FI67231C - Foerfarande foer framstaellning av en hypokolesteremisk foerening - Google Patents
Foerfarande foer framstaellning av en hypokolesteremisk foerening Download PDFInfo
- Publication number
- FI67231C FI67231C FI801857A FI801857A FI67231C FI 67231 C FI67231 C FI 67231C FI 801857 A FI801857 A FI 801857A FI 801857 A FI801857 A FI 801857A FI 67231 C FI67231 C FI 67231C
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- culture
- solution
- compound
- flask
- hours
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D309/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom, not condensed with other rings
- C07D309/16—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom, not condensed with other rings having one double bond between ring members or between a ring member and a non-ring member
- C07D309/28—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom, not condensed with other rings having one double bond between ring members or between a ring member and a non-ring member with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
- C07D309/30—Oxygen atoms, e.g. delta-lactones
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/06—Antihyperlipidemics
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
- C12N1/145—Fungal isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
- C12P17/02—Oxygen as only ring hetero atoms
- C12P17/06—Oxygen as only ring hetero atoms containing a six-membered hetero ring, e.g. fluorescein
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/62—Carboxylic acid esters
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
- C12R2001/66—Aspergillus
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Mycology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Obesity (AREA)
- Hematology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Botany (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
- Steroid Compounds (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
Description
fl KUULUTUSjULKAISU
•jggr· M ^UTLAGGNINGSSKIUFT 6/231 C Patc-nttl myönnetty 11 CZ 1935
Patent sic-ddoiat \3&g/ 3 3 C 12 P 7/26, 7/42, (S1) KvJk./IM.CL c 07 D 309/30 SUOMI—FINLAND (21) 801857 (22) H»k«pWy*M—Awllluilrmrfu 10.06.80 (23) AHotpMvt—GHt%»it»du 10.06.80 (41) TMhc faMaakd — M*RοΚμκΜ| 16.12.80
PltHtl- ja rekisterifadiitm /4ft NSmMMsmkm Jt Ιπι·Ι ...........pvm. — htent> och registerstyreben ' ' A-ait»» »dqpl odi KUkriltw pulMond 31-10.84 (32)(33)(31) Frr***r muoaum%-9mefH pm*** 15.06.79 21.09.79, 23-01.80 USA(US) 48946, 77807, 114459 (71) Merck 6 Co., Inc., 126 E. Lincoln Avenue, Rahway, New Jersey, USA(US) (72) Richard L. Monaghan, Somerset, New Jersey, Alfred W. Alberts, Short Hills, New Jersey, Carl H. Hoffman, Scotch Plains, New Jersey,
George A1 bers-Schonberg, Princeton, New Jersey, Henry Joshua,
Staten Island, New York, Maria B. Lopez, Elizabeth, New Jersey, USA(US) (74) Oy Kolster Ab (54) Menetelmä hypokolestereemisen yhdisteen valmistamiseksi - Förfarande för framstälIning av en hypokolesteremisk förening
Keksinnön kohteena on menetelmä hypokolestereemisen yhdisteen valmistamiseksi, jolla on kaava
Q
i J
CH3'^]"0 ^ CH3/A^X^CH3 ch3 2 67231 jossa katkoviivan kohdalla voi olla yksinkertainen sidos tai kaksois-sidos, ja Q on Η0γ^γ0
V VH
Keksinnön mukaisella menetelmällä valmistetut yhdisteet pystyvät erittäin hyvin estämään kolesterolin biosynteesiä, ja ne ovat siten käyttökelpoisia hyperkolesterolemian ja hyperlipidemian käsittelyssä.
Koska korkean veren kolesterolipitoisuuden ja verisuonten kalkkeutumisen välillä on mahdollinen syy-yhteys, on monia ponnisteluja tehty sellaisten keinojen ja aineiden löytämiseksi, jotka vähentävät kolesterolimäärää imettäväisen kehossa. Eräs näistä keinoista on estää kolesterolisynteesi.
US-patenttijulkaisuissa 4 049 495 ja 3 983 140 on kuvattu fermentaatiotuote, joka on saatu viljelemällä Penicillium-sukuun kuuluvaa mikro-organismia ja eristämällä tuote viljelyväliaineesta. Sille annettiin nimi ML 236 B, ja sen ja kahden läheisen yhdisteen, 236 A ja 236 C, rakennekaavat määritettiin. Myös A. G. Brown, T. C. Smale ja T. J. King, J. Chem. Soc. (Perkin I) 1165 (1975), määrittivät tämän yhdisteen rakenteen, ja nimittivät yndistettä kompaktii-niksi. Tämän yhdisteen on todettu olevan kolesterolin inhibiittori in vivo.
Menetelmä kaavan I mukaisen yhdisteen (MSD 803) valmistamiseksi viljelemällä mikro-organismia Monascus ruber 1005 tunnetaan FI-patenttihakemuksesta 800506.
Esillä oleva keksintö perustuu havaintoon, että viljelemällä Aspergillus-sukuun kuuluvaa mikro-organismia, saadaan yhdisteitä, jotka ovat samoin erittäin vahvoja kolesterolin biosynteesin estäjiä imettäväisillä.
Uusien yhdisteiden farmaseuttisesti hyväksyttäviä suoloja ovat sellaisten kationien kuten natriumin, kaliumin, aluminiumin, kalsiumin, litiumin, magnesiumin, sinkin, ammoniumin, etyleenidiamii-nin, N-metyleeniglukamiinin, lysiinin, arginiinin, ornitiitin, kolii-nin, N, N'-dibentsyylietyleenidiamiinin, klooriprokaiinin, dietanoli- 3 67231 amiinin, prokaiinin, N-bentsyylifenyylietyyliamiinin, 1-p-kloori-bentsyyli-2-pyrrolidin-1'-yylimetyylibentsimidatsolin, dietyyliaroii-nin, piperatsiinin, tris(hydroksimetyyli)aminometaanin ja tetrame-tyvliammoniumin suolat.
Keksinnön mukaisella menetelmällä valmistetut yhdisteet ovat erittäin käyttökelpoisia antihyperkolestereemisia aineita ateros-kleroosin, hyperlipidemian ja muiden sen kaltaisten tautien käsittelyyn ihmisellä. Niitä voidaan antaa lääkkeeksi oraalisesti tai pa-renteraalisesti kapselien, tablettien tai injektiovalmisteiden ym. muodossa. Yleensä on edullista käyttää oraalista lääkeantoa. Annokset vaihtelevat riippuen potilaan iästä, taudin vakavuudesta, potilaan kehon painosta ja muista olosuhteista, mutta aikuisilla päivittäinen annos on tavallisesti 2 - 2000 mg (edullisesti 2-100 mg), joka voidaan antaa 2-4 osa-annoksena. Tarvittaessa voidaan myös antaa suurempia annoksia.
Keksinnön mukaisesti valmistetuilla yhdisteillä on myös käyttökelpoista sientenvastäistä aktiivisuutta. Niitä voidaan käyttää estämään esimerkiksi seuraavien sienten kasvua:
Penicillium sp.,
Aspergillus niger,
Cladosporium sp.,
Cochliobolus miyabeorus ja Helminthosporium cynodnotis.
Tässä tarkoituksessa niitä sekoitetaan sopiviin kantaja- ja lisäaineisiin, kuten jauheisiin, emulgointiaineisiin tai liuottimiin, kuten vesipitoiseen etanoliin, ja suihkutetaan tai pölytetään suojeltaville kasveille.
Keksinnön mukaisen menetelmän mukaisesti viljellään Asper-gillus-sukuun kuuluvaa mikro-organismia ja otetaan muodostunut yhdiste talteen viljelyväliaineesta. Taksonomisten tutkimusten perusteella käytetty, eristetty Aspergillus-kanta identifioitiin tähän asti tuntemattomaksi mikro-organismiksi, jolle annettiin nimitys MF-4833 ja joka tallennettiin Merck and Co.'n viljelykokoelmaan, Rahway, N. J., sekä pysyvänä talletuksena kokoelmaan American Type Culture Collection, 12301 Parkland Drive, Rockville, Maryland 20852, jossa sille annettiin tunnusnumero ATCC 20541. Samankaltainen organismi, joka on Merkc'in viljelmäkokoelmassa merkillä MF-4845, on myös talletettu talletusnumerolla ATCC 20542. Tällä viimeksi mainitulla organismilla saadaan parempi saanto.
4 67231
Mikro-organismien MF-4833 ja MF-4845 morfologiset tunnusmerkit ovat:
Konidioiden päät kompaktit, pylväsmäiset; väri vaalean ruskea -ruskea (tummenee viljelmän vanhetessa).
Konidioforit sileät, värittömät.
Vesiklit puolipallonmuotoiset, ylempi puolikas - 2/3 sterigmojen peittämä.
Sterigmat kahdessa sarjassa.
Konidiot pallomaiset - lievästi soikeat; sileät.
Mikro-organismien MF-4833 ja MF-4845 kasvuominaisuudet ovat: 1. Kasvualustana perunadekstroosiagar (pH 5,6), Saboraud-maltoosi-agar (pH 5,6), Czapek-Dox(sakkaroosinitraatti)agar (pH 7,3); lämpötila 28°C. Pesäkkeet kasvavat hyvin, ja melko nopeasti; muodostuu runsaasti itiöitä. Pesäkkeet ovat aluksi valkoiset, muuttuvat sitten keltaisiksi - kellertävän ruskeiksi, itiöiden muodostusvaiheessa pesäkkeet ovat keskiruskeat (kanelinruskeat). Pesäkkeiden pinta on samettimainen - rakeinen, tasomaiset reunat ohuet ja hieman epätasaiset. Muodostuu usein nestepisaroita. Kääntöpuoli keltaisen ruskea, muuttuen tumman ruskeaksi.
2. Kasvualustana hiivauute-mallasuute-dekstroosi-agar (pH 7,2). kasvu pääasiallisesti kuten kohdassa 1; usein on havaittavissa myös valkoisia, epämääräisen muotoisia pesäkealueita.
Käyttämällä alan standarditeoksessa "Manual of the Asper-gilli", Charles Thom ja Kenneth B. Rasper, julkaisija Williams and Wilkins Company, Baltimore, Md. 1945, esitettyjä kriteerejä ja vertaamalla niitä tunnettuihin lajeihin kumpikin kanta määritettiin kuuluvaksi lajiin Aspergillus terreus.
Keksinnön mukaisen menetelmän mukaisesti mikro-organismeja viljellään sellaisissa vesipitoisissa viljelyväliaineissa, joita käytetään muiden fermentointituotteiden valmistuksessa. Tällaiset väliaineet sisältävät sellaisia hiilen ja typen lähteitä ja epäorgaanisia suoloja, joita mikro-organismi pystyy assimiloimaan.
Assimiloituvina hiilen lähteinä ravintoväliaineessa on yleensä hiilihydraatteja, kuten sokereja, esimerkiksi glukoosia, fruktoosia, maltoosia, sakkaroosia, ksyloosia, mannitolia ym., tai tärkkelystä, kuten viljaa, esimerkiksi kauraa, ruista, maissitärk- 5 67231 kelystä, maissijauhoa tms., joko yksinään tai yhdistettynä muiden hiilen lähteiden kanssa. Viljelyväliaineessa käytetyn hiilen lähteen tai lähteiden tarkka määrä riippuu osaksi muista väliaineen aineosista; hiilihydraatin määrä on yleensä 1-6 paino-% väliaineen painosta. Näitä hiilen lähteitä voidaan käyttää yksinään tai useampia niistä voidaan käyttää yhdessä. Typen lähteinä voidaan fermen-tointiprosessissa käyttää monia erilaisia proteiinipitoisia aineita. Sopivia typen lähteitä ovat esimerkiksi hiivahydrolysaatit, primäärinen hiiva, soijapapujauho, puuvillasiemenjauho, kaseiinihydroly-saatit, maissin liuotusliemi, liukoinen tislaamojäte tai tomaatti-tahna ym. Typen lähteitä käytetään joko yksin tai yhdistelminä noin 0,2-6 paino-% vesipitoisen väliaineen painosta.
Viljelyväliaineeseen sisällytettäviä epäorgaanisia suoloja ovat sellaiset tavalliset suolat, joilla väliaineeseen saadaan natrium-, kalium-, ammonium-, kalsium-, fosfaatti-, sulfaatti-, kloridi-, karbonaatti- ym. ioneja. Myös hivenaineita käytetään, kuten kobolttia, mangaania, rautaa ja magnesiumia.
On huomattava, että esimerkeissä kuvatut väliaineet on esitetty ainoastaan niiden monien erilaisten viljelyaineiden valaisemiseksi, joita voidaan käyttää, eikä niitä voida pitää keksintöä rajoittavina. Erityisesti keksinnön mukaisten yhdisteiden valmistuksessa käytettyjä hiilen lähteitä ovat dekstroosi, dekstriini, kaura-jauho, kaurajauhe, melassi, sitraatti, soijaöljy, glyseroli, mallas-uute, kalanmaksaöljy, tärkkelys, etanoli, viikunat, natriumaskor-baatti ja laardiöljy. Typen lähteitä ovat peptonisoitu maito, hii-va-autolysaatti, hiiva-RNA, tomaattitahna, kaseiini, primäärinen hiiva, maapähkinäjauho, liukoinen tislaamojäte, maissinliuotuslie-mi, soijapapujauho, maissijauho, NZ-amiini, lihauute, asparagiini, puuvillasiemenjauhe ja ammoniumsulfaatti. Pääasiallisesti käytettyjä ionikomponentteja ovat CaCO^, KH^PO^, MgSO^·7^0 ja NaCl ja vähäisinä määrinä CaC^^öI^O sekä hivenaineet Fe, Mn, Mo, B ja Cu.
Fermentointi suoritetaan lämpötila-aluee 11a 20 - 37°C; parhaat tulokset saadaan kuitenkin fermentoitaessa 22 - 30°C:ssa. As-pergillus-viljelmän kasvattamiseen ja uusien yhdisteiden tuottamiseen sopiva viljelyväliaineen pH voi olla noin 6,0 - 8,0.
Fermentointi suoritetaan edullisesti pinnanalaisena. Pienessä miltakaavassa fermentointi suoritetaan edullisesti ymppäämällä sopiva ravintoväliaine Aspergillus-viljelmällä, siirtämällä se tuotantoväliaineeseen ja fermentoimalla noin 28°C:ssa ravistusvil-jelmänä useiden päivien ajan.
6 67231
Fermentointi aloitetaan väliainetta sisältävässä steriloidussa pullossa yksi- tai useampivaiheisena ymppiviljelmänä. Ymppivil jelmän väliaineena voidaan käyttää mitä tahansa sopivaa hiilen ja typen lähteitä sisältävää yhdistelmää. Ymppiviljelmää ravistellaan tasaisessa lämpötilassa noin 28°C:ssa 2 vrk, tai kunnes se on kasvanut tyydyttävästi. Siitä otetaan osa ymppäämään joko toisen vaiheen ymppiviljelmää tai tuotantoväliainetta. Välivaiheen ymppiviljel-miä, milloin niitä käytetään, kasvatetaan olennaisesti samalla tavalla ja viimeisen ymppiviljemävaiheen osaa käytetään tuotantoväli-aineen ymppäämiseen. Ympättyjä pulloja ravistellaan tasaisessa lämpötilassa useiden päivien ajan, ja inkubaatiovaiheen päätyttyä pullojen sisältö lingotaan tai suodatetaan.
Suuressa mittakaavassa fermentaatio suoritetaan edullisesti sopivissa tankeissa, jotka on varustettu sekoittimilla ja fermentoin-tiväliaineen ilmastuslaitteella. Tämän menetelmän mukaan ravintovä-liaine valmistetaan tankissa ja steriloidaan kuumentamalla noin 120°C:ssa. Jäähtyneeseen steriloituun väliaineeseen lisätään ympik-si aikaisemmin kasvatettu tuotantoväliaineymppi, ja fermentointi saa jatkua 3-5 vrk noin 28°C:ssa, samalla ravintoväliainetta sekoittaen ja/tai ilmastaen. Tämä menetelmä soveltuu erityisesti uusien yhdisteiden suurien määrien tuottamiseen.
Yhdisteet eristetään fermentointiliemestä edullisesti lakto- neina.
Kaavan I
HO ^ . O
rr s^VS f CH3 ch3 7 67231 mukaisen yhdisteen (MSD-803) fysiokemialliset ominaisuudet esitetään seuraavassa:
1. Sulamispiste 170 - 1 71 °C
2. Molekyylipaino (massaspektri) 404 3. Kaava C„ „H^Or - 24 36 5 saatu massaspektrometrisesti 404,2563 laskettu 404,2563 4. UV-spektri (asetonitriilissä) maksimit 230,5 nm, E % 505,7 237,5 nm, E % 576,6 246 nm, E % 395,2 1 3 5. C NMR kemialliset siirtymät
Spektri määritettiin CDCl3“liuoksessa (20,1 mg 0,35 ml:ssa). Kemialliset siirtymät on ilmoitettu tetrametyylisilaanin suhteen (0 ppm); koeolosuhteissa liuottimen (CDCl^) signaalin keskus on kohdassa 70,0 ppm. Massaspektrin kanssa yhtävpitävästi havaitaan 24 hiiliatomia, niiden kemialliset siirtymät ovat: 11,5, 13,6, 16,0, 22,6, 24,1, 26,6, 27,2, 30,5, 32,5, 32,8, 35,9, 36,4, 37,1, 38,4, 41,3, 62,4, 67,8, 76,4, 128,4, 129,7, 131,7, 133,2, 170,8 ja 177,2 ppm.
6. 1H NMR-spektri
Spektri määritettiin CDCl^-liuoksessa. Kemialliset siirtymät nähdään kuviossa 1 ppm:inä, sisäisenä standardina on tetrametyyli-silaani (0 ppm).
7. IR-spektri IR-spektri määritettiin näytettä sisältävillä KBr-pelieteillä. Se on esitetty kuviossa 2.
8. Optinen kiertokyky
Optinen kiertokyky on = 320,7°; määritetty CH^CN-liuok- sessa (5,30 mg/ml), natriumin D-viivan aaltopituudella.
Näiden ja muiden mittaustulosten perusteella yhdisteellä uskotaan melkoisella varmuudella olevan seuraava stereokemiallinen rakenne: 8 67231
H Οχ O
ΥΎ 0 L o
ch3" 0 pj H
CH3 CH3 CH3
Vastaavalla kaavan III HO
COOH
OH
O
^ III
Cli3 f f
CH3 Λ/l, CH
ch3 mukaisella hydroksihapolla on seuraava stereokemiallinen rakenne: 67231 ho
COOH
oh -tyS . Λ" CH3^|J<«.CH3 c'h3 Näiden molekyylien asymmetriakeskusten absoluuttinen konfiguraatio määritettiin röntgensäde-diffraktion perusteella.
Kaavan II
-λ y CH, ° f I 1 ch3 'γ' CH3 mukaisen yhdisteen (MSD-883) fysiokemialliset ominaisuudet ovat seu-raavat:
1. Sulamispiste 129 - 131°C
2. Molekyylipaino 406 3. Kaava ('24H38°5 saatu massaspektrometrisesti 406,2706 laskettu 406,2719 67231 10 4. ^H NMR-spektri
Spektri määritettiin CDCl3~liuoksessa. Kemialliset siirtymät nähdään kuviossa 3 ppm:inä, sisäisenä standardina oli tetrametyylisi lääni (0 ppm).
5. IR-spektri IR-spektri määritettiin käyttäen näytteen KBr-pellettiä. IR-spektri on esitetty kuviossa 4.
6. Optinen kiertokyky
Optinen kiertokyky LObJ^ = 148,6°; määritys CH3CN-liuokses- sa (5,23 mg/ml), natriumin D-viivan aaltopituudella.
1 3 7. C NMR kemialliset siirtymät CPCl3:ssa 11,8, 14,9, 16,5, 21,1, 23,1, 26,7(2C), 30,9, 31,3, 33,0, 35,7, 35,9, 37,4, 38,5, 38,6, 41,9(2C), 62,3, 70,1, 76,5, 131,0, 132,6, 171,2, 176,7.
Näiden ja muiden mittausten perusteella yhdisteellä uskotaan melkoisella varmuudella olevan seuraava stereokemiallinen rakenne : °W° i Y- ch3 ° ^
' 1 H /H CH
CH3 ch3 l 11 67231
Vastaavalla kaavan IV
H0 \
COOH k. OH
O ^ ch ? i
3 IV
ch3 A^I^ch3 mukaisella hydroksihapolla on seuraava stereokemiallinen rakenne: HO v y"^ cooh
OH
° J^H
3 I = H λΗ CH3
CH3 H
Keksintöä valaistaan seuraavilla esimerkeillä.
Esimerkki 1
Kaavojen I ja III mukaisten yhdisteiden valmistus A. Fermentaatio
Lyofilisoitua MF-4833 viljelmää sisältävä putki avataan aseptisesti, ja sisältö suspendoidaan tavalliseen, avonaiseen 250 ml:n Erlenmeyer-pulloon, joka sisältää noin 20 ml viljelyliuosta A, jolla on seuraava koostumus: 12 67231
Viljelyliuos A
Maissinliotusliemi 10 g
Tomaattitahna 80 g
Kaurajauho 20 g
Glukoosi 20 g (*
Hivenaineseos n:o 2 20 g
Tislattu vesi 1000 ml pH säädetään NaOH:lla arvoon 6,8.
*) Hivenaineseos n;o 2 FeS04*7H20 1000 mg
MnS04-4H20 1000 mg
CuC12-2H20 25 mg
CaCl2-2H20 100 mg H^BO^ 56 mg (NH4)6M07024*4H20 19 mg
SnS04-7H20 200 mg
Tislattu deioinisoitu vesi 1000 ml Ympättyä pulloa inkuboidaan 48 tuntia 28°C:ssa ravistimessa (5 cm heilahdus, 220 r/min). Tämän jälkeen ympätään kahdessa 2 litran Erlenmeyer-pullossa kummassakin oleva 500 ml viljelyliuosta B 10 ml:lla edellä valmistettua viljelmää. V.iljelyliuoksella B on seuraava koostumus:
Viljelyliuos B
Tomaattitahna 20 g
Primäärinen hiiva 10 g CPC tärkkelys 20 g
CoC12*6H20 5 mg
Tislattu vesi 1000 ml pH säädetään NaOH:lla arvoon 7,2 - 7,4.
Näitä kahta pulloa inkuboidaan 28°C:ssa 96 tuntia. Toista pulloa inkuboidaan sekoittamatta ja toista sekoittimessa (5 cm heilahdus, 150 r/min). 96 tunnin kuluttua kummankin pullon sisältö pannaan sivuun tuotteen eristämistä varten.
67231 13 B. Kaavan I mukaisen yhdisteen eristäminen Koko viljelylientä lingotaan 20 - 30 min. Kiinteät aineet säästetään uuttoon. Päällä oleva neste (pH 6-8) pannaan 950 ml:n pulloon ja siihen lisätään 150 ml XAD-hartsia (styreeni-divinyyli-bentseeni-kopolymeeri). Käyttäen etukäteen määrätyllä ohjelmalla toimivaa automaatti-uuttolaitetta seosta sekoitetaan 2 tuntia. Uutettu liemi pestään 2 kertaa 200 ml:11a deionisoitua vettä, ja pesunesteet hylätään. Lisätään 300 ml isopropanoli-etyyliasetaatti-dikloorimetaani-liuotinseosta 25:45:30. Seosta sekoitetaan 2 tuntia. Liuotin-hartsiliete suodatetaan Biichner- tai lasisintterisuo-timella, ja hartsi hylätään. Viljelyliemen kiinteitä aineita sekoitetaan 100 ral:ssa asetonia 0,5 tuntia. Seos lingotaan, ja päällä oleva neste dekantoidaan. Yhdistetty suodos ja dekantoitu neste vä-kevöidään 15 mlrksi.
C. Yhdisteen I testaus
Suodoksista kokeiltiin niiden kykyä estää 3-hydroksi-3-metyyliglutaryyli-koentsyymi A-reduktaasin (HMG-CoA-reduktaasin) vaikutusta menetelmällä, jonka ovat kuvanneet Beg, Stonik ja Brewer (1977 FEBS Letters 80, 123 - 129) käyttäen entsyymejä, joiden valmistuksen ovat kuvanneet Kleinsek, Rangatham ja Porter (1977 Prcc. Natl. Acad. Sei. 74, 1431 - 1435). Positiivinen koetulos (yli 90-% inhibiitio liuoksessa, jossa on 20 pg/ml - IC,.q = 2,3 pg/ml) osoittaa koeliuoksen sisältävän erittäin vahvaa sterolisynteesi-inhi-biittoria, joka vaikuttaa HMG-CoA-reduktaasitasolla.
Esimerkki 2
Yhdisteiden I ja III valmistus A. Fermentaatio
Lyofilisoitua Aspergillus sp. MF-4833 viljelmää sisältävä putki avataan aseptisesti ja sisältö suspendoidaan 250 ml:n Erlen-meyer-pulloon n:o 1, joka sisältää 40 ml viljelyliuosta C, jolla on seuraava koostumus:
Viljelyliuos C
Maissinliotusliemi 5 g
Tomaattitahna 40 g
Kaurajauho 10 g
Glukoosi 10 g
Hivenaineseos n:o 2 10 g
Tislattu vesi 1000 ml pH säädetään NaOH:lia arvoon 6,8.
14 6 72 31
Ympättyä pulloa inkuboidaan 24 tuntia 28°C:ssa sekoittimes-sa (5 cm heilahdus, 220 r/min). Ymppipullossa n:o 1 kasvaneella ym-pillä ympätään (2 ml/pullo) sitten kahdeksassa 250 ml:n Erlenmeyer-pullossa (ymmpipullo n:o 2) oleva 40 ml viljelyliuosta C. Näitä ymppi-pulloja inkuboidaan 24 tuntia 28°C:ssa ravistimessa (5 cm heilahdus, 220 r/min). Tämän jälkeen ympätään 20 2 litran Erlenmeyer-pullossa olevaa 500 ml viljelyliuosta B kukin 14 ml :11a kahdeksasta ymppipullos-ta n:o 2 saatua yhdistettyä kasvustoa. Näitä 20 pulloa inkuboidaan 28°C:ssa sekoittamatta 11 vrk, jonka jälkeen pullojen sisällöt yhdistetään .
B. Uutto 10,2 litraa koko viljelylientä (pH 6,0) sekoitettiin Waring-sekoittimessa raskaiden huovastokakkujen rikkomiseksi, liemi lingot-tiin, ja päällä oleva kirkas neste dekantoitiin ja suodatettiin. Saatu 10 1 suodosta uutettiin 3 litralla etyyliasetaattia, jolloin saatiin 1820 ml kirkasta uutetta. Uuttamalla toisen kerran 3 litralla etyyliasetaattia saatiin 3350 ml kirkasta uutetta. Viljelyliemen kiinteä aines uutettiin sekoittamalla sitä 2 litrassa metanolia ja suodattamalla, jolloin saatiin 2100 ml suodosta.
Näistä uutteista otettiin osa, joka kuivattiin ja aktiivisuus kokeiltiin esimerkin 1 (C) menetelmällä. Saatiin seuraavat tu lokset :
Uute
Tilavuus Kiintoaineiden kokonaismäärä Aktiivisuusyksiköiden (ml)__(mg)___kokonaismäärä__ 1820 1133 1 496 695 3350 787 314 900 2100 13,15 1 144 067 C. Geelisuodatus
Kiintoaineet esimerkissä 2 (B) saadusta kahdesta ensimmäisestä uutteesta yhdistettiin, liuotettiin metanoliin ja suodatettiin liukenemattoman kiintoaineen poistamiseksi. Saatu 30 ml suodosta vietiin geelisuodatuskolonniin (2,5 x 200 cm, 980 ml), joka oli täy- (K) tetty Sephadex^ LH-20:llä (valmistaja: Pharmacia Inc., Uppsala, Ruotsi), ja näyte fraktioitiin metanoliliuotinta käyttäen molekyyli-kokoa vastaaviksi fraktioiksi. Taitekertoimen ja UV-spektrin perusteella identifioitiin parhaat fraktiot biokokeella.
15 67231
Kiintoaineiden kokonaismäärä Aktiivisuusyksiköiden kokonaismäärä __1512)_______
Fraktio 1 - 89 106 271
Fraktio 2 - 278 1 099 680
Fraktio 3 - 779 210 357 D. Erotus ja puhdistus
Edellä saadusta fraktiosta 2 otettu näyte esisuodatettiin Waters Bondapak C18/Propasil B:tä (valmistaja Water Associates, Inc., Milford, Mass., 01757) sisältävän (1 g) kerroksen lävitse ja eluoi-tiin 5 tilavuudella metanolia. Metanolieluaatti konsentroitiin 0,5 ml:ksi. Tämä näyte kromatografoitiin useampina ajoina Waters ^iC18-kolonnilla (3,9 mm x 30 cm) käyttäen kehitysnesteenä metanolin ja ammoniumfosfaattiliuoksen (0,05-m, pH 2,9) seosta (75:25). Fraktiot tutkittiin Beckman spektrofotometrillä, ja fraktiot, joissa oli ab-sorptiomaksimit 236 nm ja olakkeet 229 nm ja 245 nm, yhdistettiin ja konsentroitiin alennetussa paineessa. Saadun vesiliuoksen pH säädettiin 2-m kaliumhydroksidilla arvoon 6,5, ja aktiiviset komponentit uutettiin etyyliasetaatilla. Orgaaninen kerros kuivattiin, haihdutettiin kuiviin, ja jäännös liuotettiin 0,3 ml:aan metanolia. Metanoliliuos kromatografoitiin samoin kuin edellä ja pantiin edelleen kiertoon. Alussa eluoituneet fraktiot yhdistettiin konsentroitiin vesiliuokseksi, joka uutettiin kloroformilla. Kloroformiuute haihdutettiin, ja jäännös liuotettiin metanoliin ja liuotin haihdutettiin typpisuojakaasussa. Saatiin 3,5 mg kuivaa tuotetta, joka identifioitiin hydroksihapoksi (yhdiste III). Toista komponenttia sisältävät fraktiot yhdistettiin ja uutettiin kloroformilla samoin kuin edellä, jolloin saatiin 0,87 mg kuivaa tuotetta, joka identifioitiin laktoniksi (yhdiste I).
Esimerkki 3
Edullisin tapa fermentoida MF-4833-kantaa yhdisteiden I ja III tuottamiseksi
Lyofilisoitua Aspergillus sp. MF-4833 viljelmää sisältävä putki avataan aseptisesti, ja sisältö suspendoidaan 250 ml:n Erlen-meyer-pulloon, joka sisältää 40 ml viljelyliuosta C. Ympättyä pulloa inkuboidaan 48 tuntia 28°C:ssa ravistimessa (5 cm heilahdus, 220 r/min). Tämän jälkeen ymppipullon kasvustolla ympätään kahdessa 16 67231 250 ml:n Erlenmeyer-pullossa oleva 40 ml viljelyliuosta D käyttäen kumpaankin pulloon 2 ml ymppiviljelmää. Viljelyliuoksella D on seu-raava koostumus:
Viljelyliuos D
Laktoosi 20 g
Liukoinen tislaamojäte 15 g
Hiiva-autolysaatti 5 g
Tislattu vesi 1000 ml pH säädetään NaOH:lla arvoon 7,0.
Näitä kahta ympättyä pulloa inkuboidaan 96 tuntia 28°C:ssa ravistimessa (5 cm heilahdus, 150 r/min). 96 tunnin inkuboinnin jälkeen pullojen sisältö uutetaan esimerkissä 2 (B) kuvatulla tavalla. Pulloista saatu kokonaisaktiivisuus on 1450 - 2000 yksikköä/ml. Esimerkki 4
Yhdisteiden I ja III valmistus
Lyofilisoitua Aspergillus MF-4845 viljelmää sisältävä putki avataan aseptisesti ja sisältö suspendoidaan 250 ml:n Erlenmeyer-pulloon (ymppipullo n:o 1), joka sisältää 40 ml viljelyliuosta C. Ympättyä pulloa inkuboidaan 24 - 48 tuntia ravistimessa (5 cm heilahdus, 220 r/min). Osaa pullon sisällöstä (noin 0,5 ml) käytetään sitten viljelyliuosta E sisältävän vinoviljelmän ymppinä. Viljely-liuoksella E on seuraava koostumus:
Viljelyliuos E
Hiivauute 4 g
Mallasuute 10 g
Dekstroosi 4 g
Agar 20 g
Tislattu vesi 1000 ml pH säädetään NaOH:lla arvoon 7,0.
Ympättyä vinoviljelmää inkuboidaan 11 vrk huoneen lämpötilassa. Sitten sitä säilytetään -60°C:ssa 3 - 4 kk. Osa vinoviljel-mästä suspendoidaan 250 ml:n Erlenmeyer-pullossa (ymppipullo n:o 2) olevaan 40 ml:aan viljelyliuosta C. Ympättyä pulloa inkuboidaan 24 tuntia 28°C:ssa ravistimessa (5 cm heilahdus, 220 r/min). Kuuteen 250 ml:n Erlenmeyer-pulloon (ymppipullot n:o 3), joista jokainen sisältää 40 ml viljelyliuosta C, ympätään 2 ml ymppipullon n:o 2 kasvustoa. Näitä kuutta pulloa inkuboidaan 48 tuntia 28°C:ssa ravistimessa (5 cm heilahdus, 220 r/min). Ymppipullojen n:o 3 sisällöllä 17 67231 ympätään sitten kuudessa Erlenmeyer-pullossa oleva 500 ml viljely-liuosta F. Viljelyliuoksella F on seuraava koostumus:
Viljelyliuos F
Maissinliotusliemi 15 g CPC tärkkelys 20 g
Maissijauho 1 g
Soijapapujauho 4 g
Glukoosi 5 g
Soijaöljy 2,5 g <NH4>2S04 4 9 KH2P04 0,3 g
CaCO^ 6 g
Tislattu vesi 1000 ml pH säädetään NaOH:lla arvoon 6,7.
Ympättyjä pulloja inkuboidaan 11 vrk sekoittamalla 28°C:ssa. 11 vrk:n kuluttua viljelyliemi uutetaan esimerkissä 2 (B) kuvatulla menetelmällä. Pulloissa saatu kokonaistuotto on 1231 yksikköä/ml. Esimerkki 5
Edullisin tapa fermentoida MF-4845-kantaa yhdisteiden I ja III tuottamiseksi
Lyofilisoitua Aspergillus MF-4845 viljelmää sisältävä putki avataan aseptisesti, ja sisältö suspendoidaan 250 ml:n Erlenmeyer-pulloon, joka sisältää 40 ml viljelyliuosta C. Ympättyä pulloa inkuboidaan 30 tuntia 28°C:ssa ravistimessa (5 cm heilahdus, 220 r/min). 40 ml viljelyliuosta G sisältävä 250 ml:n Erlenmeyer-pullo ympätään 2 ml:11a ymppipullon kasvustoa. Viljelyliuoksella G on seuraava koostumus :
Viljelyliuos G
Dekstroosi 45 g
Peptonisoitu maito 24 g
Hiiva-autolysaatti 2,5 g
Polyglycol P2000 2,5 ml
Tislattu vesi 1000 ml pH säädetään NaOH:lla arvoon 7,0.
67231 18
Ympättyä pulloa inkuboidaan 120 tuntia 28°C:ssa ravistimes-sa (5 cm heilahdus, 220 r/min). 120 tunnin kuluttua pullon sisältö uutetaan esimerkissä 2 (B) kuvatulla tavalla- Kokonaistuotto on 21> 500 yksikköä/ml.
Esimerkki 6 A. Suuressa mittakaavassa suoritettu MF-4833:n fermentoin-ti yhdisteiden I ja III tuottamiseksi
Fermentoinnin kussakin vaiheessa käytetty viljelyliuos sisältää:
Maissinliuotuslientä 5 g
Tomaattitahnaa 40 g
Kaurajauhoa 10 g
Glukoosia 10 g
Hivenaineliuosta 10 ml
Tislattua vettä 1000 ml pH säädetään NaOH:lla arvoon 6,8.
Hivenaineliuos sisältää:
FeS04‘7H20 1 g
MnS04-4H20 1 g
CuC12*2H20 25 mg
CaCl2 100 mg H3B03 56 mg (NH4)6Mo7024-4H20 19 mg
ZnSO.·7H„0 200 mg 4 2
Tislattu vesi 1000 ml
Kaikkien viljelyliuosten steriiliys tarkistettiin ennen mikro-organismin ymppäämistä.
250 ml:n Erlenmeyer-pulloon pantiin 40 ml viljelyliuosta ja lyofilisoitua organismia MF-4833 yhdestä putkesta. Pulloa ravisteltiin kiertoravistimessa 220 r/min 28°C:ssa 24 tuntia. 1 ml ensimmäisen pullon sisältöä käytettiin ymppäämään aina 40 ml viljely-liuosta uusissa pulloissa, joita ravisteltiin jälleen 24 tuntia 28°C:ssa. Tämän jälkeen 2 litran pulloon pantiin 400 ml viljely-liuosta ja 10 ml fermentointiseosta toisesta vaiheesta ja viljelmää ravisteltiin jälleen 24 tuntia 28°C:ssa.
19 67231 757 litran ruostumattomasta teräksestä valmistetussa fermen-tointitankissa valmistettiin 501 litraa viljelyliuosta, jolla oli seuraava koostumus:
Laktoosi 2 paino/tilav.-%
Liukoinen tislaamojäte 1,5 "
Hiiva-autolysaatti 0,5 "
Polyglykol P2000 0,25 pH säädettiin arvoon 7,0.
Viljelyliuos steriloitiin 15 minuuttia 121°C.ssa. Siihen ympättiin 1 litra edellä kolmannessa vaiheessa saatua seosta, ja sitä inkuboitiin 18°C:ssa sekoittaen 130 r/min ja johtaen ilmaa 0,3 m^/min.
B. Yhdisteen I eristäminen 416 litraan edellä saatua MF-4833:n viljelylientä (koko liemi) lisättiin noin 17 kg (3/4 pakkausta) piihapposuodatusapuainetta, ja seos suodatettiin 46 cm:n suodatinprässillä. Kirkas suodos (pH 6,6) säädettiin pH-arvoon 4,0 varovasti lisäämällä siihen 450 ml väkevää kloorivetyhappoa ja uutettiin sekoittamalla 1/3 tilavuuden kanssa (136 1) etyyliasetaattia. Kerrosten erotuttua ylempi liuotinkerros poistettiin ja vesikerros uutettiin jälleen etyyliasetaatilla (1441) samalla tavalla. Kerrosten erottamisen jälkeen uutteet yhdistettiin ja takaisinpestiin sekoittamalla veden (45 1) kanssa. Faasit erotettiin, ja etyyliasetaattiliuos konsentroitiin tyhjössä alle 30°C:n lämpötilassa ensin sekoittaen kattilassa ja lopuksi sekoitushaihdut-timessa vähän alle 3,8 litran tilavuuteen.
Noin 3800 ml etyyliasetaattia edellä olevasta uutosta konsentroitiin edelleen kiertohaihduttimessa (noin 10 Torr, 40°C haude-lämpötila) siirapiksi, ja sitten haihdutettiin vielä 2 kertaa polaaristen liuottimien poistamiseksi välillä lisäten yhteensä noin 1 1 metyleenikloridia. Lopuksi saatu öljy, joka kuiva-ainemäärityksen mukaan sisälsi noin 250 g kiintoainetta, laimennettiin noin 750 ml:11a etyyliasetaatti/metyleenikloridiseosta (30:70, tilavuussuhde) ja liuokseen lisättiin sekoittaen 200 g silikageeliä, jolloin saatiin liete. Tämä liete kaadettiin 14 x 36 cm kolonnin silikagee-likerrokselle, joka sisälsi 2,5 kg samaa silikageeliä pakattuna lietteenä noin 7,5 litraan samaa liuotinseosta. Kolonni kehitettiin samalla liuottimena ja esifraktiona kerättiin 3 litraa effluenttia.
20 67231 Tämän jälkeen käytettiin kehittämiseen etyyliasetaatti/mety-leenikloridiseosta (50:50, v/v), jolloin kerättiin 800 ml:n fraktioita. 12 fraktion jälkeen eluoitiin 100-% asetonilla. Fraktioiden 4-24 bioaktiivisuus kokeiltiin esimerkissä 1 kuvatulla HMG-CoA-reduktaasi-inhibiitiokokeella. Olennaista aktiivisuutta havaittiin fraktioissa 7-11. Maksimiaktiivisuus oli fraktiossa 8. Se konsentroitiin öljyksi, joka puhdistettiin edelleen. Saanto oli kuiva-ainemäärityksen mukaan 9,0 g.
Silikageelikolonnista saatua fraktiota 8 trituroitiin 50 ml:ssa metyleenikloridia. Suodattamisen jälkeen kuivattu suodatin-kakku painoi 4,9 g. Suodos vietiin 5,1 (sisäläpimitta) x 1 m kolon niin, joka oli täytetty Sephadex® LH-20 dekstraanigeelillä (Pharmacia) , joka oli saanut turvota ja tasapainottua metyleenikloridissä. Kolonni eluoitiin metyleenikloridilla 15 ml/min. Yhdiste I eluoitui välillä 0,64 - 0,81 kolonnin tilavuudesta. Liuotin poistettiin tästä fraktiosta, jolloin saatiin noin 0,290 g ruskehtavaa jäännöstä. Jäännös (213 mg) liuotettiin 1,5 ml:aan CH^Cl^-CH^CN-seosta (65:35), liuos vietiin etukäteen pakattuun tasapainotettuun silikageeliko-lonniin (EM Lobar Size B) ja eluoitiin O^C^-CH^CN-seoksella (65:35) 5 ml/min. Eluentti välillä 235 - 360 ml sisälsi tuotetta, liuotin haihdutettiin, jolloin saatiin 121 mg kiteistä tuotetta, sp. 155 - 160°C. Korkeapainenestekromatografiällä (HPLC) EM RP 18 käänteisfaasi analyyttisellä kolonnilla (E. Merck Hibar II Cat. no. 906046) käyttäen eluenttina 0,05-m natriumfosfaatti (pH 3,0) -ase-tonitriiliseosta (45:55) 2 ml/min saatiin tyypillinen UV-absorptio-huippu 11 min kohdalla.
82 mg tätä materiaalia kiteytettiin uudelleen 0,6 ml:sta vedetöntä etanolia ja sitten uudelleen 0,4 ml:sta samaa liuotinta ja kuivattiin yön yli eksikaattorissa fosforipentoksidilla, jolloin saatiin 40 mg valkeata ainetta. HPLC-analyysillä edellä kuvatulla systeemillä saatiin yksi terävä huippu 11 minuutin eluoinnin kuluttua. Vielä uusien kiteyttämisten jälkeen sp. oli 170 - 171°C.
Tällä materiaalilla saatiin in vitro HMG-CoA-reduktaasiko-keessa (esimerkki 1) IC50 0,01 pg/ml.
21 67231
Esimerkki 7
Yhdisteiden II ja IV valmistus A. Fermentaatio
Lyofilisoitua MF-4845 viljelmää sisältävä putki avataan aseptisesti ja sisältö suspendoidaan 250 ml:n Erlenmeyer-pulloon, joka sisältää noin 10 ml seuraavaa viljelyliuosta:
Viljelyliuos
Maissinliotusliemi 5 mg
Tomaattitahna 40 g
Kaurajauho 10 g
Glukoosi 10 g
Hivenaineliuos 10 g
Tislattu vesi 1000 ml pH säädetään NaOH:lla arvoon 6,8.
Hivenaineliuos
FeS04*7H20 1000 mg
MnS04‘4H20 1000 mg
CuC12*2H20 25 mg
CaCl2*2H20 100 mg 56 mg (NH4)gMo7024-4H20 19 mg
ZnSC>4'7H20 200 mg
Tislattu deionisoitu vesi 1000 ml
Ympättyä pulloa inkuboidaan 24 tuntia 28°C:ssa ravistiraessa (5 cm heilahdus, 220 r/min). Tämän jälkeen ympätään 2 litran Erlen-meyer-pullossa oleva 500 ml viljelyliuosta 10 ml:11a ensimmäisen vaiheen fermentoitua ymppiseosta. Myös tätä viljelmää ravistellaan 24 tuntia 28°C:ssa.
757 litran ruostumattomasta teräksestä valmistettuun fermen-taatiotankkiin viedään 485 litraa viljelyliuosta, jolla on seuraava koostumus:
Sereloosia 4,5 paino/tilav.-%
Peptonisoitua maitoa 2,5 paino/tilav.-%
Hiiva-autolysaattia 0,25 paino/tilav.-%
Polyglycol P2000 0,25 tilav./tilav.-% pH säädetään arvoon 7,0.
67231 22
Viljelyliuos steriloidaan kuumentamalla 121°C:ssa 15 minuuttia. Viljelyliuokseen lisätään 1 litra edellä saatua toisen asteen ymppiviljelmää ja ympättyä viljelyliuosta inkuboidaan 28°C:ssa 12 3 tuntia sekoittaen 130 r/min ja johtaen ilmaa 0,14 m /min 12 tunnin 3 ajan ja sitten 0,28 m /min 84 tunnin ajan.
B. Eristäminen 1. Uutto
Kaksi 378 litran erää koko viljelylientä yhdistettiin, tehtiin happameksi pH-arvoon 4,1 lisäämällä varovasti sekoittaen 800 ml väkevää kloorivetyhappoa ja uutettiin lisäämällä 284 1 etyyliasetaattia ja sekoittamalla edelleen kaksi tuntia.
Sitten lisättiin noin 11 kg piihapposuodatusapuainetta ja koko liete pumpattiin 61 cm:n suodatusprässin lävitse. Suodatuska-kun pesuun ja uuton jatkamiseen käytettiin vielä 284 1 etyyliasetaattia, jolloin neste pumpattiin prässin lävitse vaihtaen suuntaa neljä kertaa. Tämän jälkeen pesuneste poistettiin täysin prässistä ja yhdistettiin ensin saatuun suodokseen. Kaksifaasinen suodos sai erottua, ja vesifaasi poistettiin. Etyyliasetaattikerros pestiin 379 litralla deionisoitua vettä, faasit saivat erottua ja etyyliasetaat-tiuutteet konsentroitiin tyhjössä, jolloin saatiin noin 37,9 litraa jäännöstä.
2. Laktonisointi
Uutteessa mahdollisesti olevan yhdisteen IV syklisoimiseksi yhdisteeksi II suoritettiin seuraava atseotrooppinen käsittely.
Edellä saatuun uutteeseen lisättiin vielä kolmesta 380 litran vi1jelyliemestä saadut etyyliasetaattiuutteet ja liuos haihdutettiin tyhjötislaamalla noin 114 litraksi. Lisättiin noin 191 to-lueenia, ja liuos konsentroitiin tyhjössä 121 litraksi; tämä vaihe toistettiin, sitten lisättiin tolueenia niin, että kokonaistilavuus oli 284 1. Liuos kuumennettiin ilman tyhjöä palautustislauslämpö-tilaan ja pidettiin niin 2 tuntia, jolloin lämpötila oli yli 106°C.
Tämä liuos konsentroitiin tyhjössä pieneen tilavuuteen, ja siitä edelleen suuressa kiertohaihduttimessa tyhjössä, jolloin saatiin öljymäinen jäännös.
3. Silikageeli-kromatografia
Edellä saadusta uutteesta poistettiin muut liuottimet lisäämällä 7,6 1 metyleenikloridia ja haihduttamalla jälleen öljymäisek-si jäännökseksi.
23 6 7 2 31 öljymäinen jäännös liuotettiin noin 19 litraan etyyliasetaat-timetyleenikloridiseosta (30:70 tilav./tilav.-%) ja liuokseen luetettiin 2,8 silikageeliä.
Saatu liete levitettiin samaan liuotinseokseen pakatulle si-likageelikolonnille (30,5 x 80,5 cm) ja kolonnin eluoitiin (800 ml/min) etyyliasetaattimetyleenikloridiseoksella (40:60 tilav./ tilav.). Ensin koottiin 37,9 1 ja sitten 15 litran fraktioita. Fraktiot 6-10 konsentroitiin tyhjössä, saatu öljymäinen jäännös liuotettiin kuumaan etyyliasetaattiin, liuosta käsiteltiin värinpoisto-hiilellä, liuos suodatettiin kuumana ja suodos jäähdytettiin. MSD 803 (yhdiste I) kiteet suodatettiin ja emäliuos konsentroitiin öljyksi, joka kromatografoitiin edelleen.
4. Uudelleenkromatografointi silikageelillä 227 litran fermentoidun viljelyliemen uutosta vastaavalla käsittelyllä saatu emäliuos ja edellä saatu metyleenikloridiliuos yhdistettiin. Puolet tästä liuoksesta kromatografoitiin uudelleen silikageelillä. Pienestä näytteestä tehty määritys osoitti kiinto-ainepitoisuuden olevan 325 g. Liuosta käsiteltiin 40 g:11a värinpois-tohiiltä, liuos suodatettiin ja suodatuskakku pestiin metyleeniklo-ridilla. Yhdistetty suodos ja pesuneste haihdutettiin tyhjössä öl-jymäiseksi jäännökseksi. Se liuotettiin 800 ml:aan etyyliasetaatti-metyleeniklorid-i seosta (30:70 tilav./tilav.), ja liuokseen lietet-tiin 225 g silikageeliä. Liete levitettiin samaan liuotinseokseen pakatun silikageelikolonnin (14 x 36 cm) päälle. Kehittämiseen käytettiin etyyliasetaattimetyleenikloridiseosta (40:60 tilav./tilav.). Aluksi saatu 3 litraa pantiin sivuun, sitten koottiin 800 ml:n fraktioita.
5. Kromatografointi käänteisfaasipakkauksella Edellä saadusta kromatografoinnin fraktiosta 12 otettiin 40 ml ja haihdutettiin öljymäiseksi jäännökseksi (500 mg), joka liuotettiin 5 ml:aan asetonitriiliä. Asetonitriililiuos vietiin ruostumattomasta teräksestä valmistettuun kromatografiakolonniin (uikoläpimitta 15,9 mm, pituus 1,8 m), joka oli pakattu preparatii-visella käänteisfaasinestekromatografia-pakkausmateriaalilla, Bonda-pak C18/Porasil B (Water Associates, Inc., Milford, Mass. 01757). Kolonni eluoitiin seoksella, joka sisälsi tilavuus/tilavuus-%:eina 55 % asetonitriiliä ja 45 % 0,05-m ammoniumfosfaattia (pH 3). Taite-kertoimen perusteella eluoitu neste välillä 1360 ml:sta 1700 ml:aan yhdistettiin. Orgaaninen liuotin poistettiin tyhjössä, ja jäljelle 24 6 7 2 31 jäänyt vesiliuos uutettiin etyyliasetaatilla. Etyyliasetaatti haihdutettiin tyhjössä/ jolloin saatiin 120 mg otsikon mukaista yhdistettä, joka kiteytettiin väkevästä asetonitriililiuoksesta, jolloin saatiin kiteistä MSD 883:a (yhdiste II), sp. 129 - 131°C.
Esimerkki 8
Yhdisteiden II ja IV vaihtoehtoinen eristäminen
Esimerkissä 7 A saatu fermentoitu viljelyliemi (379 1) tehdään happameksi fosforihapolla pH-arvoon 5. Sitten siihen lisätään etyyliasetaattia (265 1) ja seosta sekoitetaan voimakkaasti. Huovas-to suodatetaan pois ja suodatuskakku pestään pienellä määrällä etyyliasetaattia; pesuneste ja uute yhdistetään. Orgaaninen faasi erotetaan ja siihen sekoitetaan 191 0,2-n natriumhydroksidi-liuosta.
Seosta sekoitetaan voimakkaasti, jonka jälkeen sen annetaan erottua. Vesikerros erotetaan ja pH säädetään fosforihapolla 9:stä 5:een. Uutetaan sitten 7,6 litralla heksaani-etyyliasetaattiseosta (2:1) ja vielä 3,8 litralla samaa seosta. Orgaaniset uutteet yhdistetään ja kuivataan vedettömällä magnesiumsulfaatilla. Magnesiumsulfaatti suodatetaan, ja suodatuskakku pestään 1 litralla samaa heksaani-etyyli-asetaattiliuosta, pesuneste ja suodos yhdistetään ja laimennetaan 2 litralla asetonia. Liuosta sekoitetaan samalla johtaen siihen am-moniakkikaasua. Kaasun absorboituessa muodostuu kiteinen sakka. Kun ammoniakin absorboituminen lakkaa ja sakka alkaa tummeta, ammoniak-kikaasun johtaminen keskeytetään ja seoksen annetaan seistä useita tunteja, minkä jälkeen se suodatetaan. Raaka ammoniumsuolasuodatus-kakku pestään asetonilla kunnes pesuneste on väritöntä, jonka jälkeen se ilmakuivataan.
Raaka ammoniumsuola kiteytetään liuottamalla 5,7 litraan kloroformi/metanoli/väkevä ammoniumhydroksidiliuos-seosta (80:20:2) ja suodattamalla liukenematon värillinen aine. Suodos laimennetaan sitten yhtä suurella tilavuusmäärällä asetoni-eetteriseosta (1:1) ja jätetään yöksi seisomaan. Suodattamalla saadaan kiteinen nahan-ruskea ammoniumsuola (96,5 g).
Lisäpuhdistusta voidaan suorittaa liuottamalla 70 g edellä kiteytettyä ainetta 2 litraan kiehuvaa isopropanoli/väkevä NH^OH-vesiliuos-seosta (95:5), lisäämällä kuumaan liuokseen aktiivihiiltä ja suodattamalla. Suodos saa jäähtyä huoneen lämpötilaan ja sitä seisotetaan sitten yön yli -20°C:ssa. Sakka suodatetaan ja suodatus- 25 6 72 31 kakku pestään kylmällä (-20°C) isopropanolilla, sitten kylmällä asetonilla ja sitten huoneen lämpöisellä eetterillä. Tuote kuivataan typpikehässä/ jolloin saadaan 60 g valkeata kiteistä ammoniumsuolaa.
4164 litran fermentoinnista saatu epäpuhdas ammoniuiasuola lak-tonisoitiin liuottamalla veteen, tekemällä liuos happameksi (pH 3) väkevällä kloorivetyhapolla, uuttamalla tolueenilla ja keittämällä palautusjäähdyttäen 2 tuntia, kuten esimerkissä 7 (B. 2.) kuvattiin. Haihduttamalla tyhjössä pieneen tilavuuteen saadaan epäpuhtaita kiteitä, jotka sisältävät yhdistettä I ja vähäisen määrän yhdistettä II. Kiteet suodatetaan ja kuivataan.
Kahdestatoista tällaisesta valmistuserästä saatu tuote yhdistetään ja kiteytetään 45,8 kg:sta etanolia, kiteet suodatetaan ja pestään etanolilla. Yhdistetyt emäliuokset ja pesunesteet konsentroidaan tyhjössä noin 11,4 litraksi, ja toinen erä yhdisteen I kiteitä suodatetaan. Tästä suodatuksesta saatua emäliuosta käsitellään seuraavasti:
Noin 0,5 litraa emäliuosta valmistetaan käänteisfaasikromato-grafointiin haihduttamalla tyhjössä etanoli, pesemällä asetonitrii-lillä ja suodattamalla liukenematon aines pois. 100 mitään asetonit-riiliä liuotettu aine johdetaan C-18 käänteisfaasipakkauksella (200 ml) täytetyn kerroksen lävitse ja kerros pestään sitten vielä 1 litralla asetonitriiliä. Yhdistetyt suodokset haihdutetaan ja jäännös liuotetaan 360 mitään kromatografointiliuotinta (asetonitriili-vesi-seos, 60:40 tilav./tilav.), liuos suodatetaan liukenemattoman aineen poistamiseksi. Kiintoaineen määrä on näytteestä tehdyn määrityksen mukaan 15,3 g.
160 ml tätä liuosta kromatografoidaan Waters Prep 500-systee-millä käyttäen kahta 5 x 30 cm patruunaa C-18 käänteisfaasipakkaus-ta (oktadekyylipäällyste sidottuna piidioksidille, valmistaja Waters Associates, Inc., Milford, Mass. 01757) ja eluointiin asetonitriili-vesiseosta (60:40 tilav./tilav.) nopeudella 130 ml/min huoneen lämpötilassa, jolloin toteamiseen käytetään taitekerrointa. Aluksi saatu epäpuhtauksia sisältävä 3900 ml eluenttia hylätään. Yhdisteen I suuri pitoisuus saadaan eluenttivälillä 3900 - 5850 ml, se otetaan talteen. Eluenttivälillä 5850 - 6500 saadaan sekafraktioita, jotka otetaan talteen uudelleenkromatografointia varten. Viimeksi eluoitu-neet (6500 - 8450 ml) puhdasta yhdistettä II sisältävät fraktiot kootaan ja haihdutetaan öljymäiseksi jäännökseksi (noin 3 g).
26 672 31
Puolet tästä yhdisteen II konsentraatista (noin 1,5 g) valmistetaan kromatografointiin yhdisteen IV ammoniumsuolana liuottamalla se sekoittaen 6 ml:aan lämmintä metanolia ja lisäämällä välittömästi 1-n natriumhydroksidi-liuosta sellainen määrä, että pH pysyy alueella 10,5 - 11; tarvittava natriumhydroksidimäärä on 3,5 - 3,8 ml. Liuosta seisotetaan 0,5 tuntia, sitten liukenematon aines suodatetaan ja suodos pumpataan kolonniin (2,5 x 86 cm), joka on täytetty 200 - 325 mesh'in hienousasteeseen jauhetulla XAD-hartsilla (sty-reeni-divinyylibentseeni-kopolymeeri) ja eluoidaan 40°C:ssa aseto-nitriilin ja 0,1-n ammoniumhydroksidin 23:77-seoksella nopeudella 2 ml/min. Kootaan 20 ml:n fraktioita, joista fraktiot 1-44 sisältävät epäpuhtauksia ja yhdisteen III suolaa. Nämä fraktiot hylätään. Fraktiot 45 - 61 otetaan talteen ja haihdutetaan tyhjössä. Saatu vesipitoinen jäännös lyofilisoidaan, jolloin saadaan 0,72 g yhdisteen IV ammoniumsuolaa.
Esimerkki 9 A. HMG koentsyymi A reduktaasin inhibiitio in vitro
Beg'in et ai., FEBS Letters, 80, 123 (1977), menetelmää muunnettiin hieman siten, että entsyymiä inkuboitiin inhibiittorin kanssa 5 minuuttia ennen reaktiota substraatin kanssa. Kun kyseessä ovat vahvat inhibiittorit, kuten keksinnön mukaiset uudet yhdisteet, ei standardimenetelmällä, jossa entsyymiä lisätään suoraan inhibiitto-ri-substraattiseokseen, saada lineaarista kinetiikkaa.
Käytettäessä modifioitua menetelmää saatiin kaavan IV natrium- -9 suolalla HMG-CoA-reduktaasin inhibiitioarvo ΙΟ,-Λ = 2,7 x 10 M, kun _ g ML 236B:n vastaava arvo on 5,4 x 10 M.
B. Kolesterolisynteesin inhibiitio in vivo (yhdiste II) Ryhmälle urospuolisia Holtzman-rottia annettiin mahaletkulla joko 5-% Emulphor-suolaliuosta tai koeyhdistettä Emulphor-suolaliuok- sessa. Tunnin kuluttua rotille annettiin intraperitoneaalisesti 80 1 4 uCi C-asetaattia/kg. 50 minuutin kuluttua rotista otettiin veri- 1 14 näytteet ja C-kolesterolimäärityksestä saatiin sterolisynteesin inhibiitio:
Annos , mg/kg__Inhibiitio-% 0,15 38 0,6 51 1,2 70 67231 27
Esimerkki 10
Yhdisteiden I, II ja ML 236B vertailu sterolisynteesin inhibiittoreina soluviljelmässä Käytettiin muunnettua A. W. Alberts1 in et ai., J. Biol. Chem.
14 249, 5241 (1974) menetelmää, jossa mitattiin C-sterolibiosyntee-1 4 si C-etikkahaposta hiiren L-M soluviljelmässä. Koeyhdistettä lisättiin 10 ulissa dimetyylisulfoksidia yksikerrosviljelmiin, joissa 14 oli 5 /uCi C-asetaattia. 3 tunnin inkuboinnin jälkeen solut saip-1 4 puoitiin, ja C-steroli uutettiin ja eristettiin ohutkerroskromato- grafisesti silikageelillä käyttäen petrolieetteri/dietyylieetteri/- 1 4 etikkahapposeosta (75:25:1). C-sterolia sisältävä kohta levyllä 1 4 identifioitiin 11a, ja C-määrä määritettiin nestetuikelaski-mella.
Tällä modifioidulla menetelmällä yhdisteen II HMG-CoA-reduk-taasin inhibiitio IC5Q = 17 nM, yhdisteen I IC50 = 22 nM ja yhdisteen ML 236B ICj-q = 46 nM.
Claims (5)
1. Menetelmä hypokolestereemisen yhdisteen valmistamiseksi, jolla on kaava Q 0 i I CH 3ΑΛ/“3 ch/ jossa katkoviivan kohdalla voi olla yksinkertainen sidos tai kaksois-sidos, ja Q on Η0γ--γ0 H0V^' f ° 0 tai 0H V V tunnettu siitä, että viljellään viljelyväliaineessa Aspergillus terreus-sukuun kuuluvaa mikro-organismia, ja yhdiste eristetään viljelyväliaineesta.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä yhdisteen valmistamiseksi, jolla on kaava 67231 29 Η0 ^jl y ch, ? CH3 tunnettu siitä, että viljellään viljelyväliaineessa Aspergillus terreus-sukuun kuuluvaa mikro-organismia ja yhdiste eristetään viljelyväliaineesta.
3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että käytetyn mikro-organimin deponointinumero on ATCC 20541 tai 20542.
4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä yhdisteen valmi s telmi seksi , jolla on kaava hovV OH V^OH ch j tunnettu siitä, että viljellään viljelyväliaineessa Aspergillus terreus-sukuun kuuluvaa mikro-organismia, ja yhdiste eristetään viljelyväliaineesta.
5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käytetään mikro-organismia, jonka deponointinumero on ATCC 20541 tai 20542. 67231 30
Applications Claiming Priority (6)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US4894679 | 1979-06-15 | ||
US06/048,946 US4231938A (en) | 1979-06-15 | 1979-06-15 | Hypocholesteremic fermentation products and process of preparation |
US7780779A | 1979-09-21 | 1979-09-21 | |
US7780779 | 1979-09-21 | ||
US11445980A | 1980-01-23 | 1980-01-23 | |
US11445980 | 1980-01-23 |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
FI801857A FI801857A (fi) | 1980-12-16 |
FI67231B FI67231B (fi) | 1984-10-31 |
FI67231C true FI67231C (fi) | 1985-02-11 |
Family
ID=27367450
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
FI801857A FI67231C (fi) | 1979-06-15 | 1980-06-10 | Foerfarande foer framstaellning av en hypokolesteremisk foerening |
Country Status (20)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0022478B1 (fi) |
AR (1) | AR224008A1 (fi) |
AT (1) | ATE2620T1 (fi) |
AU (1) | AU535944B2 (fi) |
CA (1) | CA1161380A (fi) |
DD (1) | DD157344A5 (fi) |
DE (1) | DE3062122D1 (fi) |
DK (1) | DK149003C (fi) |
EG (1) | EG16957A (fi) |
ES (1) | ES492384A0 (fi) |
FI (1) | FI67231C (fi) |
GR (1) | GR69216B (fi) |
IE (1) | IE49685B1 (fi) |
IL (1) | IL60219A (fi) |
NO (1) | NO155699C (fi) |
NZ (1) | NZ193922A (fi) |
PL (1) | PL125843B1 (fi) |
PT (1) | PT71371B (fi) |
RO (1) | RO79487A (fi) |
ZW (1) | ZW13480A1 (fi) |
Families Citing this family (31)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS5925599B2 (ja) * | 1979-02-20 | 1984-06-19 | 三共株式会社 | 新生理活性物質モナコリンkおよびその製造法 |
JPS55150898A (en) * | 1979-05-11 | 1980-11-25 | Sankyo Co Ltd | Preparation of a new physiologically active substance mb-530b |
AU548996B2 (en) * | 1980-02-04 | 1986-01-09 | Merck & Co., Inc. | Tetrahydro-2h-pyran-2-one derivatives |
PT72394B (en) * | 1980-02-04 | 1982-09-06 | Merck & Co Inc | Process for preparing dihydro and tetrahydromevinoline hypocholesterolimics |
US4282155A (en) * | 1980-02-04 | 1981-08-04 | Merck & Co., Inc. | Antihypercholesterolemic compounds |
JPH0692381B2 (ja) * | 1980-03-31 | 1994-11-16 | 三共株式会社 | Mb−530a誘導体 |
DK149080C (da) * | 1980-06-06 | 1986-07-28 | Sankyo Co | Fremgangsmaade til fremstilling af derivater af ml-236b-carboxylsyre |
JPS5835144A (ja) * | 1981-08-27 | 1983-03-01 | Sankyo Co Ltd | Mb−530b誘導体およびその製造法 |
DE8533814U1 (de) * | 1985-11-30 | 1986-01-16 | Beiersdorf Ag, 2000 Hamburg | Vorrichtung zum Spülen des Darmes |
US4681893A (en) * | 1986-05-30 | 1987-07-21 | Warner-Lambert Company | Trans-6-[2-(3- or 4-carboxamido-substituted pyrrol-1-yl)alkyl]-4-hydroxypyran-2-one inhibitors of cholesterol synthesis |
US4678806A (en) * | 1986-09-02 | 1987-07-07 | Merck & Co., Inc. | Prodrugs of antihypercholesterolemic compounds |
DE3739882A1 (de) * | 1987-11-25 | 1989-06-08 | Bayer Ag | Substituierte hydroxylamine |
NO890522L (no) * | 1988-02-25 | 1989-08-28 | Bayer Ag | Substituerte imidazolinoner og imidazolinthioner. |
AU618158B2 (en) * | 1989-01-07 | 1991-12-12 | Bayer Aktiengesellschaft | New substituted pyrido(2,3-d)pyrimidines |
DE3911064A1 (de) * | 1989-04-06 | 1990-10-11 | Bayer Ag | Substituierte 1,8-naphthyridine |
FI94339C (fi) | 1989-07-21 | 1995-08-25 | Warner Lambert Co | Menetelmä farmaseuttisesti käyttökelpoisen /R-(R*,R*)/-2-(4-fluorifenyyli)- , -dihydroksi-5-(1-metyylietyyli)-3-fenyyli-4-/(fenyyliamino)karbonyyli/-1H-pyrroli-1-heptaanihapon ja sen farmaseuttisesti hyväksyttävien suolojen valmistamiseksi |
CA2062023A1 (en) | 1992-02-10 | 1993-08-11 | Jagroop S. Dahiya | Novel fungal strains and use thereof in antibiotic production |
NZ245713A (en) * | 1992-02-10 | 1994-12-22 | Novopharm Ltd | Production of the antibiotic lovastatin from genetically engineered aspergillus strains |
EP0629184A1 (en) * | 1992-03-04 | 1994-12-21 | Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd. | TETRALIN DERIVATIVES AS HMG-CoA REDUCTASE INHIBITORS |
HU210867B (en) * | 1992-11-04 | 1995-10-30 | Biogal Gyogyszergyar | Method for extraction and purification of mevinolin from culture medium |
DE4244029A1 (de) * | 1992-12-24 | 1994-06-30 | Bayer Ag | Neue substituierte Pyridine |
SI9300303A (en) * | 1993-06-08 | 1994-12-31 | Krka Tovarna Zdravil | Process for isolation of hypolipemic effective substance |
US5409820A (en) * | 1993-08-06 | 1995-04-25 | Apotex, Inc. | Process for the production of lovastatin using Coniothyrium fuckelii |
RU2158607C2 (ru) * | 1995-07-03 | 2000-11-10 | Санкио Компани Лимитед | Лечение артериосклероза и ксантомы |
CA2199104A1 (en) | 1996-03-05 | 1997-09-05 | Tsuneaki Hida | Xanthene derivatives, their production and use |
AU6400098A (en) * | 1997-02-20 | 1998-09-09 | Gist-Brocades B.V. | Fermentative production of valuable compounds on an industrial scale using chemically defined media |
US6083497A (en) | 1997-11-05 | 2000-07-04 | Geltex Pharmaceuticals, Inc. | Method for treating hypercholesterolemia with unsubstituted polydiallylamine polymers |
SI9800057A (sl) | 1998-02-26 | 1999-08-31 | Krka, Tovarna Zdravil, D.D. | Postopek za pripravo simvastatina in njegovih derivatov |
RS53461B (en) | 2006-07-05 | 2014-12-31 | Takeda Gmbh | COMBINATION OF HMG-COA REDUCTASE INHIBITOR OR SIMVASTATIN WITH PHOSPHODIESTERASE 4 INHIBITOR AS A ROFLUMILAST FOR THE TREATMENT OF INFLAMMATORY PULMONARY DISEASES |
SI2373609T1 (sl) | 2008-12-19 | 2013-12-31 | Krka, D.D., Novo Mesto | Uporaba amfifilnih spojin za kontrolirano kristalizacijo statinov in intermediatov statinov |
EP2327682A1 (en) | 2009-10-29 | 2011-06-01 | KRKA, D.D., Novo Mesto | Use of amphiphilic compounds for controlled crystallization of statins and statin intermediates |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4049495A (en) * | 1974-06-07 | 1977-09-20 | Sankyo Company Limited | Physiologically active substances and fermentative process for producing the same |
JPS5559180A (en) * | 1978-10-30 | 1980-05-02 | Sankyo Co Ltd | 4-hydroxy-2-pyrone ring compound, its preparation, and remedy for hyperlipemia comprising it as active constituent |
-
1980
- 1980-06-03 GR GR62115A patent/GR69216B/el unknown
- 1980-06-03 IL IL60219A patent/IL60219A/xx unknown
- 1980-06-03 AU AU59017/80A patent/AU535944B2/en not_active Expired
- 1980-06-04 NZ NZ193922A patent/NZ193922A/xx unknown
- 1980-06-04 AR AR281295A patent/AR224008A1/es active
- 1980-06-06 ZW ZW134/80A patent/ZW13480A1/xx unknown
- 1980-06-09 RO RO80101368A patent/RO79487A/ro unknown
- 1980-06-10 FI FI801857A patent/FI67231C/fi not_active IP Right Cessation
- 1980-06-11 PT PT71371A patent/PT71371B/pt unknown
- 1980-06-11 CA CA000353777A patent/CA1161380A/en not_active Expired
- 1980-06-12 ES ES492384A patent/ES492384A0/es active Granted
- 1980-06-12 PL PL1980224920A patent/PL125843B1/pl unknown
- 1980-06-12 DE DE8080103286T patent/DE3062122D1/de not_active Expired
- 1980-06-12 AT AT80103286T patent/ATE2620T1/de active
- 1980-06-12 EP EP80103286A patent/EP0022478B1/en not_active Expired
- 1980-06-13 NO NO801775A patent/NO155699C/no unknown
- 1980-06-13 IE IE1232/80A patent/IE49685B1/en not_active IP Right Cessation
- 1980-06-13 DD DD80221832A patent/DD157344A5/de unknown
- 1980-06-13 DK DK254180A patent/DK149003C/da not_active IP Right Cessation
- 1980-06-14 EG EG355/80A patent/EG16957A/xx active
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
AR224008A1 (es) | 1981-10-15 |
EG16957A (en) | 1990-06-30 |
PL125843B1 (en) | 1983-06-30 |
AU535944B2 (en) | 1984-04-12 |
RO79487A (ro) | 1982-07-06 |
GR69216B (fi) | 1982-05-07 |
IL60219A0 (en) | 1980-09-16 |
ES8105389A1 (es) | 1981-06-01 |
ATE2620T1 (de) | 1983-03-15 |
DK149003C (da) | 1986-08-18 |
DK254180A (da) | 1980-12-16 |
PT71371B (en) | 1981-10-21 |
NZ193922A (en) | 1982-05-25 |
AU5901780A (en) | 1980-12-18 |
NO155699C (no) | 1987-05-13 |
CA1161380A (en) | 1984-01-31 |
IL60219A (en) | 1985-05-31 |
IE801232L (en) | 1980-12-15 |
FI801857A (fi) | 1980-12-16 |
ES492384A0 (es) | 1981-06-01 |
FI67231B (fi) | 1984-10-31 |
PT71371A (en) | 1980-07-01 |
DK149003B (da) | 1985-12-16 |
DE3062122D1 (en) | 1983-03-31 |
EP0022478A1 (en) | 1981-01-21 |
NO801775L (no) | 1980-12-16 |
EP0022478B1 (en) | 1983-02-23 |
DD157344A5 (de) | 1982-11-03 |
ZW13480A1 (en) | 1982-02-03 |
IE49685B1 (en) | 1985-11-27 |
PL224920A1 (fi) | 1981-03-27 |
NO155699B (no) | 1987-02-02 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
FI67231C (fi) | Foerfarande foer framstaellning av en hypokolesteremisk foerening | |
US5026554A (en) | Method of inhibiting fungal growth using squalene synthetase inhibitors | |
US4342767A (en) | Hypocholesteremic fermentation products | |
US4319039A (en) | Preparation of ammonium salt of hypocholesteremic fermentation product | |
KR830002329B1 (ko) | 모나콜린 k의 제조방법 | |
US5182298A (en) | Cholesterol lowering agents | |
US4294926A (en) | Hypocholesteremic fermentation products and process of preparation | |
US4231938A (en) | Hypocholesteremic fermentation products and process of preparation | |
FI66427B (fi) | Foerfarande foer framstaellning av en ny som laekemedel anvaendbar foerening monacolin k | |
US5283256A (en) | Cholesterol-lowering agents | |
US5102907A (en) | Novel squalene synthetase inhibitors | |
US5055487A (en) | Novel anti-fungal compounds | |
US5053425A (en) | Novel anti-fungal compounds | |
US5096923A (en) | Novel squalene synthetase inhibitors | |
DE68914495T2 (de) | Antihypercholesterolemisches Mittel. | |
AU640756B2 (en) | 2,8-dioxabicyclo(3,2,1)octane derivatives,their production from cultures of MF 5447 and MF 5466 and their use as anti hyper cholesterolemics | |
IE913221A1 (en) | Novel squalene synthetase inhibitors | |
US5132320A (en) | Squalene synthetase inhibitors | |
US5151365A (en) | Culture of Asperigillus versicolor and mutants thereof | |
US5254727A (en) | Acyclic tricarboxylic acid compounds | |
US5244795A (en) | Processes for preparing cholesterol lowering compounds | |
GB2261373A (en) | Inhibitors of farnesyl protein transferase as anti-cancer agents | |
CA2145204A1 (en) | Antibiotic agents | |
EP0505135A2 (en) | Cholesterol lowering agents and antifungal agents | |
JPS5840475B2 (ja) | 新生理活性物質ml−236aおよびその製造法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
ND | Supplementary protection certificate (spc) granted | ||
SPCG | Supplementary protection certificate granted |
Spc suppl protection certif: L1 Extension date: 20030622 |
|
MA | Patent expired |
Owner name: MERCK & CO INC. |