CS221919B2 - Způsob přípravy směsi hypocholesterolemický sloučenin - Google Patents

Description

Předložený vynález se týká hypocholesteremických produktů kultivace plísní druhu Aspergillus. Přesněji se týká sloučenin vzorců I až IV

(I) (II) (III)

HO

COOH

OH ,ch₃

HO

COOH

OH ,ch₃ (IV) jakož i jejich farmaceuticky vhodných solí a nižžích alkylesterů nebo fenyl-, dimetylaminonebo ecetylaminosubstituovených alkylesterů karboxylových kyselin. Předložený vynález se těká týká způsobu kultivace plísní a izolace sloučenin výše uvedených struktur z prostředí. Nové sloučeniny mají vynikající vlastnosti při inhibici biosyntézy cholesterolu a jsou použitelné proti hypercholesteremii a hyperlipemii.

Vzhledem k nové vazbě mezi vysokou hladinou cholesterolu a atherosklerózou bylo vynaloženo značné úsilí pro nelezení způsobů, které snižují hladinu cholesterolu v těle savců'.. Jedním z těchto způsobů je inhibice syntézy cholesterolu v těle savce.

Nedávno Endo a j. popsali v USA patentech č. 4 049 495 a 3 983 140 fermentační produkt získaný kultivací mikroorganismu rodu Penicillium a jeho izolaci z média.

Nazvali jej ML 236B a stanovili jeho strukturu spolu se dvěma příbuznými sloučeninami 236A a 236 C. Jejich struktura pod názvem compaction byla také stanovena v práci A. G. Brown, T. C. Smale, T. J. King, J. Chem. Soc. (Perkin I) 1165 (1975). Bylo nalezeno, že tato sloučenina je inhibitorem in vivo biosyntézy cholesterolu.

Nyní bylo nalezeno, že zcela neočekávaně kultivací velmi odliěného kmenu než jaký použil Endo a to plísně rodu Aspergillus, vznikají nové slouěeniny, které jsou rovněž velmi účinnými inhibitory biosyntézy cholesterolu u savců. Nyní bylo nalezeno, že tyto sloučeniny zahrnují v podstatě nové sloučeniny I, II, III a IV výěe uvedených struktur provázené pouze stopami jiných sloučenin. Tyto nové sloučeniny jsou účinnějěími inhibitory biosyntézy cholesterolu in vivo než sloučenina ML 236B popsaná Endem.

Farmaceuticky vhodné soli podle vynálezu zahrnují soli s kationty odvozenými od sodíku, draslíku, hliníku, vápníku, lithia, hořčíku, zinku, amoniaku, etylendiaminu, N-metylglukaminu, lysinu, argininu, ornithinu, cholinu, Ν,Ν'-dibenzyletylendiawinu, chlorprokainu, dietanolaminu, prokainu, N-benzylfenetylaminu, 1-p-chlorbenzyl-2-pyrrolidin-1 '-yl-metylbenzimidazolu, dietylaminu, piperazinu, tris(hydroxymetyl)aminometanu a tetrametylamonia.

Sloučeniny podle vynálezu jsou použitelné jako antihypercholesteremická činidla pro léčení atherosklerozy, hyperlipemie a podobných onemocnění lidí. Mohou se aplikovat orálně nebo parenterálně ve formě kapslí, tablet, injikovatelných preparátů apod. Obvykle je žádoucí použití orální aplikace. Dávky mohou být různé a závisejí na věku, vážnosti onemocnění, tělesné hmotnosti a jiných stavech pacientů. Denní dávka pro dospělé se pohybuje v rozmezí od asi 2 mg do 2 000 mg (s výhodou 2 až 100 mg), které se může aplikovat ve dvou až čtyřech rozdělených dávkách. V případě potřeby se mohou podávat i vyšší dávky.

Sloučeniny podle vynálezu mají také použitelnou protiplísnovou aktivitu. Například se mohou použít pro kontrolu kmenů Penicillium sp., Aspergillus niger, Cladosporium sp., Cochliobolus miyabeorus a Helminthosporium cynodnotis. Pro takové použití se mohou mísit s vhodnými činidly používanými pro přípravu prostředků jako jsou prášky, emulgační činidla nebo rozpouštědla, jako je vodný etanol a pak se stříkají nebo poprašujl na rostliny, které mají být oěetřeny.

Předmětem předloženého vynálezu je způsob přípravy směsi hypocholesteremických slouče nin obsahujících sloučeniny strukturních vzorců I, II, III a IV

(I) (II) (III)

HCkz-.

| COOH (IV)

CH vyznačený tím, že se živné médium obsahující asimilovatelné zdroje uhlíku, dusíku a živné anorganické soli inkubuje při 20 až 37 °C a pH 6,0 až 8,0 s mikroorganismy rodu Aspergillus terreus uloženými v American Type Culture Collection pod čísly 20541 nebo 20542 a produkty se Izolují.

Na základě toxonomických studií tento druh Aspergillus byl izolován a identifikován jako dosud nepopsaný mikroorganismus a byl označen jako MF-4833 ve sbírce kultur Merck and Co., Inc., Rahway, New Jersey a kultura tohoto typu byla umístěna pro trvalé uchováni ve sbírce American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockwille, Maryland 20852, a označen číslem ATCC 20541. Jiný vzorek obdobného organismu označený MK-4845 ve sbírce kultur firmy Merck byl rovněž umístěn pro trvalé uchování pod číslem ATCC 20542. Tento poslední organismus poskytuje lepší výtěžky. I když použití těchto zde popsaných mikroorganismů je popsáno ve spojitosti s postupem podle vynálezu¹, jsou ostatní organismy rodu Aspergillus včetně mutantů rovněž tak schopné produkce nových sloučenin a mohou se použít při postupu podle vynálezu.

Morfologické charakteristiky mikroorganismů MF-4833 a MF-4845 odpovídají rodu Aspergillus. Použitím kritérií uvedených v standardní literatuře Manual of the Aspergilli, Charles Thom and Kenneth B. Kasper, publikované Williams nad Wilkins Company, Baltimore, líd., 1945, a srovnáním se známými druhy bylo nalezeno, že oba kmeny jsou Aspergillus terreus.

Kultivace těchto organismů pro produkci nových sloučenin se provádí ve vodném médiu jako jsou média používaná pro produkci jiných fermentačních produktů. Tato média obsahují zdroj uhlíku, dusíku a anorganické soli asimilovatelné mikroorganismem.

Obecně se mohou použít cukry, jako je například glukóza, fruktóza, maltóza, sacharóza, xylóza, manitol apod., a škroby, jako jsou škroby z obilí, například ovsa, rýže, kukuřice a to buS samostatně nebo v kombinaci s jinými zdroji asimilovatelného uhlíku. Přesné množství zdroje uhlíku nebo zdrojů používaných v médiu závisí částečně na ostatních složkách média, obecně množství sacharidů se obvykle pohybuje mezi asi 1 % a 6 % hmotnosti média.

Tyto zdroje uhlíku se mohou použít individuálně nebo několik z nich se může v médiu mísit. Obecně se může použít mnohých proteinových materiálů, jakožto zdrojů dusíku. Vhodné zdroje dusíku zahrnují například hydrolyzáty kvasnic, primární kvasnice, sojová mouka, mouka z bavlněných semen, hydrolyzáty kaseinu, kukuřičné výluhy, destilační zbytky nebo tomatová pasta apod. Zdroje dusíku se mohou použít samostatně nebo v kombinaci a jejich množství se pohybuje od asi 0,2 % do 6 % hmot. vodného média.

Ze živných anorganických solí, které se mohou přidávat do kultivačního média jsou vhodné soli schopné poskytovat ionty sodíku, draslíku, vápníku a dále ionty amonné, fosfátové, sulfátové, chloridové, kerbonátové apod. Rovněž tak se zahrnují stopové kovy, jako je kobalt, mangan, železo a hořčík.

Je třeba zdůraznit, že média popsaná v příkladech jsou pouze příklady z celé řady použitelných médií a předložený vynález žádným způsobem neomezují. Jmenovitě zdroje uhlíku používané v živném médiu pro přípravu nových sloučenin podle vynálezu jsou dextróza, dextrin, ovesná mouka, melasa, citráty, sojový olej, glycerol, extrakt ze sladu, olej z tresčích jater, škrob, etanol, fíky, askorbát sodný a olej z vepřového sádla. Jako zdroje dusíku se používají peptonisované mléko, autolysované kvasnice, ribonukleové kyseliny, droždí, tomatová pasta, kasein, primární droždí, rozemleté arašídy, destilační zbytky, kukuřičné výluhy, sojová moučka, kukuřičná moučka, NZ amin, hovězí extrakt, asparagin, moučka z bavlníkových semen a síran amonný. Hlavními iontovými složkami jsou uhličitan vápenatý, KHgPO^, KgSO^. 7H₂O a NaCl a malé množství CaClg . 6H₂O a stopy železa, manganu, molybdenu, boru a mědi.

Fermentace se provádí při teplotě v rozmezí 20 až 37 °C, avěak pro optimální výsledky je výhodné provádět fermentaci při teplotě od 22 do 30 °C. Hodnota pH živného média vhodná pro růst kultury Aspergillus a pro produkci nových slouSenin se pohybuje v rozmezí od asi 6,0 až do 8,0.

I když nové sloučeniny se produkují jak povrchovou, tak submersní kulturou, je výhodné, jestliže se fermentace provádí v submersním stavu; Fermentace v malém se s výhodou provádí naočkováním vhodného živného média a provedením fermentace při konstantní teplotě asi 28 °C několik dnů.

Fermentace se započne ve sterilní bance s médiem přes jeden nebo více očkovacích stadií. živné médium pro očkovací stupně může obsahovat kterékoli vhodné kombinace zdrojů dusíku a uhlíku. Očkovací baňky se třepou dve dny při konstantní teplotě při 28 °C až je růst dostatečný a jeho část se použije pro naočkování druhého očkovacího stupně nebo produkčního média. Baňky s očkovacími mezistupni, jestliže se použijí, se Inkubují stejným způsobem, to je čéet obsahu baněk z posledního očkovacího stadia se použije pro naočkování produkčního média. Naočkované baňky se třepou několik dní při konstantní teplotě a ke konci inkubační doby se obsah baněk centrifuguje nebo filtruje.

Pro produkci ve velkém je výhodné provádět fermentaci ve vhodných tancích s míchadlem a zařízením pro provzduěňování fermentačního média. Podle této metody se živné médium zpracovává v tanku a sterilizuje zahříváním na teploty do asi 120 °C. Po ochlazení se sterilní médium naočkuje dříve vypěstovanou očkovací kulturou a fermentace se provádí po určitou dobu, například 3 až 5 dnů za míchání a/nebo provzduěňování živného média a udržování teploty na asi 28 °C. Tato metoda produkce nových sloučenin je zejména vhodná pro přípravu velkých množství.

Sloučeniny se s výhodou izolují z fermentačního média vé formě laktonů I a II. Alternativně se mohou izolovat ve formě solí sloučenin III a IV.

Sloučeniny X a II se mohou hydrolyzovat bázemi jako je NaOH a získají se tak sodné soli sloučenin III a IV. Použití bází s jinými farmaceuticky vhodnými kationty poskytuje soli těchto kationtů. Opatrným okyselením solí se získají hydroxykyseliny III a IV. Hydroxykyseliny III a IV se převedou na sloučeniny I a II v kyselém pH. Reakcí sloučenin I a II za kyselých nebo bazických podmínek s metanolem, etanolem, propanolem nebo butanolem nebo s fenyl-, dinetylamino- nebo acetylamino-alkanoly se získají odpovídající estery sloučenin III a IV, které rovněž jsou součástí předloženého vynálezu.

Sloučeniny III a IV a zejména III se mohou s výhodou izolovat bez chromatografie ve formě amonných solí. Tato izolace je výhodnější než chromatografie pro výrobu ve velkém.

Dále jsou soli III a IV aktivnější než sloučeniny I a II in vitro při inhibici biosyntézy cholesterolu a jako fungicidní Činidle. Ve skutečnosti hydroxykyseliny (a jejich soli) jsou aktivními formami. Tyto soli jsou jednou ze zejména vhodných dávkových forem. Kromě amonných solí jsou výhodnými solemi tetrametylamoniová sůl a soli s etylendiaminem, sodíkem, draslíkem, vápníkem, N-metylglukaminem, lysinem, argininem a ornithinem.

Fyzikálně chemické vlastnosti sloučeniny vzorce I (MSD-803) jsou následující:

1. Teplota tání 170 až 171 °C

2. Molekulární hmotnost (hmotové spektrum)

404

3. Vzorec (nalezeno hmotovou spektrometrií vypočteno)

404,2555

404,2563

221919 6

4. UV spektrum (v acetonitrilu): maxima

230.5 nm s E% 505,7

237.5 nm s E* 576,6 246 nm s E96 395,2

5. ¹³C NMR chemické posuny. Spektrum bylo snímáno v CDClj roztoku (20,1 mg) v 0,35 ml) Chemické posuny jsou uvedeny vzhledem k vnitřnímu standardu, tetrametylsilanu jako nulovému ppm. Za experimentálních podmínek rozpouštědlo, (CDClj) se projevuje signá lem při 70,0 ppm. V souhlase s hmotovým spektrem byly nalezeny spektrální údaje pro 24 uhlíků a jejich chemické posuny jsou následující:

11,5, 13,6, 16,0, 22,6, 24,1, 26,6, 27,2, 30,5, 32,5, 32,8, 35,9, 36,4, 37,1, 38,4, 41,3, 62,4, 67,8, 76,4, 128,4, 129,7, 131,7, 133,2, 170,8 a 177,2 ppm.

6. ’h NMR spektrum

Spektrum bylo snímáno v CDClj roztoku a chemické posuny jsou uvedeny na Obrázku 1 v ppm vztaženým na vnitřní tetrametylsilanový standard při nulovém ppm.

7. Infračervené spektrum

Infračervené spektrum se snímá v KBr mikropastilkách. Je uvedeno na obrázku 2.

8. Optická rotace

Specifická optická rotace [a] - 320,7°, byla stanovena v roztoku 5,30 mg/ml

CHjCN. Tato hodnota byla získána při měření vlnové délky sodíkové D čáry.

Na základě těchto a ostatních dat bylo možno uvést, že sloučenina se značným stupněm jistoty odpovídá stereochemické struktuře

Odpovídající hydroxykyselina III má strukturu:

Absolutní konfigurace center asymetrie v těchto molekulách byla stanovena difrakcí X-paprsky.

Fyzikálně chemické vlastnosti sloučeniny II (MSD-883) jsou shrnuty následovně: 1. Teplota tání 129 až 131 °C

2, Molekulární hmotnost 406

3. Vzorec °24^Η38^θ5 (nelezeno hmotovou spektrometrií) 406,2706 vypočteno 406,2719

4. 'h NMR spektrum

Spektrum bylo snímáno v CDCl^ roztoku a chemické posuny jsou uvedená v obrázku 3 v ppm relativně k vnitřnímu tetrametylsilanovámu standardu při nulovém ppm.

5. Infračervené spektrum

Infračervené spektrum bylo stanoveno v KBr pastilkách. Je uvedené v obrázku 4,

6. Optická rotace

Specifické optická rotace [a] = 148,6°, byla stanovena v roztoku 5,23 mg/ml CH^CN.

Tato hodnota byla získána měřením při vlnové délce sodíkové D-čáry.

7. ’³C NMR chemické posuny v CDClg

11,8, 14,9, 16,5 , 21,1, 23,1, 26,7(20 , 30,9 , 31,3 , 33,0 , 35,7 , 35,9, 37,4, 38,5, 38,6, 41,9(20, 62,3, 70,1, 76,5, 131,0, 132,6, 171,2, 176,7.

Na základě těchto a ostatních údajů se předpokládá, že struktura produktu se značným stupněm jistoty má chemickou strukturu

Odpovídající hydroxykyselina, sloučenina IV má pak strukturu:

Předložený vynález je možno znázornit v následujících příkladech.

Příklad 1

Příprava sloučenin I a III

A. Ferměntace

Zkumavka s lyofilizovanou kulturou MF-4833 se za aseptických podmínek otevře a obsah se suspenduje v 250 ml Erlenmayerově bance bez překážek (očkovací baňka) obsahující asi 20 ml média A. Médium A má následující složení:

i

Médium A:
kukuřičné výluhy	10 g
tomatová pasta	80 g
ovesná mouka	20 g
glukóza	20 g
stopové prvky, směs č. 2	20 g
destilovaná voda 1	000 ml
pH 6,8 přidáním NaOH
Stopové prvky, směs č. 2
FeSO4 . 7H2O	1 000	mg
MnS04 . 4H2O	1 000	mg
CuClg . 2H2O	25	mg
CaCl2 . 2HgO	100	mg
h3bo3	56	mg
(NH4)6Mo7024 . 4H2O	19	mg
ZnS04 . 7H2O	200	mg
destilovaná deionisované voda	1 000	mg

Naočkovaná baňka se inkubuje 48 hodin při 28 °C na třepačce s 220 otáčkami za minutu (posun 5,1 cm). Dvě 2 litrové Erlenmayerovy baňky bez přepážek obsahující 500 ml média B se pak naočkují po 10 ml ne baňku vyrostlé kultury z očkovací baňky. Médium B má následující složení:

Médium B tomatová pasta 20 g primární kvasnice 10 g

CPC škrob 20 g

CoCl₂ . ĎHgO 5 mg destilovaná voda 1 000 ml pH 7,2 až 7,4 přidáním NaOH

Tyto dvě naočkované baňky se inkubují 96 hodin při 28 °C. Jedna baňka se inkubuje bez míchání. Druhá beňka se inkubuje na třepačce s 150 otáčkami za minutu, (posun 5,1 cm). Po 46 hodinách se obsah každé baňky zvlášl zpracuje a produkt se izoluje.

B. Izolace sloučeniny I

Inkubované médium se centrifuguje 20 až 30 minut. Pevné podíly se extrahují. Čirá kapalina <pH 6 až 8) se umístí do 950 ml baňky a přidá se 150 ml ZAD-2 pryskyřice. Použitím automatického extraktoru , pracujícího podle předem nastaveného programu, se směs míchá 2 hodiny. Kapalina se pak odpustí, pryskyřice se dvakrát promyje 200 ml deionisované vody a promývací roztok se vyleje. Pak se přidá 300 ml směsi rozpouštědel: isopropanol, etylacetát dichlormetan 25:45:30. Směs se míchá dvě hodiny. Suspenze rozpouětědlo-pryskyřice se odfiltruje na Buchnerově nálevce nebo na nálevce se sintrovaným sklem a pryskyřice se vyleje. Pevné podíly z médie se míchají s 100 ml acetonu 30 minut. Směs se pak centrifuguje a supernatant se dekantuje. Spojené filtráty a dekantovaný roztok se zahustí na 15 ml.

C. Testovací sloučeniny I

Filtráty se testují na inhibici enzymu HMG-CoA reduktázy metodou popsanou v práci Beg,

Stonik a Brewer (1977 FEBS Letters 80 123 až 129) použitím enzymů připravených podle práce

Kleinsek, Rangatham a Porter (1977 Proč. Hat. Acad. Sci. 74 1431 až 1435). Pozitivní test (více než 90 % inhibice při použití dávky 20 pg na ml - IC^q 2,3 pg na ml indikuje přítomnost velmi účinného inhibitoru syntézy steroidů působícího na HMG-CoA reduktázu.

Příklad 2

Příprava sloučenin 1 β III

A. Fermentace

Zkumavka s lyofilisovanou kulturou Aspergillus sp. MF-4833 se otevře aseptlcky a obsah se suspenduje v 250ml Erlenmeyerově baňce (očkovací baňka č. 1) obsahující 40 ml média C. Médium C má následující složení:

Médium C
kukuřičné výluhy	5
tomatová pasta	40
ovesná mouka	10
glukóza	10
stopové prvky směs č. 2	10
destilovaná voda	1 000

pH 6,8 přidáním NaOH

Naočkovaná baňka se inkubuje 24 hodin při 28 °C na rotační třepačce s 220 otáčkami ze minutu (posun 5,1 cm). Pak se naočkuje dalších 8 250 ml) Erlenmeyerových baněk bez přepážek z nichž každá obsahuje 40 ml média C a po 2 ml vzrostlé kultury z baňky č. 1. Těchto oem očkovacích baněk č. 2 se pak inkubuje 24 hodin při 28 °C na třepačce s 220 otáčkami za minutu (posun 5,1 cm). Dvacet dvoulitrových Erlenmeyerových baněk bez přepážek obsahujících po 500 ml média B se pak naočkuje po 14 ml spojených vzrostlých kultur z baněk č. 2. Těchto 20 baněk se inkubuje při 28 °C bez míchání 11 dnů. Po 11 dnech se obsah těchto 20 baněk.spojí.

B. Extrakce

10,2 litrů spojeného inkubovaného média, pH 6,0 se mixuje v mixéru, aby rozbil těžké myceliální koňsky, centrifuguje se a čirý supematant se dekantuje. Po filtraci se 10 litrů získaného filtrátu extrahuje 3 litry etylacetátu a získá se 1 820 ml čirého extraktu. Druhá extrakce 3 litry etylecetátu poskytne 3 350 ml čirého extraktu. Pevné podíly z média se- extrahují jednohodinovým mícháním s 2 litry metanolu a filtrací se získá 2 10Ó ml filtrá tu.

Alikvotní podíly těchto extraktů se vysuěí a testují postupem podle příkladu 1C. Byly získány následující výsledky:

	Extrakt
objem (ml)	celkové pevné	celkové jednotky
	podíly (mg)	aktivity
1 820	1 133	1 496 695
3 350	787	314 900
2 100	13,15	1 144 067

C. Gelová filtrace

Celkové pevné podíly získané z prvních dvou extraktů v příkladu 2B se spojí, rozpustí v metanolu a filtrací se odstraní nerozpustné pevné podíly. 30 ml filtrátu se umístí na kolonu gelové filtrace (2,5 cm x,200 cm, 980 ml), naplněnou Sephadexem LH-20 a frakce se dělí podle molekulární hmotnosti použitím metanolu, jakožto rozpouštědla. Použitím indexu lomu a UV detekce se nejlepší frakce identifikují biotestem celkové pevné podíly (mg) celkové jednotky aktivity

frakce 1	89	106	27,
frakce 2	278	1 099	680
frakce 3	779	210	357

D. Dělení a čištění

Vzorek z frakce 2 výěe se filtruje na 1 g Waters Bondapak C18/Porasil B a eluuje pěti objemy metanolu. Metanolové eluáty se zahusti na 0,5 ml. Tento vzorek se chromatografuje v několika Seržích na Waters /iC18 koloně (3,9 mm x 30 cm) směsí metanolu a 0,05M fosforečnanu amonného, pH 2,9 (75:25) jakožto elučním činidlem. Frakce se sledují na Beckmann spektrometru a ty, které vykazují absorpční maxima při 236 nm s inflexy 229 β 245 nm se spojí a zahustí za sníženého tlaku na vodný roztok. Hodnota pH koncentrátu se upraví na 6,5 přidáním 2M hydroxidu draselného a aktivní složky se extrahují etylacetátem. Organické fáze se vysuší, zahustí k suchu a odparek se rozpustí v 0,3 ml metanolu. Metanolický roztok se chromatografuje výše uvedeným způsobem a recykluje se. Podíly obsahující dříve eluovanou složku se spojí, zahustí na vodný roztok a extrahují se chloroformem. Chloroformový odparek se rozpustí v metanolu a rozpouštědlo se odpaří v atmosféře dusíku. Získá se 3,5 ml suchého produktu, který byl identifikován jako hydroxykyselina (sloučenina III). Podíly obsahující druhou složku se spojí a extrahují chloroformem postupem popsaným výše. Získá se . 0,87 mg suchého produktu, který byl identifikován jako lakton (sloučenina I).

Příklad 3

Nejlepší způsob fermentace MF-4833 za vzniku sloučenin I a III

Zkumavka lyofilisované kultury Aspergillus sp. MF-4833 se asepticky otevře a obsah se suspenduje v 250 ml Erlenmeyerově baňce (očkovací, baňka) obsahující 40 ml média C). Naočkovaná baňka se 48 hodin inkubuje při 28 °C na třepačce s 220 otáčkami za minutu posunem

5,1 cm. Dvě 250 ml Erlenmeyerovy baňky, z nichž každá obsahuje po 40 ml média D, se pak očkují po 2 ml vzrostlé kultury z očkovací baňky. Médium D má následující složení:

Médium D laktóza 20 g destilační výluhy 1 5 g autolysované droždí 5 g destilovaná voda 1 000 ml pH 7,0 přidáním NaOH.

Tyto dvě naočkovaná baňky se inkubují 96 hodin při 28 °C na třepačce s 1 50 otáčkami za minutu (posun 5,1 cm). Po 96 hodinách inkubace se obsah těchto dvou baněk extrahuje postupem popsaným v příkladu 2B. Celková produkce v těchto baňkách je 1 450 až 2 000 jednotek/ml.

Příklad 4

Příprava sloučenin I a III

Zkumavka s lyofilisovanou kulturou Aspergillus MF 4845 se asepticky otevře a obsah se suspenduje v 250 ml Erlenmeyerově baňce bez přepážek (Očkovací baňka δ. 1) obsahující médium C (40 ml). Naočkovaná baňka se inkubuje 24 až 48 hodin při 28 °C ne třepačce s 220 otáčkami za minutu (posun 5,1 cm). Část z této baňky (asi 0,5 ml) se pak použije pro naočkování šikmé kultury ve zkumavce obsahující médium E. Médium E mé následující složení:

Médium E extrakt z droždí 4 g extrakt ze sladu 10 g dextróza 4 g agar 20 g destilovaná voda 1 000 ml pH 7,0 přidáním NaOH.

Naočkované šikmá kultura se inkubuje 11 dnů při teplotě místnosti. Pak se 3 až 4 měsíce skladuje při -60 °C. část obsahu této šikmé kultury se pak suspenduje v 250 ml Erlenmeyerově baňce bez přepážek (očkovací baňka č. 2) obsahující 40 ml média C. Naočkovaná baňka se inkubuje 24 hodin při 28 °C na třepačce s 220 otáčkami za minutu (posun 5,í cm). Šest

250 ml Erlénmeyerových baněk bez přepážek (očkovací baňky č. 3) obsahující po. 40 ml média C se pak naočkují po 2 ml vzrostlé kultury z baňky č. 2. Těchto Šest naočkovaných baněk se inkubuje 48 hodin při 28 °C na rotační třepačce s 220 otáčkami za minutu (púsun 5,1 cm). Šest dvoulitrových Erlenmeyerových baněk bez přepážek obsahujících po 500 ml média F se pak naočkuje obsahem očkovací baňky č. 3. Médium F má následující složení:

Médium F kukuřičné výluhy 1 5 g

CPC škrob 20 g kukuřičné mouka 1 g séjová mouka 4 g glukóza 5 δ . sójový olej 2,5 g (NH₄)₂SO₄ 4 g

KH₂PO₄ 0,3 g

CaCo₃ 6 g destilovaná voda 1 000 ml pH 6,7 přidáním NaOH.

Naočkované baňky se inkubují11 dnů bez míchání při 28 °C. Po 11 dnech se provede extrakce postupem podle příkladu 2B. Celková produkce v těchto baňkách je 1 231 jednotek/ml.

Příklad 5

Nejlepší způsob fermentace MF-4845 za vzniku sloučenin I a III • Zkumavka lyofilisované kultury Aspergillus MF-4845 se asepticky otevře a obsahy se suspendují v 250 ml Erlenmeyerově baňce bez přepážky (očkovací baňka) obsahující 40 ml média C. Naočkovaná baňka se inkubuje 30 hodin při 28 °C na třepačce s 220 otáčkami za minutu (posun 5,1 cm). 250 ml Erlenmeyerova baňka bez přepážek obsahující 40 ml média G se naočkuje 2 ml vzrostlého média z očkovací baňky. Médium G má následující složení:

Médium G dextróza 45 g

Peptonlzované mléko 24 g autolysované droždí 2,5 g polyglykol P2000 2,5 ml destilovaná voda 1 000 ml pH 7,0 přidáním NaOH.

Takto naočkovaná baňka se inkubuje 120 hodin při 28 °C na třepačce s 220 otáčkami za minutu a posunem 5,1 cm. Po 120 hodinách inkubace se obsahy baněk extrahují postupem podle příkladu 2B. Celková produkce v této baňce byla 21 500 jednotek/ml.

Přiklad

A. Fermentace MF-4833 ve velkém za vzniku sloučenin 1 a III

Médium použité pro, každý stupeň fermentace obsahovalo:

kukuřičný výluh	5	ε
tomatová pasta	40	ε
ovesná mouka	10	ε
glukóza .	10	ε
roztok stopových prvků	10	ml
destilovaná voůa 1	000	ml
upraveno na pH 6,8 hydroxidem sodným.
Roztok stopových prvků obsahoval:
FeSO4 . 7H2O	1	ε
MnSO4 . 4H2O	1	ε
CuC12 . ŽH/	25	mg
CaClg	100	mg
H3B°3	56	mg
(NH4)6Mo?024 . 4H2O	19	mg
ZnSO4 . 7H2O	200	mg
destilovaná voda	1	litr

Před naočkováním mikroorganismem byla u veškerých médií prověřena sterilita.

Do 250 ml Erlenmeyerovy baňky bez přepážek se umístí 40 ml média a obsah jedné zkumav ky lyofilisóvaného organismu MF 4833. Baňka se pak třepe na rotační třepačce s 220 otáčkami za minutu při teplotě 28 °C po dobu 24 hodin. Nové baňky se naplní 40 ml média, přidá se k nim 1 ml obsahu 1 baňky, načež se tyto třepou 24 hodin pří 28 °C. Do 2 litrové baňky se pak umístí 400 ml média a 10 ml fermentační směsi ze druhého stupně, načež se tato třepe 24 hodin při 28 °C.

Fermentační tank z nerezavějící oceli objemu 910 litrů se naplní 501 litry média obsa hujícího:

laktózu 2 % hmot./obj.

rozpustné destilační zbytky 1,5 % hmot./obj.

autolysované droždí 0,5 % hmot./obj.

polyglykol P2000 0,25 % hmot./obj.

jehož pH se upraví na 7,0. Médium se sterilizuje 15 minut při 121 °C. Do média se přidá 1 litr ze třetího očkovacího stupně a směs se inkubuje 96 hodin při 28 °C, 130 otáčkách za minutu a průtoku vzduchu 0,28 m^/min.

B. Izolace sloučeniny I

Kolem 17 kg křemičitého filtračního materiálu se přidá do 501 litrů média získaného kultivací MF-4833 popsaného výěe a směs se filtruje přes filtrační lis velikosti 46 cm. Čirý filtrát (pH 6,6) se upraví na pH 4,0 opatrným přidáním 450 ml koncentrované kyseliny chlorovodíkové a extrahuje se mícháním asi s jednou třetinou objemu (asi 164 litrů) etylacetátu. Po oddělení se vrchní rozpouštědlové fáze oddělí a vodná fáze se znovu extrahuje etylacetátem (173 litrů). Po oddělení se oba extrakty spojí a promyjí asi 54 litry vody. Po oddělení se étylacetátový roztok zahustí ve vakuu při teplotě pod 30 °C nejprve v míchaném kotli a nakonec ve vakuovém rotačním odpařováku na objem menší než 4,5 litrů.

Přibližně'3 800 ml etylacetátového koncentrátu z předcházející extrakce se dále zahustí na rotačním odpařovéku (40 °C lázeň, 1,3 kPa) na sirup, který se pak dvakrát odpaří po přídavku asi litru metylenehloridu ve dvou dávkách. Získá se tak sirup prostý polárního rozpouštědla. Asi 300 ml zbylého oleje obsahujícího podle vážení suché hmoty asi 250 g pevných podílů se rozpustí v asi 750 ml etylacetátu a metylenehloridu (30/70; obj/obj) a přidáním 200 g silikagelu se připraví suspenze, která se nanese na vrSek kolony 14 cm x 36 cm obsahující 2,5 kg silikagelu v asi 7,5 1 stejné směsi rozpouětgdel. Vyvíjení stejným rozpouštědlem se provádí tak dlouho, až se jímají 3 1 předku.

Pak se započne eluce směsí etylacetátu a metylenehloridu (50/50, obj/obj) a jímají se 800 ml frakce. Jímá se 12 frakcí a pak se započne eluce 100% etylacetétem a po dalších sedmi frakcích se započne eluce 100% acetonem. Ve frakcích 4 až 24 se stanoví biologická aktivita při inhibici HMG-CoA reduktázy testem popsaným v příkladu 1. Značná aktivita byla nalezena ve frakcích 7 až 11. Hlavní aktivita·byla nalezena ve frakci 8. Tato se zahustila na olej pro další čištění. Stanovené suchá hmotnost pevných podílů 9,0 g.

Frakce 8 z kolony silikagelu se rozmělní v 50 ml metylenehloridu, přefiltruje se . a filtrační koláč má hmotnost 4,9 g. Filtrát se nanese na 1 m dlouhou kolonu o průměru

5.1 cm naplněnou dextroveným gelem Sephadex LH20 (Pharmacia) smočeným a ekvilibrovaným v metylenehloridu a kolona se eluuje metylenchloridem rychlosti 15 ml/min. Sloučenina I se eluuje mezi 0,64 a 0,81 objemy kolony. Rozpouštědlo se z toho pásu odstraní a získá se mírně hnědý odparek hmotnosti asi 0,290 g. Tento odparek (213 mg) se rozpustí v 1,5 ml směsí dichlořmetanu a acetonitrilu (65/35) a nanese se na předem neplněnou a ekvilibrovanou kolonu silikagelu (EM LOBAK velikost B) a eluuje se směsí dichlořmetanu a acetonitrilu. (65/35) rychlostí 5 ml/min. Odpařením rozpouštědla z píku eluoveného mezi 235 a 360 ml rozpouštědla se získá 121 mg krystalického produktu t. t. 155 až 160 °C. Při vysokotlaké kapalinové chromatografii tento materiál na EM RP 18 analytické koloně s obrácenou fází E. Merck Hlbar II, Cat. No. 906046) použitím 0,05 M fosfátu sodného pH 3,0 a acetonitrilu (45/55, jakožto elučního činidla rychlostí 2 ml/min vykazuje pík s charakteristickou UV absorpcí při 11 minutě.

mg tohoto materiálu se překrystaluje 0,6 ml absolutního etanolu a pak znovu z 0,4 ml stejného rozpouštědla a po sušení přes noc v exikátoru nad Pg®5 ^se 40 mg bílých peříčkovitých krystalů. Analytická vysokotlaká kapalinová chromatografie v systému popsaném výše poskytuje jeden ostrý pík s elučním časem 11 minut. Po další rekrystalizaci byl získán produkt teploty tání 170 až 171 °C.

Produkt byl identifikován spektry a j., jakožto sloučenina I. Tento materiál při in vitro testu HMG-CoA reduktázy (příklad 1) poskytuje LC^q 0,01 mikrogramů na mililitr.

Příklad 7

Přímé izolace amonné soli sloučeniny III

Médium z fermentace*získané v postupu«'podlé příklfedu 20A (454 litrů) se okyselí kyselinou fosforečnou ha ph 5. Přidá se -etylacetát (318 litrů) a směs se intenzívně míchá.

Zbytky mycelia se odfiltrují a filtrační koláč se promyje malým množstvím etylacetátu, který se spojí s hlavním extraktem.· Organická fáze'še ^oddělí a smísí s 22,7 litru 0,2N roztoku hydroxidu sodného. Směs se intenzívně míchá a pak se nechá usadit. Vodná fáze se oddělí a pH se upraví z hodnoty 9 na 5' přidáním kyseliny fosforečné. Potom se nejprve extrahuje

9.1 litry směsi hexan-etylacetát a pak 4,5 litry stejné směsi. Oddělené organické extrakty se spojí a vysuší bezvodým síranem hořečnatým. Sušicí činidlo se pak odfiltruje a filtrační koláč se promyje jedním litrem stejného roztoku hexan-etylacetát a promývací roztok se spojí s filtrátem. Tento filtrační roztok po dalším zředění 2 litry acetonu se míchá a zavádí se do něho plynný amoniak. Plyn se absorbuje a vyloučí se krystalická sraženina. Jakmile se amoniak již dále neabsorbuje a ve sraženině se pozoruje tmavnutí, přeruší se zaváděním améniaku a směs s· nachá několik hodin stát, načež se filtruje. Filtrační koláč vysrážené amonné soli se promyje acetonem až protéká bezbarvý promývací roztok a pak se suěí na vzduchu.

Surová amonná sůl se může rekrystalovat rozpuštěním v 7,8 litrech smSsi chloroformu a metanolu a koncentrovaný vodný hydroxid amonný (80:80:2) a odfiltrováním nerozpuštěného materiálu. Roztok filtrátu se pak zředí stejným objemem směsi šceton-éter 1:1 a nechá se stát přes noc. Filtrací se získá krystalická slámově zbarvená amonná sůl (96,5 g).

Další čištění se může provádět rozpuštěním 70 g výše uvedeného překrystálováného materiálu v 2 litrech vroucí směsi isopropanol-koncentrovaný vodný hydroxid amonný (95:5). Přidá se 10 g aktivního uhlí a horký roztok se odfiltruje. Filtrát se nechá vychladnout na teplotu místnosti a nechá se stát přes noc při -20 °C. Po filtraci se filtrační koláč promyje studeným (-20 °C) isopropanolem, studeným acetonem a pak éterem při teplotě místnosti. Produkt se vysuěí v atmosféře dusíku a získá se asi 60 g bílé krystalické amonné soli.

Příklad8

Soli sloučeniny III

K roztoku 40 mg produktu z příkladu 6 v 2 ml etanolu se přidá 1 ml vodného roztoku NaOH (IO^-4 mol, 1 ekvivalent). Po 1 hodině při teplotě místnosti se směs odpaří ve vakuu k suchu a získá se sodná sůl sloučeniny III.

Stejným způsobem, použitím jednoho ekvivalentu hydroxidu draselného, se připraví draselná sůl.

Příklad 9

Sůl sloučeniny III s L-lysinem

Roztok 146 mg L-lysinu v 1,5 ml 65% etanolu se přidá k roztoku 440 mg amonné soli sloučeniny III v 11,5 ml 85% etanolu. Rozpouštědla se oddestilují ve vakuu. Odparek se rozmělní s 10 ml horkého etanolu, ochladí se a filtruje. Získá se bílá pevná látka obsahující sůl sloučeniny III s L-lysinem, t. t. 178 až 180 °C (rozklad).

Analýza pro ^C30^H52^N2°8^: vypočteno: 63,35 % C 9,22 % H 4,93 % N, nalezeno: 62,80 % C 9,13 % H 4,83 % N.

Přikladlo

Sůl sloučeniny III s L-argininem

Způsobem popsaným v příkladu 9 se nechá reagovat roztok 174 mg L-argininu s roztokem 440 mg amonné soli sloučeniny III. Rozpouštědlo se odpaří ve vakuu a odparek se rozmělní s horkým etanolem, ochladí se a přefiltruje. Vysušením se získá L-argininová sůl sloučeniny III.

Přikladli

Sůl sloučeniny III s L-ornithinem

Způsobem popsaným v příkladu 9 se roztok 132 mg volné báze L-ornithinu a roztok 440 mg amonné soli sloučeniny III smísí. Rozpouštědlo se odpaří ve vakuu a odparek se rozmělní v horkém etanolu, ochladí se, přefiltruje a vysušením se získá sůl L-ornithinu sloučeniny III.

Příklad 12

Sůl sloučeniny III s N-metylglukaminem

Způsobem popsaným v příkladu 9 se smísí roztok 195 mg N-metylglukaminu v 1,5 ml vody a 440 mg amonné soli sloučeniny III v 11,5 ml 85% etanolu. Rozpouštědlo se odpaří ve vakuu a získá se sůl sloučeniny III s N-metylglukaminem.

Příklad 13 *

Etylendlamoniová sůl sloučeniny III g sloučeniny I se rozpustí v 180 ml horkého isopropanolu a zpracuje se * 90 ml 0,5 M vodného roztoku hydroxidu sodného, míchá se 1 hodinu a zředí se 180 ml vody, odpařením ve vakuu se odstraní isopropanol a ochladí se v ledové lázni. Pomalu se přidá 90 ml 0,5M HCl a směs se extrahuje 2 x 150 ml etylacetátu, který se znovu promyje 100 ml vody a vysuší síranem hořečnatým. Rozpouštědlo se odstraní ve vakuu při nízké teplotě a odparek se rozpustí v 150 ml etanolu. Přidají se 3 ml etyléndiaminu a rozpouštědlo se odpaří ve vakuu a zbytek se rozmělní vroucím etylacetátem, ochladí se, přefiltruje a překrystaluje z 30 ml isopropanolu a vysuší ve vakuu nad ^P2°5* ^se íek 13,1 g bílých krystalů t. t.

152 až 153,5 °C.

Analýza pro (^24^7^2 * ^2^0^2^⁵ vypočteno: 66,35 % C, 9,35 % H, 3,09 % N, nelezeno: 66,08 % C, 9,49 % H, 3,01 % N.

Příklad 14

Vápenatá sůl sloučeniny III

87,9 mg amonné soli sloučeniny III se rozpustí v 3 ml HgO za mícháni a zahřívání. Pak se přidá 7,4 mg analytického Ca(OH)₂ a směs se míchá a zahřívá až se dále neodpařuje amoniak a zůstává pouze malý zákal, který se odstraní centrifugací. Bezbarvý čirý supernatant se lyofilisuje a vzorky suchého materiálu se krystalují z různých rozpouštědel a směsí roz pouětědel. Produkt krystaluje v jehličkách jestliže se horký koncentrovaný roztok v bezvodém isopropanolu nechá vychladnout na teplotu místnosti.

Příklad 15

Tetrametylamoniavá sůl sloučeniny III mg sloučeniny I v 1 ml CHgClg se nechá reagovat s 0,04 ml 24% tetrametylamonium hydroxidu v metanolu. Produkt se vysráží éterem v částečně krystalické formě, centrifuguje se a sraženina se nejprve promyje éterem a pak překrystaluje ve formě hexagonálních destiček z 1 ml isopropanolu přidáním 5 ml éteru a asi 5 ml nízkovroucího petroléteru. Získá se 27 mg (65% výtěžek), 'h NMR spektrum tetrametylamoniové soli sloučeniny III

(6 mg/0	,35 ml	při 25 °C v CDClj 300 MHz)
0,83	t	<3H, J	= 6,5)
0,84	d	(3H, J	= 7)
1 ,02	d	(32, J	= 7)
1 ,05	d	(3H, J	= 7)
1,24	m	(~>1H);	ί 1,30 až 1,80 široký multiplet

1 ,88	ddd	OH, J = 2, 8, 15)
1,98	dd	OH, 3, 15)
2,16	dd	(1H, J = 8,5, 15,5)
2,23	m	(1H, skrytý)
2,32	m	OH, skrytý)
2,37	dd	(1H, J = 3, 15,5)
2,40	m	(~1g, skrytý)
3,42	s	(12H, MeN+)
3,79	m	OH., symetrický multiplet)
4,06	m	OH, symetrický multiplet)
5,32	dt	OH, J * 3)
5,50	br.	s (1H)
5,79	dd	OH, J = 6,10)
5,98	d	OH, J = 10)
Chemické	posuny jsou v ppm dolů od
Konstanty v závorkách jsou v Hz.
Zkratky:	s = singlet, d = dublet, t
í k 1	a d	16

Amonná sůl sloučeniny III

Způsobem popsaným v přikladu 13 se sloučenina I převede na hydroxykyselinu, sloučenina III se extrahuje do etylacetátu, vysuší síranem hořečnatým, přefiltruje a zpracuje bezvo dým amoniakem za míchání a chlazení. Amonná sůl se vysráží.

Příklad 17

Příprava hydroxykyseliny sloučeniny III

Sodná sůl připravená v příkladu 7 se znovu rozpustí v 2 ml směsi etanol-voda (1:1) a přidá se k 10 ml 0,1N kyseliny chlorovodíkové a uvolněná hydroxykyselina se extrahuje etylacětátem. Rozpouštědlo se jednou promyje vodou, vysuěí a odpaří ve vakuu při teplotě lázně nepřevyšující 30 °C. Stáním hydroxykyselina pomalu přechází na lakton.

Příklad 18

Sloučenina III

453 mg etylendiamoniová soli sloučeniny III se rozpustí v 6 ml 80% etanolu, ochladí se v ledové lázni, přidá se 1 ml 1M HC1, odpaří ve vakuu, aby se odstranil etanol, přidají se 3 ml vody, extrahují do 2 x 5 ml etylacetátu a zpětně promyjí vodou, přičemž veškerá rozpouštědla se udržují v ledové lázni. Extrakt se vysuší síranem hořečnatým a zahustí ve vakuu k suchu. Ve formě bezbarvého oleje se získá hydroxykyselina.

^,3C-NMR spektrum v CDCl^ (190 mg/ml) vykazuje v tabulce uvedené chemické posuny pro prvých šest uhlíků části molekuly obsahující hydroxykyselinu. Stáním tato hydroxykyselina pomelu přechází na lakton.

• 17

Tabulka

C-NMR spektrum, ppm směrem dolů do tetrametylsilanu

Hydroxykyselina, sloučenina III

174,8

42,4, 41,6

HO

68,8

72,3

34,9

Spektrum Zbylé části molekuly je pouze mírně změněné cyklizací.

Pří kl a:d 19

Etylester sloučeniny III

Suspenze 500 mg (1,24 mmol) sloučeniny I (MSD-803) v 20 ml etanolu se míchá při teplotě místnosti v atmosféře dusíku. Přidá se malý kousek sodíku (asi 1 mg) Po 15 minutách se přidá druhý malý kousek. Po celkové době 30 minut se homogenní reakční směs zředí éterem, promyje vodou a nasyceným roztokem chloridu sodného a vysuěí síranem hořečnatým. Odpařením rozpouětědla se získá voskovité pevná látka. Analýzou vysokotlakou kapalinovou chromatografií na Whatman Partasil PAC koloně (4,6 mm x 25 cm) směsí 10% isopropanolu v hexanu pumpovanou rychlostí 6 ml/min, bylo nalezeno, že ae jedná o směs etylesteru a MSD-803 (77:23).

Tato směs se oddělí kapalinovou chromatografií o středním tlaku na silikagelu 230 až 400 mesh elucí 3% etanolu/metylenchloridu. Frakce obsahující ester se spojí a odpařením se získá 358 mg (66 %) téměř bílé pevné látky t. t. 67 °C.

část tohoto materiálu se překrystaluje z hexanu a získají se bílé jehličky t. t. 66,5 až 68,5 °C.

Analýza pro C₂₆H₄₂O₆:

vypočteno: 69,30 % C, 9,40 % H, nelezeno: 69,22 % C, 9,58 % H.

Stejným způsobem se použitím ekvivalentních množství metanolu, propanolu, butanolu, isobutanolu, t-butanolu, amylalkoholu, isoemylalkoholu, 2-dlmetylaminoetanolu, benzylalkoholu, fenetanolu, 2-acetamidoetanolu apod. připraví odpovídající estery. .

Příklad 20

Příprava sloučenin II a IV

A. Fermentace

Zkumavka lyofilisované kultury MF-4845 se asepticky otevře a obsah se suspenduje v 250 ml Erlenmeyerově baňce bez přepážek (očkovací baňka) obsahující asi 10 ml média následujícího složení:

Médium:
kukuřičné výluhy	5 g
tomatová pasta	40 g
ovesná mouka	10 g
glukóza	10 g
roztok stopových prvků	10 g
destilované voda pH 6,8 přidáním NaOH.	1 000 ml
Roztok stopových prvků
FeSO4 . ZH2O	1 000 mg
MnSO4 . 4H2O	1 000 mg
CuC12 . 2H2O	25 mg
CaCl2 . 2H2O	100 mg
h3BO3	56 mg
(NH4)6Mo7O24 . 4H2O	19 mg
ZnS04 . 7H20	200 mg
destilovaná deionisované	1 000 ml

vodě

Naočkovaná baňka se inkubuje 24 hodin při 28 °C na třepačce s 220 otáčkami za minutu (posun 5,1 co). Dvoulitrová Erlenmeyerova baňka obsahující 500 ml média se pak naočkuje 10 ml očkovací smési vzrostlé kultury z prvého stupně. Tato baňka se také třepe 24 hodin při 28 °C.

Fermentační tank obsahu 910 litrů se pak naplní 485 litry média obsahujícího:

cerelózu peptoniované mléko autolysované droždí polyglykol P2000

4.5 % hmot/obj

2.5 % hmot/obj 0,25 % hmot/obj 0,25 % hmot/obj jehož pH se upraví na 7,0. Médium se sterilizuje 15 minut při 121 °C. Jeden litr druhého očkovacího stadia připraveného výěe se pak přidá do tanku a směs se inkubuje 12 hodin při 85 otáčkách za minutu a pak při 130 otáčkách za minutu za průtoku vzduchu 0,14 m^/min po dobu 12 hodin a pak 84 hodin při průtoku 0,28 n?/min.

B. Izolace

1. Extrakce

Dvě násady z 454 litrových tanků se spoji, okyselí se za míchání na pH 4,1 opatrným přidáváním 800 ml koncentrované kyseliny chlorovodíkové a pak extrahují přidáním 340 litrů etylacetátu a dvouhodinovým mícháním.

Přidá se asi 11,3 kg křemičité filtrační hmoty a celková suspenze se pumpuje přes filtrační lis velikosti 61 cm. Pro promytí filtračního koláče se použije dalších 340 litrů etylacetátu a extrakce se provádí čtyřnásoným opakovaným zpětným pumpováním přes filtrační koláč. Veškerá promýveeí rozpouštědla se pak u filtračního koláče odstraní a spojí s prvým filtrátem. Dvoufázový filtrát se nechá usadit a vodná fáze se oddělí. Etylacetátová fáze se promyje 45 litry deionisované vody, féze se nechají oddělit a etylacetátové extrakty se zahustí ve vakuu na zbytek asi 45 litrů.

2. Laktonizace (Pro cyklizeci sloučeniny IV v extraktu na sl9učenlnu II se provede následující azeotropické zpracování.)

Etylacetátové extrakty z dalších 1 365 litrů fermentovaného média se přidají k výše připravenému extraktu a objem se zmenší destilací ve vakuu na asi 136,4 litru. Přidá se esi 227 litrů toluenu a násada se zahustí ve vakuu na asi 145 litrů. Tento stupeň se opakuje, přidá se dostatečné množství toluenu, aby se dosáhl objem 340 litrů. Bez vakua se násada zahřívá dvě hodiny k varu při teplotě nad 106 °C.

Roztok se pak zahustí ve vakuu na malý objem, který se pak dále zahustí ve velkém rotačním odpařováku ve vakuu na olejovitý odparek.

3. Chromatografie na silikagelu

Extrakt získaný výše se zbaví ostatních rozpouštědel přidáním 9 litrů metylenchloridu a zahuštěním na oleji.

Olejovitý odparek se rozpustí v asi 22,7 litrech směsi etylacetátu, a metylenchloridu (30/70 obj/obj) a přidáním 2,8 kg silikagelu se připraví suspenze.

Suspenze se pak nanese na vršek kolony silikagelu (30 x 127 cm) naplněné ve stejné směsi rozpouštědel.

Eluce se provádí směsí etylacetátu a metylenchloridu (40/60; obj/obj) rychlostí 800 ml/min. Nejprve se jímá předek 45 litrů a pak frakce po 18 litrech.

Frakce 6 až 10 včetně se zahustí ve vakuu na olejovitý zbytek, který se rozpustí v horkém etylacetátu, zpracuje s aktivním uhlím, zfiltruje za horka a ochladí. Krystaly MSD 803 (sloučenina I) se odfiltrují a matečné louhy se zahustí ve vakuu na olejovitý zbytek, který se chromatografuje dále.

4. Opakovaná chromatografie na silikagelu

Matečné louhy z obdobných extrakcí fermentovaného média, ekvivalent 2727 litrů se spojí s výše připraveným metylenchloridovým roztokem. Jedna polovina tohoto roztoku se odebere pro delší chromatografií na silikagelu. Podle malého alikvotního podílu je celkový obsah pevných látek 325 g. Roztok se zpracuje s 40 g aktivního uhlí, přefiltruje se a filtrační koláč se promyje metylenchlorldem. Spojené filtráty a promývací roztoky se zahustí ve vakuu na olejovitý odparek. Ten se znovu rozpustí v 800 ml směsi etylacetátu a metylenchloridu (30/70; obj/obj) a smísí se s 225 & silikagelu. Suspenze se nanese na kolonu 14 x 36 cm silikagelu naplněnou ve stejné směsi rozpouštědel. Kolona se vyvíjí směsí etylacetátu a metylenchloridu (40/60; obj/obj). Nejprve se jímá předek tří litrů a pak frakce po 800 ml.

5. Chromatografie ηβ obrácených fázích ml z frakce uvedené chromatografie se zahustí na olejovitý zbytek 500 mg a tento olej se znovu rozpustí v 5 ml acetonitrilu. Tento acetonitrilový roztok se nanese na nerezovou kolonu průměru 1,5 cm délky 30,5 cm naplněnou preparativním materiálem pro kapalinovou chromatografií na obrácených fázích Boňdepak C18/Porasil B (Water Associates, lne., Milford, Mass. 01 757). Kolona se eluuje směsí 55 % acetonitrilu a 45 % 0,05 M fosfátu amonného pH 3 (obj/obj). Objem rozpouštědel eluovaných mezi 1 360 ml a 1 700 ml se, podle detekce indexem lomu spojí.

Organické rozpouštědlo se^řodpaří ve vakuu a zbylý vodný roztok se extrahuje etylacetátem. Etylecetát se odpaří ve vakuu a získá se 120 mg sloučeniny uvedené v nadpisu, která krystaluje z koncentrovaného roztoku acetonitrilu. Získají se tak krystaly MSD 883 (sloučenina XI) t. t. 129 až 131 °C.

P ř í k 1 a d 21

Alternativní izolace sloučenin II a IV

Surová amonná sůl, izolovaná postupem podle příkladu 7 z 500 litrové fermentace se laktonizuje rozpuštěním Ve'vodě, okyselené na pH 3 koncentrovanou kyselinou chlorovodíkovou, extrakcí do toluenů a' dvouhodinovým zahříváním k varu, postupem podle příkladu 20-B-2. Zahuštěním ve vakuu na malý objem se získají krystaly surové sloučeniny I s malým množstvím sloučeniny II.’ Tyto se odfiltrují a vysuší.

Materiály 'i '12 takových násad se smísí a rekrystalují z 46 kg etanolu, odfiltrují se á promyjí etanolem. Spojené matečné louhy se promyjí a zahustí ve vakuu na asi 13,6 litrů a odfiltruje se druhý podíl krystalů sloučeniny I. Matečné louhy z této filtrace se zpracují následujícím způsobem:

Asi 0,5 1«těchto matečných louhů se připraví pro chromatografii na obrácených fázích zahuštěním ve vakuu, aby se odstranil etanol, rozpuštěním v acetonitrilu a odfiltrováním stop nerozpustných podílů. Roztok v 100 ml„acetonitrilu se chromatografuje na sloupci 200 ml násady C-18 fáze a sloupec se promyje dalším litrem acetonitrilu. Spojené .filtráty se zahustí a rozpustí.v celkem 360 ml rozpouštědla (60 dílů acetonitrilu a 40 dílů vody, obj/obj) a stopy nerozpustných podílů se odfiltrují. Podle analýzy alikvotního podílu je obsah pevných podílů 15j3 g.

Násada 160 ml této směsi se chromatografuje v systému Waters Prep 500 použitím dvou 5 x 30 cm sloupců s C18 obrácenou fází (Waters Assoc. vázaný oktadecylový povlak na silikagelu) směsí acetonitrilu-voda (60/40 obj/obj), jakožto elučním činidlem, rychlostí Ί30 ml/min při teplotě místnosti a detekcí indexem lomu. Nečistoty eluované v prvních 3’900 ml se vylejí. Sloučenina I se získá z frakci eluovaných mezi 3 900 až 5 850 ml. Frakce získané z 5 850 ml až 6 500 ml se ponechají pro opětovanou chromatografii. Vyčištěná sloučenina II se získá z posledního pásu eluovaného mezi 6 500 ml a 8 450 ml. Jímané frakce po zahuštění poskytnou 3 g olejovitého odparku.

Jedna polovina (asi 1,5 g) tohoto koncentrátu sloučeniny II se připraví pro ohromatografii ve formě amonné soli sloučeniny IV připravením roztoku v 6 ml b°rkého metanolu a za míchání se ihne'd přidá dostatečné množství ,N hydroxidu sodného tak, aby se pH udržovalo mezi 10,5 až ,1. Pro tento účel je zapotřebí 3,5 až 3,8 ml roztoku hydroxidu sodného. Po půlhodinovém stání se filtrací z roztoku odstraní stopy nerozpustných podílů a filtrát se pumpuje n^kolonu (2,54 x 86 cm) 200 až 325 mesh XAD-2 pryskyřice (styren-divinylbenzenový kopolymer) a eluce se provede směsí 23 % acetonitrilu a 77 % 0,1N hydroxidu amonného rychlostí 2 ml/min při 40 °C. Jímají se 20 ml frakce. Frakce 1 až 44 obsahují nečistoty a pás soli sloučeniny III. Frakce 45 až 61 se spojí, zahustí ve vakuu na malý vodný odparek, který mrazovou sublimací poskytne amonnou sůl sloučeniny IV (0,72 g).

Příklad 22

Soli sloučeniny IV

K roztoku 40 g produktu z příkladu 20 v 2 ml etanolu se přidá 1 ml vodného roztoku

NaOH (10^-4 mol, 1 ekvivalent). Po jedné hodině při teplotě místnosti se směs odpaří ve vakuu k suchu a získá se sodné sůl sloučeniny IV.

Stejným způsobem se připraví draselná sůl použitím jednoho ekvivalentu draselné soli β vápenatá sůl použitím jedná pploviny ekvivalentu CaO.

Použitím postupů popisných v příkladech 9 až 12 a 14, ale náhradou amonné soli sloučeniny III v každém případé za ekvivalentní množství amonné soli sloučeniny IV vznikají odpovídající soli sloučeniny IV s L-lysinem, L-argininem, L-ornithinem, N-metylglukaminera a vápníkem.

Použitím postupů popsaných v příkladech 13, 15 a 16,. ale záměnou sloučeniny I v každém případě za ekvivalentní množství sloučeniny II vznikají odpovídající etylendiamoniová, tetrametylamoniová a amonná sůl sloučeniny IV.

P ř í k 1 a d 23

Příprava hydroxykyseliny, sloučeniny IV

Sodná sůl připravená v příkladu 22 se znovu rozpustí v 2 ml směsi etanol-voda (1:1) a přidá se 10 ml 0,1N kyseliny chlorovodíkové, která uvolní hydroxykyselinu a která se extrahuje etylacetátem, Rozpouštědlo se promyje vodou, vysuší a odpaří ve vakuu při teplotě nepřevyšující 30 °C. Hydroxykyselina stáním pomalu přechází na lakton.

Příklad 24

Příprava hydroxykyseliny, sloučeniny IV

221 mg amonné solí sloučeniny IV se rozpustí v 4,5 ml 65% etanolu. Ochladí se ledem, okyselí asi 0,5 ml tM kyseliny chlorovodíkové, na pH 3 a odpaří se při nízké teplotě na rotační odparce na objem asi 2 ml. Přidají se další 2 ml vody a extrakce se provede 2 x 3 ml etylacetátu. Extrakt se promyje 1 ml vody, přičemž veškeré roztoky se udržují studené v lázni s ledem. Extrakt se vysuší síranem hořečnatým a odpařením ve vakuu se získá hydroxykyselina ve formě bezbarvého oleje.

'•^C-NMR spektrum v CDCl^ vykazuje chemické posuny pro prvých šest atomů uhlíku části molekuly, obsahující hydroxykyselinu, jak jsou uvedeny v tebulce. Stáním tato hydroxykyselina pomalu přechází na lakton.

Tabulka

hydroxykys elina sloučenina IV

HO.

175,0

COOH

OH

42,2, 41,7

68,8

72,5

35,0

Spektrum zbylé části molekuly je cyklizací pouze mírně změněné.

Příklad 25

Etylester sloučeniny IV

Použitím postupu popsaného v příkladů 19, ale záměnou za 1,24 mmol sloučeniny 1 za ekvi molární množství sloučeniny XI z příkladu 20 se získá etylester sloučeniny IV.

Obdobným způsobem se připraví metyl-, propyl-, butyl-, isobutyl-, t-butyl-, amyl-, isoamyl-, 2-dimetylaminoetyl-, benzyl-, fenetyl- a 2-acetamidoetylestery.

Příklad 26

A. In vitro inhibice HMG koenzymu A reduktázy

Použije se mírně modifikovaná metoda popsaná v práci Beg a j. FEBS Letters 80, 123 (1977). Inkubace enzymu s inhibitorem se provádí 5 minut před započetím reakce se substrátem. S účinnými inhibitory jako jsou nové sloučeniny podle vynálezu neposkytoval standardní postup, prováděný pouhým přidáváním enzymu ke směsi inhibitoru a substrátu, lineární kinetiky.

Použitím modifikovaného postupu sodná sůl sloučeniny IV poskytuje IC^q při inhibici HMG-CoA reduktázy 2,7 x 10“^ M se srovnáním s 5,4 x 10^ Jí pro ML 236 B.

B. In vivo inhibice syntézy cholesterolu (sloučenina II)

Slcupinám samců krys Holzman se aplikuje buď 5% emulfor v roztoku chloridu sodného nebo testovaná sloučenina v emulforu. Po jedné hodině se intreperltoneálně aplikuje 80 yuCi ¹^C acetátu na kg. Po 50 minutách se krysy nechají vykrvácet a stanovením cholesterolu se stanoví syntéza steroidů.

Dávka, mg/kg % inhibice

0,15 38

0,6 51

1.2

Příklad 27

Srovnání sloučenin I, II a ML-236B jakožto inhibitorů syntézy steroidů v buněčné kultuře

Postup A. W. Albertse a j. J. Biol. Chem. 249 5241 (1974), měřící množství ¹ ^C biosyntézy steroidů z ¹^C-acetátu u myěích L-M-buněk v kultuře, se použije s mírnou modifikací. Testovaná sloučenina v 10 /j1 DMSO se přidá k jednovrstvé kultuře spolu s 5 A>Ci ¹ ^C‘-acetátu. Po 3 hodinách inkubace se buňky zmýdelní a '^C sterol se extrahuje a izoluje chromatografií na tenké vrstvě silikagelu použitím směsi petroléteru-dietyléteru a kyseliny octové (75:25:1). Oblast desky obsahující ¹⁴C steroidní se identifikuje stáním s I, < A t a obsah *C se stanoví kapalnou scintilaci.

Použitím modifikovaného postupu sloučenina II poskytuje IC^q při inhibici HMG-CoA reduktázy při 17 nM ve srovnání s 22 nM pro sloučeninu I a 46 nM pro ML-236B.

Claims (5)

1. Způsob přípravy směsi hypocholesteremických sloučenin obsahující sloučeniny strukturních vzorců 1, II, III a IV vyznačený tím, že se živné médium obsahující asimilovatelné zdroje uhlíku, dusíku a živné anorganické soli inkubuje při 20 až 37 °C a pH 6,0 až 8,0 s mikroorganismy rodu Aspergillus terreus uloženými v American Type Culture Collection pod čísly 20541 nebo 20542 a produkty se izolují.

2. Způsob přípravy směsi hypocholesteremických sloučenin obsahující sloučeniny strukturních vzorců I a III podle bodu 1, vyznačený tím, že se živné médium inkubuje mikroorganismy rodu Aspergillus terreus, uloženými v American Type Culture Collection pod čísly 20541 nebo 20542 a produkty se izolují.

3. Způsob podle bodu 2, vyznačený tím, že se izolace provádí extrakcí fermentační směsi rozpouštědlem a následující chromatografií.

4. Způsob přípravy směsi hypocholesteremických sloučenin obsahující sloučeniny strukturních vzorců II a IV (IV) podle bodu 1, vyznačený tím, že se inkubuje živné médium mikroorganismy rodu Aspergillus terreus, uloženými v American Type Culture Collection pod čísly 20541 nebo 20542 a produkty se izolují.

5. Způsob podle bodu 4, vyznačený tím, že izolace se provádí extrakcí fermentační směsi rozpouštědlem a následující chromatografií.