Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarza¬ nia nowych laiktonów i nowych hydroksykwasów o wzorach 1, 2, 3 i 4, jak równiez farmakologicznie dopuszczalnych soli albo nizszych estrów alkilowych tych kwasów karboksylowych, przy czym rodnia alkilowy w tych estrach moze byc podstawiony grupa fenylowa, dwumetyloaminowa lub acetylo- arciiricwa.Zwiazki wytwarzane sposobem wedlug wyinalaizku maja doskonale wlasciwosci hamowania biosyntezy cholesterolu i sa uzyteczne przy zwalczaniu hiper- cholesiterolemii i hiperlipemii.Ze wzgledu na wysoce prawdopodobny zwiazek pomiedzy stezeniem cholesterolu we krwi i tward¬ nieniem tetnic czyniono wiele wysilków, w celu wynalezienia dróg oraz substancji umozliwiajacych zmniejszenie zawartosci cholesterolu w organizmach ssaków. Jedna z tych dróg jest ograniczanie zdol- nosci tych organizmów do syntezowania choleste¬ rolu.W opisach patentowych Stanów Zjednoczonych Ameryki nr nr 4049495 i 3983140 ujawniono produkt wytworzony przez hodowanie mikroorganizmu z ro¬ dzaju Penicillium i nastepnie wyosobnianie tego produktu ze srodowiska hodowli. Produkt ten; nazwano ML 236 B i okreslono jego budowe razem, z dwoma pokrewnymi zwiazkami 236 A i 236 C.Budowa tego zwiazku o nazwie „kompaktyna" zostala tez okreslona przez A. G. Browna, T. C. Smale i T. J. Kinga [J. Chem. Soc. (P^rkin I); 10 1S 20 25 2 1165 (1975)]. Stwierdzono, ze zwiazek ten powstrzy¬ muje in vivo biosynteze cholesterolu.Nieoczekiwanie stwierdzono, ze droga hodowli mikroorganizmu innego niz w sposobach znanyci^ z wyzej powolanych opisach patentowych a miano¬ wicie mikroorganizmu z rodzaju Aspergillus, wy¬ twarza sie nowe zwiazki, które równiez bardzo silnie hamuja proces biosyntezy cholesterolu u ssa¬ ków. Sa to substancje zawierajace glównie nowe zwiazki o wyzej podanych wzorach 1, 2, 3 i 4, a tyl¬ ko slady innych zwiazków. Stwierdzono, ze zwiazki te hamuja proces biosyntezy cholesterolu in vivo w stopniu znacznie silniejszym niz wspomniany wyzej zwiazek ML 236 B.Wynalazek obejmiuje równiez wytwarzanie far¬ makologicznie dopuszczalnych soli tych zwiazków, zawierajacych kationy metali taJkich, jak sód, potasT glin, wapn, lit, magnez lub cynk albo grup takich, jak grupa amonowa, grupa etylenodwuaminy, N-metyloglukaminy, lizyny, argininy, ornityny, choliny, N^-dwubenzyloetylenodwuaniiny, chlo- roprokainy, prokainy, dwuetanoloaminy, N-benzylo- fenyloetyloaminy, l-p-chlorobenzylo-2-pirolidynylo- -1-metylobenzimidazolu, dwuetyloaiminy, piperazy¬ ny, trój/hydroksymetylo)-aminometanu i grupa czte- rometyloamoniowa.Zwiazki wytwarzane sposobem wedlug wynalazku sa wysoce uzyteczne jako srodki przeciw hipercho- lesterolemii przy zwalczaniu schorzen takich, jak twardnienie tetnic, hiperlipemia i schorzenia po- 125 843125 843 dobne u ludzi. Srodki te mozna podawac doustnie, lub pozajelitowa w postaci kapsulek, tabletek, pre¬ paratów do wstrzykiwania itp.. Korzystnie jest po¬ dawac fe srodki doustnie, a ich dawka moze byc rózna, w zaleznosci od wieku pacjenta, nasilenia schorzenia, masy ciala pacjenta oraz innych wa¬ runków. Dla ludzi doroslych dzienna dawka wy¬ nosi od okolo 2 mg do 2000 mg, korzystnie 2—100 mg i mozna ja dzielic na 2—4. dawki pojedyncze.W razie potrzeby mozna stosowac dawki wieksze od wyzej podanych.Zwiazki wytwarzane sposobem wedlug wynalazku dzialaja równiez grzybobójczo i moga byc stoso¬ wane na przyklad do zwalczania szczepów Penici- llium sp., Aspergillus niger, Cladosporium sp., Cochliobolus miyabeorus i Helminthosporium cy- riocknotis. Do tych celów zwiazki te stosuje sie w postaci preparatów zawierajacych odpowiednie do¬ datki, takie jak nosniki w postaci proszku, emul¬ gatory lub rozpuszczalniki, np. uwodniony etanol.Preparaty takie stosuje sie jako ciecze lub ciala stale i rozpyla je lub opyla nimi rosliny, które maja byc chronione. zgodnie z wynalazkiem zwiazki o wzorach 1, 2, 3 i 4 wytwarza isie przez fermentacyjna hodowle mikroorganizmu nalezacego do rodzaju Aspergillus i nastepnie wyosobnianie produktu z brzeczki ho¬ dowlanej. W oparciu o badania taksonomiczne wyosobniono i zidentyfikowano ten nie znany do¬ tychczas mikroorganizm i oznaczono go w kolekcji kultur firmy Merck and Co., Inc. Rahway, N. J.Stany Zjednoczone Ameryki jako MF-4833, a kul¬ ture jego zdeponowano równiez w American Type Culture Collection w Rockville, Maryland, Stany Zjednoczone Ameryki, gdzie otrzymala ona numer ATCC 20541.Inna próbke podobnego organizmu, oznaczona w kolekcji firmy Merck and Co., Inc. jako MF 4845, równiez zdeponowano jak wyzej pod numerem ATCC 20542. Ten drugi organizm daje w procesie prowadzonym zgodnie z wynalazkiem lepsza wy¬ dajnosc. Aczkolwiek w opisie omawia sie proces wedlug wynalazku tylko w odniesieniu do tych mikroorganizmów, to jednak i inne mikroorga¬ nizmy z rodzaju Aspergillus, w tym równiez mu-? tanty obu wyzej wymienionych, moga wytwarzac nowe zwiazki o wzorach 1, 2, 3 i 4 i ich stosowa¬ nie wchodzi równiez w zakres wynalazku.Stwierdzono, ze morfologiczne cechy mikroorga¬ nizmów MF-4833 ii MF-4845 sa cechami mikroorga-? nizmów z rodzaju Aspergillus i stosujac kryteria typowe, podane w podreczniku „Manual of the Aspergilli", Charles Thom i Kenneth B. Rasper, wydanym przez Williams and Wilkins Company, Baltimore, Md., 1945 oraz porównujac ze znanymi gatunkami mikroorganizmów okreslono, ze oba te szczepy sa Aspergillus tenreus.Hodowle tych mikroorganizmów w celu wytwo¬ rzenia nowych zwiazków zgodnie z wynalazkiem, prowadzi sie w srodowiskach wodnych stosowanych przy wytwarzaniu innych produktów fermentacji.Srodowiska takie zawieraja zródla wegla, azoty i nieorganiczne sole, które moga byc przyswajane przez mikroorganizm. Jako zródla wegla w takich pozywkach przewaznie stosuje sie weglowodany, takie jak cukry, np. glikoize, fruktoze, maltoze, sa¬ charoze, ksiyloze, mannit i podobne oraz rózne ro¬ dzaje skrobii, takie jak skrobie zbozowe, np. z owsa, zyta, kukurydzy, maczke kukurydziana itp., przy s czym produkty te mozna stosowac pojedynczo lub w kombinacjach. Dokladna ilosc weglowodanów w pozywce zalezy w pewnej mierze od zawartosc; innych skladników, ale zwykle wynosi od okolo 1% do 6°/o wagowych pozywki. io W pozywce mozna stosowac jedno zródlo wegla lub kilka. Jako zródla azotu mozna stosowac rózne substancje bialkowe. Odpowiednimi zródlami azotu sa np. produkty hydrolizy drozdzy, drozdze pier¬ wotne, maczka sojowa, maczka z nasion bawelny, 15 produkty hydrolizy kazeiny, wywar kukurydziany, rozpuszczalne produkty gorzelniane, pasta pomido¬ rowa itp. Zródla azotu stosuje sie pojedynczo lub w kombinacjach, w ilosci od okolo 0,2°/o do 6% wa¬ gowych wodnego srodowiska. jo Jako odzywcze sole nieorganiczne w pozywkach mozna stosowac znane sole, bedace zródlem jonów sodu, potasu, amonu, wapnia, jonów fosforanowych, siarczanowych, chlorkowych, weglanowych itp, Mozna tez sitosowac metale sladowe, takie jak ko- 25 balt, mangan, zelazo i magnez.Nalezy zaznaczyc, ze pozywki podane w przykla¬ dach jedynie ilustruja proces i wynalazek nie jest ograniczony do stosowania tych tylko rodzajów po¬ zywki. W szczególnosci, zródla wegla stosowane 30 zgodnie z wynalazkiem do wytwarzania nowych zwiazków obejmuja substancje takie, jak dekstroza, maka owsiana, platki owsiane, melasa, cytryniany, olej sojowy, gliceryna, wyciag slodowy, tran, skro¬ bia, etanol, figi, askorbinian sodowy i oleisty tluszcz 35 wieprzowy. Zródla azotu stanowia produkty takie, jak peptyzowane mleko, autolizowane drozdzej drozdze RNA, pasta pomidorowa, kazeina, drozdzq pierwotne, maczka arachidowa, rozpuszczalne pro¬ dukty gorzelniane, wyciag kukurydziany, maczka ^ sojowa lub kukurydziana, amina NZ, ekstrakt wo¬ lowy, asparagina, maczka z nasion bawelny i siar¬ czan amonowy. Jako skladniki jonowe przewaznie stosuje siie CaC03, KH2P04, MgS04-7H20 i NaCl oraz male ilosci CaCl2-6H20, a takze slady Fe, Mn, tf Mo, B i Ou.Fermentacje prowadzi sie w temperaturze od okolo 20°C do 37°C, ale najlepsze wyniki uzyskuja sie w temperaturze od okolo 22°C do 30°C. War¬ tosc pH pozywek odpowiednich do hodowli Asper- 50 gillus i wytwarzania nowych zwiazków sposobem wedlug wynalazku wynosi od okolo 6,0 do 8,0.Aczkolwiek nowe zwiazki sa wytwarzane przy prowadzeniu hodowli zarówno powierzchniowej, jak i w stanie zanurzonym, to jednak korzystniej M jest stosowac hodowle zanurzeniowa. Fermentacja na mala skale korzystnie prowadzi sie zaszczepiajac odpowiednia pozywke hodowla Aspergillus i nas¬ tepnie przenosic ja do srodowiska produkcyjnego, w którym fermentacje prowadzi sie w stalej tem¬ peraturze wynoszacej okolo 28°C, w wytrzasarce w ciagu kilku dni.Fermentacje inicjuje sie w pozywce w kolbie, stosujac jeden lub kilka etapów posiewu. Pozywka w stadium posiewu moze zawierac dowolna, odpo- 65 wiednia kombinacje zródel wegla i azotu. Kolbe1251 5 z posiewem wytrzasa sie w pomieszczeniu o stalej temperaturze okolo 28°C w ciagu 2 dni, az do uzy¬ skania zadowalajacego wzrostu, po czym czesc pro¬ duktu wykorzystuje sie do zaszczepienia w drugiej fazie posiewu lub juz ido zaszczepienia pozywki pro- 5 dukcyjmej. Jezeli stosuje sie posrednie kolby dla posiewu, to postepuje sie z nimi podobnie, a mia¬ nowicie czesc zawartosci kolby z ostatnim stadium posiewowyim stosuje sie do zaszczepienia produk¬ cyjnej pozywki. Zaszczepione kolby wytrzasa sie 10 w stalej temperaturze w ciagu kilku dni i po za¬ konczeniu okresu inkubacji zawartosc kolb odwi¬ rowuje sie lub odsacza.Przy pracy na duza skale korzystnie jest prowa¬ dzic fermentacje w odpowiednich zbiornikach 15 z mieszadlem i z urzadzeniem do napowietrzania srodowiska fermentacji. Pozywke przygotowuje sie w zbiorniku i wyjalawia ogrzewajac do tempera¬ tury okolo 120°C, po czym chlodzi sie i zaszczepia uprzednio przygotowana hodowla posiewowa, a nas- 20 tepnie prowadzi fermentacje w ciagu np. 3—5 dni, w temperaturze okolo 28°C, mieszajac i/albo napo¬ wietrzajac. Taki sposób nadaje sie szczególnie przy wytwarzaniu nowych zwiazków sposobem wedlug wynalazku na duzaskale. 25 Wytworzone zwiazki wyosobnia sie korzystnie z brzeczki fermentacyjnej jako laktony o wzorach 1 i 2, albo tez mozna je wyosobniac w postaci soli zwiazków o wzorach 3 i 4.Zwiazki o wzorach 1 i 2 mozna hydrolizowac za 30 pomoca zasad, takich jak^NaOH, wytwarzajac sole, takie jak siole sodowe zwiazków o wzorach 3 i 4.Stosujac inne zasady z kationami farmakologicznie dopuszczalnymi w/twairza siie sole zawierajace te inne kationy. Przez ostrozne zakwaszanie takiclj 35 soli wytwarza sie hydroksykwasy o wzorach 3 i 4.Kwasy te mozna przeprowadzac w zwiazki o wzo¬ rach 1 i 2 przez zakwaszanie. Jezeli zwiazki o wzo-» rach 1 i 2 w katalitycznym srodowisku kwasnym lub zasadowym traktuje sie metanolem, etanolem, 40 propanolem lub butanolem albo fenylo-, dwume- tyloamino- lub acetyloamino- alkanolami, wówczas, otrzymuje sie odpowiednie estry zwiazków o wzc«j rach 3 i 4. Wytwarzanie tych estrów wchodzi rów¬ niez w zakreswynalazku. ^ Zwiazki o wzorach 3 i 4, a zwlaszcza zwiazek o wzorze 3, mozna wyosobniac korzystnie w pos¬ taci soli amonowych, bez potrzeby stosowania me¬ tod chromatografii, co ma znaczenie zwlaszcza przy pr^cy na skale przemyslowa. Poza tym, sole zwiaz- , 5Q ków o wzorach 3 i 4 wykazuja im vitro znacznie silniejsze dzialanie hamujace biosynteze choleste¬ rolu i dzialaja znacznie silniej grzybobójczo niz; zwiazki o wzorach 1 i 2. Wydaje sie, ze te hydro- ksykwasy i ich sole sa postaciami aktywnymi zwiazków wytwarzanych sposobem wedlug wyna¬ lazku. Z tych tez wzgledów sole te sa szczególnie odpowiednie do wytwarzania srodków zawieraja¬ cych te zwiazki. Oprócz soli amonowych korzystnie stosuje sie sole czterometyloamoniowe, sole z ety- M lenodwuamina, sole sodowe, potasowe, wapniowe, N-metyloglukaminowe, lizynowe, argininowe i orni- tynowe.Fizykochemiczne wlasciwosci zwiazków o wzo¬ rze 1 (MSD-803) sa nastepujace. - 65 . 6 Temperatura topnienia 170—171°C Ciezar czasteczkowy 404 Wz°r C24H3605 Ciezar czasteczkowy obliczony z wzoru 404,2563 Ciezar czasteczkowy wedlug widma ma¬ sowego 404,2535 Widmo UV w acetoniitrylu Maksyma: 230,5nm i E°/o 505,7 237,5nim i EP/o 576,6 246mm i EP/o 395,2 Widmo 13C NMR — przesuniecia. Widmo rejestro¬ wano w roztworze w CDCI3 (20,1 mg w 0,35 ml).Chemiczne przesuniecia podawano w stosunku do wewnetrznego czterometylosilanu przy zero ppm.W warunkach, w których prowadzono próby, sygnal rozpuszczalnika (CDCI3) jest zesrodkowany przy 70,0 ppm. Zgodnie z danymi z widma masowego zaobserwowano 24 atomy wegla, a ich chemiczne przesuniecia sa: 11,5, 13,6, 16,0, 22,6, 24,1, 26,6, 27,2, 30,5, 32,5, 32,8, 35,9, 36,4, 37,1, 38,4, 41,3, 62,4, 67,8, 76,4, 128,4, 129,7, 131,7, 133,2, 170,8 i 177,2 ppm.Widmo iH NMR Widmo rejestrowano w roztworze w CDCI3 i prze¬ suniecia chemiczne sa podane na fig. 1 rysunku w ppm wzgledem wewnetrznego czterometylosilanu przy zero ppm.Widmo IR Widmo w podczerwieni rejestrowano w pastylkach w KBr. Wyniki podano na fig. 2 rysunku.Skrecalnosc optyczna Wlasciwa skrecalnosc optyczna [a]^ =320,7° oznaczono w roztworze w CH3CN o stezeniu 5,30 mg/ml. Wartosc te otrzymano mierzac dlugosc fali dla linii D sodu.Na podstawie tych i innych danych mozna ze znaczna doza pewnosci przyjac, ze zwiazek o wzo¬ rze 1 ma budowe stereochemiczna o wzorze la.Odpowiedni hydroksykwas o wzorze 3 ma budowe stereochemiczna o wzorze 3a. Bezwzgledny uklad srodków asymetrii w tych czasteczkach oznaczono na podstawie ugiecia promieni rentgenowskich.Eizykocherniczne wlasciwosci zwiazku o wzorze 2 (MD3-883) sa nastepujace.Temperatura topnienia 129—131°C Ciezar czasteczkowy 406 Wzór C24H33O3 Ciezar czasteczkowy obliczony z wzoru 406,2719 Ciezar czasteczkowy wedlug widma ma¬ sowego 406,2706 Widmo *H NMR Widmo rejestrowano w roztworze w CDC13 i prze¬ suniecia chemiczne sa podane na fig. 3 rysunku w ppm wzgledem wewnetrznego czterometylosilanu przy zero ppm.Widmo IR Widmo w podczerwieni rejestrowano w pastylkach w KBr. Wyniki- podano na fig. 4 rysunku.Skrecalnosc optyczna Wlasciwa skrecalnosc optyczna [a] ^ = 148,6° oznaczono w roztworze w CH3CN o stezeniu 5,23 mg/ml. Wartosc te otrzymano mierzac dlugosc fali dla linii D sodu.Widmo nC NMR — przesuniecia chemiczne w CDCI3. 11,8, 14,9, 16,5, 21,1, 23,1, 26,7<2C), 30,9, 31,3, 33,0,125 843 35,7, 35,9, 37,4, 38,5, 38,6 41,9(2C), 62,3, 70,1, 76,5, 131,0, 132,6, 171,2, 176,7.. Na podstawie tych i innych danych (mozna ze znaczna doza pewnosci przyjac, ze zwiazek o wzo¬ rze 2 ma budowe stereochemiczna o wzorze 2a, a odpowiadajacy mu hydroksykwas o wzorze 4 ma stereochemiczna budowe o wzorze 4a.Wynalazek zilustrowano w nizej podanych przy¬ kladach.Przyklad I. Wytwarzanie zwiazków o wzo¬ rach 1 i 3.A. Fermentacja.Rurke z liofilizowana kultura MF-4833 otwiera sie aseptycznie i zawartosc wprowadza do bezprze- grodowej kolby Erlenmeyera o pojemnosci 250 ml (kolba posiewowa), zawierajacej okolo 20 ml po¬ zywki A.Pozywka A ma nastepujacy sklad: namok kukurdziany 10 g pasta pomidorowa 80 g makaowsiana 20 g glikoza 20 g mieszanka nr 2 pierwiastków sladowych 20 g woda destylowana 1000 ml Za pomoca NaOH doprowadza sie wartosc pH po¬ zywki do 6,8.Mieszanka nr 2 pierwiastków sladowych ma sklad nastepujacy: FeS04-7H20 1000 mg MnS04-4H2O 1000 mg CuCl2-2H20 25 mg CaCl2-2H20 100 mg H3BO3 56 mg (NH4)6M07024-4H20 19 mg ZnS04-7H20 200 mg destylowana, zdejonizowana woda 1000 ml.Zaszczepiona mieszanine w kolbie poddaje sie hodowli w ciagu 48 godzin w temperaturze 28°C na wytrzasarce o skoku 5 cm. Do dwóch bezprze- grodowych erlenmeyerek o pojemnosci 2 litry, za¬ wierajacych po 500 ml pozywki B, wprowadza sie po 10 ml brzeczki hodowlanej z kolby posiewowej.Pozywka B ma nastepujacy sklad: pasta pomidorowa 20 g drozdze pierwotne 10 g skrobia CPC 20 g C0C12-6H2O 5 g woda destylowana 1000 ml Za pomoca NaOH doprowadza sie wartosc pH po¬ zywki do 7,2r—7,4.W obu zaszczepionych kolbach prowadzi sie ho¬ dowle w temperaturze 28°C w ciagu 96 godzin, przy czym w jednej kolbie prowadzi sie hodowle bez mdeszania, a druga kolbe wytrzasa sie na wstrza- sarce o 150 obrotach/minute, przy skoku 5 cm. Po uplywie 96 godzin obie kolby odstawia sie i wy¬ osobnia produkt.B. Wyosobnianie zwiazku o wzorze 1.Wszystka brzeczke odwirowuje sie w ciagu 20— —30 minut i substancje stale pozostawia do eks¬ trakcji. Oddzielona ciecz (wartosc pH 6—8) umiesz¬ cza sie w butli o pojemnosci 950 ml i dodaje 150 ml zywicy XAD-2 (kopolimer styrenu z dwuwinylo- benzemem). Stosujac samoczynny ekstraktor, jxra- 20 cujacy wedlug z góry ustalonego programu, miesza sie mieszanine w ciagu 2 godzin, po czym oddziela sie zuzyta brzeczke i odrzuca. Zywice plucze sie 2 porcjami po 200 ml zdejonizowanej wody i po- 5 pluczyny odrzuca. Nastepnie do zywicy dodaje sie 300 ml mieszaniny zawierajacej izopropanol, octan etylowy i dwuchlDrometan w stosunku 25 :45 : 30.Miesza sie w ciagu 2 godzin, po czym zawiesincj zywicy w rozpuszczalniku przesacza sie na lejku 10 Buchnera lub przez filtr ze spiekanego szkla i osad zywicy odrzuca sie. Substancje stale oddzielone od brzeczki na wstepie opisywanego procesu ekstra¬ huje sie 100 ml acetonu w ciagu 1/2 godziny, od¬ dziela ciecz przez dekantacje i miesza ja z prze- 15 saczem po oddzieleniu zywicy. Polaczone roztwory odparowuje sie do objetosci 15 ml.C. Badanie zwiazku o wzorze 1.Roztwory otrzymane w sposób opisany w uste¬ pie B bada sie w celu okreslenia ich zdolnosci przeciwdzialania enzymowi reduktazy HMG-CoA.Badanie prowadzi sie metoda podana przez Beg, Stonik i Brewer w 1977 FEBS Letters 80, str. 123—129, stosujac enzymy przygotowane metoda Kleinsek, Rangatham i Porter, podana w 1977 25 Proc. Nat. Acad. Soi, 74, str. 1431—1435. Badanie wykazalo stopien zahamowania powyzej 90°/o przy stezeniu 20 mikrogramów/mililitr — IC50 2,3 mikro- gramy/mililitr, co oznacza obecnosc bardzo silnego srodka hamujacego synteze sterolowa, dzialajacego 30 na poziomie rediuktaizy HMG-CoA.Przyklad II. Wytwarzanie zwiazków o wzo¬ rach 1 i 3.A Fermentacja.Rurke z liofilizowana kultura Aspergillus sp.MF-4833 otwiera sde aseptyoznie i zawartosc wpro¬ wadza do bezprzegrodowej kolby Erlenmeyera o po¬ jemnosci 250 ml (kolba posiewowa nr 1) zawieraja¬ cej 40 ml pozywki C. 40 Pozywka C ma nastepujacy sklad: wywar kukurydziany 5 g pasta pomidorowa 40 g makaowsiana 10 g glikoza 10 g 45 mieszanka nr 2 pierwiastków sladowych 10 g woda destylowana 1000 ml.Wartosc pH pozywki doprowadza sie za pomoca NaOH dlo 6,8 Zaszczepiona zawiesine w kolbie poddaje sie ho- M dowli w temperaturze 28°C w ciagu 24 godzin na wstrzasarce o 220 obrotach/niiniute i skoku 5 cm.Do kazdej z 8 bezprzegrodowych kolb Erlenmeyera o pojemnosci po 250 ml (kolby posiewowe nr 2), zawierajacych po 40 ml pozywki C, wprowadza sie S5 2 ml brzeczki hodowlanej z kolby posiewowej nr 1, po czym w zaszczepionych kolbach prowadza sie hodowle w temperaturze 28°C w ciagu 24 godzin, na wstnzasairce o 220 obrotach/minute i o skoku 5 om. Nastepnie, do kazdej z 20 bezprzegrodowych w kolb Erlenmeyera o pojemnosci 1 litra, zawieraja¬ cych po 500 ml pozywki B, wprowadza sie po 14 ml polaczonej brzeczki z 8 kolb posiewowych nr 2 i prowadzi hodowle w temperaturze 28°C, bez wy¬ trzasania, w ciagu 11 dni, po czyim zawartosc tych 6i kolb laczy sie. 359 B. Extrakcja. 10,2 litra pelnej brzeczki o wartosci pH 6,0 miesza sie w mieszarce Waringa w celu rozdrobnienia grubych platów grzybna, odwirowuje i dekantuje klarowna ciecz znad osadu. Po przesaczeniu 10 lit¬ rów przesaczu ekstrahuje sie 3 litrami octanu ety¬ lowego, otrzymujac 1820 ml blarownegO' wyciagu.Druga ekstrakcja 3 litrami octanu etylowego daje 3350 ml klarownego wyciagu. Stale substancje z brzeczki ekstrahuje sie mieszajac z 2 litrami me¬ tanolu w ciagu 1 godziny, po czym przesacza, otrzy¬ mujac 2100 ml przesaczu. Próbki tych wyciagów stanowiace okreslona ich czesc suszy sie i poddaje badaniu w sposób opisany w przykladzie I C, otrzy¬ mujac nastepujace wyniki.Wyciagi Objetosc (ml) 1 1320 | 3350 [ 2100 Calkowita zawar¬ tosc substancji stalych (mg) 1133 787 13,5 | Calkowita 1 aktywnosc w jednostkach 1496695 | 314900 | 1144067 1 C. chroimatoigrafia zelowa.Calkowite ilosci substancji stalych otrzymane z pierwszych dwóch wyciagów opisanych w przy¬ kladzie II B laczy sie, rozpuszcza w metanolu i przesacza w celu oddzielenia substancji nie roz¬ puszczonych. 30 ml przesaczu wprowadza sie na kolumne do filtrowania przez zel (2,5 omX 200 cm, 980 ml), wypelniona preparatem Sephadex LH-20 i frakcjonuje w zaleznosci od wielkosci czasteczki, stosujac metanol jako rozpuszczalnik. Frakcje gro- madizi sie biorac pod uwage wspólczynnik zalama¬ nia swiatla i widmo w nadfiolecie i najlepsze frak¬ cje bada sie imetoda bioanalizy.Frakcja 1 1 Frakcja 2 1 Frakcja ó Calkowita ilosc substancji stalych 89 mg 278 mg 779 mg Calkowita ak¬ tywnosc w jed- i mostkach 106271 1099680 | 210357 1 D Rozdzielanie i oczyszczanie.Próbki z opisanej wyzej frakcji 2 saczy sie przez 1 g preparatu Waters Bondapah C13/Forasil B i eluuje 5-krotnie wieksza objetoscia metanolu.Eluat zateza sie do objetosci 0,5 ml i próbke te chromatografuje kilkakrotnie na kolumnie Watersa u C18 (3,9 mmX30 cm), eluujac mieszanina meta¬ nolu z 0,05 m roztworem fosforanu amonowego o wartosci pH 2,9 (75 : 25). Frakcje bada sie za po¬ moca spektrofotometru Beokmana i frakcje wyka- 55 zujace najwyzsza absorpcje przy 236 om z prze¬ gieciami przy 229 nim i 245 nm laczy sie i zateza pod zmniejszonym cisnieniem tak, aby uzyskac wodny roztwór. Wartosc pH tego koncentratu do¬ prowadza sie do 6,5 za pomoca 2m wodorotlenku ^ potasowego i aktywne skladniki ekstrahuje octa¬ nem etylowym. Organiczny roztwór suszy sie, od¬ parowuje do sucha, pozostalosc rozpuszcza sie w 0,3 ml metanolu i roztwór ten chromatografuje jak podano wyzej, zawracajac, ei 843 10 Frakcje zawierajace poczatkowy skladnik eluuja- cy laczy sie, zateza tak, aby uzyskac wodny roztwór i ekstrahuje chloroformem. Roztwór chloroformowy miesza sie z metanolem i odparowuje pod zmniej- i szonym cisnieniem, otrzymujac 3,5 mg suchego pro¬ duktu, który identyfikuje sie jako hydroksyfcwas o wzorze 3. Frakcje zawierajace drugi skladnik laczy sie i ekstrahuje chloroformem jak opisano wyzej,.otrzymujac 0,87 mg suchego produktu, który io identyfikuje sie jako lakton o wzorze 1.Przyklad III. Szczególnie korzystny sposób prowadzenia fermentacji przy udziale MF-4833, w celu wytworzenia zwiazków o wzorach 113 Rurke z liofilizowana kultura Aspergillus sp. 15 MF-4833 otwiera sie aseptycznie i zawartosc wpro¬ wadza do bezprzegrodowej kolby Erlenimeyera o po¬ jemnosci 250 ml (kolba posiewowa), zawierajacej 40 ml pozywki. C. Zaiszczepiona zawiesine w kolbie poddaje sie hodowli w temperaturze 28°C w ciagu 20 48 godzin na wytrzasarce o 220 obrotach/minute i skoku 5 cm. Do kazdej z dwóch bezprzegrodowych kolb Brlenmeyera o pojemnosci 250 ml, zawieraja- cej 40 ml pozywki D wprowadza sie 2 ml brzeczki z kolby posdewowej. Pozywka D ma nastepujacy a sklad: laktoza 20 g rozpuszczalne produkty gorzelniane 15 g autoliizowane drozdze 5 g destylowana woda 1000 ml.M Wartosc pH pozywki doprowadza sie za pomoca NaOH do 7,0.Po zaszczepieniu zawartosc tych dwóch kolb pod¬ daje sie hodowli w temperaturze 28°C w ciagu 96 godzin na wstrzasarce o 150 obrotach/minute 31 i skoku 5 cm. Nastepnie zawartosc obu kolb pod¬ daje sie ekstrakcji w sposób opisany w przykla¬ dzie II B. Otrzymuje sie produkt o calkowitej ak¬ tywnosci 1450—2000 jednostek/ml.Przyklad IV. Wytwarzanie zwiazków o wzo- 40 rach 1 i 3.Rurke z liofilizowana kultura Aspergillus MF- -4345 otwiera sie aseptycznie i zawartosc jej wpro¬ wadza do bezprzegrodowej kolby Erlenmeyera o po¬ jemnosci 250 ml (kolba posiewowa nr 1), zawiera- 49 jacej 40 ml pozywki C. Zaszczepiona zawiesine w kolbie poddaje sie hodowli w temperaturze 23°C w ciagu 24^-48 godzin na wstrzasarce o 220 obro¬ tach/minute i skoku 5 cm. Czesc (okolo 0,5 ml) za¬ wartosci tej kolby zuzywa sie nastepnie do zasacze- 50 pienia skosnej rurki zawierajacej pozywke E. Po¬ zywka E ma nastepujacy sklad: wyciag drozdzowy 40 g wyciag slodowy 10 g dekstroza 4 g agar 20 g destylowana woda 1000 ml.Wartosc pH pozywki doprowadza sie do 7,0 za po¬ moca NaOH.Zaszczepiona skosna rurke poddaje sie hodowli w pokojowej temperaturze w ciagu 11 dni, po czym przechowuje w temperaturze —60°C w ciagu 3—4 miesiecy. Czesc zawartosci tej rurki wprowadza sie nastepnie do bezprzegrodowej kolby Erlenmeyera o pojemnosci 250 ml (kolba posiewowa nr 2), za¬ wierajacej 40 ml pozywki C i poddaje hodowli11 125843 U w temperaturze 286C w ciagu 24-godzin na wstrza¬ sarce o 220 obrotach/minute i slkoku 5 cm. Naste¬ pnie, po 2 ml brzeczki z tej kolby wprowadza sie o pojemnosci 250 ml (kolby posiewowe nir 3), za¬ wierajacej 40 ml pozywki C i prowadzi hodowle w temperaturze 28°C w ciagu 48 godzin na wstrza- sarce o 220 obrotach/minute i skoku 5 cm. Naste¬ pnie, zawartoscia kolby posiewowej nr 3 zaszczepia sie 6 kolb Erlenmeyeira o pojemnosci 2 litry, za¬ wierajacych po 500 ml pozywki F. Pozywka F ma nastepujacy sklad: naimok kukurydziany skrotia-GPG majka kukurydziana maka sojowa glikoza olej sojowy (NH4)2S04 KH2P04 Co303 woda destylowana 15 g 20 g 1 g 4g 5 g 2,5 g 4g 0,3 g 6g 1000 ml.Wartosc pH tej pozywki doprowadza sie do 6,7 za pomocar NaOIL W kolbach tych prowadzi sie hodowle w tempe¬ raturze 28°C w ciagu 11 dni, nie stosujac mieszania.Nastepnie brzeczke" ekstrahuje sie w sposób opi¬ sany w przykladzie II B, otrzymujac lacznie pro¬ dukt o aktywnosci 1231 jednostek/mL Przyklad. V. Szczególnie korzystny sposób prowadzenia fermentacji przy udziale MF-4845, w c£kx wytworzenia zwiazków o wzorach 1 i 3. Rurke z liofilizowana kultura Aspergillus MF-4845 otwiera aie. aseptycztoie i zawartosc jej wprowadza do bez- przegrodowej kolby IMenmeyera o pojemnosci 250 ml (kolba plosiewowa) zawierajacej 40 ml po¬ zywki C, po czyim prowadzi sie hodowle w tempe¬ raturze 28°C w ciagu 30 godzin na wstrzasarce O 220 obrotach/minute i o skoku 5 cm. 2 ml brzeczki z tej kolby wprowadza sie do bezprzegrodowej kol¬ by Erlenwieyera o pojemnosci 250 ml, zawierajacej 40 ml pozywki G. Pozywka G ma nastepujacy sklad: dekstroza peptyzowane mleko autolizowane drozdze poliglikol P2000 destylowana woda 45 g 24 g 2,5 g 2,5 ml 1000 ml.Wartosc pil tej pozywki doprowadza sie do 7,0 za pomoca NaOH.Po zaszczepieniu prowadzi sie hodowle w tempe¬ raturze 28°C w ciagu 120 godzin na wstrzasarce o 220 obraitachyminiute i o skoku 5 cm. Po uplywie 120 godzin zawartosc kolby poddaje sie ekstrakcji w sposób opisany w przykladzie II B, otrzymujac prodfukt o aktywnosci 21500 jednostek/ml.Przyklad VI. Wytwarzanie zwiazków o wzo¬ rach 1 i 3 'na duza skale na drodze fermentacji przy udziale MF-4833.A. Fermentacja, W poszczególnych etapach fermentacji stosuje sie pozywke o nastepujacym skladzie: namok kukiurydciany 5g pasta pomidorowa 40 g makaowsiana 10 g 10 ii 39 M 51 FeS04-7H20 MnSO4-4H20 CuCl2-2H20 Cadi H3BO3 (NH4)6MO7024-4H20 ZnS04-7H20 woda destylowana 65 glikoza 10 g roztwór pierwiastków sladowych 10 ml woda destylowana 1000 ml.Wartosc pH pozywki doprowadza sie do 6,8 za po¬ moca NaOH.Roztwór pierwiastków sladowych ma nastepujacy sklad: 1 g Ig 25 mg 100 mg 56 mg 19 mg 200 mg 1 litr Przed zaszczepieniem niikroorganlizniu kazda po¬ zywke bada sie w celu sprawdzenia jej jalowosci.Do kolby Erlenmeyera o pojemnosci 250 ml wpro¬ wadza sie 40 ml pozywki i zawartosc rurki z liofi¬ lizowanym mikroorganizmem MF-4833, po czym wytrzasa na obrotowej wstrzaisarce o 220 obro¬ tach/minute w ciagu 24 godzin w temperaturze 28°C. Nastepnie do innych kolb wlewa sie po 40 mlf pozywki, do kazdej kolby wprowadza sie 1 ml za¬ wartosci pierwszej kolby i wytrzasa w tempera¬ turze 28°C w ciagu dalszych 24 godzin. 10 ml mie¬ szaniny z drugiego stadium fermentacji wprowadza sie do kolby o pojemnosci 2 litry, zawierajacej 400 ml pozywki i wytrzasa kolbe w temperaturze 28°C w ciagu 24 godzin.Do kadzi fermentacyjnej z nierdzewnej stali, ma¬ jacej pojemnosc 760 litrów, wlewa sie 501 litrów pozywki, która zawiera w procentach wagowo/obje¬ tosciowych nastepujace skladniki: laktoza 2°/o rozpuszczalne produkty gorzelniane 1,5% autolizowane drozdze 0,5D/o poliglikol P2000 0,25°/o Wartosc pH pozywka doprowadza sie do 7,0 i wy¬ jalawia pozywke w ciagu 15 minut w temperaturze 121°C, po ozym dodaje sie 1 litr produktu z opi¬ sanego wyzej trzeciego stadium fermentacji i pro¬ wadzi hodowle w temperaturze 28°C w ciagu 96 go¬ dzin, mieszajac z predkoscia 130 obrotów/minute i wprowadzajac powietrze w ilosci 0,28 mtyininute.B. Wyosobnianie zwiazku o wzorze 1.Do 418 litrów pelnej brzeczki z hodowli opisanej wyzej w ustepie A dodaje srie okolo 17 kg krze¬ mionkowego srodka pomocniczego przy filtracji i filtruje mieszanine w prasie filtracyjnej o sred¬ nicy 45 cm. Klarowny przesacz o wartosci pH 6,6 zakwasza sie do wartosci pH 4,0 przez ostrozne do¬ dawanie 450 ml stezonego kwasu solnego i ekstra¬ huje mieszajac z 137 Mtramd octanu etylowego. Po rozdzieleniu warstw oddziela sie górna warstwe, a warstwe wodna ponownie ekstrahuje przez mie¬ szanie z 144 litrami octanu etylowego, po czym warstwy rozdziela sie, laczy oba wyciagi organiczne i przemywa je woda, mieszajac z 46 litrami wody.Po oddzieleniu wody roztwór w octanie etylowym zateza sie pod zmniejszonym cisnieniem, najpierw w temperaturze ponizej 30°C w kotle z mieszadlem, a nastepnie w prózniowej wyparce obrotowej tak, aby otrzymac pozostalosc o objetosci nieco mniej¬ szej ndz 3,8 litra.u 125843 14 10 15 Otrzymany koncentrat w octamie etylowym zateza sie dalej w prózniowej wyparce obrotowej pod cisnieniem 13,3 hPa, na lazni o temperaturze 40°C, az *do otrzymania syropu, który nastepnie steza sie jeszcze dwukrotnie, po dodaniu okolo 1 litra chlor¬ ku metylenu w 2 porcjach, w celu usuniecia z sy¬ ropu rozpusizezalndka polarnego.Otrzymuje sie okolo 300 ml oleistej pozostalosci, zawierajacej okolo 250 g suchej masy. Produkt ten rozciencza sie do objetosci okolo 750 ml przez do¬ danie mieszaniny octanu etylowego z chlorkiem metylenu (30 :70 objetosciowo) i dodaje 200 g zelu krzemionkowego, po czym miesza w celu wytwo¬ rzenia zawiesiny. Zawiesine te podaje sie na wierz¬ cholek kolumny 14 em X 36 om, zawierajacej 2,5 kg takiego samego zelu kizemionkowego w postaci okolo 7,5 lstra zawiesiny w takiej samej miesza¬ ninie rozpuszczalników. Eluuje sie takim samym rozpaisacsalndjkiem az do zebrania 3 litrów odcieku stanowiacego przedgon. Nastepnie rozpoczyna sie tt eluowanie mieszanina octanu etylowego z chlor¬ kiem metylenu (50-^50 objetosciowo), odbierajac frakcje po 800 ml.Po zebraniu 12 frakcji rozpoczyna sie eluowanie samym octanem etylowym (100%) i zbiera 7 frakcji, n a nastepnie eluuje sie samym acetonem <100Vo).Frakcje 4—24 bada sie w celu okreslenia ich bio- aktywnosci przez oznaczenie stopnia hamowania dzialania reduktazy HMG-CoA, jak opisano w przykladzie I. Stwierdzono silna aktywnosc we M frakcjach 7—11, a najwieksza we firakcji 8. Erakcje ta zateza sie, otrzymujac oleisty produkt, zawiera* jacy 9,0 g substancji stalych. Produkt ten rozciera Fic z 50 ml chlorku metylenu, odsacza i suszy osad, otrzymujac 4,9 £ produktu. Przesacz podaje sie na n kolumne o wysokosci 1 m i wewnetrznej srednicy 5 cm, wypelniona preparatem Sephadex LH-20, to jest zelem dekstranowym, speczndonym i zrówno¬ wazonym w chlorku metylenu. Kolumne eluuje sie chlorkieni metylenu z predkoscia 15 ml/minute.Zwiazek o wzorze 1 eluuje sie miedzy 0,64 i 0,81 objetosci kolumny. Z frakcji tej usuwa sie rozpusz¬ czalnik, otrzymujac okolo 0,290 g pozostalosci o barwie brazowawej. Pozostalosc ta (213 mg) roz¬ puszcza sie w 1,5 ml mieszaniny CHjzds z CHjCN (65 :35) i wpirowadza na upakowana i zrównowa¬ zona kolumne z zelu krzemionkowego (EM LOBAR Size B) i eluuje taka sama mieszanina CH2CI2 z CHjCN z predkoscia 5 ml/minute. Frakcje po¬ miedzy 235 i 360 ml duentu odparowuje sie, otrzy- mujac 121 mg krystalicznego produktu o tempera¬ turze topnienia 155—160°C.Produkt ten badany metoda cisnieniowej chro¬ matografii cieczowej na kolumnie analitycznej do chromatografii ekstrakcyjnej (E. Merck H1BAR II, m nr katalogowy 906046), przy uzyciu 0,05 m roztworu, fosforanu sodowego o wartosci pH 3,0 z aceto- nitrylem (45—55) jako mieszaniny eLuujacej, z pred¬ koscia 2 ml/minuite, wykazuje charakterystyczny pik absorpcyjny w nadfiolecie po 11 minutach elu- m owania^ 82 mg otrzymanego produktu przekrystalizowuje sie z 0,6 ml absolutnego etanolu i powtórnie z 0,4 ml takiego samego rozpuszczalnika, suszy w eksyka- torze PjÓ'* w ciagu nocy i otrzymuje 4C mg krysta- w licznego, pierzastego fcaroduktu o barwie bialej. Pro¬ dukt ten badany chromatograficznie jak wyzej opi¬ sano daje pojedynczy, ostry pik po 11 minutach eluowania. Po dalszym przekrystalizowywaniu otrzymuje sie produkt o temperaturze topnienia 170—171°C. Na podstawie badan widma itp. stwier¬ dza sie, ze produkt ten jest zwiazkiem o wzorze 1.Baidany in vitro w próbie z reduktaza HMG-CoA opisanej w przykladzie I produkt wykazuje wartosc IC50 wynoszaca 0,01 mikrograma/mildlitr.Przyklad VII. Bezposrednie wyosobnianie soli amonowej zwiazku o wzorze 3. 380 litrów brzeczki fermentacyjnej wytworzonej w sposób opisany w przykladzie VIA zakwasza Sie kwasem ortofosforowym do wartosci pH 5, dodaje 265 litrów octaniu etylowego, miesza energicznie i odsacza grzybnie, przemywajac osad mala iloscia octanu etylowego, przy czym popluczyny laczy sie z przesaczem. Z przesaczu oddziela sie faze orga¬ niczna, dodaje do niej 19 litrów 0,2n roztworu wo¬ dorotlenku sodowego, miesza energicznie i pozosta¬ wia do odstania. Warstwe wodna oddziela sie i jej wartosc pH wynoszaca 9 doprowadza do 5 przez dodawanie H$PO«, po czym ekstrahuje sie najpierw 7,6 litra mieszaniny heksanu z octanem etylowym (2:1), a nastepnie 3,8 litra tej samej mieszaniny.Organiczne wyciagi laczy sie, suszy nad bezwodnym siarczanem magnezowym, przesacza, przemywa osad za pomoca 1 litra tajkdej samej mieszaniny heksanu z octanem etylowym i popluczyny laczy z przesaczem. Przesacz rozciencza sie 2 litrami ace¬ tonu i mieszajac wprowadza gazowy amoniak, któ¬ ry ulega pochlanianiu i pojawia sie krystaliczny osad. Gdy absorpcja amoniaku ustaje i osad na¬ biera ciemnego zabarwienia, przerywa sie wprowa¬ dzanie amoniaku, pozostawia mieszanine na okres kilku godzin, po czym odsacza. Surowa sól amo¬ nowa na saczku przemywa sie acetonem az do uzyskania bezbarwnych popluczyn, po czym suszy w powietrzu.Surowa sól rozpuszcza sie w 5,7 litra mieszaniny chloroformu z metanolem i stezonym roztworem wodorotlenku amonowego (80:20 :2) i odsacza za¬ barwione substancje stale. Do przesaczu dodaje sie taka sama objetosc mieszaniny acetonu z eterem (1:1) i pozostawia na noc, po czym odsacza krysta¬ liczny osad, otrzymujac 96,5 g soli amonowej o za- barwiendu brazowym, W celu dalszego oczyszczenia 70. g otrzymanego produktu rozpuszcza sie w 2 litrach wrzacej mie¬ szaniny izopropanolu ze stezonym roztworem wod¬ nym NH4OH (95:5), dodaje 10 g aktywowanego wegla, pozostawia do ochlodzenia sie do tempera¬ tury pokojowej i przechowuje w temperaturze —20°C w ciagu nocy, a nastepnie odsacza i prze¬ mywa osad zimnym (—20°C) izopropanolem oraz eterem o temperaturze pokojowej. Produkt suszy sie w atmosferze azotu, otrzymujac okolo 60 g krystalicznej soli amonowej o barwie bialej.Przyklad VIII. Sole zwiazku o wzorze 3. 40 mg produktu otrzymanego w sposób opisany w przykladzie VI rozpuszcza sie w 2 ml etanolu i dodaje 1 ml wodnego roztworu NaOH, zawiera¬ jacy 10~* mola NaOH, to jest 1 równowaznik. Po uplywie 1 godziny mieszanine o temperaturze po-II 125 843 1* kojowej odparowuje sie do sucha pod zrnniejezo- nym clsruemaem, otrzymujac sól sodowa wwiazku o wzorze 3, . W analogiczny sposób, stosujac 1 równowaznik wodorotlenku potasowego, wytwarza &ie sól pota¬ sowa.Przyklad DC, Sol L-lizynowa zwiazku o wzo¬ rze 3.Do roztworu 140 mg soli amonowej zwiazku o wzorze 3 w U,5 ml 85% etanolu dodaje sie roz¬ twór 146 mg L-lizyny w 1,5 ml 65% etanolu, po czym oddestylowiuje sie rozpuszczalniki pod zmniej¬ szonym cisi^niem, pozostalosc rozciera sie z 10 ml cieplego metanolu, chlodzi, odsacza osad o barwie bialej i suszy go, otrzymujac 430 mg soli Lr-lizyno- wej zwiazku o wzorze 3, topniejacego z objawami rozkladu w temperaturze 170—180°C.Analiza Wzór C*Hi»NtQi.%C %H %. N obliczono: 63,35 9,22 4,93 znaleziono: 62,80 9,13 4,83.Przyklad X. SólL-argininowazwiazku o wzo¬ rze 3.W sposób analogiczny do opasanego w przykla¬ dne IX roztwór 174 mg zasady k-argkimowej laczy sie z romtwarean 440 mg soli amonowej zwiazku o wwrse 3, odparowuje rozpuszczalniki pod zmniej¬ szonym cisjiienie^n, pozostalosc rozciera z cieplym etanolem, chlodoi, odsacza i suscy, otrzymujac sól L-wrgininowa zwiazku o wzorze 3.Pr zy k lad XI. Sól I^ornitymowa zwiazkii ówzfiti& s. - • W sposób analogiczny do opisanego w przykla¬ dane IX roótwór 132 mg L-otnnityny w postaci wol- ncj zasady miesza sie z roztworem 440 mg soli ikonowej zwiazku o wzorze 3, odparowuje roz- pusBGZJllnik pod zmniejszonym cisnieniem, pozosta¬ losc iioizciera z cieplym etanolem, chlodzi, odsacza Osad i fluszy, otrzymujac sól Lromitynorwa zwiazku o wzorze 3. £r*yklad XII. Sol N^netyloglwkaminowa zwiaakti o wzorze 3."W sposób analogiczny do opisanego w przykla¬ dzie IX, roztwór 195 mg N-meiylogliukaminy w 1,5 ml wody mdesiza sie z roztworem 440 mg soli amonowej zwiazku o wzorze 3 w 11,5 ml 85% eta¬ nolu i oddestylowuje ixw^usLczalniki pod smniej- szonym cisniendem, otrzymujac sól N-metylogluka- rniffowa zwiazku o wzoraae 3.Przyklad XIII Sol zwjaztou. o wzorze 3 z efcylenodwuamiria.Ig g zwiaalou o wzorce 1 rozpuszcza aie w }8Q ml cieplego izopropairfcolu, traktuje 90 ml 0,$m roztwora wodnego NaOH, pozostawia na okres 1 godziny, rfraeiencza 180 ml wody i odjparowuje izopropanol pod zmniejszonym cisnieniem* Pozostalosc chlodzi sie w kapieli lodowej, dodaje powoli 90 ml Q,5m HG1, ekstrahuje mtaazaiiAne 2 porcjami po 15*0 ml octanu etylowego, przemywa wyciagi 100 ml wody, suszy nad MgSO« i odparowuje rozpuszczalnik w niskiej temperaturze, pod zmniejszonym ciszeniem. Po¬ zostalosc rozpuszcza sie w 150 mJ etanolu, dodaje 3 ml etylenodwuaminy, odparowuje rozpuszczalnik pod anffMjszonym oismemem, pozostalosc rozciera z wrzacym octanem etylowym, chfcx$zi, odsacza, przetoy#tali«owuje z 30 ml izopropaiKrtu i suszy pod zmniejszonym cisnieniem nad PjOf, Otrzymuje sie 13,1 g krystalicznego produktu o barwie bialej i temperaturze topraewia 152—153,5°C. 5 Analiza. Wzór (C*4H:n06),--(C2Hi(N2)^+.% C % H % N obliczono: 66,35 9,35 3,09 zmtezwno: 66,08 9,45 3,01.Przyklad XIV. Sól wapniowa zwiazku o wzo- 10 rze 3. 87,9 mg soli amonowej zwiaaku o wzorze 3 roz¬ puszcza sie w 3 ml wody mieszajac i ogrzewajac, po czym dodaje sie 7,4 mg Ca(OH)* o czystosci ana¬ litycznej i ogrzewa mieszanina az do ustania wy- y dzielamia sit amoniaku i utrzymania nieznacznego tylko zmetnienia, które usuwa sie przez odwiro¬ wanie. Bezbarwny, kla/rowny roztwór liofilizuje sie i próbki suchego produktu pozostawia do krysta¬ lizacji z róznych rozpuszczalników i ich maeazaniru 20 Produkt iterystatauje w postaci dtgiel, gdy goracy, stezony roztwór w bezwodnym izopropanolu po* zostawia sie do ochlodzenia w temperaturze poko¬ jowej.Przyklad XV. Sól czteanometyloamoniowa * zwiazku o wzorze 3. 34 mg zwiazku o wzorze 1 w 1 ml CHiCfc trak¬ tuje sie 0,4 ml 24% roatwonu wodorotlenku cztero- metyloamoniowego w metanolu. Produkt wytraca sie eterem czesciowo w postaci krystalicznej, odwi- * rowiuje, przemywa najpierw eterem i przekrystali- zowuje w postaci heksagonalnych plytek z 1 ml izopropanohi przez dodanie 5 ml eteru i okolo 5 ml eteru naftowego o niskiej temperaturze wrzenia.Otrzymuje sie 27 mg produktu, co stanowi 65% 3i wydajnosci teoretycznej.Widmo *H NMR otrzymanej soli czterometylo- amoniowej zwiazku o wzorze 1 jest nastepujace (6 mg/0,35 ml GDCls w temperaturze 25°C, przy 300 MHz). Przesuniecia chemiczne podano w czes- ^ ciach na milion (ppm) wzgledem wzorca wewnetrz¬ nego caterometylosilanai. Stale sprzezenia w na¬ wiasach podano w Hz. 0,83 t (3H, J =» 6,5) 0,84 d (3H, J«7) 45 l,0ad CSH, J«r7) l,05d (3H, J = 7) 1,24 m (^1H), 1,30—1,80 brjn.otoczka 1,88 ddd (1H, J«8, 8, 15) 1,98 dd (1H, 3, 15) m 2,16 dd <1H, J • 8,5, 15,5) 2,23m (1H, zakryte) 2,32m (1H, zakryte) 2,37dd (1H, J ~ 3, 15,5) 2,40m (^IH, zatoryte) w 3,426 (12H, MeN+) 3,79m (1H, symetryczny multiplet) 4,06m (1H, eym^tiryczniy multiplet) 5,32dt (1H, J^-3) 5,50brA (1H) 5,79dd (1H, J~6, 10) 5,98d (1H, J = 10).Przyklad XVI. Sól amonowa zwiazku o wzo- ' rze 3, W sposób analogiczny do opisanego w przykla- u dzie XIII zwiazek o wzorze 1 przeprowadza siett 125843 li w hydroksykwas o wzorze 3, ekstrahuje octanem etylowym, suszy wyciag nad MgS04, przesacza, do przesaczu wprowadza, mieszajac, bezwodny amo¬ niak, po czym chlodzi i odsacza osad soli amonowej.Przyklad XVII. Wytwarzanie hydiroksykwa- su o wzorze 3.Sól sodowa wytworzona w sposób opisany w przykladzie VII rozpuszcza sie w 2 ml mieszaniny etanolu z woda (1 : 1) i dodaje do 10 ml 0,ln kwasu solnego, po czym z mieszaniny ekstrahuje sie wolny hydroksykwas octanem etylowym. Wyciag plucze sie woda, suszy i odparowuje rozpuszczalnik pod, zmniejiszonym cisnieniem na lazni o temperaturze nie wyzszej niz 30°C. Wytworzony hydroksykwas w miare stania przeksztalca sie ponownie w lakton.Przyklad XVIII. Zwiazek o wzorze 3. 453 mg soli etylenodwuaminowej zwiazku o wzo¬ rze 3 rozpuszcza sie w 6 ml 80% etanolu, chlodzi w kapieli lodowej, traktujac 1 ml Im HC1, odpa¬ rowuje pod zmniejszonym cisnieniem etanol, do pozostalosci dodaje 3 ml wody, ekstrahuje 2 porcja¬ mi po 5 ml octanu etylowego i wyciag plucze woda, przy czym wszystkie te roztwory utrzymuje sie w temperaturze kapieli lodowej. Wyciag suszy sde nad ItegSOi f odparowuje do sucha pod zmniejszonym cisnieniem, otrzymujac hydroksykwas w postaci bezbarwnego oleju. Widmo 18C NMR produktu w CDCI3 (190 imig/me) wykaizuje chemiczne przesu¬ niecie dla pierwszych 6 atomów wegla z hydroksy- kwasu podane nizej w tabeli 1. Numeracje atomów wegla rozpoczyna sie od atomu wegla grupy karbo¬ ksylowej we wzorze 3 i kontynuuje w kierunku przecdwnytm do kierunku ruchu wskazówki zegara.Widmo reszty czasteczki hydroksykwasu ulega tylko nieznacznym zmianom przy zamknieciu piers¬ cienia, to jest gdly zwiazek o wzorze 3 w miare stania przeksztalca sde w lakton.Tabela 1 Widmo 19C NMR zwiazku o wzorze 3 podane w ppm wzgledem czterometylosilanu Ci 1 c2, C4 C3 C5 1 Cs 174,8 42,4, 41,6 | 63,8 | 72,3 | 34,9 | 10 15 20 35 Przyklad XIX. Ester etylowy zwiazku o wzo- ^ rze 3.Zawiesine 500 mg {1,24 milimola) zwiazku o wzo¬ rze 1 (MSD-803) w 20 ml etanolu miesza sie w po¬ kojowej temperaturze w atmosferze azotu, dodaje maly kawalek sodiu (okolo 1 mg) i po uplywie 55 15 minut dodaje ponownie kawalek sodu. Po uply¬ wie lacznie 30 minut homogeniczna mieszanine roz¬ ciencza sie eterem, plucze woda i nasyconym roz¬ tworem wodnym NaCl i suszy nad MgS04. Po od¬ parowaniu rozpuszczalnika otrzymuje sie staly pro- ^ dukt o konsystencji wosku. Analiza metoda chro¬ matografii cieczowej pod wysokim cisnieniem na kolumnie Whatman Partasil 10 PAC (4,6 mm X X 25 cm), przy pompowaniu 10°/o propanolu z hek¬ sanem z predkoscia 6 ml/minute wykaauje, ze pro- w dukt stanowi mieszanine estru etylowego zwiazku o wzorze 3 ze zwiajzteiem o wzorze 1 (77 : 23).Mieszanine te rozdziela sie metoda chromato¬ grafii sredmoctónieniowej na zelu krzemionkowym (o srednicy oczek 0,062—0,037 mm), eluujac 3% etanolu z chlorkiem metylenu. Frakcje zawierajace ester laczy sie i odparowuje, otrzymujac 358 mg (66% wydajnosci teoretycznej) produktu o barwie brudnobialej i temperaturze topnienia I7°C. Próbke produktu przekrystalizowuje sie z heksanu, otrzy¬ mujac produkt w postaci iglastych krysztalów o temperaturze topnienia 66,5—68,5°C.Analiza. Wzór C26H4206.% C °/o H obliczono: 69,30 9,40 znaleziono: 69,22 9,58 W podobny sposób, stosujac równowazne ilosci metanolu propanolu, butanolu, izobutamolu, Ill-rzed.- butanolu, alkoholu amylowego, alkoholu izoamylo7 wego, 2-dwiumetyioaniinoetanolu, alkoholu benzylo¬ wego ,ienyloeaanolu, 2^cetaimidoetanolu itp. otrzy¬ muje sie oc^owiednde estry.Przeklad XX. Wytwarzanie zwiazków o wzo¬ rach 2 i 4.A. Fermentacja.Rurke z liofilizowana kultura MF-8445 otwiera sie aceptycznde i jej zawartosc wprowadza do bez- przegrodowej kolby stozkowej o pojemnosci 250 ml (kolba posiewowa), zawierajacej okolo ia ml zywki o- nastepujacym skladzie: namok kukurydziany 5 g pasta pomidorowa 40 g maka owsiana N 10 g glilkoza 10 g roztwór pierwiastków sladowych 10 g woda destylowana 1000 ml.Wartosc pH pozywki doprowadza sie do 6,8 za po¬ moca NaOH.Roztwór pierwiastków sladowych ma nastepujacy sklad1: 1000 mg 1000 mg 25 mg 100 mg 56 mg 19 mg 200 mg po- FeS04-7H20 MnS04-4H20 CuCl2-2H20 CaCl2-2H20 H3BOs (NHJeMojOj^HzO ZnS04-7H20 woda destylowana, zdejonizowana 1000 ml.Zaszczepiona zawiesine w kolbie poddaje sie ho¬ dowli w temperaturze 28°C w ciagu 24 godzin na wstrzasarce o 220 obrotach/miuite i 5 cm skoku, po czym za pomoca 10 ml brzeczki fermentacyjnej z tej kolby posiewowej wprowadza sie do bezprze- grodowej kolby stozkowej zawierajacej 500 ml po¬ zywki i wytrzasa w temperaturze 88°C w ciagu 240 godzin.W kadzi iermentacyjnej z nierdzewnej stali, ma¬ jacej pojemnosc 760 litrów, umieszcza sie 485 litrów pozywki zawierajacej nastepujace skladniki w pro- cen/tach wagowo-objetosciowych: cereloza 4,5*/© peptonizowane mleko 2,5% aiutolizowane drozdze 0,25°/o poliglikol P2000 0,25%125843 1* 30 Wartoic pH pozywki doprowadza sie do 7,0 i wy¬ jalawia pozywke w ciagu 15 minut w temperatu¬ rze 121°C, po czyim dodaje sie 1 litr brzeczki, z po¬ danego wyzej drugiego stadium fermentacji i pro¬ wadzi hodowle w temperaturze 28°C, mieszajac w ciagu 12 godzin za pomoca mieszadla o 85 obro¬ tach/minute, nastepnie w ciagu 84 godzin mieszajac z predkoscia 130 obrotów/minute, wprowadzajac w ciagu pierwszych 12 godzin powietrze w ilosci, 0,15 mtyminute i w ciagu 84 godzin w ilosci 0,3 mtyini/nute.B. Wyosobnianie 1. Ekstrakcja.Dwie partie pelnej brzeczki po 380 litrów laczy sie, zakwasza do wartosci pH 4,1 dodajac ostroznie 800 ml stezonego kwasu solnego i ekstrahuje mie¬ szajac z 285 litrami octanu etylowego w ciagu 2 go¬ dzin. Nastepnie dodaje sie okolo 11,4 kg krzemion¬ kowego srodka ulatwiajacego saczenie i calosc za¬ wiesiny pompuje przez prase o srednicy plyt 0,5 m.Osad przemywa sie 285 Mitrami octanu etylowego i kontynuuje proces ekstrakcji zmieniajac kierunek przeplywu przez prase cztenokrotnie, po czym po¬ pluczyny miesza sie z pierwszym przesaczem, po¬ zostawia do odstania i oddziela warstwe wodna.Roztwór w octanie etylowym plucze sie 38 litrami zdejonizowanej wody, rozdziela warstwy i faze organiczna odparowuje pod zmniejszonym cisnie- niem do objetosci okolo 38 litrów. 2. Laktonizacja.W celu przeprowadzenia zwiazku o wzorze 4, ewentualnie znajdujacego sie w otrzymanym ste¬ zonym wyciagu, w zwiazek cykliczny o wzorze 2, postepuje sie w ten sposób, ze do produktu otrzy¬ manego w sposób opisany wyzej w ustepie 1 dodaje sie wyciag w octanie etylu z innej partii brzeczki o objetosci 1140 litrów i odparowuje pod zmniej¬ szonym cisnieniem do objetosci okolo 114 litrów, po czyim dodaje sie okolo 190 litrów toluenu i odpa¬ rowuje pod zmniejszonym cisnieniem do objetosci okolo 120 litrów. Zabieg ten powtarza sie, po czym dodaje sie tyle toluenu, aby otrzymac objetosc cieczy okolo 285 litrów i pod cisnieniem atmosfe¬ rycznym doprowadza do wrzenia, utrzymujac w temperaturze 106°C w ciagu 2 godzin. Otrzymany roztwór zateza siie pod zmniejszonym cisnieniem do malej objetosci, a nastepnie odparowuje w du¬ zej, obrotowej wyparce prózniowej, otrzymujac oleista pozostalosc. 3. Chromatografowanie na zelu krzemionkowym.Z produktu otrzymanego w sposób opisany w ustepie 2 odpedza sie rozpuszczalniki, dodajac 7,6 litra chlorku metylenu i ponownie odparowujac.Oleista pozostalosc rozpuszcza sie w okolo 19 litrach mieszaniny octanu etylowego z chlorkiem mety¬ lenu (30 :70, dodaje 2,8 kg zelu krzemionkowego i otrzymana zawiesine wprowadza na wierzcholek kolumny z zelu krzemionkowego (30 cm X 125 cm), upakowanej przy uzyciu takiej samej mieszaniny rozpuszczalników. Eluuje sie mieszanina octanu etylowego z chlorkiem metylenu (40 :60) z pred¬ koscia 800 ml/minute, zbierajac 38 litrów przed¬ gonu i nastepnie frakcje po 15,2 litra. Frakcje 6—10 zateza sie pod zmniejisizonym cisnieniem, oleista po¬ zostalosc rozpuszcza w goracym, octanie etylowym, traktuje weglem aktywowanym, przesacza na go¬ raco i chlodzi. Krystaliczny zwiazek o wzorze 1 odsacza sie, lugi macierzyste zateza i oleista po¬ zostalosc dalej chromatografuje. 5 4. Ponowne chromatografowainie na zelu krzemion- kornym.Oleista pozostalosc, otrzymana w sposób opisany w ustepie 3, rozpuszcza sie w chlorku metylenu i miesiza z pozostaloscia z lugów macierzystych, otrzymanych w podobny sposób z 2280 litrów brzecz¬ ki z innych, analogicznych procesów fermentacji.Polowe otrzymanego roztworu poddaje sie dalszej chromatografii na zelu krzemionkowyni, przy czym okreslonej objetosci próbka pobrana z tego roz¬ tworu wskazuje, ze roztwór ten zawiera 325 g sub¬ stancji stalych. Roztwór traktuje sie 40 g wegla aktywowanego, przesacza, osad przemywa chlor¬ kiem metylenu i przesacz wraz z popluczynami od¬ parowuje sie pod zmniejszonym cisnieniem. Oleista pozostalosc rozpuszcza sie w 800 ml mieszaniny octanu etylowego z chlorkiem metylenu (30 :70), miesza z 225 g zelu krzemionkowego i otrzymana zawiesine podaje na wierzcholek kolumny z zelu krzemionkowego (14 X 36 om) upakowanego przy uzyaiu takiej samej mieszaniny rozpuszczalników^ Eluuje sie mieszanina octanu etylowego z chlor¬ kiem metylenu (40 :60), przy czym pierwsze 3 litry odrzuca sie i zbiera frakcje po 800 ml. 5 Chromatografowanie ekstrakcyjne. 40 ml frakcji 12 otrzymanej w sposób opisany w ustepie 4 odparowuje srie, otrzymujac 500 mg oleistej pozostalosci, która rozpuszcza sie w 5 ml acetonitrylu i otrzymany roztwór podaje na ko¬ lumne z nierdzewnej stali, majaca zewnetrzna sred¬ nice 1,1 cm i wysokosc 1,8 m, upakowana prepara¬ tem Bondapak XX C18/Porasil B firmy Water Associates, Inc. Milford, St. Zjedn. Am. Kolumne eluuje sie mieszanina zawierajaca 55% objetoscio¬ wych acetonitrylu ii 45°/o roztworu fosforanu amo¬ nowego o stezeniu 0,05m i wartosci pH 3. Frakcje od 1360 ml do 1700 ml laczy sie na podstawie wspólczynnika zalamania swiatla, odparowuje orga¬ niczny rozpuszczalnik pod zmniejszonym cisnie¬ niem i pozostaly wodny roztwór ekstrahuje octa¬ nem etylowym. Z wyciagu odparowuje sie pod zmniejsizonym cisnieniem octan etylowy otrzymuj a. c 120 mg zwiazku o wzorze 2. Po przekrystalizowaniu z acetoniitrylu otrzymuje sie krystaliczny zwiazek, o wzorze 2, topniejacy w temperaturze 129—131°C.Przyklad XXI. Ininy sposób wyosobniania zwiazków o wzorach 2 i 4.Surowa sól amonowa, otrzymana w sposób opi¬ sany w przykladzie VII z 4180 litrów brzeczki fer¬ mentacyjnej, przeprowadza sie w lakton przez roz¬ puszczenie w wodzie, zakwaszenie do wartosci pH 3 stezonym kwasem solnym, ekstrahowanie toluenem i utrzymywanie w stanie wrzenia pod chlodnica zwrotna w ciagu 2 godzin, jak to opisano w przy¬ kladzie XX B, 2. Po zatezeniu do malej objetosci otrzymuje sie surowy, krystaliczny zwiazek O wzo¬ rze 1, zmieszany z mala iloscia zwiazku o wzo¬ rze 2. Produkt ten odsacza sie i suszy.Produkt z 12 takich partii laczy sie i przekrysta- lizowuje z 46 kg etanolu, odsacza i przemywa eta¬ nolem. Polaczone lugi macierzyste steza sie pod 15 20 25 30 35 40 45 50 55 6021 125 843 zinniejszonyim cisnieniem «do objetosci okolo 11 lit¬ rów i odsacza druga partie krystalicznego zwiazku o wzorze 1. Macierzyste lugi z tego saczenia prze¬ rabia sie w ten sposób, ze 0,5 litra tych lugów odparowuje sie pod zmniejszonym cisnieniem w celu usuniecia etanolu, po czym przesacza w celu oddzielenia sladów substancji nierozpuszczalnych.Przesacz miesza sie z 100 ml acetonitrylu, przepusz¬ cza przez 200 ml zloza preparatu C-18 do chroma¬ tografii ekstrakcyjnej i przemywa kolumne 1 litrem acetonitrylu. Polaczone przesacze zateza sie, roz¬ puszcza w 360 ml rozpuszczalnika chromatogra¬ ficznego (60% objetosciowych acetonitrylu i 40% objetosciiswych wody) i przesacza w celu oddzielenia sladów substancji nierozpuszczalnych. Przesacz za¬ wiera 15,3 g substancji stalych. 160 ml tego przesaczu chromatografuje sie w ukladzie Waters Prep 500, stosujac 2 gatunki 5 X 30 cm preparatu C-18 do chromatografii eks¬ trakcyjnej (zwiazana powloka oktadecylowa na krzemionce) i eluujac mieszanina acetonitrylu z woda (60 :40) w ilosci 130 ml/minute, w pokojo¬ wej temperaturze, przy czym frakcje ocenia sie na podstawie wspólczynnika zalamania. Pierwsze 3900 ml eluatu zawierajace zanieczyszczenia od¬ rzuca sie. Duzy pik zwiazku o wzorze 2 wykazuje eluat 3900—5850 ml i frakcje te odstawia sie. Mie¬ szane frakcje otrzymane przy 5850—6500 ml prze¬ znacza sie do ponownego chromatografowania.Oczyszczony zwiazek o wzorze 2 otrzymuje sie z frakcji 6500—8450 ml. Frakcje te odparowuje sde, otrzymujac okolo 3 g oleistej pozostalosci.Okolo 1,5 g tego produktu przeprowadza sie w sól amonowa zwiazku o wzorze 4, w celu przygotowa¬ nia do chromatografii! Produkt ten rozpuszcza sie w 6 ml cieplego metanolu i mieszajac dodaje nie¬ zwlocznie tyle 1 n roztworu NaOH, aby utrzymac wartosc pH roztworu 10,5—11. Zuzywa sie do tego celu 3,5—3,8 ml roztworu NaOH. Po uplywie 1/2 go¬ dziny roztwór przesacza sie, aby usunac substancje nie rozpuszczone, przesacz pompuje na kolumne (2,5 X 85 cm) zywicy XAD-2 (kopolimer styrenu z dwuwiinylobenzenem) o rozdrobnieniu 0,074— —0,044 mm i eluuje w temperaturze 40°C miesza¬ nina 23% acetonitrylu z 77% 0,ln roztworu wodo¬ rotlenku sodowego, podajac eluent z predkoscia 2 ml/minute. Zbiera sde frakcje po 20 ml, przy czym frakcje 1—44 zawieraja zanieczyszczenia oraz sól zwiazku o wzorze 3, totez frakcje te odrzuca sie. Frakcje 45—61 zateza sie do malej objetoscia wodnego roztworu i suszy przez wymrazanie, otrzy¬ mujac 0,72 g soli amonowej zwiazku o wzorze 4.Przyklad XXII. Sole zwiazku o wzorze 4. 40 mg produktu otrzymanego w sposób opisany w przykladzie XX rozpuszcza sie w 2 ml i do otrzy¬ manego roztworu dodaje 1 ml wodnego roztworu NaOH (10—4 mola, 1 równowaznik) i utrzymuje mie¬ szanine w temperaturze pokojowej w ciagu 1 go¬ dziny, a nastepnie odparowuje dó sucha pod zmniej¬ szonym cisnieniem, otrzymujac sól sodowa zwiazku 0 wzorze 4.W analogiczny sposób, stosujac zamiast NaOH 1 równowaznik wodorotlenku potasowego albo 0,5 równowaznika CaO, otrzymuje sie sól potasowa albo sodowa^zwiazku o wzorze4. w 10 u 20 35 45 Postepujac w sposób analogiczny do sposobów podanych w przykladach IX—XII lub XIV i ston sujac w kazdym przypadku zamiast soli amonowej zwiazku o wzorze 3 równowazna ilosc soli amono¬ wej zwiazku o wzorze 4, wytwarza sie sól zwiazku o wzorze 4 z L-lizyma, L-arginina, L-ornityna, N-metylokiukamina i sól wapniowa.Postepujac w sposób analogiczny do opisanych w przykladach XIII, XV i XVI, ale stosujac zamiast zwiazku o wzorze 1 równowazna ilosc zwiazku o wzorze 2, otrzymuje sie sól zwiazku o wzorze 4 z etyleniodwuamina, sól czterometyloamoniowa i sól amonowa.Przyklad XXIII. Wytwarzanie hydroksykwa- su o wzorze 4.Sól sodowa zwiazku o wzorze 4, wytworzona w sposób opisany w przykladzie XXII, rozpuszcza sie w 2 ml mieszaniny etanolu z woda (1:1) i otrzy¬ many roztwór dodaje do 10 ml 0,ln kwasu solnego, po czym uwolniony^hydroksykwais ekstrahuje sie octanem etylowym. Wyciag plucze sie woda, suszy i odparowuje rozpuszczalnik pod zmniejszonym cisnieniem, w temperaturze kapieli nie wyzszej niz 30°C. Otrzymany hydroksykwas w miare stania przeksztalca sie powoli w lakton.Przyklad XXIV. Wytwarzanie hydroksykwa- su o wzorze 4. 221 nig soli amonowej zwiazku o wzorze 4 roz¬ puszcza sie w 4,5 ml 65% etanolu, chlodzi lodem, zakwasza do wartosci pH 3 za pomoca okolo 0,5 ml Im HC1 i odparowuje w obrotowej wyparce, w nis¬ kiej temperaturze, do objetosci okolo 2 ml. Nas¬ tepnie dodaje sie 2 ml wody, ekstrahuje 2 porcjami po 3 ml octanu etylowego i przemywa 1 ml wody, przy czym we wszystkich tych zabiegach roztwory utrzymuje sie w kapieli lodowej. Wyciag suszy sie nad MgS04 i odparowuje do sucha pod zmniejszonym cisnieniem, otrzymujac hydroksykwas o wzorze 4 w postaci bezbarwnego oleju. Widmo 13C NMR produktu w CDCls wykazuje chemiczne przesu¬ niecia dla pierwszych 6 atomów wegla w czasteczce hydroksykwasu podane nizej w tabeli Numero¬ wanie tych atomów wegla rozpoczyna sie od atomu wegla w grupie karboksylowej i prowadzi dalej w kierunku przeciwnym do kierunku ruchu wska¬ zówek zegara. Otrzymany hydroksykwas w miare stania przeksztalca sie powoli w lakton.Tabela 2 Widmo "C NMR zwiazku o wzorze 4 podane w ppm wzgledem cztoometylosilanu 55 C1 c2, c4 C3 c5 c« 175,0 42,2 41,7 | 68,8 | 72,5, 1 35,0 | 60 Widmo reszty czasteczki ulega tylko nieznacznym zmianom przy zamknieciu pierscienia.Przyklad XXV. Ester etylowy zwiazku o wzo¬ rze 4.Postepujac w sposób analogiczny do opisanego w przykladzie XIX, ale stosujac zamiast 1,24 mili- mola zwiazku o wzorze 1 równomolowa ilosc zwian-23 125 843 24 ku ó wzorze 2, wytworzonego w sposób opisany w przykladzie XX, otrzymuje sie ester etylowy zwiiazku o wzorze 4.W podobny sposób wytwarza sie ester metylowy propylowy, butylowy, izobutylowy, Ill-rzed.butylo- wy, amylowy, izoamylowy, 2-dwumetyloaiminoety- lowy, benzylowy, fenyloetylowy i 2-acetoamidoety- lowy zwiazku o wzorze 4.Hamowanie HMG koenzymu A reduktazy in vitro.A Próby prowadzi sie metoda Beg'a i wspólpra¬ cowników [FEBS Letters 80, str. 123 (1977)] zmie¬ niona nieco w ten sposób, ze enzym poddaje sie hodowli z inhibitorem w ciagu 5 minut przed za¬ poczatkowaniem reakcji z substratem, poniewaz w przypadku inhibitorów tak silnych, jak zwiazki wytwarzane sposobem wedlug wynalazku, metoda ta, polegajaca na zwyklym dodawaniu enzymu do mieszaniny inhibitora z substratem, nie pozwala na uzyskanie liniowego wykresu kinetyki procesu, W próbach prowadzonych metoda zmodyfikowana sól sodowa zwiazku o wzorze 4 daje wartosc IC50 przy inhibitowaniu HMG-CoA reduktazy 2,7 X X 10-9M, podczas gdy znany zwiazek ML236B daje wartosc 5,4 X K)-»M B. Hamowanie syntezy cholesterolu przez zwiazek o wzorze 2 ki vivo^ Grupom samców szczura odmiany Holtzman po¬ dawano przez zglebnik zoladkowy 5% roztworów emulgatora w solance lub badanego zwiazku w emulgatorze. Po uplywie 1 godziny dozylnie poda¬ wano 14C octan w ilosci 80 /*Ci na 1 kg masy ciala i po uplywie 50 minut okreslano zawartosc 14C cho¬ lesterolu we krwi szczurów, jako miare syntezy sterolu. Wyniki prób podano ponizej.Dawka mg/kg | 0,15 | 0,6 1,2 % zahamowania 38 51 70 Porównanie zwiazków o wzorach 1 i 2 oraz zwiaz¬ ku ML-236B jako srodków hamujacych synteze sterolu w hodowli komórek.Próbe prowadzi sie zmieniona nieco -metoda A. W. Alberts'a i wspólpracowników [J. Biol. Chem. 249, str. 5241 (1974] mierzenia ilosci 14C sterolu, wy¬ twarzanego droga biosyntezy z 14C kwasu octowego w hodowli komórek L—M myszy. Do jednowar¬ stwowych kultur z 5 jLtCl UC octanu dodaje sie ba¬ dany zwiazek w 10 p\ sulfotlenku dwumetylu, pro¬ wadzi hodowle w ciagu 3 godzin, po czym zmydla sie komórki, ekstrahuje **C sterol i wyosobnia go metoda chromatografii cienkowarstwowej na zelu krzemionkowym eluujac mieszanina eteru nafto- s wego z eterem dwuetylowym i kwasem octowym.Obszar na plytce zawierajacy "C sterol identyfikuja sie za pomoca plamienia jodem i zawartosc 14C okresla sie metoda cieczowego liczenia scentyla- cyjmego. Dla zwiazku o wzorze 2 wartosc IC50 przy 10 inhibitowaniu HMG-CoA reduktazy wynosi 17 nM, podczas gdy dla zwiazku o wzorze 1 wartosc ta wynosi 22 nM, zas dla znanego zwiazku ML-236B 46nM. 15 Zastrzezenia patentowe 1. Sposób wytwarzania nowych laiktonów i hydro- ksykwasów, a mianowicie nowego latkonu o wzo¬ rze 1 i odpowiadajacego mu hydroksykwasu o wzo¬ rze 3 oraz nowego laktonu o wzorze 2 i odpowia- 20 dajacego mu hydroksykwasu o wzorze 4, znamien- ty tym, ze w pozywce prowadzi sie proces hodowli mikroorganizmu z rodzaju Aspergillus terreus i wy¬ osobnia otrzymane zwiazki. 2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze 25 prowadzi sie proces hodowli mikroorganizmu ATCC 20541 albo ATCC 20542, 3. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze wytworzone zwiazki wyosobnia sie przez ekstrakcje brzeczki fermentacyjnej rozpuszczalnikiem i naste- 3« pnie chromatografie. 4. Sposób wytwarzania nowego hydroksykwasu o wzorze 3,-znamienny tym, ze w pozywce prowadzi sde proces hodowli mikroorganizmu z rodzaju Aspergillus terreus, wyosobnia otrzymany lakton 35 o wzorze 1, poddaje go hydrolizie za pomoca zasady i wytworzona sól kwaisu o wzorze 3 przeprowadza sie w wolny kwas lub w inna sól albo w nizszy ester alkilowy, w którym rodnik alkilowy jest ewentualnie podstawiony grupa fenylowa, dwume- 40 tyloaminowa albo acetyloaminowa. 5. Sposób wytwarzania nowego hydroksykwasu o wzorze 4, znamienny tym, ze w pozywce prowadzi sde proces hodowli mikroorganizmu z rodzaju Aapergiluus terreus, wyosobnia otrzymany lakton 45 o wzorze 2, poddaje go hydrolizie za pomoca za¬ sady i wytworzona sól kwasu o wzorze 4 przepro¬ wadza sie w wolny kwas lub w inna sól albo w nizszy ester alkilowy, w którym rodnik alkilowy jest ewentualnie podstawiony grupa , fenylowa, 50 dwumetyloaminowa lub acetyloaminowa.125 843 FIG. 1 FiG.2 FIG. 3 FIG.4 25 9.8 M 0.1 t.b &8 10 ~ 9 ' V) ^ \ 4. f H u^_ 5 6 7 a .i i 9 » ¦i tz L J 9 2*0 ftf «» 4400 CM125 843 HO.CK O CH* .0 -CH3 CH o k^ "WHH CH CH3 h OCH; Wzór 2a CH CH3 Wzór 3 HO^^^COOH o k - H T^H f,H C CH; Wzór 3a H°Y^COOH M/Zór 4.OZGraf. Z.P. Dz-wo, z. 9$4 (80+15) 6.85 Cena IN il PL PL PL PL PL