ppm i forhold til intern tetramethylsilanstandard ved 0 ppm.

25 7# ir spektrum

Det infrarøde spektrum blev optaget i et KBr-pellet præparat af en prøve. Det er vist på fig.

2.

30 8. Optisk drejning 25 ή

Den specifikke optiske drejning [aj^ = 320,7 blev bestemt på en opløsning af 5,30 mg pr. ml CHjCN. Denne værdi blev også opnået ved måling 35 af natrium-D-linie-bølgelængden.

149003 9 På basis af disse og andre data blev produktets struktur med forholdsvis stor sikkerhed bestemt til at have følgende stereokemiske struktur: Λ* 13

Den tilsvarende hydroxysyre III har strukturen:

HCL

15 V^cook

p S<°H

ChTX

20 CH3

Den absolutte konfiguration for de assymetriske centre i disse molekyler er blevet bestemt ved røntgenanalyse.

25 De fysisk-kemiske egenskaber for forbindelse II (MSD-883) er summariseret som følger:

1. Smeltepunkt 129-131°C

30 2. Molekylvagt 406 3. Formel C24H38°5 (Fundet ved massespektrometri 406,2706

Beregnet) 406.2719 35 10 149003 4. NMR spektrum

Spektret blev optaget i CDCl^-opløsning, og kemiske spring er vist i fig. 3 i ppm i forhold til indre tetramethylsilan ved o ppm.

5 5. IR spektrum

Det infrarøde spektrum blev optaget i et KBr-pellet præparat af en prøve. Det er vist på fig.

10 6. Optisk drejning

Den specifikke optiske drejning [a]^5 = 148,6° blev bestemt på en opløsning af 5,23 mg pr. ml 15 CH^CN. Denne værdi blev også opnået ved måling af natrium-D-linie-bølgelængden.

7. 13C NMR kemiske spring i CDClj 11,8, 14,9, 16,5, 21,1, 23,1, 26,7(2C), 30,9, 20 31,3, 33,0, 35,7, 35,9, 37,4, 38,5, 38,6, 41,9 (2C), 62,3, 70,1, 76,5, 131,0, 132,6, 171,2, 176,7.

På basis af disse og andre data blev produktets struktur bestemt til, med en vis sikkerhed, at have følgen-25 de kemiske struktur: BO^.0 30 CH.j£ jK jp 3

Den tilsvarende hydroxysyre, forbindelse IV, har så strukturen: 35 149003 11 HO- ^ V'Ntoch VS8 5 !

Opfindelsen forklares nærmere ved hjælp af de efterfølgende eksempler.

10 EKSEMPEL 1

FREMSTILLING AF FORBINDELSER I OG III

A. Fermentering

Et rør med lyofiliseret kultur Aspergillus terreus ATCC 20541 åbnes aseptisk, og indholdet suspenderes i en 250 ml Erlenmeyer-kolbe (podebeholder) indeholdende cirka 20 ml medium A. Medium A har følgende 20 sammensætning: 12 149003

Medium A

Majsstøbevæske 10 g

Tomatpasta 80 g

Havregryn 20 g 5 Glucose 20 g

Sporstofblanding nr. 2 20 g

Destilleret vand 1000 ml

ph 6,8 med NaOH

Sporstofblanding nr. 2 10 FeS04-7H20 1000 mg

MnS04-4H20 1000 mg

CuC12-2H20 25 mg

CaCl2-2H20 100 mg Η^ΒΟ^ 56 mg 15 (NH4)6Mo7024*4H20 19 mg

ZnS04«7H20 200 mg

Destilleret afioniseret vand 1000 ml

Den inokulerede beholder inkuberes i 48 timer ved 28°C på en 220 orodr./min. ryster (5 cm udsving). To 2 20 liters Erlenmeyer-kolber, der hver indeholder 500 ml medium B, inokuleres derpå hver især med 10 ml af væksten fra podebeholderen. Medium B har følgende sammensætning:

Medium B

25 Tomatpasta 20 g

Primær gær 10 g CPC-stivelse 20 g

CoC12»6H20 5 mg

Destilleret vand 1000 ml

30 pH 7,2 - 7,4 med NaOH

Disse to inokulerede beholdere inkuberes i 96 timer ved 28°C. Den ene beholder inkuberes uden omrøring eller omrystning. Den anden beholder inkuberes på 149003 13 en 150 omdr./min. omryster (5 cm udsving) . Efter 96 timers forløb sættes indholdet af hver beholder til side til isolering af produktet.

B. Isolering af forbindelse I

5 Hele dyrkningsmediet centrifugeres i 20 - 30 minutter. Fast stof gemmes til ekstraktion. Den overliggende væske (pH 6-8) anbringes i en 950 ml beholder, og 150 ml Amberlite ® XAD-2 harpiks (en polystyrenad-sortentnarpiks fra Rohm & Haas Co.) tilsættes. Under X0 anvendelse af en automatisk ekstraktør, der drives på forudind-stillet måde, omrøres blandingen i 2 timer. Det anvendte dyrkningsmedium frasprøjtes derpå og bortkastes. Harpiksen vaskes to gange med 200 ml afioniseret vand, og vaskevandet bortkastes. Dernæst til-15 sættes en portion på 300 ml blandet opløsningsmiddel: isopropanol/ethylacetat/dichlormethan 25:45:30.

Blandingen omrøres 2 timer. Opløsningsmiddel/harpiks-opslæmningen filtreres på en Biichner-tragt eller sintret glastragt, og harpiksen bortkastes. Det faste 20 stof fra dyrkningsmediet omrøres med 100 ml acetone i en halv time. Blandingen centrifugeres derpå, og den overliggende væske dekanteres. Det kombinerede filtrat og dekantat koncentreres til 15 ml.

C. Afprøvning af forbindelse I

25 Filtraterne blev afprøvet som inhibitorer for HMG-CoA-reduktaseenzym ved den metode, der er beskrevet af Beg, Stonik og Brewer (1977 FEBS Letters JJO 123 -129) under anvendelse af enzymer fremstillet som beskrevet af Kleinsek, Rangatham og Porter (1977 Proc.

30 Nat. Acad. Sci. 74 1431 - 1435). Det positive forsøg (over 90% inhibering ved 20 mikrogram pr. ml - en IC^q-værdi på 2,3 mikrogram pr. ml - indikerede tilstedeværelsen af en meget stærk inhibitor for sterolsynte-se, der virker på HMG-CoA-reduktase-niveauet.

14 149003 EKSEMPEL 2 FREMSTILLING AF FORBINDELSER I OG III A. Fermentering

Et rør med lyofiliseret kultur af Aspergillus terreus 5 ATCC 20541 åbnes aseptisk/ og indholdet suspenderes i en 250 ml Erlenmeyer-kolbe (podebeholder nr. 1) indeholdende 40 ml medium C. Medium C har følgende sammensætning:

Medium C

Majsstøbevæske 5 g 10 Tomatpasta 40 g

Havregryn 10 g

Glucose 10 g

Sporstofblanding nr. 2 10 g

Destilleret vand 1000 ml

15 pH 6,8 med NaOH

Den podede beholder inkuberes i 24 timer ved 28°C på en 220 omdr./min. ryster (5 cm udsving) i 24 timer.

Endnu otte 250 ml Erlenmeyer-kolber (podebeholder nr. 2), der hver indeholder 40 ml medium C, inokule-20 res derpå hver især med 2 ml pr. kolbe af væksten fra podebeholder nr. 1. Disse otte podebeholdere nr. 2 inkuberes i 24 timer ved 28°C på en 220 omdr./min. ryster (5 cm udsving). Tyve 2 liters Erlenmeyer-kolber indeholdende 500 ml medium B inokuleres derpå 25 hver især med 14 ml pr. kolbe af den kombinerede vækst fra de otte podebeholdere nr. 2. Disse tyve kolber inkuberes ved 28°C uden omrystning eller omrøring i 11 dage. Efter 11 dages inkubering samles indholdet af disse tyve kolber.

30 B. Ekstraktion 10,2 liter helt næringsmedium med dyrket materiale, pH 6,0, blev blandet i en Waring-blender til nedbrydning U9003 15 af de tunge mycelieplader, centrifugeret, og den klare overliggende væske blev dekanteret. Efter filtrering blev de 10 liter filtrat ekstraheret med 3 liter ethyl-acetat, hvilket gav 1820 ml klar ekstrakt. En anden 5 ekstraktion med 3 liter ethylacetat gav 3350 ml klar ekstrakt. Det faste stof fra dyrkningsmediet blev ekstraheret ved omrøring 1 time med 2 liter methanol og filtrering til opnåelse af 2100 ml filtrat.

Lige store portioner af disse ekstrakter blev tørret og 10 sendt til undersøgelse ved den procedure, der er beskrevet i eksempel 1 (C) med følgende resultater:

Ekstrakt

Volumen (ml) Fast stof i alt (mg) Aktivitetsenheder i alt 1820 1133 1.496.695 15 3350 787 314.900 2100 13,15 1.144.067 C. Gelfiltrering

Den totale mængde fast stof opnået fra de første to ekstrakter i eksempel 2 (B) blev kombineret, opløst i 20 methanol og filtreret til fjernelse af uopløseligt fast stof. De 30 ml filtrat blev påført en gelfiltreringssøjle (2,5 cm x 200 cm, 980 ml) pakket med Sephadex® LH-20, og prøven blev fraktioneret efter molekylstør-relse under anvendelse af methanol som opløsningsmid-25 del. Med refraktionsindekset og UV-optagelser som rettesnor blev de bedste fraktioner identificeret ved bioafprøvning.

Fast stof i alt (mg) Aktivitetsenheder i alt

Fraktion 1-89 106.271 30 Fraktion 2 - 278 1.099.680

Fraktion 3 - 779 210.357 16 149003 D. Adskillelse og rensning

En prøve fra fraktion 2 i det foregående blev forfiltreret gennem et leje på 1 g Waters Bondapak Cl8/Pora-sil B og elueret med fem volumen methanol. Methanol-5 eluatet blev koncentreret til 0,5 ml. Denne prøve blev kroma tograf eret, flere gange, på en Waters pC18.-søjle (3,9 mm x 30 cm) med methanol: 0,05 M ammoni- umphosphat, pH 2,9 (75:25) som udviklingsmiddel. Fraktioner blev skanderet på et Beckman-spektrofotometer, 10 og de fraktioner, der udviste absorptionsmaksima ved 236 nm med skuldre ved 229 nm og 245 nm, blev kombineret og koncentreret under reduceret tryk til en vandig opløsning. pH for koncentratet blev indstillet til 6,5 med 2 M kaliumhydroxid, og de aktive komponenter 15 blev ekstraheret med ethylacetat. De organiske lag blev tørret, koncentreret til tørhed, og resten blev opløst i 0,3 ml methanol. Methanolopløsningen blev kromato-graferet som i det foregående og recirkuleret. Fraktioner indeholdende tidligere elueret komponent blev 20 kombineret, koncentreret til en vandig opløsning og ekstraheret med chloroform. Chloroformresten blev optaget i methanol, og opløsningsmidlet blev afdampet under nitrogen. Der blev opnået 3,5 mg tørret produkt, der blev identificeret som hydroxysyre (forbindelse III).

25 Fraktioner indeholdende den anden komponent blev kombineret og ekstraheret med chloroform som i det foregående. Der blev opnået 0,87 mg tørret produkt, der blev identificeret som lacton (forbindelse I).

EKSEMPEL 3

30 Foretrukken metode til fermentering af Aspergillus ter-reus ATCC 20541 til fremstilling af forbindelser I og II

Et rør med lyofiliseret kultur af Aspergillus terreus ATCC 20541 åbnes aseptisk, og indholdet suspenderes i en 250 ml Erlenmeyer-kolbe (podebeholder) indeholdende 35 40 ml medium C. Den inokulerede beholder inkuberes i 149003 17 48 timer ved 28°C på en 220 omdr./min. ryster (5 cm udslag). To 250 ml Erlenmeyer-kolber hver indeholdende 40 ml medium D inokuleres hver med 2 ml af væksten fra podebeholderen. Medium D har følgende sammensæt-5 ning:

Medium D

Lactose 20 g

Distillers solubles 15 g

Autolyseret gær 5 g 10 Destilleret vand 1000 ml

pH 7,0 med NaOH

Disse to inokulerede beholdere inkuberes i 96 timer ved 28°C på en 150 omdr./min. ryster (5 cm udsving). Efter 96 timers inkubering ekstraheres indholdet af disse to 15 beholdere ved den i eksempel 2 (B) beskrevne procedure. Totalproduktion i disse beholdere er 1450 - 2000 enhe-der/ml.

EKSEMPEL 4

Fremstilling af forbindelser I og III

20 Et rør med lyofiliseret kultur af en Aspergillus terreus ATCC 20542 åbnes aseptisk, og indholdet suspenderes i en 250 ml Erlenmeyer-kolbe (podebeholder nr. 1) indeholdende 40 ml medium C. Den inokulerede beholder inkuberes i 24 - 48 timer ved 28°C på en 220 omdr./min.

25 ryster (5 cm udsving). En portion (cirka 0,5 ml) fra denne beholder anvendes derpå til inokulering af et skrårør indeholdende medium E. Medium E har følgende sammensætning :

Medium E

30 Gærekstrakt 4 g

Maltekstrakt 10 g 18 149003

Medium E (fortsat)

Dextrose 4 g

Agar 20 g

Destilleret vand 1000 ml

5 pH 7,0 med NaOH

Den inokulerede skråkultur inkuberes i 11 dage ved stuetemperatur. Den opbevares derpå ved -60°C i 3-4 måneder. En del af indholdet af denne skråkultur suspenderes derpå i en 250 ml Erlenmeyer-kolbe (podebeholder 10 nr. 2) indeholdende 40 ml medium C. Den inokulerede beholder inkuberes derpå i 24 timer ved 28°C på en 220 omdr./min. ryster (5 cm udsving). Seks 250 ml Erlenmeyer-kolber (podekolber nr. 3) indeholdende 40 ml medium C inokuleres derpå hver med 2 ml af væksten 15 fra podebeholder nr. 2. Disse seks inokulerede beholdere inkuberes i 48 timer ved 28°C på en 220 omdr./min. ryster (5 cm udsving). Seks 2 liters Erlenmeyer-kolber indeholdende 500 ml medium F inokuleres derpå hver især med indholdet af podebeholder nr. 3. Medium F 20 har følgende sammensætning:

Medium F

Majsstøbevæske 15 g CPC-stivelse 20 g

Majsmel 1 g

Sojabønnemel 4 g

Glucose 5 g

Sojaolie 2,5 g (NH4)2S04 4 g KH2P04 0,3 g

CaC03 6 g

Destilleret vand 1000 ml

pH 6,7 med NaOH

De inokulerede beholdere inkuberes i 11 dage uden om- 149003 19 røring eller omrystning ved 28°C. Efter 11 dages forløb ekstraheres reaktionsmediet ved den i eksempel 2(B) beskrevne procedure. Totalproduktion i disse beholdere er 1231 enheder/ml.

5 EKSEMPEL 5

Foretrukken metode til fermentering med Aspergillus ter-reus ATCC 20542 til fremstilling af forbindelser I og III

Et rør med lyofiliseret kultur af en Aspergillus terreus ATCC 20542 åbnes aseptisk, og indholdet suspenderes i en 10 250 itil Erlenmeyer-kolbe (podebeholder) indeholdende 40 ml medium C. Den inokulerede beholder inkuberes i 30 timer ved 28°C på en 220 omdr./min. ryster (5 cm udsving). En 250 ml Erlenmeyer-kolbe indeholdende 40 ml medium G inokuleres med 2 ml af væksten fra 15 podebeholderen pr. kolbe. Medium G har følgende sammensætning :

Medium G

Dextrose 45 g

Peptioniseret mælk 24 g 20 Autolyseret gær 2,5 g

Polyglycol P2000 2,5 ml

Destilleret vand 1000 ml

pH 7,0 med NaOH

Denne inokulerede kolbe inkuberes i 120 timer ved 228°C 25 på en 220 omdr./min. ryster (5 cm udsving). Efter 120 timers inkubering ekstraheres kolbens indhold ved den i eksempel 2(B) angivne procedure. Den totale produktion i denne beholder er 21.500 enheder/ml.

20 149003 EKSEMPEL 6

A. Fermentering i stor målestok med Aspergillus terreus ATCC 20541 til fremstilling af forbindelser I og III

Det i hvert trin anvendte fermenteringsmedium omfat-5 tedei

Majsstøbevæske 5 g

Tomatpasta 40 g

Havremel 10 g

Glucose 10 g 10 Sporstof-opløsning 10 ml

Destilleret vand 1000 ml ph 6,8 med natriumhydroxid.

Sporstofopløsningen omfattede: . FeS04*7H20 1 g 15 MnS04*4H20 1 g

CuC12*2H20 25 mg

CaCl2 100 mg H3B03 56 mg (NH4)6 Mo7024*4H20 19 mg 20 Zn S04*7H20 200 mg

Destilleret vand 1 liter

Alle medier blev kontrolleret for sterilitet før inoku-lering med en mikroorganisme.

Til en 250 ml Erlenmeyer-kolbe blev der sat 40 ml af me-25 diet og indholdet af 1 rør lyofiliseret Aspergillus terreus ATCC 20541. Der blev derpå omrystet i 24 timer ved 28VC på en roterende omryster ved 230 omdr./min., I nye kolber blev der derpå anbragt 40 ml medium og 1 ml af den første kolbes indhold, og der blev omrystet yderligere 24 30 timer ved 28°C. I en 2 liters beholder blev der derpå anbragt 400 ml medium og 10 ml af en fermenteringsblanding fra andet trin, og disse to stoffer blev rystet 149003 21 i 24 timer ved 28°C.

1 et fermenteringskar af rustfrit stål på 757 liter blev der derpå anbragt 501 liter af et medium omfattende: 5 Lactose 2 % efter vægt/vol.

Distiller's solubles 1,5 % efter vægt/vol.

Autolyseret gær 0,5 % efter vægt/vol.

Polyglycol P2000 0,25% efter vægt/vol.

pH 7,0.

10 Dernæst blev der steriliseret i 15 minutter ved 121°C.

Dernæst blev der sat 1 liter af fermenteringsproduktet fra tredje trin. og blandingen blev inkuberet ved 130 omdr./min. ved 28°C i 96 timer med en luftstrøm på 4720 cm3/s.

15 B. Isolering af forbindelse I

Cirka 17 kg (3/4 sæk) filterhjælp af siliciumoxidtypen blev sat til 412,5 liter hel fermenteringsblanding fra dyrkning af Aspergillus terreus ATCC 20541 san beskrevet i det foregående, og blandingen blev filtreret gennem en 47,5 cm filter-20 presse. Det klarede filtrat (pH 6,6) blev indstillet til pH 4,0 ved omhyggelig tilsætning af 450 ml koncentreret saltsyre og ekstraheret ved omrøring eller omrystning med cirka 1/3 volumen (135 liter) ethylacetat.

Efter fraskillelse blev det øvre opløsningsmiddellag 25 fjernet, og vandfasen blev igen ekstraheret med ethylacetat (142,5 liter) på lignende måde. Efter adskillelse blev de to ekstrakter kombineret og vasket tilbage ved agitering med cirka 45 liter vand. Efter fraskillelse blev ethylacetatopløsningen koncentreret under vakuum .

30 ved en temperatur under 30°C, først i en omrørt kedel og endelig i en roterende vakuuminddamper til et restvolumen på lidt mindre end 3,75 liter. v 22 149003

Cirka 3800 ml ethylacetat-koncentrat fra den forudgående ekstraktion blev yderligere koncentreret på en roterende inddamper (cirka 10 mm, 40°C bad) til en sirup og blev derpå koncentreret yderligere to gange 5 efter tilsætning af cirka 1 liter methylenchlorid i to portioner for at befri sirupen for polært opløsningsmiddel. Den endelige olie på cirka 300 ml, som indeholdt cirka 250 g fast stof efter tørvægt, blev optaget til cirka 750 ml med ethylacetat/methylenchlo-10 rid (30:70, v/v), og 200 g silicagel blev tilsat og blandet til dannelse af en opslæmning. Denne blev anbragt på toppen af en 14 cm x 36 cm søjle indeholdende 2,5 kg af samme silicagel i omtrent 7,5 liter volumen, som var blevet pakket med en opslæmning i 15 samme opløsningsmiddelblanding. Udvikling med samme opløsningsmiddel blev fortsat, indtil der var aftaget 3 liter som forløb.

Udvikling med ethylacetat/methylenchlorid (50:50; v/v) blev begyndt, idet der blev opsamlet effluentfraktioner 20 på 800 ml. Der blev opsamlet 12 fraktioner, hvorpå eluering med 100% ethylacetat blev begyndt, og efter opsamling af yderligere 7 fraktioner blev eluering med 100% acetone påbegyndt. Fraktionerne nr. 4-24 blev afprøvet for bioaktivitet i HMG-CoA-reduktase-25 inhiberingsforsøg som omhandlet i eksempel 1. Der blev fundet en væsentlig aktivitet i fraktionerne 7-11.

Spidsaktivitet blev fundet i fraktion 8. Den blev koncentreret til en olie til yderligere rensning; tørvægten af fast stof blev bestemt til 9,0 g.

30 Fraktion 8 fra silicagelsøjlen blev tritureret med 50 ml methylenchlorid og filtreret; den tørrede filterkage veje 4,9 g. Filtratet blev ført til en 5 cm I.D. med en 1 meter lang søjle fyldt med Sephadex© LH-20 dextran-gel (Pharmacia) kvældet og bragt i ligevægt med methyl-35 enchlorid, og søjlen blev elueret med methylenchlorid med 149003 23 en hastighed på 15 ml/min. Forbindelse I blev elueret mellem 0,64 og 0,81 søjlevolumina. Opløsningsmiddel blev fjernet fra denne spidsfraktion, hvilket gav en let brun rest, der vejede cirka 0,290 g. Denne rest 5 (213 mg) blev optaget i 1,5 ml C^C^'CH^CN (65-35), sat til en forudpakket silicagelsøjle (EM LOBAR Size B), der var bragt i ligevægt, og der blev elueret med CHjCIj-CHjCN (65-35) ved en hastighed på 5 ml/min.

Afdampning af opløsningsmidlet fra spidselueringen 10 mellem 235 og 360 ml elueringsmiddel efterlod 121 mg krystallinsk produkt, smp. 155 - 160°C. HPLC af dette materiale på en EM RP 18 omvendt-fase analytisk søjle (E. Merck HIBAR II, Cat. No. 906046) under anvendelse af 0,05 M natriumphosphat pH 3,0/acetonitril 15 45:55 som elueringsmiddel ved en hastighed på 2 ml/min.

viste en karakteristisk UV-absorptionsspids ved 11 min.

88 mg af dette materiale blev omkrystalliseret fra 0,6 ml absolut ethanol, derpå igen fra 0,4 ml af samme opløsningsmiddel til opnåelse af, efter tørring natten 20 over i en ekssikkator over ^ m9 hvide, fjerag- tige krystaller. Analytisk HPLC på det i det foregående beskrevne system gav en enkelt skarp spids ved 11 min. elueringstid. Efter yderligere omkrystalliseringer blev der opnået et smeltepunkt på 170 - 171°C.

25 Produktet blev identificeret ved hjælp af spektre etc. som forbindelse I. Dette materiale gav i in vitro HMG-CoA reduktase-forsøget (fra eksempel 1) en IC^q-værdi på 0,01 mikrogram pr. ml.

EKSEMPEL 7

30 Direkte isolering af ammoniumsaltet af forbindelse III

Dyrkningsmediet fra en fermentering som i eksempel 2A (375 liter) syrnes med H^PO^ til pH 5. Ethylacetat (262,5 liter) tilsættes, og blandingen omrøres kraftigt. Den 24 149003 filtreres derpå fra mycelieresten, og kagen vaskes med en lille smule ethylacetat, som kombineres med hovedekstrakten. Den organiske fase fraskilles og blandes med 18,75 liter 0,2 N natriumhydroxidopløsning. Blan- 5 dingen omrøres kraftigt og får derpå lov at sætte sig.

Det vandige lag fraskilles, og pH indstilles fra 9 til 5 ved tilsætning af H^PO^. Der ekstraheres derpå, først med 7,5 liter hexan/ethylacetat 2:1 blanding og derpå med 3,75 liter af samme blanding. De separate or-10 ganiske ekstrakter kombineres og tørres over vandfrit MgSO^. Tørringsmidlet fraskilles derpå ved filtre- . ring, og kagen vaskes med 1 liter af samme hexan/ethyl-acetat-opløsning, idet vaskevæsken kombineres med filtratet. Denne filtratopløsning omrøres efter yderligere 15 fortynding med 2 liter acetone under omrøring og ind- "'s, føring af ammoniakgas. Gassen absorberes, og der forekommer et krystallinsk bundfald. Når ammoniak ikke længere absorberes, og der iagttages en mørkning i farven i bundfaldet, afsluttes indføringen af ammoniak, 20 og blandingen får lov at henstå flere timer, hvorefter den filtreres. Den rå ammoniumsalt-filterkage vaskes med acetone til farveløs vaskevæske og lufttørres der-på.

Det rå ammoniumsalt kan omkrystalliseres ved at opløse 25 det i 5,6 liter af en blanding af chloroform, methanol og koncentreret vandig ammoniumhydroxid (80:20:2) og filtrere det farvede, uopløselige materiale fra. Filtratopløsningen fortyndes derpå med et lige så stort volumen acetone/ether 1:1 og får lov at henstå natten 30 over. Det krystallinske, tan-farvede ammoniumsalt (96,5 g) opnås ved filtrering.

Yderligere resning kan opnås ved at opløse 70 g af nævnte omkrystalliserede materiale i 2 liter kogende isopropanol/koncentreret vandig NH4OH (95:5). 10 g 35 aktivkul tilsættes, og den varme opløsning filtreres.

149003 25

Filtratet får lov at afkøle til stuetemperatur og henstår natten over ved -20°C. Efter filtrering vaskes kagen med kold (-20°C) isopropanol efterfulgt af kold acetone og derpå ether ved stuetemperatur. Produktet 5 tørres under nitrogen til opnåelse af cirka 60 g hvidt krystallinsk ammoniumsalt.

EKSEMPEL 8

Salte af forbindelser III

Til en opløsning af 40 mg af produktet fra eksempel 6 -4 10 i 2 ml ethanol sættes 1 ml vandig NaOH (10 mol, 1 ækvivalent). Efter 1 times forløb ved stuetemperatur bringes blandingen til tørhed i vakuum til opnåelse af natriumsaltet af forbindelsen III.

På lignende måde fremstilles kaliumsaltet under an-15 vendelse af 1 ækvivalent kaliumhydroxid.

EKSEMPEL 9

L-lysinsalt af forbindelse III

En opløsning af 146 mg L-lysin i 1,5 ml 65% ethanol sættes til en opløsning af 440 mg af ammoniumsaltet 20 af forbindelse III opnået på den i eksempel 7 beskrevne måde i 11,5 ml 85% ethanol. Opløsningsmidlerne afdestilleres i vakuum. Resten tritureres med 10 ml varm ethanol, afkøles og filtreres, og det hvide faste stof tørres til opnåelse af 430 mg af L-lysinsaltet af forbindelse III, 25 smp.: 178-180°C (dek.).

Analyse for C3qH52N2®8:

Beregnet: C 63,35 - H 9,22 - N 4,93

Fundet : C 62,80 - H 9,13 - N 4,83.

149003 26 EKSEMPEL 10

L-arqininsalt af forbindelse III

På i det væsentlige samme måde som beskrevet i eksempel 9 kombineres en opløsning af 174 mg L-argininbase og en 5 opløsning af 440 mg af ammoniumsaltet af forbindelse III. Opløsningsmidlet afdampes i vakuum, og resten tri-tureres med varm ethanol, afkøles, filtreres og tørres til opnåelse af L-argininsaltet af forbindelse III.

EKSEMPEL 11

10 L-ornithinsalt af forbindelse III

På i det væsentlige samme måde som beskrevet i eksempel 9 kombineres en opløsning af 132 mg L-ornithin fri base og en opløsning af 440 mg ammoniumsalt af forbindelse III opnået ifølge éksenpel 7. Opløsningsmidlet afdampes i vakuum, og resten tri-15 tureres med varm ethanol, afkøles, filtreres og tørres til opnåelse af L-ornithinsaltet af forbindelse III.

EKSEMPEL 12

N-methylglucaminsalt af forbindelse III

På i det væsentlige samme måde som beskrevet i eksempel 20 9 kcnibineres en opløsning af 195 mg N-methylglucamin i 1,5 ml vand og 440 mg af ammoniumsaltet af forbindelse ttt opnået ifølge éksertpel 7 i 11,5 ml 85% ethanol. Opløsningsmidlet afdairpes i vakuum til opnåelse af N-methylglucaminsaltet af forbindelse III.

25 EKSEMPEL 13

Ethylendiaminsalt af forbindelse III

18 g af forbindelse I opløses i 180 ml varm isopropanol og behandles med 90 ml 0,5 M vandig NaOH-opløsning, henstår 1 time, fortyndes med 180 ml vand, inddampes i 30 vakuum til fjernelse af isopropanolen og afkøles i 149003 27 et isbad. Langsomt tilsættes 90 ml 0,5 M HC1, og blandingen ekstraheres med 2 x 150 ml ethylacetat, som vaskes tilbage med 100 ml vand og tørres over MgS04· Opløsningsmidlet fjernes i vakuum ved lav temperatur, og 5 resten opløses i 150 ml ethanol. Der tilsættes 3 ml ethylendiamin, og opløsningsmidlet afdampes i vakuum, og resten tritureres med kogende ethylacetat, afkøles, filtreres og omkrystalliseres fra 30 ml isopropanol og tørres i vakuum over P2°5 opnåelse af 13,1 g hvide 10 krystaller, smp.: 152- 153,5°C.

Analyse for C24H37°6^2*^C2H10N2^ :

Beregnet: C 66,35 - H 9,35 - N 3,09

Fundet : C 66,08 - H 9,49 - N 3,01.

EKSEMPEL 14

15 Calciumsalt af forbindelse III

87,9 g ammoniumsalt af forbindelse III opnået ifølge eksempel 7 opløses i 3 ml vand under omrøring og opvarmning. Derpå tilsættes 7,4 mg Ca(0H)2 af analytisk kvalitet, og blandingen omrøres og opvarmes, indtil der ikke afdamper mere ammoniak, og 20 der kun er en lille uklarhed tilbage, som fraskilles ved centrifugering. Den farveløse, klare overliggende væske lyofiliseres, og prøver af tørt materiale sættes op til krystallisering fra forskellige opløsningsmidler og opløsningsmiddelblandinger. Produktet krystalliserer i 25 nåle, når en varm koncentreret opløsning i tør isopropanol fårlov at afkøle til stuetemperatur.

EKSEMPEL 15

Tetramethylammoniumsalt af forbindelse III

34 mg af forbindelse I opnået ifølge eksempel 6 i 1 ml Q^Clj be-30 handles med 0,04 ml 24% tetramethylaitmoniumhydroxid i methanol. Produktet udfældes med ether på delvis krystallinsk form, een- 149003 28 trifugeres, og bundfaldet vaskes først med ether og omkrystalliseres derpå som hexagonale plader fra 1 ml isopropanol ved tilsætning af 5 ml ether og cirka 5 ml lavtkogende petroleumsether. Der opnås 27 mg eller 5 65%.

NMR-spektrum for forbindelse III i form af tetra-methylammoniumsaltet (6 mg/0,35 ml ved 25°C i CDCl^ ved 300 MHz) 0,83 t (3H, J = 6,5) 10 0,84 d (3H, J = 7) • 1,02 d (3H, J = 7) 1.05 d (3H, J = 7) 1,24 m (<^1H) ; 1,30 - 1,80 br.m. inhyllingskurve 1,88 ddd (IH, J = 2, 8, 15) 15 1,98 dd (IH, 3, 15) 2,16 dd (IH, J = 8,5, 15,5) 2,23 (IH, tilsløret) 2.32 m (IH, tilsløret) 2,37 dd (IH, J » 3, 15,5) 20 2,40 (~1H, tilsløret) 3,42 s (12H, MeN+) 3.79 m (IH, symmetrisk multiplet) 4.06 m (IH, symmetrisk multiplet) 5.32 dt (IH, J 3) 25 5,50 br.s(lH) 5.79 dd (IH, J = 6,10) 5,98 d (IH, J = 10)

Kemiske spring i ppm i nedadgående retning for indre TMS. Koblingskonstanter i parenteser i Hz.

30 Forkortelser: s = singlet, d = dublet, t = triplet, m = multiplet.

149003 29

EKSEMPEL 16 Ammoniumsalt af forbindelse III

På i det væsentlige samme måde son beskrevet i eksempel 13 overføres forbindelsen I opnået ifølge eksempel 6 i hydroxy syren, forbindelse 5 III, der ekstraheres med ethylacetat, tørres over MgSO^, filtreres og behandles med vandfri ammoniak under omrøring og afkøling til udfældelse af ammoniumsaltet.

EKSEMPEL 17

Fremstilling af hydroxysyre, forbindelse III

10 Det i eksempel 7 fremstillede natriumsalt genopløses i 2 ml ethano1/vand (1:1) og sættes til 10 ml 0,1 N saltsyre, hvorfra frigjort hydroxysyre ekstraheres med ethylacetat. Sidstnævnte opløsningsmiddel vaskes en gang med vand, tørres og fjernes i vakuum med en bad-15 temperatur på ikke over 30°C. Den opnåede hydroxysyre vender ved henstand langsomt tilbage til lactonformen.

EKSEMPEL 18

Forbindelse III

453 mg af ethylendiaminsaltet af forbindelse III fremstillet 20 ifølge éksenpel 13 opløses i 6 ml 80% ethanol, afkøles i et isbad, behandles med 1 ml 1 M HCl, inddampes i vakuum til fjernelse af ethanolen, behandles med yderligere 3 ml vand, ekstraheres over i 2 x 5 ml ethylacetat og vaskes tilbage med vand, idet alle opløsninger holdes kolde i et is-25 bad. Ekstrakten tørres over MgSO^ og koncentreres til tørhed i vakuum til opnåelse af hydroxysyren som en farveløs olie.

13 A C-NMR-spektret i CDCl^ (190 mg/ml) udviser kemiske spring for de første 6 carbonatomer i hydroxysyredelen 30 som anført i tabellen. Ved henstand overgår denne hy- 149003 30 droxysyre langsomt i lactonen.

TABEL

^3C-NMR-spektrum, ppm nedad fra tetramethylsilan

Hydroxysyre,

Forbindelse III

HO 3 ^ 1 C^· 5 Y^COOH C2,C4 174,8 4Y°H C3 42,4, 41,6 I 6 C5 68.8 C6 72,3 34,9 10 Spektret af resten af molekylet er kun lidt ændret ved ringslutningen.

EKSEMPEL 19

Ethylester af forbindelse III

En suspension af 500 mg (1,24 millimol) forbindelse I fremstillet 15 ifølge eksempel 6 (MSD-803) i 20 ml ethanol anrøres ved stuetemperatur under en nitrogenatmosfære. Et lille stykke natrium (cirka 1 mg) tilsættes. Efter 15 minutters forløb tilsættes endnu et lille stykke natrium. Efter en total reaktionstid på 30 minutter fortyndes den homo-20 gene reaktionsblanding med ether, vaskes med vand og mættes med saltvand og tørres (MgSO^). Afdampning af opløsningsmidlet giver et voksagtigt fast stof. Analyse ved HPCL på en Whatman Partasil 10 PAC-søjle (4,6 mm x 25 cm) med 10% isopropanol/hexan tilpumpet 25 i en hastighed på 6 ml/min. indikerede en blanding af ethylester og MSD-803 (77:23). Denne blanding fraskilles ved kromatografi ved mellemtryk på silicagel (230 - 400 mesh) og eluering med 3% ethanol/methylen- 149003 31 chlorid. De fraktioner, der indeholder esteren, kombineres og inddampes til opnåelse af 358 mg (66%) af et hvidt fast stof, smp.: 67°C.

En portion af dette materiale omkrystalliseres fra hexan 5 til opnåelse af hvide nåle, smp.: 66,5 - 68,5°C.

Analyse for C2gH420g:

Beregnet: C 69,30 - H 9,40 Fundet : C 69,22 - H 9,58.

På lignende måde, ved anvendelse af ækvivalente mængder 10 methanol, propanol, butanol, isobutanol, t-butanol, amylalkohol, isoamylalkohol, 2-dimethylaminoethanol, benzylalkohol, phenethanol og 2-acetamidoethanol opnås tilsvarende estere..

EKSEMPEL 20

15 Fremstilling af forbindelser II og IV

A. Fermentering

Et rør med lyofiliseret kultur Aspergillus terreus ATCC 20542 åbnes aseptisk, og indholdet suspenderes i en 250 ml Erlenmeyer-kolbe (podebeholder) indeholdende cirka 10 ml af et medium 20 med følgende sammensætning:

Majsstøbevæske 5 g

Tomatpasta 40 g

Havregryn 10 g

Glucose 10 g 25 Sporelement-opløsning 10 g

Destilleret vand 1000 ml

pH 6,8 med NaOH

149003 32

Sporelementopløsning:

FeS04-7H20 1000 mg

MnS04*4H20 1000 mg

CuC12*2H20 25 mg 5 CaCl2'2H20 100 mg Η^ΒΟ^ 56 mg (NH4)6Mo7024-4H20 19 mg

ZnS04*7H20 200 mg

Destilleret afioniseret vand 1000 ml 10 Den inokulerede beholder inkuberes i 24 timer ved 28°C på en 220 omdr./min. omryster (5 cm udsving). En 2 liters Erlenmeyer-kolbe indeholdende 500 ml af mediet inokuleres derpå med 10 ml af fermenteringsvæksten fra første trin fra podeblandingen. Disse to stoffer blev omrystet 24 15 timer ved 28°C.

Et 750 liters fermenteringskar af rustfrit stål blev derpå fyldt med 485 liter af et medium omfattende:

Cerelose 4,5 % vægt/vol.

Peptoniseret mælk 2,5 % vægt/vol.

20 Autolyseret gær 0,25% vægt/vol.

Polyglycol P2000 0,25% vol./vol.

pH indstillet til 7,0.

Der blev steriliseret 15 minutter ved 121°C. En liter af mediet fra andet trin i det foregående blev derpå til-25 sat, og blandingen blev inkuberet ved 85 omdr./min. i 12 timer, derpå ved 130 omdr./min. i 84 timer ved 28°C med en luftstrøm på 5 cfm (2350 cm3/s) i 12 timer og 3 derpå ved 10 cfm (4720 cm /s) i 84 timer.

B. Isolering 30 1· Ekstraktion

To portioner på 375 liter helt dyrkningsmedium blev 149003 33 kombineret, syrnet under omrøring til pH 4,1 ved omhyggelig tilsætning af 800 ml koncentreret saltsyre og ekstraheret ved tilsætning af 281,25 liter ethylacetat og yderligere omrøring i 2 timer.

5 Der blev derpå tilsat cirka 227 kg filterhjælp af siliciumoxidtypen, og hele opslæmningen blev pumpet gennem en 61 cm filterpresse. Yderligere 281,25 liter ethylacetat blev anvendt til at vaske pressekagen og fortsat ekstraktion, idet pumperetningen gennem pres-10 sen blev vendt fire gange. Al vaskevæske blev fjernet fra pressen og kombineret med det første filtrat. To-fasefiltratet fik lov at sætte sig, og det vandige lag blev fjernet. Ethylacetatlaget blev vasket med 15 liter afioniseret vand, faserne fik lov at adskilles, og 15 ethylacetatekstrakterne blev koncentreret under vakuum til en rest på cirka 37,5 liter.

2. Lactonisering (For at ringslutte en forbindelse IV i ekstrakten til en forbindelse II blev følgende azeotrope behandling udført).

20 Ethylacetatekstrakter fra yderligere 1125 liter dyrkningsmedium blev sat til ovennævnte ekstrakt, og volumenet blev reduceret til cirka 112,5 liter ved vakuumdestillation. Cirka 50 gal. toluen blev tilsat, og portionen blev koncentreret under vakuum til 120 liter; dette trin 25 blev gentaget; derpå blev der tilsat tilstrækkelig mængde frisk toluen til at bringe volumenet op på 281,25 liter Uden vakuum blev portionen bragt til kogning under tilbagesvaling, hvor den blev i 2 timer, ved en temperatur over 106°C.

30 Denne opløsning blev derpå koncentreret under vakuum til et lille volumen, som blev yderligere koncentreret til en olieagtig rest på en stor roterende inddamper under vakuum.

149003 34 3. K£22?åi29£§i i_på_silicagel

Den i det foregående opnåede ekstrakt blev befriet for andre opløsningsmidler ved tilsætning af 7,5 liter methyl-enchlorid og rekoncentrering til en olie.

5 Den olieagtige rest blev opløst i ca. 18,75 liter ethylace-tat/methylenchlorid (30:70; vol./vol.), og der blev fremstillet en opslæmning ved tilsætning af 2,8 kg silicagel.

Opslæmningen blev ført til toppen af en 30,5 cm x 127 cm 10 silicagel-søjle pakket med samme opløsningsmiddelblanding.

Eluering med ethylacetat/methylenchlorid (40:70; vol./vol.) ved 800 ml/min. Et forløb på 37,5 liter og derpå yderligere fraktioner på hver 15 liter blev opsamlet.

Fraktionerne 6-10, inklusive, blev koncentreret under 15 vakuum til en olieagtig rest, som blev opløst i varm ethyl-acetat, behandlet med affarvet kul, filtreret varmt og afkølet. Krystaller af MSD-803 (forbindelse I) blev frafiltreret, og moderluden blev koncentreret til en olie til yderligere kromatografi.

20 4. Rek^omatografi_på_silicagel

Moderludsrester fra lignende dyrkningsmedieekstrakt-oparbejdninger svarende til yderligere 2250 liter fra fermenteringsproduktionen blev kombineret med ovennævnte i methylenchloridopløsning. Halvdelen af denne 25 opløsning blev udtaget til yderligere silicagel-kroma-tografi. En lille portion viste et totalindhold på 325 g. Opløsningen blev behandlet med 40 g affarvende kul, filtreret, og kagen blev skyllet med methylenchlo-rid. Kombinationen af filtrat og vaskevæske blev kon-30 centreret under vakuum til en olieagtig rest. Denne blev genopløst i 800 ml ethylacetat/methylenchlorid (30:70; vol./vol.) og opslæmmet med 225 g silicagel.

149003 35

Opslæmningen blev ført til toppen af et 14 x 36 cm søjleleje eller -lag af silicagel pakket i samme opløsningsmiddelblanding. Udvikling foregik med ethylacetat/ methylenchlorid (40:60; vol./vol.). ET forløb på 3 5 liter blev frataget; derpå blev der opsamlet fraktioner på hver 800 ml.

5. Kromatografi_på_omvendt-fase-pakning 40 ml fra fraktion 12 fra den i det foregående anførte kromatografi blev koncentreret til en olie, der.vejede 10 500 mg, ogolien blev genopløst i 5 ml acetonitril. Den ne acetonitrilopløsning blev ført til en 1,59 cm (ydre diameter) x 182,9 cm lang krcmatografikolonne af rustfrit stål pakket med kolonnepakningsmateriale "Bondapak C18/PorasilB" (Water Associates, Inc., Milford, Mass. 01757) til 15 præparativ omvendt fase-væskekromatografi. Kolonnen blev elueret med en blanding i volumenforholdet 55:45 af acetonitril og 0,05 M ammoniumphosphat pH 3. Elu-eringsvolumenet mellem 1360 ml og 1700 ml blev kombineret på basis af refraktionsindex-undersøgelse. Det or-20 ganiske opløsningsmiddel blev fjernet i vakuum, og den resterende vandige opløsning blev ekstraheret med ethylacetat. Ethylacetat-fjernelse i vakuum efterlod 120 mg af titelforbindelsen, som udkrystalliserede fra en koncentreret acetonitrilopløsning, hvilket gav krystaller 25 af MSD-883 (forbindelse II), smp.: 129 - 131°C.

EKSEMPEL 21

Alternativ isolering af forbindelserne II og IV

Råt ammoniumsalt, isoleret som beskrevet (i eksempel 7) fra en 4125 liter fermentering lactoniseres ved at op-30 løse i vand, syrne til pH 3 med koncentreret saltsyre, ekstrahere med toluen og koge under tilbagesvaling i 2 timer som beskrevet i eksempel 20-B-2. Koncentrering under vakuum til et lille volumen giver krystaller af rå forbindelse I blandet med en mindre mængde for-35 bindelse II; disse frafiltreres og tørres.

149003 36

Materiale fra tolv sådanne portioner kombineres og omkrystalliseres fra 45,85 kg éthanol, filtreres og vaskes med ethanol. De kombinerede portioner moderlud og vaskevæske koncentreres i vakuum til cirka 11,25 liter 5 og en anden portion krystaller af forbindelse I fra-filtreres. Portionerne af moderlud fra denne filtrering oparbejdes som følger:

Cirka 0,5 1 moderlud fremstilles til omvendt-fase-kromatografi ved koncentrering under vakuum til fjernelse 10 af ethanol, skylles med acetonitril og filtreres for spor af uopløseligt materiale. En opløsning i 100 ml acetonitril passeres gennem et 200 ml leje af C-18 om-vendt-fase-pakning, og lejet vaskes med yderligere 1 liter acetonitril. De kombinerede filtrater koncentre-15 res og opløses i i alt 360 ml kromatografisk opløsningsmiddel (acetonitril/vand 60:40 vol./vol.) og filtreres til fjernelse af spor af uopløseligt materiale. Faststofindholdet af prøveportioner er 15,3 g.

En portion på 160 ml af dette fødemateriale kromatogra-20 feres i et Waters Prep 500 system under anvendelse af to 5 x 30 cm stykker C-18 omvendt-fase-pakning (Waters Assoc.,; bundet octadecylovertræk på siliciumoxid) og acetonitril/vand, 60:40 (vol./vol.) som elueringsmid-del ved 130 ml/min. ved omgivelsernes temperatur og 25 refraktionsindexmåling. Urenheder elueret i de første 3900 ml elueringsmiddel kasseres. Der opnås en stor spids af forbindelse I fra 3900 til 5850 ml elueringsmiddel, og den tilsvarende portion gemmes. Blandede fraktioner opnås fra 5850 ml til 6500 ml eluering. Dis-30 se gemmes til rekromatografi. Renset forbindelse II

opnås svarende til den sidste spids; fraktionen mellem 6500 og 8450 ml eluering samles og koncentreres til en olieagtig rest på ca. 3 g.

149003 37

Halvdelen (cirka 1,5 g) af dette koncentrat af forbindelse II fremstilles til kromatografi som ammoniumsaltet af forbindelse IV ved at fremstille en opløsning i 6 ml varm methanol under omrøring og umiddelbar tilsætning 5 af tilstrækkelig 1 N natriumhydroxid til at holde pH på 10,5 - 11; 3,5 - 3,8 ml alkali kræves. Efter henstand en halv time filtreres opløsningen til fjernelse af spor af uopløseligt materiale, og filtratet pumpes til en kolonne, 1” x 34” med 200-325 mesh formalet XAD-2 10 harpiks (en styren/divinylbenzen-copolymer), og der elu-eres med 23% acetonitril og 77% 0,1 N ammoniumhydroxid ved 2 ml/min. og 40°C. Der opsamles fraktioner på 20 ml; fraktionerne 1 - 44 indeholder urenheder og et maksimum for forbindelse Ill-salt, og en spids af 15 salt fra forbindelse III, som kasseres. Fraktionerne 45-61 opsamles, koncentreres under vakuum til et lille vandigt restvolumen og frysetørres til en rest af ammoniumsalt af forbindelse IV, 0,72 g.

EKSEMPEL 22

20 Salte af forbindelse IV

Til en opløsning af 40 mg af produktet fra eksempel -4 20 i 2 ml ethanol sættes 1 ml vandig NaOH (10 mol; 1 ækvivalent). Efter en times forløb ved stuetemperatur bringes blandingen til tørhed i vakuum til opnå-25 else af natriumsaltet af forbindelse IV.

På lignende måde fremstilles kaliumsaltet under anvendelse af et ækvivalent kaliumhydroxid og natriumsaltet under anvendelse af et halvt ækvivalent CaO.

Under anvendelse af procedurer i det væsentlige som 30 beskrevet i eksemplerne 9-12 og 14, men ved at ererstatte anmoniumsaltet af forbindelsen III i hvert tilfælde mad en ækvivalent meaigde af annoniumsaltet af forbindelsen IV opnået ifølge eksempel 21 opnås henholdsvis L-lysin-, L-arginin-, 149003 38 L-ornithin-, N-methylglucamin- og calciumsalte af forbindelse IV.

Under anvendelse af procedurer, som i det væsentlige beskrevet i eksemplerne 13, 15 og 16, men ved at erstatte 5 forbindelse I i hvert tilfælde med en ækvivalent mængde af II, fremstilles ethylendiamin-, tetramethylammonium-og ammoniumsalte af forbindelse IV.

EKSEMPEL· 23

Fremstilling af hydroxysyre, forbindelse IV

10 Det i eksempel 22 fremstillede natriumsalt genopløses i 2 ml ethanol/vand (1:1) og sættes til 10 ml 0,1 N saltsyre, hvorfra den frigjorte hydroxysyre ekstraheres med ethylacetat. Sidstnævnte opløsningsmiddel vaskes en gang med vand, tørres og fjernes i vakuum med en badtemperatur 15 på ikke over 30°C. Den afledte hydroxysyre overføres langsomt i lactonen ved henstand.

EKSEMPEL 24

Fremstilling af hydroxysyre, forbindelse IV

221 mg af ammoniumsaltet af forbindelse IV opnået ifølge eksempel 20 21 opløses i 4,5 ml 65% ethanol. Der afkøles i is, symes cirka 0,5 ml 1 M HC1 til pH 3 og inddampes ved lav temperatur på en roterende inddamper til et volumen på cirka 2 ml.

Der tilsættes yderligere 2 ml vand og ekstraheres med 2 x 3 ml ethylacetat og vaskes tilbage med 1 ml vand, 25 idet alle opløsninger holdes kolde i et isbad. Ekstrakten tørres over MgSO^ og inddampes til tørhed i vakuum til opnåelse af hydroxysyren som en farveløs olie.

* A ^^C-NMR-spektrum i CDCl-j viser kemiske spring for de første seks carbonatomer i hydroxysyredelen af molekylet 30 som anført i følgende tabel. Ved henstand overgår denne hydroxysyre langsomt i lactonen.

149003 39 TABEL 1 3 C-NMR-spektrum i CDCl^, ppm ned fra tetramethylsilan

Hydroxysyre,

Forbindelse IV

««f^COOH L\- 175'° 5 c2 4 42,2, 41,7 > * 68,8 r5 72,5 6 35,0

Spektret af resten af molekylet er kun i ringe grad ændret af ringslutningen.

10 EKSEMPEL 25

Ethylester af forbindelse IV

Under anvendelse af en procedure i det væsentlige som beskrevet i eksempel 19, men med en ækvimolekylær mængde forbindelse II fra eksempel 20 i stedet for 1:24 mmol 15 forbindelse I som anvendt deri, opnås ethylesteren af forbindelse IV.

På lignende måde fremstilles methyl-, propyl-, butyl-, isobutyl-, t-butyl-, amyl-, isoamyl-, 2-dimethylamino-ethyl-, benzyl-, phenethyl- og 2-acetamidoethylestere.

20 A. In vitro inhibering af HMG coenzym A reduktase

Metoden af Beg et al., FEBS Letters, 8£, 123 (1977) blev modificeret let ved inkubering af enzymet med inhibitoren i fem minutter før initiering af reaktio-25 nen med substratet. Med kraftige inhibitorer, såsom 149003 40 de forbindelser, der opnås ifølge opfindelsen, gav standardproceduren ved blot at tilsætte enzym til inhibi-tor/substrat-blandingen ikke lineær kinetik.

Under anvendelse af den modificerede procedure giver 5 natriumsaltet af forbindelse IV en i^Q-værdi ved inhibe-ring af HMG-CoA reduktase på 2,7 x 10“% sammenlignet med 5,4 x 10“9M for ML236B.

B. In vivo inhibering af cholesterolsyntese (forbindelse II)

Grupper af Holtzman-hanrotter blev doseret med enten 5% 10 emulphor i saltvand eller prøveforbindelsen i emulphor med mavesonde. Efter en times forløb blev der indgivet 14 pCi C acetat/kg i.p. Rotterne blev tappet for blod 14 50 minutter senere, og C cholesterol blev bestemt som et mål for sterolsyntese: 15 Dosis, mg/kg Inhibering, % 0,15 38 0,6 51 1,2 70

Sammenligning mellem I, II og ML-236B som inhibitorer 20 for sterolsyntese i cellekultur

Proceduren af A.W. Alberts et al., J. Biol. Chem. 249; 5241 (1974), hvor man måler mængden af^C-sterolbiosyntese 14 fra C eddikesyre i mus L-M-celler i kultur blev anvendt

med modifikation. Prøveforbindelsen blev i 10 μΐ DMSO

14 25 sat til de monomolekylare kulturer med 5 pC C acetat.

Efter en 3 timers inkubering blev cellerne forsæbet, 14 og C sterol blev ekstraheret og isoleret ved tyndt- lagskromatografi på silicagel under anvendelse af pe- troleumsether/diethylether/eddikesyre (75:25:1). Det 30 område på pladen, der indeholdt ^C, blev identificeret 14 ved farvning med I2, og C-indholdet blev bestemt ved væske-scintillationstælling.

Claims (4)

149003 Under anvendelse af den modificerede procedure giver forbindelsen II IC^0 i inhibering af HMG-CoA reduktase 17 nM i sammenligning med 22 nM for forbindelse I og 46 nM for ML-236B. 5

1. Fremgangsmåde til fremstilling af polyhydro-3,7-dime-^ thyl-8-(2-tetrahydro-4-hydroxy-6-oxo-2H-pyran-2-y1) ethyl)- 1-naphthyl-l-methylbutyrat-forbindelser med formlerne I og II eller de tilsvarende hydroxysyrer med formlerne III og IV

15 H°v^f0 H0W° -aY CH3 fe3jAJyCH3 CH3 CH, CT3 I II ΗΟχ Λ V^COOH ΗΟνγ^Ν.θρθΗ

25 -A T -ΑΓ CH3 ch3 30. lv eller farmaceutisk acceptable salte eller estere deraf, kendetegnet ved, at man fermenterer et nae-ringsmedium med en mikroorganisme af arten Aspergillus terreus og isolerer produkterne, hvorefter man om ønsket 35 overfører en fremstillet forbindelse i et farmaceutisk acceptabelt salt eller en ester deraf.