CS221919B2 - Způsob přípravy směsi hypocholesterolemický sloučenin - Google Patents
Způsob přípravy směsi hypocholesterolemický sloučenin Download PDFInfo
- Publication number
- CS221919B2 CS221919B2 CS415780A CS415780A CS221919B2 CS 221919 B2 CS221919 B2 CS 221919B2 CS 415780 A CS415780 A CS 415780A CS 415780 A CS415780 A CS 415780A CS 221919 B2 CS221919 B2 CS 221919B2
- Authority
- CS
- Czechoslovakia
- Prior art keywords
- compounds
- medium
- mixture
- compound
- iii
- Prior art date
Links
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 title claims description 67
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims description 48
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 22
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims description 13
- 230000000871 hypocholesterolemic effect Effects 0.000 title claims description 6
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims description 24
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims description 24
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 14
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 12
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims description 12
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims description 9
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 9
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 7
- 241001465318 Aspergillus terreus Species 0.000 claims description 5
- 238000000638 solvent extraction Methods 0.000 claims 2
- 229910017053 inorganic salt Inorganic materials 0.000 claims 1
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 86
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 62
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 59
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 48
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 48
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 45
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 38
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 36
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 33
- NLFBCYMMUAKCPC-KQQUZDAGSA-N ethyl (e)-3-[3-amino-2-cyano-1-[(e)-3-ethoxy-3-oxoprop-1-enyl]sulfanyl-3-oxoprop-1-enyl]sulfanylprop-2-enoate Chemical compound CCOC(=O)\C=C\SC(=C(C#N)C(N)=O)S\C=C\C(=O)OCC NLFBCYMMUAKCPC-KQQUZDAGSA-N 0.000 description 30
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 26
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 23
- 150000001261 hydroxy acids Chemical class 0.000 description 22
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 description 21
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 21
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 21
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 20
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- OBTZDIRUQWFRFZ-UHFFFAOYSA-N 2-(5-methylfuran-2-yl)-n-(4-methylphenyl)quinoline-4-carboxamide Chemical compound O1C(C)=CC=C1C1=CC(C(=O)NC=2C=CC(C)=CC=2)=C(C=CC=C2)C2=N1 OBTZDIRUQWFRFZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 15
- 239000000047 product Substances 0.000 description 15
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N ether Substances CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 13
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 13
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 13
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 11
- 239000000463 material Substances 0.000 description 11
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 11
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 11
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 10
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 9
- AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N L-Ornithine Chemical compound NCCC[C@H](N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 9
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 9
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 9
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 9
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 9
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 9
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 9
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 9
- 239000012065 filter cake Substances 0.000 description 9
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 description 8
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 8
- HTSGKJQDMSTCGS-UHFFFAOYSA-N 1,4-bis(4-chlorophenyl)-2-(4-methylphenyl)sulfonylbutane-1,4-dione Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1S(=O)(=O)C(C(=O)C=1C=CC(Cl)=CC=1)CC(=O)C1=CC=C(Cl)C=C1 HTSGKJQDMSTCGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 7
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 7
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 7
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 7
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 7
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 7
- 235000015113 tomato pastes and purées Nutrition 0.000 description 7
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 7
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 7
- 102000004286 Hydroxymethylglutaryl CoA Reductases Human genes 0.000 description 6
- 108090000895 Hydroxymethylglutaryl CoA Reductases Proteins 0.000 description 6
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 6
- MBBZMMPHUWSWHV-BDVNFPICSA-N N-methylglucamine Chemical compound CNC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO MBBZMMPHUWSWHV-BDVNFPICSA-N 0.000 description 6
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M Potassium hydroxide Chemical compound [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 6
- 150000002596 lactones Chemical class 0.000 description 6
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 6
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 6
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 6
- PIICEJLVQHRZGT-UHFFFAOYSA-N Ethylenediamine Chemical compound NCCN PIICEJLVQHRZGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N Orn-delta-NH2 Natural products NCCCC(N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 5
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 5
- 235000008504 concentrate Nutrition 0.000 description 5
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 5
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 5
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 5
- 229960003104 ornithine Drugs 0.000 description 5
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 5
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 5
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 5
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 5
- QEMXHQIAXOOASZ-UHFFFAOYSA-N tetramethylammonium Chemical compound C[N+](C)(C)C QEMXHQIAXOOASZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 4
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 4
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 4
- 238000004821 distillation Methods 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 4
- 235000013312 flour Nutrition 0.000 description 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 4
- 238000002329 infrared spectrum Methods 0.000 description 4
- PCZOHLXUXFIOCF-BXMDZJJMSA-N lovastatin Chemical compound C([C@H]1[C@@H](C)C=CC2=C[C@H](C)C[C@@H]([C@H]12)OC(=O)[C@@H](C)CC)C[C@@H]1C[C@@H](O)CC(=O)O1 PCZOHLXUXFIOCF-BXMDZJJMSA-N 0.000 description 4
- 125000000896 monocarboxylic acid group Chemical group 0.000 description 4
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 4
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 4
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 4
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 4
- 239000011877 solvent mixture Substances 0.000 description 4
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- CZDYPVPMEAXLPK-UHFFFAOYSA-N tetramethylsilane Chemical compound C[Si](C)(C)C CZDYPVPMEAXLPK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 244000285963 Kluyveromyces fragilis Species 0.000 description 3
- 235000014663 Kluyveromyces fragilis Nutrition 0.000 description 3
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N L-arginine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 3
- 229930064664 L-arginine Natural products 0.000 description 3
- 235000014852 L-arginine Nutrition 0.000 description 3
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 3
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- IFIFFBWHLKGTMO-SJIDJMGWSA-N [(1s,3s,4ar,7s,8s,8as)-8-[2-[(2r,4r)-4-hydroxy-6-oxooxan-2-yl]ethyl]-3,7-dimethyl-1,2,3,4,4a,7,8,8a-octahydronaphthalen-1-yl] (2s)-2-methylbutanoate Chemical compound C([C@H]1[C@@H](C)C=C[C@H]2C[C@H](C)C[C@@H]([C@H]12)OC(=O)[C@@H](C)CC)C[C@@H]1C[C@@H](O)CC(=O)O1 IFIFFBWHLKGTMO-SJIDJMGWSA-N 0.000 description 3
- 239000000908 ammonium hydroxide Substances 0.000 description 3
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 3
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 3
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 3
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 3
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 3
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 3
- 125000004494 ethyl ester group Chemical group 0.000 description 3
- -1 figs Substances 0.000 description 3
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 3
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 3
- AJLFOPYRIVGYMJ-INTXDZFKSA-N mevastatin Chemical compound C([C@H]1[C@@H](C)C=CC2=CCC[C@@H]([C@H]12)OC(=O)[C@@H](C)CC)C[C@@H]1C[C@@H](O)CC(=O)O1 AJLFOPYRIVGYMJ-INTXDZFKSA-N 0.000 description 3
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 3
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 3
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 3
- 229920000151 polyglycol Polymers 0.000 description 3
- 239000010695 polyglycol Substances 0.000 description 3
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 3
- XAEFZNCEHLXOMS-UHFFFAOYSA-M potassium benzoate Chemical compound [K+].[O-]C(=O)C1=CC=CC=C1 XAEFZNCEHLXOMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 238000001644 13C nuclear magnetic resonance spectroscopy Methods 0.000 description 2
- 239000004254 Ammonium phosphate Substances 0.000 description 2
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 2
- 241000228257 Aspergillus sp. Species 0.000 description 2
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 description 2
- VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L Calcium carbonate Chemical compound [Ca+2].[O-]C([O-])=O VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N D-xylopyranose Chemical compound O[C@@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N 0.000 description 2
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 2
- UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N Ornithine Natural products OC(=O)C(C)CCCN UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GLUUGHFHXGJENI-UHFFFAOYSA-N Piperazine Chemical compound C1CNCCN1 GLUUGHFHXGJENI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 2
- DKGAVHZHDRPRBM-UHFFFAOYSA-N Tert-Butanol Chemical compound CC(C)(C)O DKGAVHZHDRPRBM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-MICDWDOJSA-N Trichloro(2H)methane Chemical compound [2H]C(Cl)(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-MICDWDOJSA-N 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 2
- 125000005907 alkyl ester group Chemical group 0.000 description 2
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 229910000148 ammonium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019289 ammonium phosphates Nutrition 0.000 description 2
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000009697 arginine Nutrition 0.000 description 2
- 239000002585 base Substances 0.000 description 2
- 159000000007 calcium salts Chemical class 0.000 description 2
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 2
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000012230 colorless oil Substances 0.000 description 2
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 2
- 235000012343 cottonseed oil Nutrition 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N diammonium hydrogen phosphate Chemical compound [NH4+].[NH4+].OP([O-])([O-])=O MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 2
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 2
- IDGUHHHQCWSQLU-UHFFFAOYSA-N ethanol;hydrate Chemical compound O.CCO IDGUHHHQCWSQLU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002024 ethyl acetate extract Substances 0.000 description 2
- OAYLNYINCPYISS-UHFFFAOYSA-N ethyl acetate;hexane Chemical compound CCCCCC.CCOC(C)=O OAYLNYINCPYISS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 2
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 2
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 2
- ZXEKIIBDNHEJCQ-UHFFFAOYSA-N isobutanol Chemical compound CC(C)CO ZXEKIIBDNHEJCQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 description 2
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 2
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 2
- WPBNNNQJVZRUHP-UHFFFAOYSA-L manganese(2+);methyl n-[[2-(methoxycarbonylcarbamothioylamino)phenyl]carbamothioyl]carbamate;n-[2-(sulfidocarbothioylamino)ethyl]carbamodithioate Chemical compound [Mn+2].[S-]C(=S)NCCNC([S-])=S.COC(=O)NC(=S)NC1=CC=CC=C1NC(=S)NC(=O)OC WPBNNNQJVZRUHP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 2
- XELZGAJCZANUQH-UHFFFAOYSA-N methyl 1-acetylthieno[3,2-c]pyrazole-5-carboxylate Chemical compound CC(=O)N1N=CC2=C1C=C(C(=O)OC)S2 XELZGAJCZANUQH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012299 nitrogen atmosphere Substances 0.000 description 2
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 description 2
- 239000003208 petroleum Substances 0.000 description 2
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 2
- 239000013587 production medium Substances 0.000 description 2
- BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N propan-1-ol Chemical compound CCCO BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000425 proton nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000001448 refractive index detection Methods 0.000 description 2
- 238000007363 ring formation reaction Methods 0.000 description 2
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 2
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 235000012424 soybean oil Nutrition 0.000 description 2
- 239000003549 soybean oil Substances 0.000 description 2
- 229910001220 stainless steel Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000010935 stainless steel Substances 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- WPLOVIFNBMNBPD-ATHMIXSHSA-N subtilin Chemical compound CC1SCC(NC2=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C(C)CC)C(=O)NC(=C)C(=O)NC(CCCCN)C(O)=O)CSC(C)C2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C1NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C1NC(=O)C(=C/C)/NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)CNC(=O)C(NC(=O)C(NC(=O)C2NC(=O)CNC(=O)C3CCCN3C(=O)C(NC(=O)C3NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(=C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(CCCCN)NC(=O)C(N)CC=4C5=CC=CC=C5NC=4)CSC3)C(C)SC2)C(C)C)C(C)SC1)CC1=CC=CC=C1 WPLOVIFNBMNBPD-ATHMIXSHSA-N 0.000 description 2
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 2
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 2
- WGTYBPLFGIVFAS-UHFFFAOYSA-M tetramethylammonium hydroxide Chemical compound [OH-].C[N+](C)(C)C WGTYBPLFGIVFAS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- CABVTRNMFUVUDM-VRHQGPGLSA-N (3S)-3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)C[C@@](O)(CC(O)=O)C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 CABVTRNMFUVUDM-VRHQGPGLSA-N 0.000 description 1
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003006 2-dimethylaminoethyl group Chemical group [H]C([H])([H])N(C([H])([H])[H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- WRMNZCZEMHIOCP-UHFFFAOYSA-N 2-phenylethanol Chemical compound OCCC1=CC=CC=C1 WRMNZCZEMHIOCP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000094 2-phenylethyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- FZLSDZZNPXXBBB-KDURUIRLSA-N 5-chloro-N-[3-cyclopropyl-5-[[(3R,5S)-3,5-dimethylpiperazin-1-yl]methyl]phenyl]-4-(6-methyl-1H-indol-3-yl)pyrimidin-2-amine Chemical compound C[C@H]1CN(Cc2cc(Nc3ncc(Cl)c(n3)-c3c[nH]c4cc(C)ccc34)cc(c2)C2CC2)C[C@@H](C)N1 FZLSDZZNPXXBBB-KDURUIRLSA-N 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 240000002470 Amphicarpaea bracteata Species 0.000 description 1
- 235000000073 Amphicarpaea bracteata Nutrition 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000228245 Aspergillus niger Species 0.000 description 1
- 244000075850 Avena orientalis Species 0.000 description 1
- 235000007319 Avena orientalis Nutrition 0.000 description 1
- ZOXJGFHDIHLPTG-UHFFFAOYSA-N Boron Chemical compound [B] ZOXJGFHDIHLPTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241001207508 Cladosporium sp. Species 0.000 description 1
- 241000228437 Cochliobolus Species 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000371644 Curvularia ravenelii Species 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- 239000004375 Dextrin Substances 0.000 description 1
- 229920001353 Dextrin Polymers 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 241000132179 Eurotium medium Species 0.000 description 1
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 208000035150 Hypercholesterolemia Diseases 0.000 description 1
- 208000031226 Hyperlipidaemia Diseases 0.000 description 1
- 235000019766 L-Lysine Nutrition 0.000 description 1
- 125000002059 L-arginyl group Chemical class O=C([*])[C@](N([H])[H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])N([H])C(=N[H])N([H])[H] 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 150000008545 L-lysines Chemical class 0.000 description 1
- WHXSMMKQMYFTQS-UHFFFAOYSA-N Lithium Chemical compound [Li] WHXSMMKQMYFTQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 238000003820 Medium-pressure liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- ZOKXTWBITQBERF-UHFFFAOYSA-N Molybdenum Chemical compound [Mo] ZOKXTWBITQBERF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AMQJEAYHLZJPGS-UHFFFAOYSA-N N-Pentanol Chemical compound CCCCCO AMQJEAYHLZJPGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PVCJKHHOXFKFRP-UHFFFAOYSA-N N-acetylethanolamine Chemical compound CC(=O)NCCO PVCJKHHOXFKFRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UEEJHVSXFDXPFK-UHFFFAOYSA-N N-dimethylaminoethanol Chemical compound CN(C)CCO UEEJHVSXFDXPFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 1
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 1
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 241000228143 Penicillium Species 0.000 description 1
- 241000228168 Penicillium sp. Species 0.000 description 1
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 1
- 235000019764 Soybean Meal Nutrition 0.000 description 1
- 229940122572 Steroid synthesis inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 229930182558 Sterol Natural products 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000002441 X-ray diffraction Methods 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000738 acetamido group Chemical group [H]C([H])([H])C(=O)N([H])[*] 0.000 description 1
- 150000007960 acetonitrile Chemical class 0.000 description 1
- PBCJIPOGFJYBJE-UHFFFAOYSA-N acetonitrile;hydrate Chemical compound O.CC#N PBCJIPOGFJYBJE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 1
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000000843 anti-fungal effect Effects 0.000 description 1
- 239000003529 anticholesteremic agent Substances 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003121 arginine Drugs 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000015278 beef Nutrition 0.000 description 1
- UPABQMWFWCMOFV-UHFFFAOYSA-N benethamine Chemical compound C=1C=CC=CC=1CNCCC1=CC=CC=C1 UPABQMWFWCMOFV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001797 benzyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000008687 biosynthesis inhibition Effects 0.000 description 1
- 230000002051 biphasic effect Effects 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 229910052796 boron Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000000484 butyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 229910000019 calcium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 1
- 238000001460 carbon-13 nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 1
- 150000001735 carboxylic acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 1
- 239000003610 charcoal Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- WEQAYVWKMWHEJO-UHFFFAOYSA-N chlormezanone Chemical compound O=S1(=O)CCC(=O)N(C)C1C1=CC=C(Cl)C=C1 WEQAYVWKMWHEJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VDANGULDQQJODZ-UHFFFAOYSA-N chloroprocaine Chemical compound CCN(CC)CCOC(=O)C1=CC=C(N)C=C1Cl VDANGULDQQJODZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002023 chloroprocaine Drugs 0.000 description 1
- OEYIOHPDSNJKLS-UHFFFAOYSA-N choline Chemical compound C[N+](C)(C)CCO OEYIOHPDSNJKLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001231 choline Drugs 0.000 description 1
- 150000001860 citric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 239000010941 cobalt Substances 0.000 description 1
- 229910017052 cobalt Inorganic materials 0.000 description 1
- GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N cobalt atom Chemical compound [Co] GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000012716 cod liver oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000003026 cod liver oil Substances 0.000 description 1
- 238000005056 compaction Methods 0.000 description 1
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- 239000002274 desiccant Substances 0.000 description 1
- 235000019425 dextrin Nutrition 0.000 description 1
- WBKFWQBXFREOFH-UHFFFAOYSA-N dichloromethane;ethyl acetate Chemical compound ClCCl.CCOC(C)=O WBKFWQBXFREOFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZBCBWPMODOFKDW-UHFFFAOYSA-N diethanolamine Chemical compound OCCNCCO ZBCBWPMODOFKDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940043237 diethanolamine Drugs 0.000 description 1
- HPNMFZURTQLUMO-UHFFFAOYSA-N diethylamine Chemical compound CCNCC HPNMFZURTQLUMO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 201000005577 familial hyperlipidemia Diseases 0.000 description 1
- 239000012526 feed medium Substances 0.000 description 1
- 239000012458 free base Substances 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 239000000417 fungicide Substances 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 1
- 239000002198 insoluble material Substances 0.000 description 1
- 238000009413 insulation Methods 0.000 description 1
- 125000000959 isobutyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 125000001972 isopentyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 238000007273 lactonization reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000005567 liquid scintillation counting Methods 0.000 description 1
- 229910052744 lithium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000007937 lozenge Substances 0.000 description 1
- 229960003646 lysine Drugs 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 235000013379 molasses Nutrition 0.000 description 1
- 229910052750 molybdenum Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011733 molybdenum Substances 0.000 description 1
- 238000004264 monolayer culture Methods 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 125000000740 n-pentyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 238000000655 nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 230000020477 pH reduction Effects 0.000 description 1
- WVDDGKGOMKODPV-ZQBYOMGUSA-N phenyl(114C)methanol Chemical compound O[14CH2]C1=CC=CC=C1 WVDDGKGOMKODPV-ZQBYOMGUSA-N 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 235000020004 porter Nutrition 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000004262 preparative liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- MFDFERRIHVXMIY-UHFFFAOYSA-N procaine Chemical compound CCN(CC)CCOC(=O)C1=CC=C(N)C=C1 MFDFERRIHVXMIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004919 procaine Drugs 0.000 description 1
- 125000001436 propyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 238000005086 pumping Methods 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 238000001953 recrystallisation Methods 0.000 description 1
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 1
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 description 1
- 238000010898 silica gel chromatography Methods 0.000 description 1
- PPASLZSBLFJQEF-RKJRWTFHSA-M sodium ascorbate Substances [Na+].OC[C@@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1[O-] PPASLZSBLFJQEF-RKJRWTFHSA-M 0.000 description 1
- 235000010378 sodium ascorbate Nutrition 0.000 description 1
- 229960005055 sodium ascorbate Drugs 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- PPASLZSBLFJQEF-RXSVEWSESA-M sodium-L-ascorbate Chemical compound [Na+].OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1[O-] PPASLZSBLFJQEF-RXSVEWSESA-M 0.000 description 1
- 239000004455 soybean meal Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 150000003432 sterols Chemical class 0.000 description 1
- 235000003702 sterols Nutrition 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 1
- 125000000999 tert-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000003613 toluenes Chemical class 0.000 description 1
- 231100000041 toxicology testing Toxicity 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000000825 ultraviolet detection Methods 0.000 description 1
- 238000002211 ultraviolet spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000005292 vacuum distillation Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
Předložený vynález se týká hypocholesteremických produktů kultivace plísní druhu Aspergillus. Přesněji se týká sloučenin vzorců I až IV
(I) (II) (III)
HO
COOH
OH ,ch3
HO
COOH
OH ,ch3 (IV) jakož i jejich farmaceuticky vhodných solí a nižžích alkylesterů nebo fenyl-, dimetylaminonebo ecetylaminosubstituovených alkylesterů karboxylových kyselin. Předložený vynález se těká týká způsobu kultivace plísní a izolace sloučenin výše uvedených struktur z prostředí. Nové sloučeniny mají vynikající vlastnosti při inhibici biosyntézy cholesterolu a jsou použitelné proti hypercholesteremii a hyperlipemii.
Vzhledem k nové vazbě mezi vysokou hladinou cholesterolu a atherosklerózou bylo vynaloženo značné úsilí pro nelezení způsobů, které snižují hladinu cholesterolu v těle savců'.. Jedním z těchto způsobů je inhibice syntézy cholesterolu v těle savce.
Nedávno Endo a j. popsali v USA patentech č. 4 049 495 a 3 983 140 fermentační produkt získaný kultivací mikroorganismu rodu Penicillium a jeho izolaci z média.
Nazvali jej ML 236B a stanovili jeho strukturu spolu se dvěma příbuznými sloučeninami 236A a 236 C. Jejich struktura pod názvem compaction byla také stanovena v práci A. G. Brown, T. C. Smale, T. J. King, J. Chem. Soc. (Perkin I) 1165 (1975). Bylo nalezeno, že tato sloučenina je inhibitorem in vivo biosyntézy cholesterolu.
Nyní bylo nalezeno, že zcela neočekávaně kultivací velmi odliěného kmenu než jaký použil Endo a to plísně rodu Aspergillus, vznikají nové slouěeniny, které jsou rovněž velmi účinnými inhibitory biosyntézy cholesterolu u savců. Nyní bylo nalezeno, že tyto sloučeniny zahrnují v podstatě nové sloučeniny I, II, III a IV výěe uvedených struktur provázené pouze stopami jiných sloučenin. Tyto nové sloučeniny jsou účinnějěími inhibitory biosyntézy cholesterolu in vivo než sloučenina ML 236B popsaná Endem.
Farmaceuticky vhodné soli podle vynálezu zahrnují soli s kationty odvozenými od sodíku, draslíku, hliníku, vápníku, lithia, hořčíku, zinku, amoniaku, etylendiaminu, N-metylglukaminu, lysinu, argininu, ornithinu, cholinu, Ν,Ν'-dibenzyletylendiawinu, chlorprokainu, dietanolaminu, prokainu, N-benzylfenetylaminu, 1-p-chlorbenzyl-2-pyrrolidin-1 '-yl-metylbenzimidazolu, dietylaminu, piperazinu, tris(hydroxymetyl)aminometanu a tetrametylamonia.
Sloučeniny podle vynálezu jsou použitelné jako antihypercholesteremická činidla pro léčení atherosklerozy, hyperlipemie a podobných onemocnění lidí. Mohou se aplikovat orálně nebo parenterálně ve formě kapslí, tablet, injikovatelných preparátů apod. Obvykle je žádoucí použití orální aplikace. Dávky mohou být různé a závisejí na věku, vážnosti onemocnění, tělesné hmotnosti a jiných stavech pacientů. Denní dávka pro dospělé se pohybuje v rozmezí od asi 2 mg do 2 000 mg (s výhodou 2 až 100 mg), které se může aplikovat ve dvou až čtyřech rozdělených dávkách. V případě potřeby se mohou podávat i vyšší dávky.
Sloučeniny podle vynálezu mají také použitelnou protiplísnovou aktivitu. Například se mohou použít pro kontrolu kmenů Penicillium sp., Aspergillus niger, Cladosporium sp., Cochliobolus miyabeorus a Helminthosporium cynodnotis. Pro takové použití se mohou mísit s vhodnými činidly používanými pro přípravu prostředků jako jsou prášky, emulgační činidla nebo rozpouštědla, jako je vodný etanol a pak se stříkají nebo poprašujl na rostliny, které mají být oěetřeny.
Předmětem předloženého vynálezu je způsob přípravy směsi hypocholesteremických slouče nin obsahujících sloučeniny strukturních vzorců I, II, III a IV
(I) (II) (III)
HCkz-.
| COOH (IV)
CH vyznačený tím, že se živné médium obsahující asimilovatelné zdroje uhlíku, dusíku a živné anorganické soli inkubuje při 20 až 37 °C a pH 6,0 až 8,0 s mikroorganismy rodu Aspergillus terreus uloženými v American Type Culture Collection pod čísly 20541 nebo 20542 a produkty se Izolují.
Na základě toxonomických studií tento druh Aspergillus byl izolován a identifikován jako dosud nepopsaný mikroorganismus a byl označen jako MF-4833 ve sbírce kultur Merck and Co., Inc., Rahway, New Jersey a kultura tohoto typu byla umístěna pro trvalé uchováni ve sbírce American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockwille, Maryland 20852, a označen číslem ATCC 20541. Jiný vzorek obdobného organismu označený MK-4845 ve sbírce kultur firmy Merck byl rovněž umístěn pro trvalé uchování pod číslem ATCC 20542. Tento poslední organismus poskytuje lepší výtěžky. I když použití těchto zde popsaných mikroorganismů je popsáno ve spojitosti s postupem podle vynálezu1, jsou ostatní organismy rodu Aspergillus včetně mutantů rovněž tak schopné produkce nových sloučenin a mohou se použít při postupu podle vynálezu.
Morfologické charakteristiky mikroorganismů MF-4833 a MF-4845 odpovídají rodu Aspergillus. Použitím kritérií uvedených v standardní literatuře Manual of the Aspergilli, Charles Thom and Kenneth B. Kasper, publikované Williams nad Wilkins Company, Baltimore, líd., 1945, a srovnáním se známými druhy bylo nalezeno, že oba kmeny jsou Aspergillus terreus.
Kultivace těchto organismů pro produkci nových sloučenin se provádí ve vodném médiu jako jsou média používaná pro produkci jiných fermentačních produktů. Tato média obsahují zdroj uhlíku, dusíku a anorganické soli asimilovatelné mikroorganismem.
Obecně se mohou použít cukry, jako je například glukóza, fruktóza, maltóza, sacharóza, xylóza, manitol apod., a škroby, jako jsou škroby z obilí, například ovsa, rýže, kukuřice a to buS samostatně nebo v kombinaci s jinými zdroji asimilovatelného uhlíku. Přesné množství zdroje uhlíku nebo zdrojů používaných v médiu závisí částečně na ostatních složkách média, obecně množství sacharidů se obvykle pohybuje mezi asi 1 % a 6 % hmotnosti média.
Tyto zdroje uhlíku se mohou použít individuálně nebo několik z nich se může v médiu mísit. Obecně se může použít mnohých proteinových materiálů, jakožto zdrojů dusíku. Vhodné zdroje dusíku zahrnují například hydrolyzáty kvasnic, primární kvasnice, sojová mouka, mouka z bavlněných semen, hydrolyzáty kaseinu, kukuřičné výluhy, destilační zbytky nebo tomatová pasta apod. Zdroje dusíku se mohou použít samostatně nebo v kombinaci a jejich množství se pohybuje od asi 0,2 % do 6 % hmot. vodného média.
Ze živných anorganických solí, které se mohou přidávat do kultivačního média jsou vhodné soli schopné poskytovat ionty sodíku, draslíku, vápníku a dále ionty amonné, fosfátové, sulfátové, chloridové, kerbonátové apod. Rovněž tak se zahrnují stopové kovy, jako je kobalt, mangan, železo a hořčík.
Je třeba zdůraznit, že média popsaná v příkladech jsou pouze příklady z celé řady použitelných médií a předložený vynález žádným způsobem neomezují. Jmenovitě zdroje uhlíku používané v živném médiu pro přípravu nových sloučenin podle vynálezu jsou dextróza, dextrin, ovesná mouka, melasa, citráty, sojový olej, glycerol, extrakt ze sladu, olej z tresčích jater, škrob, etanol, fíky, askorbát sodný a olej z vepřového sádla. Jako zdroje dusíku se používají peptonisované mléko, autolysované kvasnice, ribonukleové kyseliny, droždí, tomatová pasta, kasein, primární droždí, rozemleté arašídy, destilační zbytky, kukuřičné výluhy, sojová moučka, kukuřičná moučka, NZ amin, hovězí extrakt, asparagin, moučka z bavlníkových semen a síran amonný. Hlavními iontovými složkami jsou uhličitan vápenatý, KHgPO^, KgSO^. 7H2O a NaCl a malé množství CaClg . 6H2O a stopy železa, manganu, molybdenu, boru a mědi.
Fermentace se provádí při teplotě v rozmezí 20 až 37 °C, avěak pro optimální výsledky je výhodné provádět fermentaci při teplotě od 22 do 30 °C. Hodnota pH živného média vhodná pro růst kultury Aspergillus a pro produkci nových slouSenin se pohybuje v rozmezí od asi 6,0 až do 8,0.
I když nové sloučeniny se produkují jak povrchovou, tak submersní kulturou, je výhodné, jestliže se fermentace provádí v submersním stavu; Fermentace v malém se s výhodou provádí naočkováním vhodného živného média a provedením fermentace při konstantní teplotě asi 28 °C několik dnů.
Fermentace se započne ve sterilní bance s médiem přes jeden nebo více očkovacích stadií. živné médium pro očkovací stupně může obsahovat kterékoli vhodné kombinace zdrojů dusíku a uhlíku. Očkovací baňky se třepou dve dny při konstantní teplotě při 28 °C až je růst dostatečný a jeho část se použije pro naočkování druhého očkovacího stupně nebo produkčního média. Baňky s očkovacími mezistupni, jestliže se použijí, se Inkubují stejným způsobem, to je čéet obsahu baněk z posledního očkovacího stadia se použije pro naočkování produkčního média. Naočkované baňky se třepou několik dní při konstantní teplotě a ke konci inkubační doby se obsah baněk centrifuguje nebo filtruje.
Pro produkci ve velkém je výhodné provádět fermentaci ve vhodných tancích s míchadlem a zařízením pro provzduěňování fermentačního média. Podle této metody se živné médium zpracovává v tanku a sterilizuje zahříváním na teploty do asi 120 °C. Po ochlazení se sterilní médium naočkuje dříve vypěstovanou očkovací kulturou a fermentace se provádí po určitou dobu, například 3 až 5 dnů za míchání a/nebo provzduěňování živného média a udržování teploty na asi 28 °C. Tato metoda produkce nových sloučenin je zejména vhodná pro přípravu velkých množství.
Sloučeniny se s výhodou izolují z fermentačního média vé formě laktonů I a II. Alternativně se mohou izolovat ve formě solí sloučenin III a IV.
Sloučeniny X a II se mohou hydrolyzovat bázemi jako je NaOH a získají se tak sodné soli sloučenin III a IV. Použití bází s jinými farmaceuticky vhodnými kationty poskytuje soli těchto kationtů. Opatrným okyselením solí se získají hydroxykyseliny III a IV. Hydroxykyseliny III a IV se převedou na sloučeniny I a II v kyselém pH. Reakcí sloučenin I a II za kyselých nebo bazických podmínek s metanolem, etanolem, propanolem nebo butanolem nebo s fenyl-, dinetylamino- nebo acetylamino-alkanoly se získají odpovídající estery sloučenin III a IV, které rovněž jsou součástí předloženého vynálezu.
Sloučeniny III a IV a zejména III se mohou s výhodou izolovat bez chromatografie ve formě amonných solí. Tato izolace je výhodnější než chromatografie pro výrobu ve velkém.
Dále jsou soli III a IV aktivnější než sloučeniny I a II in vitro při inhibici biosyntézy cholesterolu a jako fungicidní Činidle. Ve skutečnosti hydroxykyseliny (a jejich soli) jsou aktivními formami. Tyto soli jsou jednou ze zejména vhodných dávkových forem. Kromě amonných solí jsou výhodnými solemi tetrametylamoniová sůl a soli s etylendiaminem, sodíkem, draslíkem, vápníkem, N-metylglukaminem, lysinem, argininem a ornithinem.
Fyzikálně chemické vlastnosti sloučeniny vzorce I (MSD-803) jsou následující:
1. Teplota tání 170 až 171 °C
2. Molekulární hmotnost (hmotové spektrum)
404
3. Vzorec (nalezeno hmotovou spektrometrií vypočteno)
404,2555
404,2563
221919 6
4. UV spektrum (v acetonitrilu): maxima
230.5 nm s E% 505,7
237.5 nm s E* 576,6 246 nm s E96 395,2
5. 13C NMR chemické posuny. Spektrum bylo snímáno v CDClj roztoku (20,1 mg) v 0,35 ml) Chemické posuny jsou uvedeny vzhledem k vnitřnímu standardu, tetrametylsilanu jako nulovému ppm. Za experimentálních podmínek rozpouštědlo, (CDClj) se projevuje signá lem při 70,0 ppm. V souhlase s hmotovým spektrem byly nalezeny spektrální údaje pro 24 uhlíků a jejich chemické posuny jsou následující:
11,5, 13,6, 16,0, 22,6, 24,1, 26,6, 27,2, 30,5, 32,5, 32,8, 35,9, 36,4, 37,1, 38,4, 41,3, 62,4, 67,8, 76,4, 128,4, 129,7, 131,7, 133,2, 170,8 a 177,2 ppm.
6. ’h NMR spektrum
Spektrum bylo snímáno v CDClj roztoku a chemické posuny jsou uvedeny na Obrázku 1 v ppm vztaženým na vnitřní tetrametylsilanový standard při nulovém ppm.
7. Infračervené spektrum
Infračervené spektrum se snímá v KBr mikropastilkách. Je uvedeno na obrázku 2.
8. Optická rotace
Specifická optická rotace [a] - 320,7°, byla stanovena v roztoku 5,30 mg/ml
CHjCN. Tato hodnota byla získána při měření vlnové délky sodíkové D čáry.
Na základě těchto a ostatních dat bylo možno uvést, že sloučenina se značným stupněm jistoty odpovídá stereochemické struktuře
Odpovídající hydroxykyselina III má strukturu:
Absolutní konfigurace center asymetrie v těchto molekulách byla stanovena difrakcí X-paprsky.
Fyzikálně chemické vlastnosti sloučeniny II (MSD-883) jsou shrnuty následovně: 1. Teplota tání 129 až 131 °C
2, Molekulární hmotnost 406
3. Vzorec °24Η38θ5 (nelezeno hmotovou spektrometrií) 406,2706 vypočteno 406,2719
4. 'h NMR spektrum
Spektrum bylo snímáno v CDCl^ roztoku a chemické posuny jsou uvedená v obrázku 3 v ppm relativně k vnitřnímu tetrametylsilanovámu standardu při nulovém ppm.
5. Infračervené spektrum
Infračervené spektrum bylo stanoveno v KBr pastilkách. Je uvedené v obrázku 4,
6. Optická rotace
Specifické optická rotace [a] = 148,6°, byla stanovena v roztoku 5,23 mg/ml CH^CN.
Tato hodnota byla získána měřením při vlnové délce sodíkové D-čáry.
7. ’3C NMR chemické posuny v CDClg
11,8, 14,9, 16,5 , 21,1, 23,1, 26,7(20 , 30,9 , 31,3 , 33,0 , 35,7 , 35,9, 37,4, 38,5, 38,6, 41,9(20, 62,3, 70,1, 76,5, 131,0, 132,6, 171,2, 176,7.
Na základě těchto a ostatních údajů se předpokládá, že struktura produktu se značným stupněm jistoty má chemickou strukturu
Odpovídající hydroxykyselina, sloučenina IV má pak strukturu:
Předložený vynález je možno znázornit v následujících příkladech.
Příklad 1
Příprava sloučenin I a III
A. Ferměntace
Zkumavka s lyofilizovanou kulturou MF-4833 se za aseptických podmínek otevře a obsah se suspenduje v 250 ml Erlenmayerově bance bez překážek (očkovací baňka) obsahující asi 20 ml média A. Médium A má následující složení:
i
| Médium A: | ||
| kukuřičné výluhy | 10 g | |
| tomatová pasta | 80 g | |
| ovesná mouka | 20 g | |
| glukóza | 20 g | |
| stopové prvky, směs č. 2 | 20 g | |
| destilovaná voda 1 | 000 ml | |
| pH 6,8 přidáním NaOH | ||
| Stopové prvky, směs č. 2 | ||
| FeSO4 . 7H2O | 1 000 | mg |
| MnS04 . 4H2O | 1 000 | mg |
| CuClg . 2H2O | 25 | mg |
| CaCl2 . 2HgO | 100 | mg |
| h3bo3 | 56 | mg |
| (NH4)6Mo7024 . 4H2O | 19 | mg |
| ZnS04 . 7H2O | 200 | mg |
| destilovaná deionisované voda | 1 000 | mg |
Naočkovaná baňka se inkubuje 48 hodin při 28 °C na třepačce s 220 otáčkami za minutu (posun 5,1 cm). Dvě 2 litrové Erlenmayerovy baňky bez přepážek obsahující 500 ml média B se pak naočkují po 10 ml ne baňku vyrostlé kultury z očkovací baňky. Médium B má následující složení:
Médium B tomatová pasta 20 g primární kvasnice 10 g
CPC škrob 20 g
CoCl2 . ĎHgO 5 mg destilovaná voda 1 000 ml pH 7,2 až 7,4 přidáním NaOH
Tyto dvě naočkované baňky se inkubují 96 hodin při 28 °C. Jedna baňka se inkubuje bez míchání. Druhá beňka se inkubuje na třepačce s 150 otáčkami za minutu, (posun 5,1 cm). Po 46 hodinách se obsah každé baňky zvlášl zpracuje a produkt se izoluje.
B. Izolace sloučeniny I
Inkubované médium se centrifuguje 20 až 30 minut. Pevné podíly se extrahují. Čirá kapalina <pH 6 až 8) se umístí do 950 ml baňky a přidá se 150 ml ZAD-2 pryskyřice. Použitím automatického extraktoru , pracujícího podle předem nastaveného programu, se směs míchá 2 hodiny. Kapalina se pak odpustí, pryskyřice se dvakrát promyje 200 ml deionisované vody a promývací roztok se vyleje. Pak se přidá 300 ml směsi rozpouštědel: isopropanol, etylacetát dichlormetan 25:45:30. Směs se míchá dvě hodiny. Suspenze rozpouětědlo-pryskyřice se odfiltruje na Buchnerově nálevce nebo na nálevce se sintrovaným sklem a pryskyřice se vyleje. Pevné podíly z médie se míchají s 100 ml acetonu 30 minut. Směs se pak centrifuguje a supernatant se dekantuje. Spojené filtráty a dekantovaný roztok se zahustí na 15 ml.
C. Testovací sloučeniny I
Filtráty se testují na inhibici enzymu HMG-CoA reduktázy metodou popsanou v práci Beg,
Stonik a Brewer (1977 FEBS Letters 80 123 až 129) použitím enzymů připravených podle práce
Kleinsek, Rangatham a Porter (1977 Proč. Hat. Acad. Sci. 74 1431 až 1435). Pozitivní test (více než 90 % inhibice při použití dávky 20 pg na ml - IC^q 2,3 pg na ml indikuje přítomnost velmi účinného inhibitoru syntézy steroidů působícího na HMG-CoA reduktázu.
Příklad 2
Příprava sloučenin 1 β III
A. Fermentace
Zkumavka s lyofilisovanou kulturou Aspergillus sp. MF-4833 se otevře aseptlcky a obsah se suspenduje v 250ml Erlenmeyerově baňce (očkovací baňka č. 1) obsahující 40 ml média C. Médium C má následující složení:
| Médium C | |
| kukuřičné výluhy | 5 |
| tomatová pasta | 40 |
| ovesná mouka | 10 |
| glukóza | 10 |
| stopové prvky směs č. 2 | 10 |
| destilovaná voda | 1 000 |
pH 6,8 přidáním NaOH
Naočkovaná baňka se inkubuje 24 hodin při 28 °C na rotační třepačce s 220 otáčkami ze minutu (posun 5,1 cm). Pak se naočkuje dalších 8 250 ml) Erlenmeyerových baněk bez přepážek z nichž každá obsahuje 40 ml média C a po 2 ml vzrostlé kultury z baňky č. 1. Těchto oem očkovacích baněk č. 2 se pak inkubuje 24 hodin při 28 °C na třepačce s 220 otáčkami za minutu (posun 5,1 cm). Dvacet dvoulitrových Erlenmeyerových baněk bez přepážek obsahujících po 500 ml média B se pak naočkuje po 14 ml spojených vzrostlých kultur z baněk č. 2. Těchto 20 baněk se inkubuje při 28 °C bez míchání 11 dnů. Po 11 dnech se obsah těchto 20 baněk.spojí.
B. Extrakce
10,2 litrů spojeného inkubovaného média, pH 6,0 se mixuje v mixéru, aby rozbil těžké myceliální koňsky, centrifuguje se a čirý supematant se dekantuje. Po filtraci se 10 litrů získaného filtrátu extrahuje 3 litry etylacetátu a získá se 1 820 ml čirého extraktu. Druhá extrakce 3 litry etylecetátu poskytne 3 350 ml čirého extraktu. Pevné podíly z média se- extrahují jednohodinovým mícháním s 2 litry metanolu a filtrací se získá 2 10Ó ml filtrá tu.
Alikvotní podíly těchto extraktů se vysuěí a testují postupem podle příkladu 1C. Byly získány následující výsledky:
| Extrakt | ||
| objem (ml) | celkové pevné | celkové jednotky |
| podíly (mg) | aktivity | |
| 1 820 | 1 133 | 1 496 695 |
| 3 350 | 787 | 314 900 |
| 2 100 | 13,15 | 1 144 067 |
C. Gelová filtrace
Celkové pevné podíly získané z prvních dvou extraktů v příkladu 2B se spojí, rozpustí v metanolu a filtrací se odstraní nerozpustné pevné podíly. 30 ml filtrátu se umístí na kolonu gelové filtrace (2,5 cm x,200 cm, 980 ml), naplněnou Sephadexem LH-20 a frakce se dělí podle molekulární hmotnosti použitím metanolu, jakožto rozpouštědla. Použitím indexu lomu a UV detekce se nejlepší frakce identifikují biotestem celkové pevné podíly (mg) celkové jednotky aktivity
| frakce 1 | 89 | 106 | 27, |
| frakce 2 | 278 | 1 099 | 680 |
| frakce 3 | 779 | 210 | 357 |
D. Dělení a čištění
Vzorek z frakce 2 výěe se filtruje na 1 g Waters Bondapak C18/Porasil B a eluuje pěti objemy metanolu. Metanolové eluáty se zahusti na 0,5 ml. Tento vzorek se chromatografuje v několika Seržích na Waters /iC18 koloně (3,9 mm x 30 cm) směsí metanolu a 0,05M fosforečnanu amonného, pH 2,9 (75:25) jakožto elučním činidlem. Frakce se sledují na Beckmann spektrometru a ty, které vykazují absorpční maxima při 236 nm s inflexy 229 β 245 nm se spojí a zahustí za sníženého tlaku na vodný roztok. Hodnota pH koncentrátu se upraví na 6,5 přidáním 2M hydroxidu draselného a aktivní složky se extrahují etylacetátem. Organické fáze se vysuší, zahustí k suchu a odparek se rozpustí v 0,3 ml metanolu. Metanolický roztok se chromatografuje výše uvedeným způsobem a recykluje se. Podíly obsahující dříve eluovanou složku se spojí, zahustí na vodný roztok a extrahují se chloroformem. Chloroformový odparek se rozpustí v metanolu a rozpouštědlo se odpaří v atmosféře dusíku. Získá se 3,5 ml suchého produktu, který byl identifikován jako hydroxykyselina (sloučenina III). Podíly obsahující druhou složku se spojí a extrahují chloroformem postupem popsaným výše. Získá se . 0,87 mg suchého produktu, který byl identifikován jako lakton (sloučenina I).
Příklad 3
Nejlepší způsob fermentace MF-4833 za vzniku sloučenin I a III
Zkumavka lyofilisované kultury Aspergillus sp. MF-4833 se asepticky otevře a obsah se suspenduje v 250 ml Erlenmeyerově baňce (očkovací, baňka) obsahující 40 ml média C). Naočkovaná baňka se 48 hodin inkubuje při 28 °C na třepačce s 220 otáčkami za minutu posunem
5,1 cm. Dvě 250 ml Erlenmeyerovy baňky, z nichž každá obsahuje po 40 ml média D, se pak očkují po 2 ml vzrostlé kultury z očkovací baňky. Médium D má následující složení:
Médium D laktóza 20 g destilační výluhy 1 5 g autolysované droždí 5 g destilovaná voda 1 000 ml pH 7,0 přidáním NaOH.
Tyto dvě naočkovaná baňky se inkubují 96 hodin při 28 °C na třepačce s 1 50 otáčkami za minutu (posun 5,1 cm). Po 96 hodinách inkubace se obsah těchto dvou baněk extrahuje postupem popsaným v příkladu 2B. Celková produkce v těchto baňkách je 1 450 až 2 000 jednotek/ml.
Příklad 4
Příprava sloučenin I a III
Zkumavka s lyofilisovanou kulturou Aspergillus MF 4845 se asepticky otevře a obsah se suspenduje v 250 ml Erlenmeyerově baňce bez přepážek (Očkovací baňka δ. 1) obsahující médium C (40 ml). Naočkovaná baňka se inkubuje 24 až 48 hodin při 28 °C ne třepačce s 220 otáčkami za minutu (posun 5,1 cm). Část z této baňky (asi 0,5 ml) se pak použije pro naočkování šikmé kultury ve zkumavce obsahující médium E. Médium E mé následující složení:
Médium E extrakt z droždí 4 g extrakt ze sladu 10 g dextróza 4 g agar 20 g destilovaná voda 1 000 ml pH 7,0 přidáním NaOH.
Naočkované šikmá kultura se inkubuje 11 dnů při teplotě místnosti. Pak se 3 až 4 měsíce skladuje při -60 °C. část obsahu této šikmé kultury se pak suspenduje v 250 ml Erlenmeyerově baňce bez přepážek (očkovací baňka č. 2) obsahující 40 ml média C. Naočkovaná baňka se inkubuje 24 hodin při 28 °C na třepačce s 220 otáčkami za minutu (posun 5,í cm). Šest
250 ml Erlénmeyerových baněk bez přepážek (očkovací baňky č. 3) obsahující po. 40 ml média C se pak naočkují po 2 ml vzrostlé kultury z baňky č. 2. Těchto Šest naočkovaných baněk se inkubuje 48 hodin při 28 °C na rotační třepačce s 220 otáčkami za minutu (púsun 5,1 cm). Šest dvoulitrových Erlenmeyerových baněk bez přepážek obsahujících po 500 ml média F se pak naočkuje obsahem očkovací baňky č. 3. Médium F má následující složení:
Médium F kukuřičné výluhy 1 5 g
CPC škrob 20 g kukuřičné mouka 1 g séjová mouka 4 g glukóza 5 δ . sójový olej 2,5 g (NH4)2SO4 4 g
KH2PO4 0,3 g
CaCo3 6 g destilovaná voda 1 000 ml pH 6,7 přidáním NaOH.
Naočkované baňky se inkubují11 dnů bez míchání při 28 °C. Po 11 dnech se provede extrakce postupem podle příkladu 2B. Celková produkce v těchto baňkách je 1 231 jednotek/ml.
Příklad 5
Nejlepší způsob fermentace MF-4845 za vzniku sloučenin I a III • Zkumavka lyofilisované kultury Aspergillus MF-4845 se asepticky otevře a obsahy se suspendují v 250 ml Erlenmeyerově baňce bez přepážky (očkovací baňka) obsahující 40 ml média C. Naočkovaná baňka se inkubuje 30 hodin při 28 °C na třepačce s 220 otáčkami za minutu (posun 5,1 cm). 250 ml Erlenmeyerova baňka bez přepážek obsahující 40 ml média G se naočkuje 2 ml vzrostlého média z očkovací baňky. Médium G má následující složení:
Médium G dextróza 45 g
Peptonlzované mléko 24 g autolysované droždí 2,5 g polyglykol P2000 2,5 ml destilovaná voda 1 000 ml pH 7,0 přidáním NaOH.
Takto naočkovaná baňka se inkubuje 120 hodin při 28 °C na třepačce s 220 otáčkami za minutu a posunem 5,1 cm. Po 120 hodinách inkubace se obsahy baněk extrahují postupem podle příkladu 2B. Celková produkce v této baňce byla 21 500 jednotek/ml.
Přiklad
A. Fermentace MF-4833 ve velkém za vzniku sloučenin 1 a III
Médium použité pro, každý stupeň fermentace obsahovalo:
| kukuřičný výluh | 5 | ε |
| tomatová pasta | 40 | ε |
| ovesná mouka | 10 | ε |
| glukóza . | 10 | ε |
| roztok stopových prvků | 10 | ml |
| destilovaná voůa 1 | 000 | ml |
| upraveno na pH 6,8 hydroxidem sodným. | ||
| Roztok stopových prvků obsahoval: | ||
| FeSO4 . 7H2O | 1 | ε |
| MnSO4 . 4H2O | 1 | ε |
| CuC12 . ŽH/ | 25 | mg |
| CaClg | 100 | mg |
| H3B°3 | 56 | mg |
| (NH4)6Mo?024 . 4H2O | 19 | mg |
| ZnSO4 . 7H2O | 200 | mg |
| destilovaná voda | 1 | litr |
Před naočkováním mikroorganismem byla u veškerých médií prověřena sterilita.
Do 250 ml Erlenmeyerovy baňky bez přepážek se umístí 40 ml média a obsah jedné zkumav ky lyofilisóvaného organismu MF 4833. Baňka se pak třepe na rotační třepačce s 220 otáčkami za minutu při teplotě 28 °C po dobu 24 hodin. Nové baňky se naplní 40 ml média, přidá se k nim 1 ml obsahu 1 baňky, načež se tyto třepou 24 hodin pří 28 °C. Do 2 litrové baňky se pak umístí 400 ml média a 10 ml fermentační směsi ze druhého stupně, načež se tato třepe 24 hodin při 28 °C.
Fermentační tank z nerezavějící oceli objemu 910 litrů se naplní 501 litry média obsa hujícího:
laktózu 2 % hmot./obj.
rozpustné destilační zbytky 1,5 % hmot./obj.
autolysované droždí 0,5 % hmot./obj.
polyglykol P2000 0,25 % hmot./obj.
jehož pH se upraví na 7,0. Médium se sterilizuje 15 minut při 121 °C. Do média se přidá 1 litr ze třetího očkovacího stupně a směs se inkubuje 96 hodin při 28 °C, 130 otáčkách za minutu a průtoku vzduchu 0,28 m^/min.
B. Izolace sloučeniny I
Kolem 17 kg křemičitého filtračního materiálu se přidá do 501 litrů média získaného kultivací MF-4833 popsaného výěe a směs se filtruje přes filtrační lis velikosti 46 cm. Čirý filtrát (pH 6,6) se upraví na pH 4,0 opatrným přidáním 450 ml koncentrované kyseliny chlorovodíkové a extrahuje se mícháním asi s jednou třetinou objemu (asi 164 litrů) etylacetátu. Po oddělení se vrchní rozpouštědlové fáze oddělí a vodná fáze se znovu extrahuje etylacetátem (173 litrů). Po oddělení se oba extrakty spojí a promyjí asi 54 litry vody. Po oddělení se étylacetátový roztok zahustí ve vakuu při teplotě pod 30 °C nejprve v míchaném kotli a nakonec ve vakuovém rotačním odpařováku na objem menší než 4,5 litrů.
Přibližně'3 800 ml etylacetátového koncentrátu z předcházející extrakce se dále zahustí na rotačním odpařovéku (40 °C lázeň, 1,3 kPa) na sirup, který se pak dvakrát odpaří po přídavku asi litru metylenehloridu ve dvou dávkách. Získá se tak sirup prostý polárního rozpouštědla. Asi 300 ml zbylého oleje obsahujícího podle vážení suché hmoty asi 250 g pevných podílů se rozpustí v asi 750 ml etylacetátu a metylenehloridu (30/70; obj/obj) a přidáním 200 g silikagelu se připraví suspenze, která se nanese na vrSek kolony 14 cm x 36 cm obsahující 2,5 kg silikagelu v asi 7,5 1 stejné směsi rozpouětgdel. Vyvíjení stejným rozpouštědlem se provádí tak dlouho, až se jímají 3 1 předku.
Pak se započne eluce směsí etylacetátu a metylenehloridu (50/50, obj/obj) a jímají se 800 ml frakce. Jímá se 12 frakcí a pak se započne eluce 100% etylacetétem a po dalších sedmi frakcích se započne eluce 100% acetonem. Ve frakcích 4 až 24 se stanoví biologická aktivita při inhibici HMG-CoA reduktázy testem popsaným v příkladu 1. Značná aktivita byla nalezena ve frakcích 7 až 11. Hlavní aktivita·byla nalezena ve frakci 8. Tato se zahustila na olej pro další čištění. Stanovené suchá hmotnost pevných podílů 9,0 g.
Frakce 8 z kolony silikagelu se rozmělní v 50 ml metylenehloridu, přefiltruje se . a filtrační koláč má hmotnost 4,9 g. Filtrát se nanese na 1 m dlouhou kolonu o průměru
5.1 cm naplněnou dextroveným gelem Sephadex LH20 (Pharmacia) smočeným a ekvilibrovaným v metylenehloridu a kolona se eluuje metylenchloridem rychlosti 15 ml/min. Sloučenina I se eluuje mezi 0,64 a 0,81 objemy kolony. Rozpouštědlo se z toho pásu odstraní a získá se mírně hnědý odparek hmotnosti asi 0,290 g. Tento odparek (213 mg) se rozpustí v 1,5 ml směsí dichlořmetanu a acetonitrilu (65/35) a nanese se na předem neplněnou a ekvilibrovanou kolonu silikagelu (EM LOBAK velikost B) a eluuje se směsí dichlořmetanu a acetonitrilu. (65/35) rychlostí 5 ml/min. Odpařením rozpouštědla z píku eluoveného mezi 235 a 360 ml rozpouštědla se získá 121 mg krystalického produktu t. t. 155 až 160 °C. Při vysokotlaké kapalinové chromatografii tento materiál na EM RP 18 analytické koloně s obrácenou fází E. Merck Hlbar II, Cat. No. 906046) použitím 0,05 M fosfátu sodného pH 3,0 a acetonitrilu (45/55, jakožto elučního činidla rychlostí 2 ml/min vykazuje pík s charakteristickou UV absorpcí při 11 minutě.
mg tohoto materiálu se překrystaluje 0,6 ml absolutního etanolu a pak znovu z 0,4 ml stejného rozpouštědla a po sušení přes noc v exikátoru nad Pg®5 se 40 mg bílých peříčkovitých krystalů. Analytická vysokotlaká kapalinová chromatografie v systému popsaném výše poskytuje jeden ostrý pík s elučním časem 11 minut. Po další rekrystalizaci byl získán produkt teploty tání 170 až 171 °C.
Produkt byl identifikován spektry a j., jakožto sloučenina I. Tento materiál při in vitro testu HMG-CoA reduktázy (příklad 1) poskytuje LC^q 0,01 mikrogramů na mililitr.
Příklad 7
Přímé izolace amonné soli sloučeniny III
Médium z fermentace*získané v postupu«'podlé příklfedu 20A (454 litrů) se okyselí kyselinou fosforečnou ha ph 5. Přidá se -etylacetát (318 litrů) a směs se intenzívně míchá.
Zbytky mycelia se odfiltrují a filtrační koláč se promyje malým množstvím etylacetátu, který se spojí s hlavním extraktem.· Organická fáze'še ^oddělí a smísí s 22,7 litru 0,2N roztoku hydroxidu sodného. Směs se intenzívně míchá a pak se nechá usadit. Vodná fáze se oddělí a pH se upraví z hodnoty 9 na 5' přidáním kyseliny fosforečné. Potom se nejprve extrahuje
9.1 litry směsi hexan-etylacetát a pak 4,5 litry stejné směsi. Oddělené organické extrakty se spojí a vysuší bezvodým síranem hořečnatým. Sušicí činidlo se pak odfiltruje a filtrační koláč se promyje jedním litrem stejného roztoku hexan-etylacetát a promývací roztok se spojí s filtrátem. Tento filtrační roztok po dalším zředění 2 litry acetonu se míchá a zavádí se do něho plynný amoniak. Plyn se absorbuje a vyloučí se krystalická sraženina. Jakmile se amoniak již dále neabsorbuje a ve sraženině se pozoruje tmavnutí, přeruší se zaváděním améniaku a směs s· nachá několik hodin stát, načež se filtruje. Filtrační koláč vysrážené amonné soli se promyje acetonem až protéká bezbarvý promývací roztok a pak se suěí na vzduchu.
Surová amonná sůl se může rekrystalovat rozpuštěním v 7,8 litrech smSsi chloroformu a metanolu a koncentrovaný vodný hydroxid amonný (80:80:2) a odfiltrováním nerozpuštěného materiálu. Roztok filtrátu se pak zředí stejným objemem směsi šceton-éter 1:1 a nechá se stát přes noc. Filtrací se získá krystalická slámově zbarvená amonná sůl (96,5 g).
Další čištění se může provádět rozpuštěním 70 g výše uvedeného překrystálováného materiálu v 2 litrech vroucí směsi isopropanol-koncentrovaný vodný hydroxid amonný (95:5). Přidá se 10 g aktivního uhlí a horký roztok se odfiltruje. Filtrát se nechá vychladnout na teplotu místnosti a nechá se stát přes noc při -20 °C. Po filtraci se filtrační koláč promyje studeným (-20 °C) isopropanolem, studeným acetonem a pak éterem při teplotě místnosti. Produkt se vysuěí v atmosféře dusíku a získá se asi 60 g bílé krystalické amonné soli.
Příklad8
Soli sloučeniny III
K roztoku 40 mg produktu z příkladu 6 v 2 ml etanolu se přidá 1 ml vodného roztoku NaOH (IO-4 mol, 1 ekvivalent). Po 1 hodině při teplotě místnosti se směs odpaří ve vakuu k suchu a získá se sodná sůl sloučeniny III.
Stejným způsobem, použitím jednoho ekvivalentu hydroxidu draselného, se připraví draselná sůl.
Příklad 9
Sůl sloučeniny III s L-lysinem
Roztok 146 mg L-lysinu v 1,5 ml 65% etanolu se přidá k roztoku 440 mg amonné soli sloučeniny III v 11,5 ml 85% etanolu. Rozpouštědla se oddestilují ve vakuu. Odparek se rozmělní s 10 ml horkého etanolu, ochladí se a filtruje. Získá se bílá pevná látka obsahující sůl sloučeniny III s L-lysinem, t. t. 178 až 180 °C (rozklad).
Analýza pro C30H52N2°8: vypočteno: 63,35 % C 9,22 % H 4,93 % N, nalezeno: 62,80 % C 9,13 % H 4,83 % N.
Přikladlo
Sůl sloučeniny III s L-argininem
Způsobem popsaným v příkladu 9 se nechá reagovat roztok 174 mg L-argininu s roztokem 440 mg amonné soli sloučeniny III. Rozpouštědlo se odpaří ve vakuu a odparek se rozmělní s horkým etanolem, ochladí se a přefiltruje. Vysušením se získá L-argininová sůl sloučeniny III.
Přikladli
Sůl sloučeniny III s L-ornithinem
Způsobem popsaným v příkladu 9 se roztok 132 mg volné báze L-ornithinu a roztok 440 mg amonné soli sloučeniny III smísí. Rozpouštědlo se odpaří ve vakuu a odparek se rozmělní v horkém etanolu, ochladí se, přefiltruje a vysušením se získá sůl L-ornithinu sloučeniny III.
Příklad 12
Sůl sloučeniny III s N-metylglukaminem
Způsobem popsaným v příkladu 9 se smísí roztok 195 mg N-metylglukaminu v 1,5 ml vody a 440 mg amonné soli sloučeniny III v 11,5 ml 85% etanolu. Rozpouštědlo se odpaří ve vakuu a získá se sůl sloučeniny III s N-metylglukaminem.
Příklad 13 *
Etylendlamoniová sůl sloučeniny III g sloučeniny I se rozpustí v 180 ml horkého isopropanolu a zpracuje se * 90 ml 0,5 M vodného roztoku hydroxidu sodného, míchá se 1 hodinu a zředí se 180 ml vody, odpařením ve vakuu se odstraní isopropanol a ochladí se v ledové lázni. Pomalu se přidá 90 ml 0,5M HCl a směs se extrahuje 2 x 150 ml etylacetátu, který se znovu promyje 100 ml vody a vysuší síranem hořečnatým. Rozpouštědlo se odstraní ve vakuu při nízké teplotě a odparek se rozpustí v 150 ml etanolu. Přidají se 3 ml etyléndiaminu a rozpouštědlo se odpaří ve vakuu a zbytek se rozmělní vroucím etylacetátem, ochladí se, přefiltruje a překrystaluje z 30 ml isopropanolu a vysuší ve vakuu nad P2°5* se íek 13,1 g bílých krystalů t. t.
152 až 153,5 °C.
Analýza pro (^24^7^2 * ^2^0^2^5 vypočteno: 66,35 % C, 9,35 % H, 3,09 % N, nelezeno: 66,08 % C, 9,49 % H, 3,01 % N.
Příklad 14
Vápenatá sůl sloučeniny III
87,9 mg amonné soli sloučeniny III se rozpustí v 3 ml HgO za mícháni a zahřívání. Pak se přidá 7,4 mg analytického Ca(OH)2 a směs se míchá a zahřívá až se dále neodpařuje amoniak a zůstává pouze malý zákal, který se odstraní centrifugací. Bezbarvý čirý supernatant se lyofilisuje a vzorky suchého materiálu se krystalují z různých rozpouštědel a směsí roz pouětědel. Produkt krystaluje v jehličkách jestliže se horký koncentrovaný roztok v bezvodém isopropanolu nechá vychladnout na teplotu místnosti.
Příklad 15
Tetrametylamoniavá sůl sloučeniny III mg sloučeniny I v 1 ml CHgClg se nechá reagovat s 0,04 ml 24% tetrametylamonium hydroxidu v metanolu. Produkt se vysráží éterem v částečně krystalické formě, centrifuguje se a sraženina se nejprve promyje éterem a pak překrystaluje ve formě hexagonálních destiček z 1 ml isopropanolu přidáním 5 ml éteru a asi 5 ml nízkovroucího petroléteru. Získá se 27 mg (65% výtěžek), 'h NMR spektrum tetrametylamoniové soli sloučeniny III
| (6 mg/0 | ,35 ml | při 25 °C v CDClj 300 MHz) | |
| 0,83 | t | <3H, J | = 6,5) |
| 0,84 | d | (3H, J | = 7) |
| 1 ,02 | d | (32, J | = 7) |
| 1 ,05 | d | (3H, J | = 7) |
| 1,24 | m | (~>1H); | ί 1,30 až 1,80 široký multiplet |
| 1 ,88 | ddd | OH, J = 2, 8, 15) |
| 1,98 | dd | OH, 3, 15) |
| 2,16 | dd | (1H, J = 8,5, 15,5) |
| 2,23 | m | (1H, skrytý) |
| 2,32 | m | OH, skrytý) |
| 2,37 | dd | (1H, J = 3, 15,5) |
| 2,40 | m | (~1g, skrytý) |
| 3,42 | s | (12H, MeN+) |
| 3,79 | m | OH., symetrický multiplet) |
| 4,06 | m | OH, symetrický multiplet) |
| 5,32 | dt | OH, J * 3) |
| 5,50 | br. | s (1H) |
| 5,79 | dd | OH, J = 6,10) |
| 5,98 | d | OH, J = 10) |
| Chemické | posuny jsou v ppm dolů od | |
| Konstanty v závorkách jsou v Hz. | ||
| Zkratky: | s = singlet, d = dublet, t | |
| í k 1 | a d | 16 |
Amonná sůl sloučeniny III
Způsobem popsaným v přikladu 13 se sloučenina I převede na hydroxykyselinu, sloučenina III se extrahuje do etylacetátu, vysuší síranem hořečnatým, přefiltruje a zpracuje bezvo dým amoniakem za míchání a chlazení. Amonná sůl se vysráží.
Příklad 17
Příprava hydroxykyseliny sloučeniny III
Sodná sůl připravená v příkladu 7 se znovu rozpustí v 2 ml směsi etanol-voda (1:1) a přidá se k 10 ml 0,1N kyseliny chlorovodíkové a uvolněná hydroxykyselina se extrahuje etylacětátem. Rozpouštědlo se jednou promyje vodou, vysuěí a odpaří ve vakuu při teplotě lázně nepřevyšující 30 °C. Stáním hydroxykyselina pomalu přechází na lakton.
Příklad 18
Sloučenina III
453 mg etylendiamoniová soli sloučeniny III se rozpustí v 6 ml 80% etanolu, ochladí se v ledové lázni, přidá se 1 ml 1M HC1, odpaří ve vakuu, aby se odstranil etanol, přidají se 3 ml vody, extrahují do 2 x 5 ml etylacetátu a zpětně promyjí vodou, přičemž veškerá rozpouštědla se udržují v ledové lázni. Extrakt se vysuší síranem hořečnatým a zahustí ve vakuu k suchu. Ve formě bezbarvého oleje se získá hydroxykyselina.
,3C-NMR spektrum v CDCl^ (190 mg/ml) vykazuje v tabulce uvedené chemické posuny pro prvých šest uhlíků části molekuly obsahující hydroxykyselinu. Stáním tato hydroxykyselina pomelu přechází na lakton.
• 17
Tabulka
C-NMR spektrum, ppm směrem dolů do tetrametylsilanu
Hydroxykyselina, sloučenina III
174,8
42,4, 41,6
HO
68,8
72,3
34,9
Spektrum Zbylé části molekuly je pouze mírně změněné cyklizací.
Pří kl a:d 19
Etylester sloučeniny III
Suspenze 500 mg (1,24 mmol) sloučeniny I (MSD-803) v 20 ml etanolu se míchá při teplotě místnosti v atmosféře dusíku. Přidá se malý kousek sodíku (asi 1 mg) Po 15 minutách se přidá druhý malý kousek. Po celkové době 30 minut se homogenní reakční směs zředí éterem, promyje vodou a nasyceným roztokem chloridu sodného a vysuěí síranem hořečnatým. Odpařením rozpouětědla se získá voskovité pevná látka. Analýzou vysokotlakou kapalinovou chromatografií na Whatman Partasil PAC koloně (4,6 mm x 25 cm) směsí 10% isopropanolu v hexanu pumpovanou rychlostí 6 ml/min, bylo nalezeno, že ae jedná o směs etylesteru a MSD-803 (77:23).
Tato směs se oddělí kapalinovou chromatografií o středním tlaku na silikagelu 230 až 400 mesh elucí 3% etanolu/metylenchloridu. Frakce obsahující ester se spojí a odpařením se získá 358 mg (66 %) téměř bílé pevné látky t. t. 67 °C.
část tohoto materiálu se překrystaluje z hexanu a získají se bílé jehličky t. t. 66,5 až 68,5 °C.
Analýza pro C26H42O6:
vypočteno: 69,30 % C, 9,40 % H, nelezeno: 69,22 % C, 9,58 % H.
Stejným způsobem se použitím ekvivalentních množství metanolu, propanolu, butanolu, isobutanolu, t-butanolu, amylalkoholu, isoemylalkoholu, 2-dlmetylaminoetanolu, benzylalkoholu, fenetanolu, 2-acetamidoetanolu apod. připraví odpovídající estery. .
Příklad 20
Příprava sloučenin II a IV
A. Fermentace
Zkumavka lyofilisované kultury MF-4845 se asepticky otevře a obsah se suspenduje v 250 ml Erlenmeyerově baňce bez přepážek (očkovací baňka) obsahující asi 10 ml média následujícího složení:
| Médium: | |
| kukuřičné výluhy | 5 g |
| tomatová pasta | 40 g |
| ovesná mouka | 10 g |
| glukóza | 10 g |
| roztok stopových prvků | 10 g |
| destilované voda pH 6,8 přidáním NaOH. | 1 000 ml |
| Roztok stopových prvků | |
| FeSO4 . ZH2O | 1 000 mg |
| MnSO4 . 4H2O | 1 000 mg |
| CuC12 . 2H2O | 25 mg |
| CaCl2 . 2H2O | 100 mg |
| h3BO3 | 56 mg |
| (NH4)6Mo7O24 . 4H2O | 19 mg |
| ZnS04 . 7H20 | 200 mg |
| destilovaná deionisované | 1 000 ml |
vodě
Naočkovaná baňka se inkubuje 24 hodin při 28 °C na třepačce s 220 otáčkami za minutu (posun 5,1 co). Dvoulitrová Erlenmeyerova baňka obsahující 500 ml média se pak naočkuje 10 ml očkovací smési vzrostlé kultury z prvého stupně. Tato baňka se také třepe 24 hodin při 28 °C.
Fermentační tank obsahu 910 litrů se pak naplní 485 litry média obsahujícího:
cerelózu peptoniované mléko autolysované droždí polyglykol P2000
4.5 % hmot/obj
2.5 % hmot/obj 0,25 % hmot/obj 0,25 % hmot/obj jehož pH se upraví na 7,0. Médium se sterilizuje 15 minut při 121 °C. Jeden litr druhého očkovacího stadia připraveného výěe se pak přidá do tanku a směs se inkubuje 12 hodin při 85 otáčkách za minutu a pak při 130 otáčkách za minutu za průtoku vzduchu 0,14 m^/min po dobu 12 hodin a pak 84 hodin při průtoku 0,28 n?/min.
B. Izolace
1. Extrakce
Dvě násady z 454 litrových tanků se spoji, okyselí se za míchání na pH 4,1 opatrným přidáváním 800 ml koncentrované kyseliny chlorovodíkové a pak extrahují přidáním 340 litrů etylacetátu a dvouhodinovým mícháním.
Přidá se asi 11,3 kg křemičité filtrační hmoty a celková suspenze se pumpuje přes filtrační lis velikosti 61 cm. Pro promytí filtračního koláče se použije dalších 340 litrů etylacetátu a extrakce se provádí čtyřnásoným opakovaným zpětným pumpováním přes filtrační koláč. Veškerá promýveeí rozpouštědla se pak u filtračního koláče odstraní a spojí s prvým filtrátem. Dvoufázový filtrát se nechá usadit a vodná fáze se oddělí. Etylacetátová fáze se promyje 45 litry deionisované vody, féze se nechají oddělit a etylacetátové extrakty se zahustí ve vakuu na zbytek asi 45 litrů.
2. Laktonizace (Pro cyklizeci sloučeniny IV v extraktu na sl9učenlnu II se provede následující azeotropické zpracování.)
Etylacetátové extrakty z dalších 1 365 litrů fermentovaného média se přidají k výše připravenému extraktu a objem se zmenší destilací ve vakuu na asi 136,4 litru. Přidá se esi 227 litrů toluenu a násada se zahustí ve vakuu na asi 145 litrů. Tento stupeň se opakuje, přidá se dostatečné množství toluenu, aby se dosáhl objem 340 litrů. Bez vakua se násada zahřívá dvě hodiny k varu při teplotě nad 106 °C.
Roztok se pak zahustí ve vakuu na malý objem, který se pak dále zahustí ve velkém rotačním odpařováku ve vakuu na olejovitý odparek.
3. Chromatografie na silikagelu
Extrakt získaný výše se zbaví ostatních rozpouštědel přidáním 9 litrů metylenchloridu a zahuštěním na oleji.
Olejovitý odparek se rozpustí v asi 22,7 litrech směsi etylacetátu, a metylenchloridu (30/70 obj/obj) a přidáním 2,8 kg silikagelu se připraví suspenze.
Suspenze se pak nanese na vršek kolony silikagelu (30 x 127 cm) naplněné ve stejné směsi rozpouštědel.
Eluce se provádí směsí etylacetátu a metylenchloridu (40/60; obj/obj) rychlostí 800 ml/min. Nejprve se jímá předek 45 litrů a pak frakce po 18 litrech.
Frakce 6 až 10 včetně se zahustí ve vakuu na olejovitý zbytek, který se rozpustí v horkém etylacetátu, zpracuje s aktivním uhlím, zfiltruje za horka a ochladí. Krystaly MSD 803 (sloučenina I) se odfiltrují a matečné louhy se zahustí ve vakuu na olejovitý zbytek, který se chromatografuje dále.
4. Opakovaná chromatografie na silikagelu
Matečné louhy z obdobných extrakcí fermentovaného média, ekvivalent 2727 litrů se spojí s výše připraveným metylenchloridovým roztokem. Jedna polovina tohoto roztoku se odebere pro delší chromatografií na silikagelu. Podle malého alikvotního podílu je celkový obsah pevných látek 325 g. Roztok se zpracuje s 40 g aktivního uhlí, přefiltruje se a filtrační koláč se promyje metylenchlorldem. Spojené filtráty a promývací roztoky se zahustí ve vakuu na olejovitý odparek. Ten se znovu rozpustí v 800 ml směsi etylacetátu a metylenchloridu (30/70; obj/obj) a smísí se s 225 & silikagelu. Suspenze se nanese na kolonu 14 x 36 cm silikagelu naplněnou ve stejné směsi rozpouštědel. Kolona se vyvíjí směsí etylacetátu a metylenchloridu (40/60; obj/obj). Nejprve se jímá předek tří litrů a pak frakce po 800 ml.
5. Chromatografie ηβ obrácených fázích ml z frakce uvedené chromatografie se zahustí na olejovitý zbytek 500 mg a tento olej se znovu rozpustí v 5 ml acetonitrilu. Tento acetonitrilový roztok se nanese na nerezovou kolonu průměru 1,5 cm délky 30,5 cm naplněnou preparativním materiálem pro kapalinovou chromatografií na obrácených fázích Boňdepak C18/Porasil B (Water Associates, lne., Milford, Mass. 01 757). Kolona se eluuje směsí 55 % acetonitrilu a 45 % 0,05 M fosfátu amonného pH 3 (obj/obj). Objem rozpouštědel eluovaných mezi 1 360 ml a 1 700 ml se, podle detekce indexem lomu spojí.
Organické rozpouštědlo seřodpaří ve vakuu a zbylý vodný roztok se extrahuje etylacetátem. Etylecetát se odpaří ve vakuu a získá se 120 mg sloučeniny uvedené v nadpisu, která krystaluje z koncentrovaného roztoku acetonitrilu. Získají se tak krystaly MSD 883 (sloučenina XI) t. t. 129 až 131 °C.
P ř í k 1 a d 21
Alternativní izolace sloučenin II a IV
Surová amonná sůl, izolovaná postupem podle příkladu 7 z 500 litrové fermentace se laktonizuje rozpuštěním Ve'vodě, okyselené na pH 3 koncentrovanou kyselinou chlorovodíkovou, extrakcí do toluenů a' dvouhodinovým zahříváním k varu, postupem podle příkladu 20-B-2. Zahuštěním ve vakuu na malý objem se získají krystaly surové sloučeniny I s malým množstvím sloučeniny II.’ Tyto se odfiltrují a vysuší.
Materiály 'i '12 takových násad se smísí a rekrystalují z 46 kg etanolu, odfiltrují se á promyjí etanolem. Spojené matečné louhy se promyjí a zahustí ve vakuu na asi 13,6 litrů a odfiltruje se druhý podíl krystalů sloučeniny I. Matečné louhy z této filtrace se zpracují následujícím způsobem:
Asi 0,5 1«těchto matečných louhů se připraví pro chromatografii na obrácených fázích zahuštěním ve vakuu, aby se odstranil etanol, rozpuštěním v acetonitrilu a odfiltrováním stop nerozpustných podílů. Roztok v 100 ml„acetonitrilu se chromatografuje na sloupci 200 ml násady C-18 fáze a sloupec se promyje dalším litrem acetonitrilu. Spojené .filtráty se zahustí a rozpustí.v celkem 360 ml rozpouštědla (60 dílů acetonitrilu a 40 dílů vody, obj/obj) a stopy nerozpustných podílů se odfiltrují. Podle analýzy alikvotního podílu je obsah pevných podílů 15j3 g.
Násada 160 ml této směsi se chromatografuje v systému Waters Prep 500 použitím dvou 5 x 30 cm sloupců s C18 obrácenou fází (Waters Assoc. vázaný oktadecylový povlak na silikagelu) směsí acetonitrilu-voda (60/40 obj/obj), jakožto elučním činidlem, rychlostí Ί30 ml/min při teplotě místnosti a detekcí indexem lomu. Nečistoty eluované v prvních 3’900 ml se vylejí. Sloučenina I se získá z frakci eluovaných mezi 3 900 až 5 850 ml. Frakce získané z 5 850 ml až 6 500 ml se ponechají pro opětovanou chromatografii. Vyčištěná sloučenina II se získá z posledního pásu eluovaného mezi 6 500 ml a 8 450 ml. Jímané frakce po zahuštění poskytnou 3 g olejovitého odparku.
Jedna polovina (asi 1,5 g) tohoto koncentrátu sloučeniny II se připraví pro ohromatografii ve formě amonné soli sloučeniny IV připravením roztoku v 6 ml b°rkého metanolu a za míchání se ihne'd přidá dostatečné množství ,N hydroxidu sodného tak, aby se pH udržovalo mezi 10,5 až ,1. Pro tento účel je zapotřebí 3,5 až 3,8 ml roztoku hydroxidu sodného. Po půlhodinovém stání se filtrací z roztoku odstraní stopy nerozpustných podílů a filtrát se pumpuje n^kolonu (2,54 x 86 cm) 200 až 325 mesh XAD-2 pryskyřice (styren-divinylbenzenový kopolymer) a eluce se provede směsí 23 % acetonitrilu a 77 % 0,1N hydroxidu amonného rychlostí 2 ml/min při 40 °C. Jímají se 20 ml frakce. Frakce 1 až 44 obsahují nečistoty a pás soli sloučeniny III. Frakce 45 až 61 se spojí, zahustí ve vakuu na malý vodný odparek, který mrazovou sublimací poskytne amonnou sůl sloučeniny IV (0,72 g).
Příklad 22
Soli sloučeniny IV
K roztoku 40 g produktu z příkladu 20 v 2 ml etanolu se přidá 1 ml vodného roztoku
NaOH (10-4 mol, 1 ekvivalent). Po jedné hodině při teplotě místnosti se směs odpaří ve vakuu k suchu a získá se sodné sůl sloučeniny IV.
Stejným způsobem se připraví draselná sůl použitím jednoho ekvivalentu draselné soli β vápenatá sůl použitím jedná pploviny ekvivalentu CaO.
Použitím postupů popisných v příkladech 9 až 12 a 14, ale náhradou amonné soli sloučeniny III v každém případé za ekvivalentní množství amonné soli sloučeniny IV vznikají odpovídající soli sloučeniny IV s L-lysinem, L-argininem, L-ornithinem, N-metylglukaminera a vápníkem.
Použitím postupů popsaných v příkladech 13, 15 a 16,. ale záměnou sloučeniny I v každém případě za ekvivalentní množství sloučeniny II vznikají odpovídající etylendiamoniová, tetrametylamoniová a amonná sůl sloučeniny IV.
P ř í k 1 a d 23
Příprava hydroxykyseliny, sloučeniny IV
Sodná sůl připravená v příkladu 22 se znovu rozpustí v 2 ml směsi etanol-voda (1:1) a přidá se 10 ml 0,1N kyseliny chlorovodíkové, která uvolní hydroxykyselinu a která se extrahuje etylacetátem, Rozpouštědlo se promyje vodou, vysuší a odpaří ve vakuu při teplotě nepřevyšující 30 °C. Hydroxykyselina stáním pomalu přechází na lakton.
Příklad 24
Příprava hydroxykyseliny, sloučeniny IV
221 mg amonné solí sloučeniny IV se rozpustí v 4,5 ml 65% etanolu. Ochladí se ledem, okyselí asi 0,5 ml tM kyseliny chlorovodíkové, na pH 3 a odpaří se při nízké teplotě na rotační odparce na objem asi 2 ml. Přidají se další 2 ml vody a extrakce se provede 2 x 3 ml etylacetátu. Extrakt se promyje 1 ml vody, přičemž veškeré roztoky se udržují studené v lázni s ledem. Extrakt se vysuší síranem hořečnatým a odpařením ve vakuu se získá hydroxykyselina ve formě bezbarvého oleje.
'•^C-NMR spektrum v CDCl^ vykazuje chemické posuny pro prvých šest atomů uhlíku části molekuly, obsahující hydroxykyselinu, jak jsou uvedeny v tebulce. Stáním tato hydroxykyselina pomalu přechází na lakton.
Tabulka
hydroxykys elina sloučenina IV
HO.
175,0
COOH
OH
42,2, 41,7
68,8
72,5
35,0
Spektrum zbylé části molekuly je cyklizací pouze mírně změněné.
Příklad 25
Etylester sloučeniny IV
Použitím postupu popsaného v příkladů 19, ale záměnou za 1,24 mmol sloučeniny 1 za ekvi molární množství sloučeniny XI z příkladu 20 se získá etylester sloučeniny IV.
Obdobným způsobem se připraví metyl-, propyl-, butyl-, isobutyl-, t-butyl-, amyl-, isoamyl-, 2-dimetylaminoetyl-, benzyl-, fenetyl- a 2-acetamidoetylestery.
Příklad 26
A. In vitro inhibice HMG koenzymu A reduktázy
Použije se mírně modifikovaná metoda popsaná v práci Beg a j. FEBS Letters 80, 123 (1977). Inkubace enzymu s inhibitorem se provádí 5 minut před započetím reakce se substrátem. S účinnými inhibitory jako jsou nové sloučeniny podle vynálezu neposkytoval standardní postup, prováděný pouhým přidáváním enzymu ke směsi inhibitoru a substrátu, lineární kinetiky.
Použitím modifikovaného postupu sodná sůl sloučeniny IV poskytuje IC^q při inhibici HMG-CoA reduktázy 2,7 x 10“^ M se srovnáním s 5,4 x 10^ Jí pro ML 236 B.
B. In vivo inhibice syntézy cholesterolu (sloučenina II)
Slcupinám samců krys Holzman se aplikuje buď 5% emulfor v roztoku chloridu sodného nebo testovaná sloučenina v emulforu. Po jedné hodině se intreperltoneálně aplikuje 80 yuCi 1^C acetátu na kg. Po 50 minutách se krysy nechají vykrvácet a stanovením cholesterolu se stanoví syntéza steroidů.
Dávka, mg/kg % inhibice
0,15 38
0,6 51
1.2
Příklad 27
Srovnání sloučenin I, II a ML-236B jakožto inhibitorů syntézy steroidů v buněčné kultuře
Postup A. W. Albertse a j. J. Biol. Chem. 249 5241 (1974), měřící množství 1 ^C biosyntézy steroidů z 1^C-acetátu u myěích L-M-buněk v kultuře, se použije s mírnou modifikací. Testovaná sloučenina v 10 /j1 DMSO se přidá k jednovrstvé kultuře spolu s 5 A>Ci 1 ^C‘-acetátu. Po 3 hodinách inkubace se buňky zmýdelní a '^C sterol se extrahuje a izoluje chromatografií na tenké vrstvě silikagelu použitím směsi petroléteru-dietyléteru a kyseliny octové (75:25:1). Oblast desky obsahující 14C steroidní se identifikuje stáním s I, < A t a obsah *C se stanoví kapalnou scintilaci.
Použitím modifikovaného postupu sloučenina II poskytuje IC^q při inhibici HMG-CoA reduktázy při 17 nM ve srovnání s 22 nM pro sloučeninu I a 46 nM pro ML-236B.
Claims (5)
1. Způsob přípravy směsi hypocholesteremických sloučenin obsahující sloučeniny strukturních vzorců 1, II, III a IV vyznačený tím, že se živné médium obsahující asimilovatelné zdroje uhlíku, dusíku a živné anorganické soli inkubuje při 20 až 37 °C a pH 6,0 až 8,0 s mikroorganismy rodu Aspergillus terreus uloženými v American Type Culture Collection pod čísly 20541 nebo 20542 a produkty se izolují.
2. Způsob přípravy směsi hypocholesteremických sloučenin obsahující sloučeniny strukturních vzorců I a III podle bodu 1, vyznačený tím, že se živné médium inkubuje mikroorganismy rodu Aspergillus terreus, uloženými v American Type Culture Collection pod čísly 20541 nebo 20542 a produkty se izolují.
3. Způsob podle bodu 2, vyznačený tím, že se izolace provádí extrakcí fermentační směsi rozpouštědlem a následující chromatografií.
4. Způsob přípravy směsi hypocholesteremických sloučenin obsahující sloučeniny strukturních vzorců II a IV (IV) podle bodu 1, vyznačený tím, že se inkubuje živné médium mikroorganismy rodu Aspergillus terreus, uloženými v American Type Culture Collection pod čísly 20541 nebo 20542 a produkty se izolují.
5. Způsob podle bodu 4, vyznačený tím, že izolace se provádí extrakcí fermentační směsi rozpouštědlem a následující chromatografií.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US06/048,946 US4231938A (en) | 1979-06-15 | 1979-06-15 | Hypocholesteremic fermentation products and process of preparation |
| US7780779A | 1979-09-21 | 1979-09-21 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CS221919B2 true CS221919B2 (cs) | 1983-04-29 |
Family
ID=26726709
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CS415780A CS221919B2 (cs) | 1979-06-15 | 1980-06-12 | Způsob přípravy směsi hypocholesterolemický sloučenin |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| CS (1) | CS221919B2 (cs) |
| HU (1) | HU182144B (cs) |
-
1980
- 1980-06-12 HU HU148680A patent/HU182144B/hu unknown
- 1980-06-12 CS CS415780A patent/CS221919B2/cs unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| HU182144B (en) | 1983-12-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US4342767A (en) | Hypocholesteremic fermentation products | |
| US4319039A (en) | Preparation of ammonium salt of hypocholesteremic fermentation product | |
| KR830002438B1 (ko) | 저 콜레스테린 혈증성 발효 생성물의 제법 | |
| EP0022478B1 (en) | Polyhydro-3,7-dimethyl-8-(2-(tetrahydro-4-hydroxy-6-oxo-2h-pyran-2-yl)-ethyl)-1-naphthylenyl-2-methylbutanoates, corresponding hydroxy acids, process for preparing and pharmaceutical compositions containing the same | |
| US4294846A (en) | Hypocholesteremic fermentation products and products of preparation | |
| US4294926A (en) | Hypocholesteremic fermentation products and process of preparation | |
| US5026554A (en) | Method of inhibiting fungal growth using squalene synthetase inhibitors | |
| US5102907A (en) | Novel squalene synthetase inhibitors | |
| DE68914495T2 (de) | Antihypercholesterolemisches Mittel. | |
| US5053425A (en) | Novel anti-fungal compounds | |
| US5096923A (en) | Novel squalene synthetase inhibitors | |
| US4420491A (en) | Hypocholesteremic fermentation products and process of preparation | |
| GB2046737A (en) | Antihypercholesteraemic Agent, Monacolin K, and Its Preparation | |
| US4376863A (en) | Hypocholesterolemic fermentation products | |
| EP0450812A1 (en) | Antihypercholesterolemics | |
| AU640756B2 (en) | 2,8-dioxabicyclo(3,2,1)octane derivatives,their production from cultures of MF 5447 and MF 5466 and their use as anti hyper cholesterolemics | |
| EP0475706A1 (en) | Novel squalene synthetase inhibitors | |
| US5132320A (en) | Squalene synthetase inhibitors | |
| EP0052366B1 (en) | Hypocholesterolemic fermentation products and process of preparation | |
| US4387242A (en) | Hypocholesterolemic fermentation products and process of preparation | |
| US5254727A (en) | Acyclic tricarboxylic acid compounds | |
| CS221919B2 (cs) | Způsob přípravy směsi hypocholesterolemický sloučenin | |
| US5270332A (en) | Cholesteral lowering agents | |
| EP0408806A1 (en) | Antihypercholesterolemic agents | |
| GB2265147A (en) | Antibiotic eicosenoic acids |