KR0176414B1 - 신규 아실-코에이:콜레스테롤 아실전이효소 활성 저해물질 및 이의 제조방법 - Google Patents

신규 아실-코에이:콜레스테롤 아실전이효소 활성 저해물질 및 이의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 토양으로부터 분리된 곰팡이 아스퍼질러스 푸미가투스(Aspergillus fumigatus) FM-F-93, 그에 의해 생산된, 아실-CoA : 콜레스테롤 전이효소의 저해제인 하기 구조식(Ⅰ)의 GERI-BPOO2A 및 그의 제조방법에 관한 것이다.

Description

신규 아실-코에이 : 콜레스테롤 아실전이효소(ACAT) 활성 저해물질 및 이의 제조 방법
제1도는 자외선-가시광선 분광기에 의한 GERI-BP002A의 흡광도 분석 스펙트럼을 나타내고,
제2도는 VG70-VSEQ 질량분석기에 의한 GERI-BP002A의 분자량 분석 스펙트럼을 나타내고,
제3도는 브룩커(Bruker) AM-300에 의한 GERI-BPOO2AM의 300MHz에서의1H-NMR 분석 스텍트럼을 나타내고,
제4도는 브록커 AM-300에 의한 GERI-BP002A의 75MHz에서의13C-NMR 분석 스텍트럼을 나타낸다.
본 발명은 신규 아실 coA : 콜레스테롤 아실전이효소(ACAT) 저해제 및 그의 제조방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 토양으로부터 분리된 곰팡이 아스퍼질러스 푸미가투스(Aspergillus fumigatus) FM-F-93(이하, 아스퍼질러스 푸미가투스 F93이라 약함), 그에 의해 생산된, 고지혈증 치료에 응용할 수 있는 신규 아실-CoA : 콜레스테롤 아실전이효소(ACAT) 저해제 GERI-BP002A 및 그의 생산방법에 관한 것이다.
문명의 발달과 더불어 인간의 고령화와 식생활의 구미화에 따라 심장순환기계질병(고혈압, 동맥경화증, 혈중 고지혈증, 콜레스테롤 과다증 등)이 암보다 더 중요한 사망의 원인이 되고 있어 이 분야 질병의 치료제 개발이 중요해지고 있다. 심장순환기계 질병은 동맥의 내먁에 침윤된 마크로파지(macrophage) 및 세포내의 에스테르의 침착이 그 원인이라고 밝혀져 있다.
한편, 최근에 보고된 연구(Robin Schnitzer-Polokoff et, al., Comp. Biochem. Physiol. 99A, 665∼670(1991))에 의하면 아실 CoA : 콜레스테롤 0-아실전이효소(ACAT) 라는 효소가 세포내 콜레스테롤의 에스테르화를 촉진하며, 소장에서 콜레스테롤이 흡수될 때, ACAT에 의해 에스테르화된 형태로 흡수된다는 것이 밝혀졌으므로, ACAT 활성을 저해하면 콜레스테롤의 흡수가 저해되어 결과적으로 동물의 혈중 콜레스테롤의 양이 감소하는 것으로 추측되고 있다.
따라서, ACAT 활성 저해체를 합성하거나, 천연물로부터 추출함으로써 고지혈증 치료효과, 특히 혈중 콜레스테롤 강하제의 역할을 할 수 있는 원료물질을 개발할수 있음이 밝혀졌다.
최근에 ACAT 저해제 개발 목표를 가지고 선진국의 몇몇 연구기관에서는 미생물로부터 ACAT 저해제 탐색을 활발히 수행한 결과 다음과 같은 신규 ACAT 저해제 물질들의 개발에 성공하였다.
이에 본 발명자들은 ACAT 저해물질을 미생물로부터 탐색하고자 노력하는 과정에서 위에 보고된 물질과는 상이한 신규 물질 GERI-BP002A를 곰팡이 아스퍼질러스 푸미가투스 F93의 배양액으로부터 추출하는데 성공하였다.
본 발명의 목적은 토양으로부터 분리된 곰팡이 아스퍼질러스 푸미가투스 F93 및 그로부터 분리해낸, 신규한 ACAT 저해물질 GERI-BP002A를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 아스퍼질러스 푸미가투스 F93을 배양함을 포함하는 GERI-BP002A의 제조방법을 제공하는 것이다.
이하 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.
본 발명은 아실-CoA : 콜레스테롤 아실전이효소의 활성을 저해하는 하기 구조식(Ⅰ)의 화합물에 관한 것이다.
상기 화합물은 GERI-BP002A로 명명되었으며 그의 이화학적 성질을 요약하면 하기 표 2와 같다.
GERI-BPOO2A는 아스퍼질러스속 미생물, 예를들어 아스퍼질러스 푸미가투스 F93(KCTC 0111BP)을 배양함으로써 생산할 수 있으며, 다른 한편으로는, 화학적 합성법에 의해서도 역시 생산할 수 있다. 아스퍼질러스 푸미가투스 F93을 배양함으로써 GERI-BP002A를 생산하고자 할 때, 사용가능한 배지는 포도당 1%, 효모추출물 0.5% 및 맥아추출물 0.5%로 조성되고 pH가 6.5인 배지이며, 배양조건은 교반속도 100rpm, 통기량 0.3vvm, 용존산소 10-60%, 온도 28℃ 및 pH 6.5가 바람직하다.
배양이 완료된 후, 배양액을 탈지면으로 여과하여 균체를 수거하고, 이를 아세톤 및 에틸 아세테이트로 차례로 추출하여 얻은 조추출물을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피 및 HPLC를 이용하여 정제한다.
한편, GERI-BP002A의 ACAT 저해활성은 타바스(Tabas)등의 방법(J. Biol. Chem. 261. 3147-3154(1986))을 일부 변형한 방법에 의해 측정한 결과, ACAT의 활성을 50% 감소시키는 농도, 즉 IC은 약 150μM로 나타났다.
본 발명의 GERI-BP002A는 콜레스테롤의 에스테르화를 촉진하는 아실 CoA : 콜레스테롤 아실전이효소의 활성을 저해하여 콜레스테롤의 흡수를 저지시킬 수 있으므로, 고지혈증등의 치료제, 특히 혈중 콜레스테롤 강하제로서 사용될 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의하여 보다 상세히 설명하고자 하지만, 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1]
미생물의 분리 및 동정
대한민국 대전시 유성구 장동에서 채취한 토양 시료를 멸균수에 희석하여 통상적으로 사용되는 포테이토-덱스트로즈 한천평판배지에 도말한후 27℃에서 5일간 배양하여 나타난 곰팡이 균총을 수집하였다.
상기 곰팡이는 문헌[R.A. Samson and J. I. Pitt, Advances in Penicillium and Aspergillus systematics 1985, Plenum Press, New York and London] 및 [R.A. Samson and J.I. Pitt, Modern Concepta in Penicillium and Aspergillus Classification, 1989. Plenum Press. New York and London]에 기술된 방법에 따라 동정한 결과 아스퍼질러스 푸미가투스로 확인되었다.
분리된 곰팡이를 아스퍼질러스 푸미가투스 FM-F-93으로 명명하고, 1994년 5월 24일자로 한국과학기술연구원 유전공학연구소 부설 유전자은행(KCTC)에 기탁번호제 KCTC 0111BP호로서 기탁하였다.
[실시예 2]
GERI-BP002A의 발효생산
아스퍼질러스 푸미가투스 F93 균주를 포도당 1%, 효모추출물 0.3% 및 맥아 추출물 0.3%(pH 6.5)로 이루어진 멸균된 종균용배지 200㎖가 들어있는 2개의 1000㎖ 삼각 플라스크에 접종한후 28℃에서 2일간 진탕 배양하였다.
상기 접종용 배양액 200㎖를 121℃에서 30분간 멸균한 8ℓ의 발효 배지(포도당 1.5%, 효모 추출물 0.5%, 맥아추출물 0.5%, pH6.5)가 들어있는 14ℓ 생물 반응기(bioreactor)에 접종한후 교반속도 100rpm, 통기속도 0.3VVM, 용존산소 60% 이상, 온도 28℃, pH 6.5에서 작동시켜 120 시간만에 발효를 완료하였다.
[실시예 3]
GERI-BP002A의 분리 및 정제
상기 실시예 2로부터 얻은 아스퍼질러스 푸미가투스 F93의 발효액으로부터 다음과 같은 방법으로 GERI-BP002A를 분리 및 정제하였다. 발효액 8ℓ를 탈지면에 통과시켜 균체를 분리하고, 분리된 균체에 동부피의 아세톤을 넣어 약 12시간 동안 교반한후 여과하였다. 아세톤 추출을 2회 반복한후 균체 추출액을 모아서 감압농축하였다. 농축액에 물을 가하여 500㎖로 만든 후, 에틸 아세테이트를 500㎖씩 가하여 3회 추출하였다. 추출된 에틸아세테이트층에 무수 망초를 넣어 탈수시킨 후 감압 건조하여 황갈색의 조추출물을 얻었다.(6g).
실리카겔 60(미국 Merck 사, 230-400 메쉬) 120g을 CHCl용액을 사용하여 칼럼(4.5 ×30cm)에 충진한 후, 조추출물을 6g의 실리카겔에 흡착시켜서 칼럼 상단에 충진하였다. 흡착된 조추출물을 클로로포름:메탄올(100:0) 용액으로부터 점차적으로 메탄올의 비율을 높이면서 단계적으로 용출시켜 50㎖씩의 분획으로 수집하였다.
활성물질이 들어있는 분획을 감압건조하여 910㎎의 조ACAT 저해 활성물질을 얻었고, 최종적으로 HPLC(Perkin-Elmer 사, S410)를 이용하여 정제하였는데, 이때 HPLC 칼럼으로는 페노메넥스(Phemomenex)사의 울트라카브(Ultracarb) 10 OBS(250 × 22.5mm, 10μ)를 이용하였으며 활성 물질은 80% 아세토니트릴로 매분 5㎖의 유속으로 용출시켜 225nm의 자외선(UV) 흡수파장에서 피크를 확인하였다.
흡수피크들에 대한 효소활성검색 결과 정체시간(Rt)이 32분일 때의 피크가 ACAT 저해 활성을 나타내었다. 최종적으로 HPLC를 통해 얻은 순수한 ACAT 활성물질은 20㎎이었다.
[실시예 4]
GERI-BP002A의 구조결정
ACAT 저해활성물질의 구조결정을 위해 다음과 같이 여러가지 기기 분석을 실시하였다.
1)자외선(UV)-가시광선(Visible) 흡광도 분석: HPLC에 최종 정제된 활성물질 0.1㎎을 100% 메탄올 2㎖에 녹여서 자외선-가시광선 분광기(Shimazu 사, UV-265)를 이용하여 흡수파장을 분석하였으며, 212nm와 281nm에서 흡수피크가 나타남을 확인하였다(제1도).]
2)분자량 분석: VG70-VSEQ 질량분석기(Vacuum Generator, UK)를 이용하여 HREI(High-Resolution Electron Impaction)-MS 방법으로 분자량을 측정하였다. 측정결과 340.24036에서 [M] 이온분자 피크가 나타났다(제2도). 이때 수학적 계산방식에 의해 분자량 340.2418을 갖는 물질의 분자식으로 CHO를 얻을 수 있었다.
3)핵자기공명(NMR) 분석: 활성물질을 완전건조시켜 CDCl에 녹인 후 5mm 튜브에 넣어 브룩커(Bruker) AM-300 기종으로 NMR 분석을 하였다. H-NMR은 300.13MHz로, C-NMR은 75.47MHz로 측정하였으며, H 스펙트럼 및 C 스펙트럼을 해석한 결과(제3도 및 제4도), 활성물질의 분자구조는 CHO임을 알 수 있었다.
따라서 상기의 여러 가지 분석 방법을 종합하여 해석해 볼 때 본 발명자들에 의해 발견된 ACAT 저해물질의 구조는 상기 구조식(Ⅰ)과 같다.
[실시예 5]
GERI-BP002A의 ACAT 저해활성 검정
ACAT 저해 활성의 측정은 [1- C] 올레오일-CoA를 기질로 하여 타바스(Tabas) 등 (J.Biol. Chem. 261. 3147-3154(1986))의 방법을 일부 수정하여 다음과 같이 실시하였다. 10㎕의 시료, 10㎕의 쥐의 간조직의 미립체 효소(단백질로 10㎎/㎖), 20.0㎕의 분석완충액(1M KPB(KH2PO4/K2HPO4), pH 7.4), 10㎕의 소혈청 알부민(180㎎/㎖, 필수적으로 지방산이 유리된 것), 콜레스테롤 5㎎/㎖의 아세톤 용액 2.0㎕ 및 130㎕의 증류수를 혼합하여 37℃에서 15분간 예비반응시켰다.
이 반응액에 [1- C] 올레오일-CoA(0.02μCi, 최종농도 30μM) 20㎕를 가하여 다시 37℃에서 30분간 반응시킨 후, 이소프로판올-헵탄(4:1 ; v/v) 1㎖를 가하여 반응을 정지시키고, 헵탄 0.6㎖와 증류수 0.4㎖를 가하여 잘 섞은 후 3,000rpm으로 5분동안 원심분리하였다.
효소활성의 측정은 원심 분리하여 얻은 상층액 100㎕에 신틸레이션 칵테일(Lipoluma) 5㎖를 첨가한 후 액체 신틸레이션 계수기를 이용하여 생성된 클레스테릴 에스테르의 양을 CPM(count per minute) 단위로 결정하였다. ACAT 저해 활성은 다음과 같은 계산하였다.
이때 공시료는 GERI-BP002A를 처리하지 않고 0℃에서 반응시켰으며, 대조용 시료로는 발효액을 포함하지 않는 시료를 사용하였다.
GERI-BP002A는 ACAT 활성 저해도 측정 결과 IC50이 150μM로 확인되었다.

Claims (3)

  1. 하기 구조식(Ⅰ)의 신규 화합물 GER1-BP002A:
  2. GERI-BP002A 생산균주인 아스퍼질러스 푸미가투스(Aspergillus fumigatus) FM-F-93 균주(KCTC 0111BP).
  3. 아스퍼질러스 푸미가투스(Aspergillus fumigatus) FM-F-93 균주(KCTC 0111BP)를 배양함을 포함하는 GERI-BP002A의 제조방법.
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