DE69834630T2 - Fermentative herstellung von wertstoffen in industriellem umfang durch verwendung von chemisch definierten media - Google Patents

Fermentative herstellung von wertstoffen in industriellem umfang durch verwendung von chemisch definierten media Download PDF

Info

Publication number
DE69834630T2
DE69834630T2 DE69834630T DE69834630T DE69834630T2 DE 69834630 T2 DE69834630 T2 DE 69834630T2 DE 69834630 T DE69834630 T DE 69834630T DE 69834630 T DE69834630 T DE 69834630T DE 69834630 T2 DE69834630 T2 DE 69834630T2
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
medium
chemically defined
fermentation
strain
glucose
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
DE69834630T
Other languages
English (en)
Other versions
DE69834630D1 (de
Inventor
Theodorus Wilhelmus DE LAAT
Cornelis Johannes PREUSTING
Pieter Bertus KOEKMAN
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
DSM IP Assets BV
Original Assignee
DSM IP Assets BV
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by DSM IP Assets BV filed Critical DSM IP Assets BV
Application granted granted Critical
Publication of DE69834630D1 publication Critical patent/DE69834630D1/de
Publication of DE69834630T2 publication Critical patent/DE69834630T2/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P1/00—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes
    • C12P1/04—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes by using bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/90—Isomerases (5.)
    • C12N9/92—Glucose isomerase (5.3.1.5; 5.3.1.9; 5.3.1.18)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/02—Oxygen as only ring hetero atoms
    • C12P17/06—Oxygen as only ring hetero atoms containing a six-membered hetero ring, e.g. fluorescein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/18—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms containing at least two hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring system, e.g. rifamycin
    • C12P17/188—Heterocyclic compound containing in the condensed system at least one hetero ring having nitrogen atoms and oxygen atoms as the only ring heteroatoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/44—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides
    • C12P19/60—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides having an oxygen of the saccharide radical directly bound to a non-saccharide heterocyclic ring or a condensed ring system containing a non-saccharide heterocyclic ring, e.g. coumermycin, novobiocin
    • C12P19/62—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides having an oxygen of the saccharide radical directly bound to a non-saccharide heterocyclic ring or a condensed ring system containing a non-saccharide heterocyclic ring, e.g. coumermycin, novobiocin the hetero ring having eight or more ring members and only oxygen as ring hetero atoms, e.g. erythromycin, spiramycin, nystatin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P23/00—Preparation of compounds containing a cyclohexene ring having an unsaturated side chain containing at least ten carbon atoms bound by conjugated double bonds, e.g. carotenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P35/00—Preparation of compounds having a 5-thia-1-azabicyclo [4.2.0] octane ring system, e.g. cephalosporin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P37/00—Preparation of compounds having a 4-thia-1-azabicyclo [3.2.0] heptane ring system, e.g. penicillin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C12P7/6436—Fatty acid esters
    • C12P7/6445—Glycerides
    • C12P7/6472—Glycerides containing polyunsaturated fatty acid [PUFA] residues, i.e. having two or more double bonds in their backbone
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor

Description

  • Gebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Fermentation, d.h. die fermentative Produktion von Wertstoffen, beispielsweise von primären oder sekundären Metaboliten, pharmazeutischen Proteinen oder Peptiden oder industriellen Enzymen.
  • Stand der Technik
  • Viele Wertstoffe werden durch fermentative Produktion in großen Fermentern im industriellen Umfang hergestellt, d.h. der Mikroorganismus, der einen interessierenden Wertstoff produziert, wird unter kontrollierten Bedingungen in einem Fermenter mit 10 bis 300 m3 gezüchtet. Bei derzeitigen Fermentationsverfahren im industriellen Umfang wird der Produktionsorganismus gewöhnlich in einem komplexen Fermentationsmedium fermentiert. Unter einem komplexen Medium versteht man ein Medium, das eine komplexe Stickstoff- und/oder Kohlenstoffquelle umfasst, wie Sojamehl, Baumwollsamenmehl, Maisquellwasser, Hefeextrakt, Caseinhydrolysat, Melasse und dergleichen.
  • Die Vorteile der komplexen Medien sind, dass die komplexen Bestandteil-Rohmaterialien nicht teuer sind, leicht verfügbar sind und eine vollständige oder nahezu vollständige Nahrungsquelle für den Mikroorganismus bilden, welche eine Kohlenstoff- und Stickstoffquelle sowie Vitamine und Mineralien enthalten. Das Gemisch aus biologischen Makromolekülen, wie es in komplexen Rohstoffen, beispielsweise Proteinen, Kohlenhydraten, Lipiden und dergleichen vorhanden ist, muss durch Enzyme abgebaut werden, die durch den Mikroorganismus vor ihrem Verbrauch ausgeschieden werden. Demzufolge werden verbrauchbare kleine Moleküle gleichmäßig im Fermenter und während des Fermentationsverfahrens verfügbar, wodurch Konzentrationsgradienten und Mischprobleme vermieden werden und die Menge dieser verbrauchbaren kleinen Moleküle unter Hemmungskonzentrationen gehalten wird. Darüber hinaus geben diese Makromoleküle sowie die organischen Säuren, die ebenfalls in komplexen Medien vorhanden sind, dem Medium eine Pufferkapazität, was auf diese Weise die Steuerung des pH-Wertes erleichtert.
  • Neben diesen Vorteilen haben die komplexen Fermentationsmedien mehrere wichtige Nachteile. Am wichtigsten ist, dass die komplexen Rohmaterialien eine chemisch undefinierte Zusammensetzung und eine variable Qualität aufweisen, unter Anderem aufgrund von jahreszeitlichen Schwankungen und unterschiedlichem geographischen Ursprung. Da die Zusammensetzung der Fermentationsmedien einen bedeutenden Einfluss auf die Fermentationsparameter, wie Viskosität, Wärmeübertragung und Sauerstoffübertragung haben, sind komplexe Rohmaterialien der Hauptgrund für eine Verfahrensabweichung. Zudem behindern sie die stromabwärts erfolgende Verarbeitung und können die Qualität des Endproduktes beeinträchtigen. Fermentationsbrühen, insbesondere filamentöse Mikroorganismen, können bei der Verwendung komplexer Rohmaterialen ein gesenktes Filtervermögen aufweisen.
  • Komplexe Rohmaterialien können ebenfalls Verbindungen enthalten, die sich unabsichtlich im Endprodukt anreichern oder zusammen mit diesem isoliert werden. Schwermetalle, Pestizide oder Herbizide sind Beispiele für ungewünschte Verbindungen, die in komplexen Rohmaterialien vorhanden sein können. Darüber hinaus können komplexe Rohmaterialien Toxine enthalten oder können zu deren Bildung führen.
  • Weitere Nachteile sind, dass komplexe Medien einen unangenehmen Geruch bei der Sterilisation erzeugen und ungewünschte Abfallströme produzieren.
  • Trotz der vorstehend erkannten Nachteile, die mit der Verwendung der komplexen Medien einhergehen, sind diese Medien noch für industrielle Fermentationsverfahren im großen Umfang bevorzugt. Es gibt verschiedene Gründe, warum Medien, die keine komplexen Rohmaterialien enthalten, d.h. chemisch definierte Medien, nicht zur Verwendung bei Fermentationsverfahren im industriellen Umfang berücksichtigt wurden. Ein offensichtlicher Grund findet sich in den Vorteilen, die mit der Verwendung der komplexen Medien einher gehen. Die Produktausbeuten, die mit Hilfe chemisch modifizierter Medien im industriellen Umfang erhalten werden, sind bedeutenderweise erheblich niedriger als solche, die man mit Medien erhält, die komplexe Rohmaterialien enthalten. Zudem können hochproduzierende mikrobielle Stämme, die für industrielle Verfahren in komplexen Medien entwickelt wurden, nicht ihre gute Leistung in chemisch definierten Medien beibehalten. Ein Grund für eine unbefriedigende Leistung in einem chemisch definierten Medium ist womöglich, dass die derzeitigen industriellen Stämme verschiedene Mutagenese- und Selektionsrunden durchlaufen haben, ohne dass ihre Leistung auf chemisch definierten Medien berücksichtigt wird.
  • Chemisch definierte Medien wurden somit nur für Forschungszwecke verwendet, d.h. in Laborkulturen in Petrischalen und/oder Schüttelflaschen oder in einem relativ kleinen fermentativen Umfang, der gewöhnlich ein Volumen von etwa 20 bis 40 Liter nicht übersteigt. Siehe beispielsweise die fermentative Produktion von sekundären Metaboliten, wie Penicillin (Jarvis und Johnson, J. Am. Chem. Soc. 69, 3010-3017 (1947); Stone und Farrell, Science 104, 445-446 (1946); White et al., Arch. Biochem. 8, 303-309 (1945)), Clavulansäure (Romero et al., Appl. Env. Mikrobiol. 52, 892-897 (1986) und Erythromycin (Bushell et al., Microbiol. 143, 475-480 (1997)).
  • Untersuchungen bezüglich der Verwendung chemisch definierter Medien in solchen kleinen Forschungsumfängen vermitteln dem Fachmann keine Erkenntnisse in Bezug auf die Anwendbarkeit dieser Medien bei industriellen Fermentationsverfahren im großen Umfang für Produktionszwecke, gewöhnlich mit einem Volumenumfang von etwa 10 m3 oder mehr.
  • Zur Vermeidung der Probleme, die mit der Verwendung der herkömmlichen Rezepte für komplexe Medien in der derzeitigen industriellen Praxis einhergehen, ist es wünschenswert, chemisch definierte Rezepte für Fermentationen im industriellen Umfang anzuwenden.
  • Hier beschreiben wir die Verwendung chemisch definierter Medien für Fermentationsverfahren im industriellen Umfang, die in Kombination mit einem geeigneten Stamm die Produktion von Wertstoffen, wie primären oder sekundären Metaboliten, pharmazeutischen Proteinen oder Peptiden oder industriellen Enzymen, in einer ökonomisch verheißungsvollen Ausbeute ermöglichen.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung offenbart ein industrielles Verfahren zur Herstellung eines Wertstoffs, bei dem man einen mikrobiellen Stamm in einem Fermentationsmedium, bei dem es sich um ein im wesentlichen aus chemisch definierten Bestandteilen bestehendes chemisch definiertes Medium handelt, fermentiert und den Wertstoff aus der Fermentationsbrühe gewinnt.
  • Die vorliegende Erfindung offenbart weiterhin ein Verfahren zur Herstellung und/oder Verbesserung eines mikrobiellen Stammes, der einen interessierenden Wertstoff produziert, der im industriellen Umfang in einem chemisch definierten Medium fermentiert werden kann, wobei man in dem Verfahren:
    • • einen geeigneten Ausgangsstamm einer Mutagenbehandlung, ausgewählt aus der Gruppe physikalischer Mittel und chemischer Mutagene, und/oder einer DNA-Transformation unterzieht,
    • • die erhaltenen Mutanten und/oder Transformanten einem Screening auf ihre Wachstumsleistung auf einem chemisch definierten Medium und auf ihr Produktionsniveau des interessierenden Wertstoffs unterzieht,
    • • Mutanten, die eine ähnliche oder verbesserte Wachstumsleistung auf einem chemisch definierten Medium und/oder ein verbessertes Produktionsniveau des interessierenden Wertstoffs im Vergleich zum Ausgangsstamm aufweisen, selektiert.
  • Eingehende Beschreibung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung beschreibt die Verwendung chemisch definierter Fermentationsmedien für die Fermentation eines geeigneten mikrobiellen Stammes im industriellen Umfang, wobei der geeignete mikrobielle Stamm einen Wertstoff produzieren kann.
  • Unter einem Fermentationsverfahren im industriellen Umfang oder einem industriellen Verfahren versteht man in der Beschreibung der Erfindung ein Fermentationsverfahren in einem Volumenumfang von ≥ 10 m3, vorzugsweise ≥ 25 m3, stärker bevorzugt ≥ 50 m3, am stärksten bevorzugt ≥ 100 m3.
  • Der Begriff "chemisch definiert" wird für Fermentationsmedien, die im Wesentlichen aus chemisch definierten Bestandteilen bestehen, verwendet. Ein Fermentationsmedium, das im Wesentlichen aus chemisch definierten Bestandteilen besteht, umfasst ein Medium, das keine komplexe Kohlenstoff- und/oder Stickstoffquelle enthält, d.h. das keine komplexen Rohmaterialien mit einer chemisch undefinierten Zusammensetzung aufweist. Ein Fermentationsmedium, das im Wesentlichen aus chemisch definierten Bestandteilen besteht, kann zudem ein Medium umfassen, das eine im Wesentlichen kleine Menge einer komplexen Stickstoff- und/oder Kohlenstoffquelle umfasst, eine Menge wie nachstehend definiert, welche gewöhnlich nicht ausreicht, dass das Wachstum des Mikroorganismus aufrecht erhalten bleibt und/oder die Bildung einer hinreichenden Menge an Biomasse gewährleistet ist.
  • Diesbezüglich haben komplexe Rohmaterialien eine chemisch undefinierte Zusammensetzung, weil diese Rohmaterialien beispielsweise viele verschiedene Verbindungen enthalten, zu denen komplexe heteropolymere Verbindungen gehören, und sie eine variable Zusammensetzung aufgrund jahreszeitlicher Schwankungen und Unterschiede des geographischen Ursprungs aufweisen. Übliche Beispiele für komplexe Rohmaterialien, die als komplexe Kohlenstoff- und/oder Stickstoffquelle bei der Fermentation wirken, sind Sojamehl, Baumwollsamenmehl, Maisquellwasser, Hefeextrakt, Caseinhydrolysat, Melasse, und dergleichen.
  • Eine im Wesentlichen kleine Menge einer komplexen Kohlenstoff- und/oder Stickstoffquelle kann in einem erfindungsgemäßen chemisch definierten Medium vorhanden sein, beispielsweise als Einschleppung aus dem Impfgut für die Hauptfermentierung. Das Impfgut für die Hauptfermentierung wird nicht notwendigerweise durch Fermentation auf einem chemisch definierten Medium erhalten. Eine Einschleppung aus dem Impfgut lässt sich meist durch die Anwesenheit einer kleinen Menge einer komplexen Stickstoffquelle in dem chemisch definierten Medium für die Hauptfermentierung nachweisen.
  • Die Verwendung einer komplexen Kohlenstoff- und/oder Stickstoffquelle in dem Fermentationsverfahren des Impfgutes für die Hauptfermentierung, beispielsweise zur Beschleunigung der Bildung von Biomasse, zur Steigerung der Wachstumsrate des Mikroorganismus und/oder zur Erleichterung der Steuerung des internen pH-Wertes, kann vorteilhaft sein. Aus dem gleichen Grunde kann es vorteilhaft sein, eine im Wesentlichen kleine Menge einer komplexen Kohlenstoff- und/oder Stickstoffquelle, beispielsweise Hefeextrakt, zum Anfangsstadium der Hauptfermentierung hinzuzufügen, insbesondere zur Beschleunigung der Biomassebildung in dem frühen Stadium des Fermentationsprozesses.
  • Eine im Wesentlichen kleine Menge einer komplexen Kohlenstoff- und/oder Stickstoffquelle, die in dem chemisch definierten Medium vorhanden ist, ist als diejenige Menge definiert, die höchstens etwa 10% der Gesamtmenge von Kohlenstoff und/oder Stickstoff (Kjeldahl-N), der in dem chemisch definierten Medium vorzugsweise in einer Menge von höchstens 5% der Gesamtmenge von Kohlenstoff und/oder Stickstoff, zugegen ist, stärker bevorzugt eine Menge von höchstens 1% der Gesamtmenge von Kohlenstoff und/oder Stickstoff ausmacht. Am stärksten bevorzugt ist keine komplexe Kohlenstoff- und/oder Stickstoffquelle in dem erfindungsgemäßen chemisch definierten Medium vorhanden.
  • Der Begriff "chemisch definiertes Medium", wie er erfindungsgemäß verwendet wird, umfasst ein Medium, wobei alle notwendigen Komponenten vor dem Beginn des Fermentationsverfahrens zum Medium gegeben werden, und er umfasst weiterhin ein Medium, bei dem ein Teil der notwendigen Komponenten vor dem Start zugegeben wird, und ein Teil während des Fermentationsverfahrens zum Medium zugegeben wird.
  • Die vorliegende Erfindung offenbart weiter, dass mikrobielle Stämme die einfachen Rohmaterialien chemisch definierter Medien in eine ökonomisch verheißungsvolle Menge Wertstoff im industriellen Umfang umwandeln können. Man hat überraschend entdeckt, dass die Produktivität der mikrobiellen Stämme in chemisch definierten Medien, gemessen im industriellen Umfang, vergleichbar sein kann mit ihrer Produktivität in komplexen Medien oder in einigen Fällen sogar noch höher.
  • Ein weiterer Vorteil der Verwendung der chemisch definierten Medien ist, dass die Sauerstoffübertragung von der Gasphase in die Flüssigphase und die Kohlendioxid-Übertragung von der flüssigen Phase in die Gasphase verglichen mit der Verwendung komplexer Medien erheblich verbessert wird. Der Fachmann weiß, dass die Konzentrationen von gelöstem Sauerstoff und gelöstem Kohlendioxid zwei wichtige Faktoren bei der Vergrößerung eines Fermentationsverfahrens sind, und sie die ökonomische Machbarkeit eines industriellen Verfahrens bestimmen können. Die erhaltene verbesserte Massenübertragung unter Verwendung von chemisch definierten Medien kann auf das Fehlen erheblicher Mengen an Verbindungen, die die Vereinigung von Gasblasen fördern, in diesen Medien zurückgeführt werden. Verbindungen, die diese Vereinigung fördern, können beispielsweise unter bestimmten hydrophoben und/oder polymeren Verbindungen gefunden werden, die in komplexen Rohmaterialien zugegen sind. Die Vereinigung von Gasblasen führt gewöhnlich zu einem niedrigeren Massenübertragungskoeffizienten (van't Riet und Tramper, in: Basic Bioreactor Design, S. 236-273 (1991)).
  • Die Sauerstoffübertragung ist oft ein begrenzender Faktor bei Fermentationsverfahren, insbesondere bei Fermentationen filamentöser Mikroorganismen. Die verbesserte Sauerstoffübertragungskapazität, die erhalten wird, wenn die Fermentation mit einem erfindungsgemäßen chemisch definierten Medium durchgeführt wird, bietet einen viel billigeren Weg zur Optimierung der Produktivität als Investitionen in Hardware, wie Energieeingabe, Sauerstoffanreicherung der Einlassluft oder Fermenterdruck.
  • Bei industriellen Fermentationsverfahren werden filamentöse Mirkoorganismen, beispielsweise filamentöse Bakterien, wie Actinomyceten oder filamentöse Pilze, wie Penicillium oder Aspergillus, gewöhnlich mit einer Pelletmorphologie gezüchtet. Diesbezüglich haben Proteine und Peptide, die in komplexen Fermentationsmedien zugegen sind, die Bestrebung zur Produktion flockiger Pellets, die leicht zu einem verteilten Mycel mit sehr langen und verzweigten Hyphen als Folge der hohen Wachstumsraten auseinanderfallen, die gewöhnlich mit den komplexen Medien erhalten werden. Daher kann eine flockige Pelletmorphologie gewöhnlich eine ungewollt hohe Brühenviskosität verursachen. Die Verwendung von chemisch definierten Medien hat einen günstigen Einfluss auf die Morphologie, beispielsweise durch Produktion eines festeren Pellets, das bei der Fermentation nicht leicht auseinander fällt. Auf diese Weise kann eine signifikante Abnahme der Viskosität der filamentösen Fermentationsbrühen mit chemisch definierten Medien erhalten werden. Da eine niedrige Viskosität der Fermentationsbrühe für die Produktbildung vorteilhaft ist, ist die Steuerung der Viskosität bei Fermentationsverfahren im industriellen Umfang von allerhöchster Bedeutung.
  • Ein weiterer Vorteil der Verwendung chemisch definierter Medien wird bei der stromabwärts erfolgenden Verarbeitung des Produktes gefunden. Für bestimmte Stamm-Produkt-Kombinationen, insbesondere wenn filamentöse Stämme fermentiert werden, wird die Verarbeitung stromabwärts signifikant verbessert, indem chemisch definierte Medien verwendet werden.
  • Ein chemisch definiertes Medium, das in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden soll, sollte üblicherweise die sogenannten strukturellen und die sogenannten katalytischen Elemente aufweisen.
  • Strukturelemente sind solche Elemente, die Bestandteile mikrobieller Makromoleküle sind, d.h. Wasserstoff, Sauerstoff, Kohlenstoff, Stickstoff, Phosphor und Schwefel. Die Strukturelemente Wasserstoff, Sauerstoff, Kohlenstoff und Stickstoff sind gewöhnlich in der Kohlenstoff- und Stickstoffquelle enthalten. Phosphor und Schwefel werden gewöhnlich als Phosphat und Sulphat und/oder Thiosulfationen zugegeben.
  • Der Typ der Kohlenstoff- und Stickstoffquelle, die in dem chemisch definierten Medium verwendet wird, ist erfindungsgemäß nicht entscheidend, vorausgesetzt, dass die Kohlenstoff- und Stickstoffquelle im Wesentlichen einen chemisch definierten Charakter aufweisen.
  • Eine Kohlenstoffquelle wird vorzugsweise aus der Gruppe ausgewählt, bestehend aus Kohlenhydraten, wie Glucose, Lactose, Fructose, Saccharose, Maltodextrinen, Stärke und Inulin, Glycerin, Pflanzenölen, Kohlenwasserstoffen, Alkoholen, wie Methanol und Ethanol, organische/n Säuren, wie Acetat und höhere Alkansäuren. Eine Kohlenstoffquelle wird stärker bevorzugt aus der Gruppe ausgewählt, bestehend aus Glucose, Saccharose und Sojaöl. Die Kohlenstoffquelle ist am stärksten bevorzugt Glucose. Der Begriff "Glucose" umfasst selbstverständlich Glucosesirupe, d.h. Glucose-Zusammensetzungen, die Glucoseoligomere in definierten Mengen enthalten.
  • Eine Stickstoffquelle wird vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Harnstoff, Ammoniak, Nitrat, Ammoniumsalzen, wie Ammoniumsulfat, Ammoniumphosphat und Ammoniumnitrat und Aminosäuren, wie Glutamat und Lysin. Eine Stickstoffquelle wird stärker bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Ammoniak, Ammoniumsulfat und Ammoniumphosphat. Die Stickstoffquelle ist am stärksten bevorzugt Ammoniak. Die Verwendung von Ammoniak als Stickstoffquelle hat den Vorteil, dass Ammoniak zusätzlich als pH-Wert-Steuermittel wirken kann. Werden Ammoniumsulfat und/oder Ammoniumphosphat als Stickstoffquelle verwendet, kann ein Teil oder der gesamte Schwefel- und/oder Phosphorbedarf gedeckt werden.
  • Katalytische Elemente sind solche Elemente, die Bestandteile von Enzymen oder Enzymcofaktoren sind. Diese Elemente sind beispielsweise Magnesium, Eisen, Kupfer, Calcium, Mangan, Zink, Kobalt, Molybdän, Selen, Bor.
  • Neben diesen strukturellen und katalytischen Elementen sollten Kationen, wie Kalium- und Natriumionen, vorhanden sein, die als Gegenion und zur Steuerung des intrazellulären pH-Wertes und der Osmolarität dienen.
  • Verbindungen, die gegebenenfalls in einem chemisch definierten Medium enthalten sein können, sind Chelatbildner, wie Citronensäure, und Puffermittel, wie Mono- und Dikaliumphosphat, Calciumcarbonat und dergleichen. Puffermittel werden vorzugsweise zugesetzt, wenn man Verfahren ohne externe pH-Wert-Steuerung durchführt. Zudem kann ein Antischäummittel vor und/oder während des Fermentationsverfahrens zugegeben werden.
  • Makromoleküle und organische Säuren, die in komplexen Medien zugegen sind, bieten in diesen Medien Pufferkapazität. Aufgrund des Fehlens dieser Verbindungen in chemisch definierten Medien, ist die pH-Wert-Steuerung schwieriger in chemisch definierten als in komplexen Medien. Die vorliegende Erfindung zeigt, dass eine pH-Wert-Steuerung, wobei entweder eine Säure oder eine Base zugegeben werden kann, je nach der pH-Wert-Entwicklung in der Brühe, ein korrektes pH-Wert-Profil in einem chemisch definierten Verfahren im industriellen Umfang ermöglicht.
  • Vitamine betreffen eine Gruppe strukturell unverwandter organischer Verbindungen, die für den normalen Stoffwechsel von Mikroorganismen notwendig sind. Mikroorganismen variieren weithin hinsichtlich ihrer Fähigkeit zur Synthese der Vitamine, die sie benötigen. Ein Vitamin sollte zum Fermentationsmedium eines Mikroorganismus zugegeben werden, der das Vitamin nicht synthetisieren kann. Chemisch definierte Fermentationsmedien für Hefen oder Bakterien oder für bestimmte niedere Pilze, beispielsweise Mucorales, können durch ein oder mehrere Vitamin(e) ergänzt werden. Höhere Pilze haben am häufigsten keinen Vitaminbedarf.
  • Vitamine werden ausgewählt aus der Gruppe Thiamin, Riboflavin, Pyridoxal, Nikotinsäure oder Nikotinamid, Pantothensäure, Cyancobalamin, Folsäure, Biotin, Lipoinsäure, Purine, Pyrimidine, Inositol, Cholin und Hämine.
  • Strukturelle und katalytische Elemente und gegebenenfalls Vitamine sind für das Wachstum des Mikroorganismus, d.h. für die Bildung von Biomasse, notwendig.
  • Die Menge der notwendigen Verbindungen, d.h. Verbindungen, die strukturelle und katalytische Elemente und gegebenenfalls Vitamine umfassen, die zu dem chemisch definierten Medium gegeben werden soll, hängt hauptsächlich von der Menge der Biomasse ab, die in dem Fermentationsverfahren gebildet werden soll. Die Menge der entstandenen Biomasse kann weithin variieren, gewöhnlich von etwa 10 bis etwa 150 g/l Fermentationsbrühe. Gewöhnlich sind Fermentationen, die weniger als etwa 10 g/l Biomasse produzieren, industriell nicht relevant.
  • Die Optimalmenge jedes Bestandteils eines definierten Mediums, sowie welche Verbindungen essentiell sind, und welche die nicht-essentiell sind, hängen vom Typ des Mikroorganismus, der in einem definierten Medium fermentiert wird, von der Menge an Biomasse und von dem herzustellenden Produkt ab. Die Verwendung der chemisch definierten Medien ermöglicht daher vorteilhafterweise die Abwandlung der Konzentration von jeder Mediumkomponente, unabhängig von den anderen Komponenten, wodurch auf diese Weise die Optimierung der Medium-Zusammensetzung erleichtert wird.
  • Zur Produktbildung kann es notwendig sein, das chemisch definierte Medium durch zusätzliche Verbindungen zu ergänzen und/oder die Konzentration bestimmter Verbindungen, die bereits in dem chemisch definierten Medium vorhanden sind, über die für das Wachstum der Mirkoorganismen notwendige Menge hinaus, zu erhöhen. Die Funktion der Verbindungen kann sein, dass sie die Produktion einer gewünschten Verbindung durch den Mikroorganismus induzieren oder steigern, oder dass sie als Vorstufe für eine gewünschte Verbindung wirken.
  • Beispiele für Verbindungen, die ergänzt und/oder in einer erhöhten Menge zu einem chemisch definierten Medium zugegeben werden sollen, sind: Sulfat in einer erhöhten Menge zur Herstellung von β-Lactamverbindungen, stickstoffhaltige Verbindungen in einer erhöhten Menge zur Herstellung von Aminosäuren, insbesondere basischen Aminosäuren, Phenylessigsäure zur Herstellung von Penicillin G, Phenoxyessigsäure für die Herstellung von Penicillin V, Adipinsäure zur Herstellung von Adipyl-7-ADCA und Adipyl-7-ACA, Propionsäure zur Herstellung von Erythromycin.
  • In einem erfindungsgemäßen industriellen Fermentationsverfahren kann die Gesamtmenge der Kohlenstoffquelle, die zu dem chemisch definierten Medium gegeben wird, ausgedrückt als Menge Kohlenstoff/Liter Medium von 10 bis 200 g C/l, vorzugsweise von 20 bis 200 g C/l, variieren.
  • Die Gesamtmenge der Stickstoffquelle, die zu dem chemisch definierten Medium gegeben wird, kann von 0,5 bis 50 g N/l, vorzugsweise 1 bis 25 g N/l variieren, wobei N ausgedrückt ist als Kjeldahl-Stickstoff.
  • Das Verhältnis zwischen Kohlenstoff- und Stickstoffquelle in einer Fermentation kann erheblich variieren, wobei eine Determinante für ein optimales Verhältnis zwischen Kohlenstoff- und Stickstoffquelle die elementare Zusammensetzung des zu bildenden Produktes ist.
  • Zusätzliche Verbindungen, die für das Wachstum eines Mikroorganismus erforderlich sind, wie Phosphat, Sulfat oder Spurenelemente, sollen zugegeben werden, wobei die in der Tabelle 1 als Richtlinie angegebenen Konzentrationsbereiche verwendet werden. Die Konzentrationsbereiche dieser zusätzlichen Verbindungen können zwischen verschiedenen Klassen von Mikroorganismen variieren, d.h. zwischen Pilzen, Hefen und Bakterien.
  • Vitaminkonzentrationen fallen im Allgemeinen in den Bereich von 0,1 (Biotin) bis 500 (Myoinositol) mg/l.
  • Die Menge der Mediumkomponenten, die für das Wachstum eines Mikroorganismus erforderlich ist, kann in Bezug auf die in der Fermentation verwendete Menge der Kohlenstoffquelle bestimmt werden, da die entstandene Menge Biomasse vorwiegend von der Menge der verwendeten Kohlenstoffquelle abhängt. Tabelle 1. Übliche Konzentrationsbereiche für Mediumkomponenten neben der Kohlenstoff- und Stickstoffquelle, die für das Wachstum von verschiedenen Klassen von Mikroorganismen nötig sind (g/l).
    Figure 00140001
    • 1 Die grundlegende Menge an benötigtem Phosphat ist 0,5 bis 1% des Trockengewichts der Biomasse. Für diskontinuierliche Verfahren in relativ kleinem Umfang ist zusätzliches Phosphat für die pH-Wert-Steuerung notwendig.
    • 2 Sulfat kann ebenfalls über das Titrationsmittel zugegeben werden, wie K+ und Na+.
    • 3 Sulfat kann (partiell) durch Chlorid als Gegenion in den Spurenelementen ersetzt werden oder umgekehrt.
    • 4 Für einige Spurenelemente sind die unteren Grenzen schwierig zu definieren. Ihr Bedarf kann beispielsweise durch ihre Anwesenheit in anderen Mediumkomponenten gedeckt werden, beispielsweise Eisen(II)sulfat, Wasser, kleine Mengen Hefeextrakt, usw.
    • 5 Phosphat und Sulfat werden als Kalium-, Ammonium- und/oder Natriumsalze zugegeben, mit einer Präferenz von K > NH4 > Na.
  • Ein erfindungsgemäßes industrielles Fermentationsverfahren, das ein chemisch definiertes Medium verwendet, kann als diskontinuierliches, wiederholtes diskontinuierliches, Fed-Batch-, wiederholtes Fed-Batch- oder kontinuierliches Fermentationsverfahren durchgeführt werden.
  • Bei einem diskontinuierlichen Verfahren werden alle Mediumkomponenten als Ganzes zu dem Medium vor dem Beginn des Fermentationsverfahren zugegeben.
  • Bei einem wiederholten diskontinuierlichen Verfahren wird eine partielle Ernte der Brühe, begleitet von einer zusätzlichen Ergänzung des kompletten Mediums, gegebenenfalls mehrmals wiederholt.
  • Bei einem Fed-Batch-Verfahren wird entweder keine oder ein Teil der Verbindungen, die eine oder mehrere strukturelle und/oder katalytische Elemente enthalten, vor dem Beginn der Fermentation zu dem Medium gegeben, und entweder alle bzw. der restliche Teil der Verbindungen, die eine oder mehrere strukturelle und/oder katalytische Elemente umfassen, werden zu dem Fermentationsverfahren gegeben. Die zum Einspeisen ausgewählten Verbindungen können zusammen oder getrennt voneinander in das Fermentationsverfahren eingebracht werden.
  • Insbesondere in einem Fermentationsverfahren, wobei das ursprüngliche Fermentationsmedium etwa zwei- oder mehrfach durch eine Beschickung von Verbindungen verdünnt wird, die eine oder mehrere Strukturelemente enthält, kann die Beschickung zudem katalytische Elemente und zusätzliche Mediumkomponenten neben den Strukturelementen enthalten.
  • Bei einem wiederholten Fed-Batch- oder einem kontinuierlichen Fermentationsverfahren wird das komplette Startmedium zusätzlich während der Fermentation zugeführt. Das Startmedium kann zusammen mit oder getrennt von der oder den Strukturelement-Beschickung(en) zugeführt werden. Bei einem wiederholten Fed-Batch-Verfahren, wird ein Teil der Fermentationsbrühe, die die Biomasse umfasst, in regelmäßigen Zeitintervallen entfernt, wohingegen bei einem kontinuierlichen Verfahren die Entfernung des Teils der Fermentationsbrühe kontinuierlich erfolgt. Bei dem Fermentationsverfahren wird so die Menge an entfernter Fermentationsbrühe durch eine entsprechende Portion frisches Medium wieder ergänzt.
  • Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung kommt ein Fed-Batch- oder ein wiederholtes Fed-Batch-Verfahren zum Einsatz, wobei die Kohlenstoff- und/oder Stickstoffquelle und/oder Phosphat in das Fermentationsverfahren eingebracht werden. Bei einer stärker bevorzugten Ausführungsform werden die Kohlenstoff- und Stickstoffquelle in das Fermentationsverfahren eingebracht. Am stärksten bevorzugt werden Kohlenstoff- und Stickstoffquelle sowie das Phosphat eingebracht. In diesem Zusammenhang ist eine bevorzugte Kohlenstoffquelle Glucose, und eine bevorzugte Stickstoffquelle ist Ammoniak und/oder Ammoniaksalze.
  • Die Verwendung eines Fed-Batchverfahrens ermöglicht gewöhnlich die Verwendung einer erheblich höheren Menge Kohlenstoff- und Stickstoffquelle als in einem diskontinuierlichen Verfahren verwendet wird. Die Menge der in einem Fed-Batch-Verfahren verwendeten Kohlenstoff- und Stickstoffquelle kann mindestens etwa doppelt so groß sein wie die höchste Menge, die in einem diskontinuierlichen Verfahren verwendet wird. Dies wiederum bewirkt, dass eine viel größere Biomasse in einem Fed-Batchverfahren entsteht.
  • Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft die Möglichkeit der Verarbeitung stromabwärts der Fermentationsbrühe. Nach der Beendigung des Fermentationsverfahrens kann der Wertstoff gegebenenfalls aus der Fermentationsbrühe gewonnen werden, wobei eine für den interessierenden Wertstoff entwickelte Standard-Technologie verwendet wird. Diese anzuwendende relevante stromabwärts erfolgende Verarbeitungstechnologie hängt somit von der Beschaffenheit und der zellulären Lokalisation des Wertstoffs ab. Zunächst wird die Biomasse von der Fermentationsflüssigkeit mittels Zentrifugation oder Filtration getrennt. Der Wertstoff wird dann aus der Biomasse gewonnen, wenn er sich in den mikrobiellen Zellen angereichert hat, oder mit diesen assoziiert ist. Wird der Wertstoff aus der mikrobiellen Zelle ausgeschieden, wird dieser andererseits aus der Fermentationsflüssigkeit gewonnen.
  • Die Verwendung eines chemisch definierten Mediums bei der industriellen fermentativen Produktion eines interessierenden Wertstoffs erzeugt einen großen Vorteil bei der stromabwärts erfolgenden Verarbeitung, da die Menge an Nebenprodukten erheblich niedriger ist, als bei der Verwendung komplexer Medien. Die Qualität des Produktes wird zudem verbessert, da keine ungewünschten Nebenprodukte mit der interessierenden Verbindung zusammen isoliert werden.
  • Bei noch einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein geeigneter Stamm für ein industrielles Fermentationsverfahren mit einem chemisch definierten Medium identifiziert.
  • Ein geeigneter mikrobieller Stamm für ein industrielles Fermentationsverfahren, das ein chemisch definiertes Medium verwendet, kann ein Wildtypstamm sein, der einen interessierenden Wertstoff produziert, mit der Maßgabe, dass der Wildtypstamm eine gute Wachstumsleistung auf einem chemisch definierten Medium hat. Zudem kann ein geeigneter mikrobieller Stamm für ein industrielles Fermentationsverfahren, das ein chemisch definiertes Medium verwendet, ein Stamm sein, der erhalten wird und/oder verbessert wird, durch Unterwerfen eines interessierenden Ausgangsstammes einer klassischen Mutagenbehandlung oder einer DNA-Rekombinationstransformation, und zwar ebenfalls mit der Maßgabe, dass der resultierende mutierte oder transformierte mikrobielle Stamm eine gute Wachstumsleistung auf einem chemisch definierten Medium hat. Es hängt daher von der Wachstumsleistung des Ausgangsstammes auf einem chemisch definierten Medium ab, ob die resultierenden mutierten oder transformierten Stämme eine verbesserte oder ähnliche Wachstumsleistung auf einem chemisch definierten Medium verglichen mit dem Ausgangsstamm haben.
  • Ein mikrobieller Stamm hat selbstverständlich eine gute Wachstumsleistung auf einem chemisch definierten Medium, wenn der Stamm eine spezifische Wachstumsrate (μ) auf einem chemisch definierten Medium hat, die ≥ 0,05 Std.–1, vorzugsweise ≥ 0,1 Std.–1, stärker bevorzugt ≥ 0,2 Std.–1 und am stärksten bevorzugt ≥ 0,4 Std.–1 ist. Die Wachstumsleistung eines mikrobiellen Stamms auf einem chemisch definierten Medium wird herkömmlicherweise durch Fermentation des Stammes in einem chemisch definierten Medium in relativ kleinem Umfang analysiert, beispielsweise durch eine Schüttelkolbenkultur und/oder eine 10-Liter-Bench-Fermentation. Vorzugsweise wird eine 10-Liter-Bench-Fermentation mit einer pH-Wert- Temperatur- und Sauerstoff-Konzentrationssteuerung bei der Analyse der Wachstumsleistung verwendet.
  • Bei einer Ausführungsform der Erfindung werden die mikrobiellen Stämme, die in einem chemisch definierten Medium fermentiert werden können, durch Unterwerfen eines interessierenden Ausgangsstammes einer klassischen Mutagenbehandlung mit physikalischen Mitteln, wie UV-Bestrahlung, oder einem geeigneten chemischen Mutagen, wie N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin oder Ethylmethansulfonat, erhalten und/oder verbessert. Bei einer anderen Ausführungsform der Erfindung werden mikrobielle Stämme, die in einem chemisch definierten Medium fermentiert werden können, durch Unterwerfen eines interessierenden Ausgangsstammes einer DNA-Rekombinationstechnik erhalten und/oder verbessert, wodurch der Ausgangsstamm mit einer oder mehreren funktionellen interessierenden Genen transformiert wird.
  • Die vorliegende Erfindung fasst zwei Gruppen von interessierenden Ausgangsstämmen ins Auge, die einer klassischen Mutagenese und/oder einer DNA-Transformation unterworfen werden sollen. Bei einer Ausführungsform der Erfindung wird ein interessierender Ausgangsstamm aus der Gruppe von Stämmen selektiert, die eine gute Wachstumsleistung auf einem chemisch definierten Medium haben, die aber in Bezug auf ihre Produktionsmenge einer interessierenden Verbindung verbessert werden sollen. Bei einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird ein interessierender Ausgangsstamm aus der Gruppe von Stämmen ausgewählt, die eine hohe Produktionsmenge einer interessierenden Verbindung aufweisen, die aber eine schlechte Wachstumsleistung auf einem chemisch definierten Medium haben. Mikrobielle Stämme mit einer spezifischen Wachstumsrate, die kleiner als etwa 0,05 Std.–1 ist, haben eine relativ schlechte Wachstumsleistung auf einem chemisch definierten Medium.
  • Beiden Verfahren, der klassischen Mutagenbehandlung als auch dem DNA-Transformationsverfahren, folgt ein Screening der resultierenden Mutanten oder Transformanten auf ihre Wachstumsleistungen auf einem chemisch definierten Medium und ihre Produktionsmenge einer interessierenden Verbindung. Es werden mutierte Stämme oder Transformanten selektiert, welche eine gute Wachstumsleistung auf einem chemisch definierten Medium und/oder eine verbesserte Produktionsmenge einer interessierenden Verbindung verglichen mit dem Ausgangsstamm aufweisen.
  • Man beachte, dass einige mikrobielle Stämme insbesondere industrielle Stämme, die bereits einer ausgiebigen Mutagenbehandlung unterworfen wurden, um die Produktionsmengen zu verbessern, eine schlechte Leistung erbringen oder in einem chemisch definierten Medium überhaupt nicht wachsen können. Eine solche schlechte Leistung oder ein Fehlen von Wachstum eines mutagenisierten Stammes kann durch die Tatsache verursacht werden, dass das Wachstum auf einem chemisch definierten Medium niemals als Kriterium zur Auswahl der geeigneten Mutanten angewendet wurde. Es ist beispielsweise möglich, dass ein mutagenisierter Stamm eine Mutation besitzt, die einen unbekannten Wachstumsbedarf (unbekannte auxotrophe Mutation) verursacht.
  • Mikrobielle Stämme, die sich zur industriellen Fermentation mit einem chemisch definierten Medium eignen, umfassen filamentöse und nicht-filamentöse Stämme. Mikrobielle Stämme, die sich beispielsweise zur Fermentation in einem chemisch definierten Medium eignen, umfassen Pilzstämme, wie Aspergillus, Penicillium oder Mucorales, Hefestämme, wie Saccharomyces-, Pichia-, Phaffia-, oder Kluyveromyces-Stämme und bakterielle Stämme, wie die Actinomyceten. Die Verwendung der erfindungsgemäßen chemisch definierten Medien ist besonders geeignet zur industriellen Fermentation filamentöser Mikroorganismen.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren, das ein chemisch definiertes Medium verwendet, eignet sich zur fermentativen Produktion im industriellen Umfang von einer beliebigen interessierenden Verbindung, wozu primäre oder sekundäre Metaboliten, pharmazeutische Proteine oder Peptide oder industrielle Enzyme gehören. Bevorzugte Wertstoffe sind sekundäre Metabolite, wie Antibiotika oder β-Lactamverbindungen, insbesondere β-Lactam-Antibiotika.
  • Beispiele für Stamm-Produkt-Kombinationen umfassen A. niger, beispielsweise A. niger CBS 513.88, für Amyloglucosidase, A. oryzae für α-Amylase, A. terreus, beispielsweise A. terreus CBS 456.95, für Lovastatin, Mortierella alpina für Arachidonsäure oder Lipid, das Arachidonsäure enthält, Mucor miehei für Protease, P. chrysogenum, beispielsweise P. chrysogenum CBS 455.95 oder andere geeignete Stämme, für β-Lactam-Verbindungen (Penicillin G oder V), Streptomyces clavuligerus, beispielsweise S. clavuligerus ATCC 27064, für Clavulansäure, Pichia ciferrii, beispielsweise P. ciferrii NRRL Y-1031 F-60-10, für Tetraacetylphytosphingosin, Phaffia rhodozyma, beispielsweise P. rhodozyma CBS 6938, für Astaxanthin, Saccharopolyspora erythraea für Erythromycin, K. lactis für Lactase, Streptomyces natalensis für Natamycin.
  • Die vorliegende Erfindung fasst auch die Verwendung mikrobieller Stämme ins Auge, die mit einem oder mehreren interessierenden funktionellen Genen transformiert wurden, was einen transformierten Stamm hervorbringt, der ein Produkt überexprimieren kann, das von dem Stamm bereits produziert wird, oder was einen transformierten Stamm hervorbringt, der ein Produkt exprimieren kann, das von diesem Stamm nicht natürlich produziert wird.
  • Es wird somit der Auswahl des Fachmannes überlassen, welcher Stamm für die Transformation selektiert wird, vorausgesetzt, der selektierte Stamm hat eine gute Wachstumseigenschaft auf einem chemisch definierten Medium. Es kann beispielsweise ein Stamm zur Transformation selektiert werden, der bereits einer oder mehreren Mutagenbehandlungen unterworfen wurde. Alternativ kann ein nicht-mutagenisierter oder Wildtyp-Stamm selektiert werden. Neben der Analyse der Expressionsmenge einer gewünschten Verbindung sollten Transformanten, die nach der Transformation eines selektierten Stammes mit einem oder mehreren interessierenden funktionellen Genen erhalten wurden, auf ihre Wachstumsleistung auf einem chemisch definierten Medium analysiert werden.
  • Beispiele für rekombinante Stämme, die ein Produkt hervorbringen, das von dem Stamm nicht natürlich produziert wird, sind:
    • • Streptomyces lividans, beispielsweise S. lividans TK21, mit einer Expressionscassette, die die Expression von Glucoseisomerase ermöglicht, wobei das Gen, das die Glucoseisomerase codiert, aus beispielsweise Actinoplanes missouriensis stammt,
    • • Penicillium chrysogenum, beispielsweise P. chrysogenum CBS 455.95, mit einer oder mehreren Expressionscassetten, die die Expression einer Expandase und gegebenenfalls einer Hydroxylase und/oder einer Acetyltransferase ermöglichen, wobei die Gene, die die Expandase, Hydroxylase und Acetyltransferase codieren, beispielsweise aus Acremonium chrysogenum oder Streptomyces clavuligerus stammen, was die Produktion von Cephalosporin-Verbindungen ermöglicht, wie 7-ADCA oder 7-ACA, wobei Adipinsäure (siehe EP 532341 ) oder 3-Carboxymethylthiopropionsäure (siehe WO95/04148) als Seitenkettenvorstufe verwendet wird,
    • • Aspergillus niger, beispielsweise Aspergillus niger CBS 513.88 mit einer Expressionscassette, die die Expression von Human-Lactoferrin (siehe WO 93/22348) oder Rinder-Chymosin ermöglicht.
    • • Kluyveromyces lactis mit einer Expressionscassette, die die Expression von Rinder-Chymosin oder Phospholipase A2, Insulin oder rekombinantem Human-Albumin ermöglicht. Beispiele für rekombinante Stämme, die ein Enzym überproduzieren, das bereits von dem Stamm produziert wird, sind:
    • • A. niger, beispielsweise A. niger CBS 513.88, mit einer Expressionscassette, die die Überexpression von Phytase (siehe EP 420358 ) oder Endoxylanase I (siehe EP 463706 ) ermöglicht.
  • Die vorliegende Erfindung wird durch ein Fermentationsverfahren im industriellen Umfang veranschaulicht, wobei ein chemisch definiertes Medium für die Herstellung von Glucoseisomerase durch einen rekombinanten Streptomyces-Stamm verwendet wird, und durch die vorteilhafte Verwendung chemisch definierter Medien für die Penicillium-Fermentation im großen Umfang, verglichen mit komplexen Medien.
  • Zusätzliche Beispiele betreffen chemisch definierte Medien, die zum Messen der Wachstumsleistung und der Produktivität eines interessierenden Stammes verwendet werden können, wenn er in solch einem Medium im kleinen Umfang gezüchtet wird, um mikrobielle Stämme zu identifizieren, die sich zur fermentativen Produktion eines Wertstoffs eignen oder im industriellen Umfang in einem chemisch definierten Medium.
  • Kurze Beschreibung der Figuren
  • 1. Karte von pWGx.GIT.
  • 2. Entwicklung der Gesamt-Glucoseisomerase, die während der Fermentation hergestellt wird.
  • Beispiel 1
  • Industrielle Herstellung von Glucoseisomerase mit Streptomyces lividans
  • Konstruktion eines Streptomyces-Stammes, der Glucoseisomerase produziert
  • Das Glucoseisomerase-Gen aus Actinoplanes missouriensis wurde ursprünglich als 5,0 kb DNA-Fragment in E. coli K12-Stamm JM101 kloniert.
  • Ein 1,7 kb Fragment, das sich in dem 5,0 kb Fragment befindet, veranschaulicht Befunden zufolge die vollständige codierende Sequenz von Glucoseisomerase aus A. missouriensis und ihren stromabwärts gelegenen regulatorischen Bereich (siehe ebenfalls Amore und Hollenberg (1989), Nucl. Acids Res. 17, 7515).
  • Eine Glucoseisomerase-Mutante, die eine verstärkte Thermostabilität aufweist, wurde erhalten durch Ändern des Lysin codierenden Tripletts AAG innerhalb des Glucoseisomerasegens an der Position 253 des Glucoseisomeraseproteins zu einem Arginin codierenden CGG (Quax et al., (1991), Bio/Technology 9, 738-742).
  • Zur Klonierung in Streptomyces wurde Plasmid pIJ486 (Ward et al., (1986) Mol. Gen. Genet. 203, 468-478) als Vektor verwendet. Das 1737 Basenpaare große DNA-Fragment aus A. missouriensis, das die Glucoseisomerase codiert, wurde mit dem großen PstI-DNA-Fragment von pIJ486 kombiniert. Das resultierende Plasmid mit der Bezeichnung pWGx.GIT enthielt im Wesentlichen den Replikationsursprung von Plasmid pIJ101, das Thiostrepton-Resistenzgen und das GIT codierende A. missouriensis DNA-Fragment. Eine schematische Karte von pWGx.GIT ist in der 1 gezeigt.
  • Der Glucoseisomerase produzierende Stamm wurde konstruiert durch Transformation des Streptomyces lividans-Stammes TK21 (Hopwood et al., (1985), Genetic Manipulation of Streptomyces: A Laboratory Manual. The John Innes Foundation, Norwich, England) mit Plasmid pWGx.GIT.
  • Industrielle Produktion von Glucoseisomerase
  • Eine Arbeitszellbank eines Produktionsstammes, der wie in Beispiel 1 erwähnt konstruiert wurde, wurde hergestellt, indem man eine Thiostrepton-resistente Kolonie abimpft und sie in 20 ml Trypton Soyton Brühe, die Thiostrepton (50 mg/l) enthielt, in einem 100 ml Schüttelkolben bei 30°C für 40 bis 48 Std. und Schütteln bei 280 U/min züchtet.
  • Mycel, äquivalent zu 1 ml Arbeitszellbank (frisch oder als gefrorenes Mycel bei –80°C aufbewahrt) wird in 100 ml Animpf-Wachstumsmedium in einem 500 ml Schüttelkolben, der 16 g/l Bactopepton (Difco 0123/01), 4 g/l Bacto Soyton (Difco 0436/01) 20 g/l Caseinhydrolysat (Merck 2239), 10 g/l Dikaliumphosphat 3 H2O (Merck, Anal. Reagenz), 16,5 g/l Glucose·1 H2O, 0,6 g/l Sojaöl und 50 mg/l Thiostrepton enthielt, überimpft. Der pH-Wert des Mediums wird mit Natriumhydroxid und/oder Schwefelsäure vor der Sterilisation auf 7,0 eingestellt. Glucose und Thiostrepton werden getrennt nach der Sterilisation zugegeben. Thiostrepton wird bei einer Konzentration von 50 g/l in DMSO gelöst und über einem 0,2 μm Nalgene-Filter steril filtriert. Die Kultur wird für 24 Std. bei 30°C in einem Schüttelinkubator bei 280 U/min gezüchtet.
  • 50 ml der vollständig gezüchteten Kultur wird in 6 1 Wachstumsmedium des Impfgutes der zweiten Phase überführt, dessen Zusammensetzung dem vorstehend genannten Medium ähnelt, außer dass eine doppelte Glucosekonzentration (33 g/l Glucose·1 H2O), zusätzlicher Schaumhemmer (SAG5693, 0,6 g/l; ein Silicium-Schaumhemmer von der Firma Basildon) und kein Thiostrepton vorhanden war. Glucose wird wiederum getrennt in einer 50%igen Lösung sterilisiert und nach der Sterilisation des Mediums (60 min, 121°C) zugegeben. Die Kultur wird 36 Std. in einer sterilisierten Blasensäule gezüchtet, die mit 840 1 steriler Luft/Std. aus einer Düse mit 4 Löchern mit 2 mm Durchmesser belüftet wird, und die Temperatur wird bei 22°C gehalten. Alternativ kann diese Phase in Schüttelkolben durchgeführt werden (beispielsweise 12 × 500 ml Medium in 2-Liter-Erlenmeyerkolben mit Schikanen), wobei ähnliche Impfverhältnisse verwendet werden und bei 280 U/min in einem Rundschüttelinkubator geschüttelt wird.
  • Die vollständig gezüchtete Kultur wird aseptisch in einen Animpf-Fermenter überführt, der 4,5 m3 Impfmedium mit 16,3 kg Citronensäure·1 H2O, 70,8 g Ferrosulfat·7 H2O, 109 g Zinksulfat·7 H2O, 109 g Mangansulfat·1 H2O, 32,7 g Kobaltdichlorid·6 H2O, 5,45 g Dinatriummolybdat·2 H2O, 5,45 g Borsäure, 5,45 g Kupfersulfat·5 H2O, 10,9 kg Diammoniumsulfat, 10,9 kg Magnesiumsulfat·7 H2O, 463 g Calciumchlorid 2 H2O, 1090 g Sojaöl, 21,8 kg Monokaliumphosphat und 139 kg Glucose·1 H2O und 5,9 kg Hefeextrakt (Bierhefe mit 10% Kjeldahl-Stickstoff, bezogen auf das Trockengewicht) enthält. Das Medium wird folgendermaßen hergestellt; sämtliche Komponenten außer Glucose werden in der angegebenen Reihenfolge in etwa 2700 1 Leitungswasser gegeben. Der pH-Wert wird mit Natriumhydroxid und/oder Phosphorsäure auf 4,5 eingestellt, und das Medium wird für 60 min bei 122°C sterilisiert. Die Glucose wird in 1000 1 Wasser bei pH-Wert 4,5 für 60 min bei 122°C in einem gesonderten Gefäß sterilisiert. Nach dem Abkühlen der beiden Portionen wird die Glucose steril in das Impfgefäß überführt. Nach dem Mischen der beiden Portionen wird der pH-Wert mit Ammoniak auf 7,0 eingestellt, und das Volumen wird mit sterilem Wasser auf 4,5 m3 eingestellt. Die Temperatur der Fermentation wird auf 30°C eingestellt, und der Fermenter wird bei 0,5-1,0 vvm belüftet, wohingegen der pH-Wert mit gasförmigem Ammoniak bei 7,0 ± 0,1 gehalten wird, und der Überdruck bei 1,3 bis 1,4 bar gehalten wird. Das Schäumen wird nötigenfalls mit einem sterilisierten Gemisch von Sojaöl und einem Silicium-Schaumhemmer, wie SAG5693, in einem Verhältnis von 3:1 unterdrückt. Die Sauerstoffkonzentration wird über 25% der Luftsättigung gehalten, indem die Rührergeschwindigkeit (0,5 bis 3 Kw/m3 eingestellt wird. Die Kultur wird zur Hauptfermentation überführt, bevor die gesamte Glucose verbraucht ist (wie in sämtlichen vorhergehenden Wachstumsphasen) und bevor die Sauerstoffaufnahmerate über einen Spiegel von 30 mmol/l Brühenvolumen·Std. steigt.
  • Das Hauptfermentationsmedium enthält 245,1 kg Citronensäure·1 H2O, 1062 g Eisensulfat·7 H2O, 1634 g Zinksulfat·7 H2O, 1634 g Mangansulfat·1 H2O, 490 g Cobaltdichlorid·6 H2O, 82 g Dinatriummolybdat 2 H2O, 82 g Borsäure, 82 g Kupfersulfat·5 H2O, 163,4 kg Diammoniumsulfat, 163,4 kg Magnesiumsulfat·7 H2O, 6,94 kg Calciumdichlorid·2 H2O, 16,3 kg Sojaöl, 327 kg Monokaliumphosphat, 880 kg Bierhefeextrakt (10% Kj-N, bezogen auf das Trockengewicht) und 556 kg Glucose·1 H2O. Das Medium wird hergestellt wie für die Impf-Fermentation beschrieben (die Glucose wird gesondert sterilisiert). Für Glucose kann alternativ ein DE-95-Zuckersirup verwendet werden. Das Volumen des Mediums vor dem Animpfen ist 65 m3 nach der Korrektur des pH-Wertes auf 7,0 mit Ammoniak.
  • Eine Glucosebeschickung wird hergestellt mit 275 bis 550 g Glucose/l Beschickungslösung, entweder als Glucose·1 H2O oder als Glucoseäquivalente aus einem > 90-DE-Sirup. Der pH-Wert wird auf 4,5 bis 5,0 mit einer Phosphorsäurelösung eingestellt. Die Sterilisation erfolgt entweder diskontinuierlich (122°C, 45 min) oder kontinuierlich über einen Hitzeschock oder Filterhärten.
  • Die Hauptfermentation wird bei 30°C ± 0,5 und pH-Wert 7,0 ± 0,1 (unter Verwendung einer pH-Wert-Steuerung mit Ammoniak und Phosphorsäure) gesteuert. Der Luftstrom wird bei 0,5 bis 1,5 vvm, vorzugsweise 0,7 vvm eingestellt, der Überdruck ist 0,5 bis 1,5 bar; und der Fermenter wird mit Rushton-Turbinen bei einer Intensität von 0,5 bis 3 Kw/m3 gerührt, damit verhindert wird, dass die Sauerstoffkonzentration unter 0,2 mmol/l fällt, gemessen an der unteren Rührerhöhe. Die Glucosebeschickung wird begonnen, wenn ein plötzlicher Abfall der Sauerstoffaufnahmerate auftritt und die Konzentration an gelöstem Sauerstoff sowie der pH-Wert zunimmt, der sich von 6,9 auf 7,1 ändert. Die Glucosekonzentration in der Brühe sollte zu diesem Zeitpunkt << 0,2 g/l sein.
  • Die Glucosebeschickungsrate ist äquivalent zu 93 kg Glucose/Std. und steigt zu Beginn linear auf 186 kg/Std. 64 Std. nach dem Beginn der Beschickung. Nach 100 Beschickungsstunden bei 186 kg/Std. wird die Beschickungsrate auf 298 kg Glucose/Std. bis zu etwa 200 Beschickungsstunden erhöht.
  • Das Schäumen wird durch Einführen von sterilem Sojaöl bei 5,5 kg/Std. oder alternativ in Schüben von 45 kg alle 8 Std. während der ersten 100 Std. der Fermentation unterdrückt. Eine weitere Schaumsteuerung erfolgt nötigenfalls mit einem Gemisch von Sojaöl und einem Silicium-Schaumhemmer, wie SAG471 (der Silicium-Schaumhemmer von Basildon) in einem Verhältnis von 3:1.
  • Die Ammoniakkonzentration wird zwischen 750 und 1500 mg/l gehalten, indem alle 12 Std. gemessen wird und steriles Ammoniumsulfat in Portionen äquivalent zu 500 mg Ammoniak/l zugegeben wird, sobald der Spiegel unter 1000 mg/l gefallen ist.
  • Die Phosphatkonzentration in dem Kulturfiltrat sollte höher als 500 mg PO4/l gehalten werden, indem steriles Monokaliumphosphat in Portionen, die äquivalent zu 500 mg/l sind, zugegeben wird.
  • Die Produktion von Glucoseisomerase kann als aus der Brühe geerntet es und gereinigtes Protein gemessen werden, gefolgt von Proteinbestimmungsverfahren, die im Stand der Technik bekannt sind, oder in einem Enzymassay untersucht werden, der an einer stabilisierten Brühenprobe durchgeführt wird. Die Brühenproben werden stabilisiert, indem 2 g Brühe abgewogen werden und 5 ml Stabilisatorlösung zugegeben wird, die 12 g/l Tris-Hydroxymethylaminomethan und 2,4 g/l CoCl2·6 H2O enthält, was anschließend für 30 min bei 73°C erhitzt wird. Nach dem Abkühlen werden 0,42 ml stabilisierte Probe mit 0,8 ml Glucoselösung (mit 27,25 g/l Tris/HCl-Puffer pH-Wert 8,2, Glucose 67,56 g/l, MgCl2·6 H2O, 22,33 g/l Na2-EDTA·2 H2O und 5 mg/l Triton X-100) gemischt und bei 60°C inkubiert. Die Aktivität wird durch Messen der Umwandlungsraten von Glucose nach Fructose bestimmt und als GU/g ausgedrückt. (1 GU ist die Enzymmenge, die zur Bildung von 1 μmol Fructose/min. erforderlich ist.) Mit der spezifischen Aktivität von 12 Einheiten pro mg Protein kann die Proteinmenge pro kg Brühe bestimmt werden.
  • In 2 ist die Gesamtmenge an erzeugtem Enzym angegeben.
  • Wie in diesem Beispiel gezeigt können 850 kg Enzym in einem Fed-Batch-Produktionslauf hergestellt werden.
  • Beispiel 2
  • Herstellung von Penicillin V
  • Konidiosporen eines P. chrysogenum CBS 455.95 (oder eines anderen geeigneten Stammes, der von Wisconsin 54.1255 durch Mutation und Selektion auf eine höhere Produktivität hergeleitet wurde, vorzugsweise in dem Rezept, wie nachstehend beschrieben) werden mit 105 bis 106 Konidien/ml in einem Produktionsmedium angeimpft, welches 5 g/l Glucose·H2O; 80 g/l Lactose H2O; 4,5 g/l (NH2)2CO; 1,1 g/l (NH4)2SO4; 2,9 g/l Na2SO4; 5,2 g/l KH2PO4; 4,8 g/l K2HPO4·3 H2O; 10 ml/l Spurenelementelösung (150 g/l Citronensäure·H2O; 15 g/l FeSO4·7 H2O; 150 g/l MgSO4·7 H2O; 0,0075 g/l H3BO3; 0,24 g/l CuSO4·5 H2O; 0,375 g/l CoSO4·7 H2O; 1,5 g/l ZnSO4·7 H2O; 2,28 g/l MnSO4·H2O; 0,99 g/l CaCl2·2H2O); 75 ml/l Kaliumphenoxyacetatlösung, pH-Wert 7 (pH-Wert vor der Sterilisation = 6,5) enthält.
  • Die Kultur wird bei 25°C in einem Rundschüttler bei 280 U/min für 144 bis 168 Std. inkubiert. Am Ende der Fermentation wird das Mycel durch Zentrifugation oder Filtration entfernt, und die Menge quantifiziert, und das Medium wird durch HPLC-Verfahren des Standes der Technik auf das entstandene Penicillin untersucht.
  • Beispiel 3
  • Penicillium-Fermentation im großen Umfang mit komplexen und definierten Medien
  • Penicillium chrysogenum Wisconsin 54.1255 wurde auf das Wachstum und die Penicillium-Produktion auf einem chemisch definierten Medium durch Mutation und Selektion auf definierten Medien, wie in Beispiel 2 beschrieben, optimiert. Fed-Batch-Fermentationen erfolgten im 60 m3 Umfang mit einem komplexen Medium, wie beschrieben von Hersbach et al. (Biotechnology of Industrial Antibiotics S 45-140, Marcel Dekker Inc. 1984, Tabelle 4, Medium B, einschließlich der Salze, wie unter Medium A erwähnt), das 50 kg/m3 Maisquellfeststoffe enthielt. Parallel dazu erfolgte eine Fermentation in einem definierten Medium, wie in Beispiel 2 angegeben, wobei die Dosierungen wegen der hohen Zelldichteeigenschaft dieser Fed-Batch-Fermentationen verdoppelt wurden, wohingegen Lactose und Harnstoff weg gelassen wurden. Die Glucose wurde in den Fermenter eingeleitet, wobei die Glucosekonzentration unter 2 g/l gehalten wurde, um eine Glucoserepression vermieden wurde. Ammonium, Diammoniumsulfat und Phenylessigsäure wurden in den Fermenter geleitet, um den pH-Wert und die Konzentrationen von Ammonium, Sulfat und Phenylessigsäure in den gewünschten Bereichen zu steuern (Hersbach 1984).
  • Da die Sauerstoffübertragung ein wichtiger Parameter bei der Bestimmung der ökonomischen Machbarkeit eines industriellen Fermentationsverfahren ist, wurde die Leistung der vorstehenden Fermentationsverfahren analysiert, indem das Ausmaß der Sauerstoffübertragung in jedem Verfahren bestimmt wurde.
  • Ein gutes Maß für die Sauerstoffübertragung, die in einem Fermentationsverfahren erhalten wird, ist der relative kLa-Wert, wie er in einem System bestimmt wird. kLa ist definiert als der Sauerstoffübertragungskoeffizient und wird gemäß van't Riet und Tramper (Basic Bioreactor Design, Marcel Dekker Inc. (1991), S. 236-273) berechnet.
  • Die Sauerstoffübertragungskapazität, berechnet als der kLa-Wert lag Befunden zufolge während des Hauptteils der Fermentierung zwischen 10 und 20% höher in dem chemisch definierten Medium als im komplexen Medium.
  • Beispiel 4
  • Produktion von 7-ADCA
  • Das in Beispiel 2 beschriebene Verfahren wird modifiziert durch Verwendung eines P. chrysogenum-Stammes CBS 455.95 (oder eines anderen geeigneten Stammes, der von Wisconsin 54.1255 durch Mutation und Selektion auf höhere Produktivität hergeleitet wurde, vorzugsweise in dem nachstehend aufgeführten Rezept), der mit einer Expandase-Expressionscassette transformiert wird, wobei der Bereich, der die Expandase codiert, den IPNS-Promotor, wie in EP 532341 aufweist, und unter Verwendung einer 10%igen Kaliumadipatlösung anstelle von Phenoxyacetat und unter Verwendung einer Modifikation des vorstehenden Mediums, das 400 ml einer 10%igen Kaliumadipatlösung, pH-Wert 5,5, anstelle von Phenoxyacetat enthält (pH-Wert des Mediums vor der Sterilisation 5,5 anstelle von 6,5).
  • Das resultierende Adipoyl-7-ADCA wird anschließend in 7-ADCA umgewandelt, wobei das enzymatische Deacylierungsverfahren verwendet wird, wie es im Wesentlichen in Beispiel 4 oder 5 von WO95/04148 beschrieben ist.
  • Beispiel 5
  • Produktion von Lovastatin
  • Konidiosporen des Aspergillus-terreus-Stammes CBS 456.95 (oder Stämme, die davon durch Mutation und Selektion auf eine höhere Produktivität hergeleitet sind, vorzugsweise in einem der Rezepte, wie nachstehend aufgeführt) werden bei 105 bis 106 Konidien/ml in einem Produktionsmedium angeimpft, welches 40,0 g/l Dextrose; 2,2 g/l CH3COONH4; 4 g/l Na2SO4; 3,6 g/l KH2PO4; 35,1 g/l K2HPO4·3 H2O; 10 ml/l Spurenelementelösung (siehe oben, Bsp. 2) enthält.
  • Die Kultur wird bei 28°C in einem Rundschüttler bei 220 U/min für 144-168 Std. inkubiert. Am Ende der Fermentation wird das Mycel durch Zentrifugation oder Filtration entfernt, und die Menge quantifiziert, und das Medium wird durch HPLC-Verfahren des Standes der Technik auf das entstandene Lovastatin untersucht.
  • Beispiel 6
  • Produktion von Clavulansäure
  • Der Streptomyces-clavuligerus Stamm ATCC 27064 oder eine Mutante davon wird in ein Vorkulturmedium überimpft, das aus 2,75 g/l (NH4)2SO4; 0,5 g/l KH2PO4; 0,5 g/l MgSO4·7 H2O; 0,01 g/l CaCl2·2 H2O, 21 g/l 3-(N-Morpholino)propansulfonsäure; 19,9 g/l Glycerin; 5,5 g/l Natriumsuccinat; 0,06 ml/l Spurenelementelösung (2, 8 g/l ZnSO4·7 H2O; 2,7 g/l Eisen(III)ammoniumcitrat; 0,125 g/l CuSO4·5 H2O; 1 g/l MnSO4·H2O; 0,1 g/l CoCl2·6 H2O; 0,16 g/l Na2B4O7·10 H2O; 0,054 g/l Na2MoO4·2 H2O) besteht.
  • Die Kultur wird in einem Rundschüttler bei 220 U/min bei 28°C für 48 bis 72 Std. inkubiert und zum Animpfen von 20 Volumina Produktionsmedium verwendet, welches 2 g/l (NH4)2SO4; 4 g/l Asparagin; 1, 5 g/l KH2PO4; 0,5 g/l MgSO4·7 H2O; 0,01 g/l CaCl2·2 H2O; 21 g/l 3-(N-Morpholino)-propansulfonsäure; 19,9 g/l Glycerin; 5,5 g/l Natriumsuccinat; 0,06 ml/l Spurenelementelösung (siehe oben); 0,5 g/l FeSO4·7 H2O; 0,1 g/l MnCl2·4 H2O; 0,1 g/l ZnSO4·7 H2O enthält.
  • Die Inkubation wird für 144 Std. fortgesetzt, vorzugsweise in einem 500 ml-Erlenmeyerkolben mit Schikanen, der 50 ml Kulturvolumen enthält. Am Ende der Fermentation wird das Mycel durch Zentrifugation oder Filtration entfernt, und die Menge quantifiziert, und das Filtrat wird durch HPLC-Verfahren des Standes der Technik untersucht.
  • Beispiel 7
  • Produktion von Amyloglucosidase
  • Der Aspergillus-niger-Stamm CBS 513.88 oder eine Mutante davon wird mit 105 bis 106 Konidiosporen/ml in ein Keimungsmedium überimpft, das aus 0,75 g/l K2HPO4·3 H2O; 6,6 g/l KH2PO4; 5,3 g/l Na3citrat·3 H2O; 0,45 g/l Citronensäure·H2O; 25 g/l Glucose·H2O; 8 g/l (NH4)2504; 0,5 g/l NaCl; 0,5 g/l MgSO4·7 H2O; 0,1 g/l FeSO4·7 H2O; 0,05 g ZnSO4·7 H2O; 0,005 g/l CaCl2; 0,0025 g/l CuSO4·5 H2O; 0,0005 g/l MnSO4·4 H2O; 0,0005 g/l H3BO3; 0,0005 g/l Na2MoO4·2 H2O; 0,13 g/l EDTA; 3 g/l Tween 80 besteht. Nötigenfalls kann 50 μg/ml Arginin und/oder Prolin zur Verbesserung der Keimung zugegeben werden.
  • Die Kultur wird in einem Rundschüttler für 48 bis 72 Std. bei 33°C, 295 U/min inkubiert und dann zum Animpfen von 10 bis 20 Volumina eines Produktionsmediums verwendet, das aus 1-5 g/l KH2PO4; 0,5 g/l Na2HPO4·H2O; 53 g/l Na3citrat·3 H2O; 4,05 g/l Citronensäure·H2O, 70 g/l Dextrosepolymere; 8 g/l (NH4)2SO4 (NaCl; MgSO4·7 H2O, FeSO4·7 H2O, ZnSO4·7 H2O, CaCl2, CuSO4·5 H2O, MnSO4·4 H2O, H3BO3, Na2MoO4·2 H2O, EDTA): genauso wie beim Keimungsmedium, besteht.
  • Die Inkubation wird 96 Std. fortgesetzt, vorzugsweise in einem 500 ml Erlenmeyerkolben mit 100 ml Medium. Am Ende der Fermentation wird das Mycel durch Zentrifugation oder Filtration entfernt, und die Menge quantifiziert, und das Filtrat wird auf amylolytische Aktivität untersucht.
  • Beispiel 8
  • Produktion von Astaxanthin
  • Der Phaffia-rhodozyma-Stamm CBS 6938 oder eine Mutante davon wird in 25 ml eines Vorkulturmediums überimpft, welches 10 g/l Hefeextrakt, 20 g/l Pepton; 20 g/l Glucose enthält.
  • Die Kultur wird 72 Std. bei 20°C in einem 100 ml Erlenmeyerkolben mit Schikane in einem Rundschüttler bei 275 U/min inkubiert.
  • 1 ml der Vorkultur wird dann zum Animpfen von 100 ml eines Produktionsmediums verwendet, welches 30 g/l Glucose; 4,83 g/l NH4Cl; 0,88 g/l MgSO4·7 H2O; 0,06 g/l NaCl; 0,15 g/l CaCl2·6 H2O; 0,3 ml/l Spurenelementelösung (50 g/l Citronensäure·H2O; 90 g/l (NH4)2Fe(SO4)2·6 H2O; 16,7 g/l ZnSO4·7 H2O; 2,5 g/l CuSO4·5 H2O; 2 g/l MnSO4·4 H2O; 2 g/l H3BO3; 2 g/l Na2MoO4·2 H2O; 0,5 g/l KI; in 0,4N H2SO4); 1-5 ml/l Vitaminlösung (40 g/l Myoinositol; 2 g/l Nikotinsäure; 2 g/l Ca-D-pantothenat; 2 g/l Vitamin B1; 1,2 g/l p-Aminobenzoesäure; 0,2 g/l Vitamin B6; 0,008 g/l Biotin; in 0, 07N H2SO4); 0, 04 g/l Pluronic; 1 g/l KH2PO4; 20 g/l Kaliumhydrogenphthalat (pH-Wert vor der Sterilisation 5,4) enthält.
  • Die Inkubation wird für 96 Std. vorzugsweise in einem 500 ml Erlenmeyer-Kolben mit Schikane fortgesetzt. Am Ende der Fermentation wird der Astaxanthin-Gehalt der Biomasse (Menge quantifiziert) durch Lösungsmittel-Extraktion und Messen der optischen Dichte des Extraktes bei 470 bis 490 nm bestimmt.
  • Beispiel 9
  • Produktion von Arachidonsäure
  • Ein 1-ml-Gefäß einer Suspension des Mortierella alpina-Stammes ATCC 16266, der bei –80°C aufbewahrt wird, wird steril geöffnet, und der Inhalt wird zum Animpfen von 500 ml eines Produktionsmediums verwendet, welches 70 g/l Glucose; 0,5 g/l Hefeextrakt; 3,0 g/l NH4NO3; 7,2 g/l KH2PO4; 1,5 g/l MgSO4·7 H2O; 0, 3 ml/l Spurenelementelösung (50 g/l Citronensäure·H2O, 90 g/l (NH4)2Fe(SO4)2·6 H2O; 16,7 g/l ZnSO4·7 H2O; 2,5 g/l CuSO4·5 H2O; 2 g/l MnSO4·4 H2O; 2 g/l H3BO3; 2 g/l Na2MoO4·2 H2O; 0,5 g/l KI; in 0, 4 N H2SO4); (pH-Wert vor der Sterilisation 7,0) enthält.
  • Die Kultur wird in einem 2 1 Schüttelkolben mit Schikanen bei 25°C während 72 Std. in einem Rundschüttler bei 250 U/min inkubiert. Am Ende der Fermentation wird die Menge der Biomasse und der Arachidonsäuregehalt der Biomasse nach der Zentrifugation, Gefriertrocknung und Lösungsmittel-Extraktion durch GC-Verfahren des Standes der Technik bestimmt.
  • Beispiel 10
  • Produktion von Erythromycin
  • Der Saccharopolyspora erythraea-Stamm NRRL 2338 oder eine Mutante davon (selektiert auf eine gesteigerte Produktivität, vorzugsweise in dem nachstehend aufgeführten Rezept) wird in 25 ml Vorkulturmedium überimpft, welches 15 g/l lösliche Stärke, 5 g/l NaCl; 15 g/l Sojamehl; 10 g/l CaCO3; 5 g/l Hefeextrakt; 5 g/l Maisquellfeststoffe; 670 μl einer 1 g/l-Lösung von CoCl2·6 H2O enthält.
  • Die Kultur wird in einem 100 ml Schüttelkolben ohne Schikanen bei 32 bis 34°C für 3 Tage bei 250 U/min in einem Schüttelinkubator inkubiert.
  • 0,4 ml der Kultur wird in 25 ml eines sterilen Produktionsmediums überimpft, welches 2 g/l Citronensäure·H2O; 2 g/l (NH4)2SO4; 2 g/l MgSO4·7 H2O; 0,085 CaCl2·2 H2O; 0,25 g/l KH2PO4; 5 g/l HEPES ( = N-(2-Hydroxyethyl)piperazin-N'-(2-ethansulfonsäure); 1,5 g/l Glucose; 20 g/l lösliche Stärke; 0,4 g/l Sojaöl; 3,6 ml/l Spurenelementelösung (Gramm in 250 ml destilliertem Wasser: 62,5 g Citronensäure·H2O, 0,8215 g FeSO4·7 H2O; 0,0625 g CuSO4·5 H2O; 0,375 CoCl2·H2O; 0,0625 g H3BO3; 1,25 g ZnSO4·7 H2O; 1,25 g MnSO4·H2O; 0,0625 Na2MoO4·2 H2O), pH-Wert 7,0 enthält. Zu jedem Kolben wird 0,25 ml n-Propanol gegeben.
  • Die Kultur wird in einem 100 ml-Schüttelkolben mit Schikanen bei 32 bis 34°C während 5 Tagen in einem Schüttelinkubator bei 300 U/min inkubiert. Am Ende der Fermentation wird die Brühe zentrifugiert, und die Menge der Biomasse quantifiziert. Der Erythromycin-Gehalt des Überstands wird durch HPLC-Verfahren des Standes der Technik gemessen.
  • Beispiel 11
  • Produktion von β-Karotin
  • Eine Sporensuspension von Blakeslea trispora CBS 130.59 wird zum Animpfen von 114 ml Vorkulturmedium (10 g/l Hefeextrakt; 20 g/l Pepton; 20 g/l Glucose) in einem 500 ml-Schüttelkolben ohne Schikanen verwendet.
  • Die Vorkultur wird 42 Std. in einem Rotationsschüttler bei 250 U/min und 26°C inkubiert. Die Biomasse wird durch Filtration geerntet und 3 Mal mit 100 ml sterilem entmineralisiertem Wasser gewaschen, um die Komponenten des Vorkulturmediums zu entfernen. Anschließend wird die Biomasse im Blender homogenisiert, bis nur kleine Fragmente übrig bleiben und in 40 ml entmineralisiertem Wasser resuspendiert.
  • Das Produktionsmedium wird in 100 ml-Portionen in 500 ml Schüttelflaschen mit Schikanen hergestellt. Die Zusammensetzung des Produktionsmediums ist wie folgt: 40 g/l Glucose; 2 g/l Asparaginmonohydrat; 0,5 g/l KH2PO4; 0,25 g/l MgSO4·7 H2O. Zudem wird 0, 3 ml/l einer Spurenelementelösung mit der folgenden Zusammensetzung: 50 g/l Citronensäure·H2O; 90 g/l (NH4)2Fe(SO4)2·6 H2O; 16,7 g/l ZnSO4·7 H2O; 2,5 g/l CuSO4·5 H2O; 2 g/l MnSO4·4 H2O; 2 g/l H3BO3; 2 g/l Na2MoO4·2 H2O; 0,5 g/l KI; in 0,4 N H2SO4 zugegeben. Vor der Sterilisation wird der pH-Wert des Mediums auf 6,2 eingestellt. Die Kolben werden 20 min bei 120°C sterilisiert und nach der Sterilisation werden 0,05 ml einer 1 mg/ml Lösung Thiaminhydrochlorid in entmineralisiertem Wasser (sterilisiert durch Filtration) dazu gegeben.
  • Die Produktionskulturen werden mit 0,5 bis 10 ml der Suspension des vorstehend hergestellten fragmentierten Mycels beimpft. Die Kulturen werden für 139 Std. auf einem Rotationsschüttler (250 U/min; 26°C) inkubiert. Die Pilz-Biomasse wird durch Filtration geerntet, mit entmineralisiertem Wasser gewaschen, um die Mediumkomponenten zu entfernen und quantifiziert.
  • Die Menge an produziertem β-Karotin wird durch Acetonextraktion und Messen der Extinktion bei 450 nm der Acetonfraktion in einem Spektralphotometer bestimmt.

Claims (18)

  1. Verfahren zur Herstellung einer β-Lactam-Verbindung, bei dem man: – einen filamentösen mikrobiellen Stamm in industriellem Umfang in einem Fermentationsmedium, bei dem es sich um ein im wesentlichen aus chemisch definierten Bestandteilen bestehendes chemisch definiertes Medium handelt, fermentiert und – die β-Lactam-Verbindung aus der Fermentationsbrühe gewinnt.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das chemisch definierte Medium eine Menge einer komplexen Kohlenstoff- und/oder Stickstoffquelle von höchstens etwa 10% der in dem chemisch definierten Medium vorhandenen Gesamtmenge an Kohlenstoff und/oder Stickstoff (Kjedahl-N) enthält.
  3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die chemisch definierten Bestandteile des chemisch definierten Mediums eine Kohlenstoffquelle, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Kohlenhydraten, wie beispielsweise Glucose, Lactose, Fructose, Saccharose, Maltodextrinen, Stärke und Inulin, Glycerin, Pflanzenölen, Kohlenwasserstoffen, Alkoholen, wie etwa Methanol und Ethanol, organischen Säuren, wie etwa Acetat und höheren Alkansäuren, sowie eine Stickstoffquelle, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Harnstoff, Ammoniak, Nitrat, Ammoniumsalzen, wie etwa Ammoniumsulfat, Ammoniumphosphat und Ammoniumnitrat, und Aminosäuren, wie etwa Glutamat und Lysin, umfassen.
  4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei es sich bei der Kohlenstoffquelle um Glucose und bei der Stickstoffquelle um Ammoniak und/oder ein Ammoniumsalz handelt.
  5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Fermentation über ein diskontinuierliches, ein wiederholtes diskontinuierliches, ein "Fed-batch"ein wiederholtes Fed-batch- oder ein kontinuierliches Fermentationsverfahren erfolgt.
  6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei die Fermentation über ein Fed-batch-Verfahren erfolgt.
  7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei dem Verfahren eine Kohlenstoff- und/oder eine Stickstoffquelle zugeführt wird.
  8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei es sich bei der Kohlenstoffquelle um Glucose und bei der Stickstoffquelle um Ammoniak und/oder ein Ammoniumsalz handelt.
  9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei es sich bei dem filamentösen Stamm um einen Pilz handelt.
  10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei es sich bei dem Pilz um einen Penicillium-Stamm handelt.
  11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei es sich bei dem Pilz um Penicillium chrysogenum handelt.
  12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei es sich bei dem filamentösen Stamm um ein Bakterium handelt.
  13. Verfahren nach Anspruch 12, wobei es sich bei dem Bakterium um einen Actinomyceten handelt.
  14. Verfahren nach Anspruch 13, wobei es sich bei dem Actinomyceten um Streptomyces clavuligerus und bei der β-Lactam-Verbindung um Clavulansäure handelt.
  15. Verfahren zur Herstellung und/oder Verbesserung eines eine interessierende β-Lactam-Verbindung produzierenden filamentösen mikrobiellen Stamms, der in industriellem Umfang in einem chemisch definierten Medium fermentiert werden kann, wobei man in dem Verfahren: – einen geeigneten Ausgangsstamm einer Mutagenbehandlung, ausgewählt aus der Gruppe physikalischer Mittel und chemischer Mutagene, und/oder einer DNA-Transformation unterzieht, – die erhaltenen Mutanten und/oder Transformanten einem Screening auf ihre Wachstumsleistung auf einem chemisch definierten Medium und auf ihr Produktionsniveau der interessierenden β-Lactam-Verbindung unterzieht, – Mutanten und/oder Transformanten, die eine gute Wachstumsleistung auf einem chemisch definierten Medium und/oder ein verbessertes Produktionsniveau der interessierenden β-Lactam-Verbindung im Vergleich zum Ausgangsstamm aufweisen, auswählt.
  16. Verfahren nach Anspruch 15, wobei der Ausgangsstamm ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Stämmen, die eine gute Wachstumsleistung auf einem chemisch definierten Medium aufweisen, deren Produktionsniveau jedoch verbessert werden muß.
  17. Verfahren nach Anspruch 15, wobei der Ausgangsstamm ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Stämmen, die zwar ein hohes Produktionsniveau einer gewünschten β-Lactam-Verbindung, jedoch eine relativ schlechte Wachstumsleistung auf einem chemisch definierten Medium aufweisen.
  18. Verwendung eines chemisch definierten Fermentationsmediums zur Herstellung einer β-Lactam-Verbindung durch Fermentation eines filamentösen mikrobiellen Stamms in industriellem Umfang.
DE69834630T 1997-02-20 1998-02-20 Fermentative herstellung von wertstoffen in industriellem umfang durch verwendung von chemisch definierten media Expired - Fee Related DE69834630T2 (de)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP97200494 1997-02-20
EP97200494 1997-02-20
PCT/EP1998/001122 WO1998037179A2 (en) 1997-02-20 1998-02-20 Fermentative production of valuable compounds on an industrial scale using chemically defined media

Publications (2)

Publication Number Publication Date
DE69834630D1 DE69834630D1 (de) 2006-06-29
DE69834630T2 true DE69834630T2 (de) 2007-04-19

Family

ID=8228032

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE69834630T Expired - Fee Related DE69834630T2 (de) 1997-02-20 1998-02-20 Fermentative herstellung von wertstoffen in industriellem umfang durch verwendung von chemisch definierten media

Country Status (17)

Country Link
US (3) US20020039758A1 (de)
EP (4) EP1690945A3 (de)
JP (4) JP4217277B2 (de)
KR (1) KR100576576B1 (de)
CN (2) CN100351386C (de)
AT (1) ATE327340T1 (de)
AU (1) AU6400098A (de)
BR (1) BR9807362A (de)
CZ (1) CZ299290B6 (de)
DE (1) DE69834630T2 (de)
ES (1) ES2262228T3 (de)
ID (1) ID23995A (de)
PL (1) PL335227A1 (de)
PT (1) PT970236E (de)
RU (1) RU99120113A (de)
SI (1) SI0970236T1 (de)
WO (1) WO1998037179A2 (de)

Families Citing this family (74)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5340742A (en) * 1988-09-07 1994-08-23 Omegatech Inc. Process for growing thraustochytrium and schizochytrium using non-chloride salts to produce a microfloral biomass having omega-3-highly unsaturated fatty acids
CN100351386C (zh) * 1997-02-20 2007-11-28 Dsm公司 用化学上确定的培养基以工业规模发酵生产有价值的化合物
US6004784A (en) * 1998-09-14 1999-12-21 General Electric Co. Fermentation medium and method for producing α, ω -alkanedicarboxylic acids
US6440708B1 (en) 1998-09-29 2002-08-27 Dsm N.V. Fermentation of clavulanic acid at a controlled level of ammonia
KR101293135B1 (ko) 2000-01-28 2013-09-12 디에스엠 아이피 어셋츠 비.브이. 발효기 내에서 진핵 미생물의 고밀도 배양에 의한 고도불포화 지방산을 함유하는 지질의 증진된 생산 방법
DE10106493B4 (de) * 2001-02-13 2010-11-04 Plasmidfactory Gmbh & Co. Kg Verfahren zur Herstellung von Nukleinsäuren
CN100529066C (zh) 2002-07-01 2009-08-19 诺维信公司 在发酵过程中加入单丙二醇
KR100454508B1 (ko) * 2002-07-05 2004-11-03 허명준 소취기능과 다제내성균에 대한 멸균력을 갖는 자연기능수및 그의 제조방법
US6955892B2 (en) * 2002-11-12 2005-10-18 Akzo Nobel N.V. Feeding processes for fermentation
DE10317877A1 (de) * 2003-04-17 2004-11-18 Consortium für elektrochemische Industrie GmbH Verfahren zur Herstellung von Sporidiobolus ruineniae Stämmen mit verbesserter Coenzym Q10-Produktion
EP1658296B1 (de) 2003-05-28 2012-12-19 DSM Sinochem Pharmaceuticals Netherlands B.V. Cephemverbindung
EP1716243B1 (de) 2004-02-04 2014-11-05 Merck Sharp & Dohme Corp. Verfahren zur produktion von plasmid-dna durch fermentation von e. coli im grossmassstab
US20080050779A1 (en) * 2004-06-16 2008-02-28 Aurelia Defachelles Fermentation Process Using Faba Beans as Nitrogen Source
BRPI0609040B1 (pt) 2005-03-18 2018-07-31 Microbia, Inc. Fungo recombinante do gênero yarrowia, método de produção de um carotenóide e método de preparo de um aditivo alimentício ou ração contendo um carotenóide
EA012617B1 (ru) * 2005-03-24 2009-10-30 ДСМ АйПи АССЕТС Б.В. Способ микробиального производства ценного соединения
US7990102B2 (en) * 2006-02-09 2011-08-02 Karl Frederick Scheucher Cordless power supply
KR100839874B1 (ko) * 2006-07-07 2008-06-19 자연과생명기술(주) 분말 발효제 제조 방법
EP2078092A2 (de) 2006-09-28 2009-07-15 Microbia, Inc. Herstellung von carotenoiden in öliger hefe und pilzen
US20100120154A1 (en) 2007-03-21 2010-05-13 Dsm Ip Assets B.V. Method for homologous recombination
US20130189722A1 (en) * 2007-09-05 2013-07-25 Joshua Trueheart Isolation of pellet-forming microorganisms
WO2010015627A2 (en) 2008-08-05 2010-02-11 Dsm Ip Assets B.V. Adipoyl-7-adca producing strains
EP2213723A1 (de) 2009-01-30 2010-08-04 Novozymes A/S Isomaltose zur Pilzfermentation
US20110306139A1 (en) 2009-02-27 2011-12-15 Novozymes A/S Mutant Cells Suitable For Recombinant Polypeptide Production
MX2011013700A (es) 2009-07-03 2012-04-30 Dsm Ip Assets Bv Cepa talaromyces y composiciones de enzimas.
BR112012011596B1 (pt) 2009-11-04 2018-10-02 Dsm Ip Assets Bv transformante de talaromyces, processos para a produção de um transformante de talaromyces, de um transformante múltiplo de talaromyces e de uma composição polipeptídica compreendendo uma ou mais celulases, e processos para a sacarificação de material lignocelulósico e para a preparação de um produto de fermentação
CN102822191B (zh) 2010-03-30 2015-06-10 诺维信公司 晶体代谢物回收
KR101013456B1 (ko) * 2010-11-24 2011-02-14 주식회사 그린바이오텍 심플리실리움 라멜리콜라 ｂｃｐ 균주 배양용 배지 조성물 및 이의 배양방법
WO2012088276A2 (en) * 2010-12-21 2012-06-28 J3H, Inc Phospholipid production and composition manipulation through media manipulation
EP2670839B1 (de) 2011-01-31 2017-11-08 Novozymes A/S Verwendung von gebräunter Glukose für die fermentative Produktion von Thaxtomin.
US20140106398A1 (en) 2011-03-11 2014-04-17 Dsm Ip Assets B.V. Vector-host system
WO2012150968A1 (en) * 2011-05-02 2012-11-08 Renewuel Llc System and method of co-cultivating microalgae with fungus
EP2742145A1 (de) 2011-08-12 2014-06-18 Novozymes A/S Reduktion der kulturviskosität durch hinzugabe von mangan
CN104508114A (zh) 2012-06-19 2015-04-08 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 用于在细胞中表达基因的启动子
US20150203807A1 (en) 2012-07-06 2015-07-23 Novozymes A/S Inactivation of a production strain using a fatty acid
WO2014030774A1 (ja) 2012-08-24 2014-02-27 国立大学法人山口大学 酵母用培地
US20150291656A1 (en) 2012-11-01 2015-10-15 Novozymes A/S Method for removal of dna
EP2951296A2 (de) 2013-02-04 2015-12-09 DSM IP Assets B.V. Kohlenhydratabbauendes polypeptid und verwendungen davon
US9943545B2 (en) 2013-03-15 2018-04-17 Fate Therapeutics, Inc. Stem cell culture media and methods of enhancing cell survival
WO2014202620A2 (en) 2013-06-19 2014-12-24 Dsm Ip Assets B.V. Rasamsonia gene and use thereof
WO2014202622A2 (en) 2013-06-19 2014-12-24 Dsm Ip Assets B.V. Rasamsonia gene and use thereof
WO2014202624A2 (en) 2013-06-19 2014-12-24 Dsm Ip Assets B.V. Rasamsonia gene and use thereof
WO2014202621A1 (en) 2013-06-20 2014-12-24 Dsm Ip Assets B.V. Carbohydrate degrading polypeptide and uses thereof
EP2826384A1 (de) 2013-07-16 2015-01-21 Evonik Industries AG Verfahren zur Trocknung von Biomasse
JP6393898B2 (ja) * 2014-08-03 2018-09-26 国立大学法人 奈良先端科学技術大学院大学 酵母の培養方法
BR112017006834B1 (pt) 2014-10-02 2022-04-26 Evonik Operations Gmbh Processo para a preparação de um alimento para animais compreendendo pufas, produto extrudado de alimento para animais e método de criação de animais
BR112017006838B1 (pt) 2014-10-02 2021-07-06 Evonik Operations Gmbh Processo para produzir um alimento para animais compreendendo biomassa contendo pufa, alimento para animais e método para criar animais
US11324234B2 (en) 2014-10-02 2022-05-10 Evonik Operations Gmbh Method for raising animals
US11464244B2 (en) 2014-10-02 2022-10-11 Evonik Operations Gmbh Feedstuff of high abrasion resistance and good stability in water, containing PUFAs
US20190024038A1 (en) 2015-12-09 2019-01-24 Basf Se Method of purifying a protein from fermentation solids under desorbing conditions
CN105505829A (zh) * 2016-01-20 2016-04-20 黑龙江省中医药科学院 发酵类中药优势菌群选择性培养基及其制备方法和发酵类中药优势菌的筛选方法
MX2018012402A (es) 2016-04-12 2019-07-08 Wim De Laat Consultancy B V Cepas de pseudomonas y grupos de estas para su uso en la proteccion contra enfermedades de las plantas.
EP3484996B1 (de) 2016-07-14 2020-09-09 Basf Se Fermentationsmedium mit chelatbildner
JP2018023356A (ja) * 2016-08-04 2018-02-15 三洋化成工業株式会社 有用物質の生産方法
CA3033424A1 (en) 2016-08-11 2018-02-15 Wim De Laat Consultancy B.V. Single cell protein from thermophilic fungi
US11667980B2 (en) 2017-08-07 2023-06-06 Novozymes A/S Use of FCA control based on PH
CN110452945B (zh) * 2018-05-07 2023-06-23 华东理工大学 利用红色糖多孢菌发酵生产红霉素的方法
EP3927809A1 (de) 2019-02-20 2021-12-29 Basf Se Industrielles fermentationsverfahren für bacillus unter verwendung eines definierten mediums und spurenelementezufuhr
CN114096676A (zh) 2019-02-20 2022-02-25 巴斯夫欧洲公司 用确定成分培养基和镁补料的芽孢杆菌工业发酵工艺
EP3983425A1 (de) 2019-06-13 2022-04-20 Basf Se Verfahren zur rückgewinnung eines proteins aus fermentationsbrühe mithilfe eines divalenten kations
CN110283854B (zh) * 2019-08-08 2021-07-16 内蒙古金达威药业有限公司 一种发酵培养基及其应用和利用三孢布拉霉菌发酵制备番茄红素的方法
EP4077699A1 (de) 2019-12-19 2022-10-26 Basf Se Erhöhung der raum-zeit-ausbeute, der kohlenstoffkonversionseffizienz und kohlenstoffsubstratflexibilität bei der herstellung von feinchemikalien
JP2023508871A (ja) 2019-12-20 2023-03-06 ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピア テルペンの毒性の低減および微生物中での生成可能性の増大
KR102264895B1 (ko) * 2019-12-27 2021-06-15 명지대학교 산학협력단 메탄올을 소비하는 Aspergillus 균주를 이용한 유기산 생산 공정
CA3164414A1 (en) 2020-01-14 2021-07-22 Joyce Josephine Elisabeth ARNOUTS Expression of ovalbumin and its natural variants
US20230046934A1 (en) 2020-01-23 2023-02-16 The Protein Brewery B.V. Use of a defoamer for maintaining dispersed morphology in submerged fungal fermentation
AU2021231308A1 (en) 2020-03-06 2022-09-22 The Protein Brewery B.V. Improved single-cell protein production using antioxidants
WO2021176032A1 (en) 2020-03-06 2021-09-10 The Protein Brewery B.V. Pasteurisation of microbial biomass suitable for food applications
CN111548944B (zh) * 2020-06-05 2022-06-14 福建省农业科学院植物保护研究所 一种促进莱氏绿僵菌产孢的固体发酵培养基及其制备方法和应用
CA3181847A1 (en) 2020-06-23 2021-12-30 Elisa LEUNE Novel food
US20230323329A1 (en) 2020-09-04 2023-10-12 Basf Se Method for removing antifoaming agents from a fermentation broth
BR112023005111A2 (pt) 2020-09-22 2023-04-18 Basf Se Método para recuperar uma proteína de interesse de um caldo de fermentação bacteriana, e, uso de pelo menos um floculante
WO2023118565A1 (en) 2021-12-23 2023-06-29 Novozymes A/S Reduction of residual dna in microbial fermentation products
WO2023242273A1 (en) 2022-06-14 2023-12-21 Newmilkbuzz B.V. Expression of milk caseins in filamentous fungi
EP4349993A1 (de) 2022-10-06 2024-04-10 SecondCircle ApS Optimierte fermentation von anaeroben bakterien

Family Cites Families (34)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3205150A (en) * 1961-11-27 1965-09-07 Ca Nat Research Council Hydroxy fatty acid production
US3700558A (en) * 1967-11-20 1972-10-24 Lepetit Spa Production of l-tryptophan by fermentation
NZ177159A (en) * 1974-04-20 1978-03-06 Beecham Group Ltd Clavulanic acid, salts, esters and preparation thereof from streptomyces clavuligerus: pharmaceutical compositions
IE41489B1 (en) * 1974-07-30 1980-01-16 Ici Ltd Production of glucose isomerase
US4164445A (en) * 1975-03-27 1979-08-14 E. R. Squibb & Sons, Inc. Ethanol as the major source of carbon and energy in penicillin production
US4077842A (en) * 1976-03-19 1978-03-07 Cory Robert Paul Stabilized glucose isomerase enzyme concentrate
GR69216B (de) * 1979-06-15 1982-05-07 Merck & Co Inc
US4231938A (en) * 1979-06-15 1980-11-04 Merck & Co., Inc. Hypocholesteremic fermentation products and process of preparation
US4348481A (en) * 1979-11-29 1982-09-07 Institute Po Microbiologia Method of obtaining glucose isomerase
US4374929A (en) * 1980-07-14 1983-02-22 Standard Oil Company (Indiana) Production of xanthan gum from a chemically defined medium introduction
JPS59205979A (ja) * 1983-05-11 1984-11-21 Agency Of Ind Science & Technol 微生物菌体の製造方法
NZ213963A (en) * 1984-10-27 1989-01-06 Antibioticos Sa Production of clavulanic acid
JP2746371B2 (ja) * 1987-12-21 1998-05-06 サントリー株式会社 ビスホモ−γ−リノレン酸及びこれを含有する脂質の製造方法
EP0351029B1 (de) * 1988-07-15 2002-03-06 Genencor International, Inc. Glucose-Isomerase-Enzyme und deren Verwendung
US5376536A (en) * 1988-07-15 1994-12-27 Gist-Brocades, N.V. Glucose isomerase enzymes and their use
US5290690A (en) * 1988-07-15 1994-03-01 Plant Genetic Systems Methods and means for controlling the stability of proteins
CH680448A5 (de) * 1990-01-17 1992-08-31 Nestle Sa
US5658767A (en) * 1991-01-24 1997-08-19 Martek Corporation Arachidonic acid and methods for the production and use thereof
US5318896A (en) * 1991-09-11 1994-06-07 Merck & Co., Inc. Recombinant expandase bioprocess for preparing 7-aminodesacetoxy cephalosporanic acid (7-ADCA)
NZ245713A (en) * 1992-02-10 1994-12-22 Novopharm Ltd Production of the antibiotic lovastatin from genetically engineered aspergillus strains
GB9220670D0 (en) * 1992-09-30 1992-11-11 Unilever Plc Cosmetic composition
FR2700552B1 (fr) * 1993-01-19 1995-04-21 Pernod Ricard Mutants de Phaffia rhodozyma, procédé de production de beta-carotène et utilisation de biomasse riche en beta-carotène.
CA2168431A1 (en) * 1993-07-30 1995-02-09 Roelof Ary Lans Bovenberg Process for the efficient production of 7-adca via 2-(carboxyethylthio)acetyl-7-adca and 3(carboxymethylthio)propionyl-7-adca
JP2677949B2 (ja) * 1993-08-26 1997-11-17 常盤薬品工業株式会社 アラキドン酸含有健康食品
US5494808A (en) * 1994-09-15 1996-02-27 Merck & Co., Inc. Defined medium OMPC fermentation process
US5583019A (en) * 1995-01-24 1996-12-10 Omegatech Inc. Method for production of arachidonic acid
DE69635154T2 (de) * 1995-05-30 2006-06-22 Suntory Limited Hühnereier mit einem hohen anteil an mehrfach ungesättigten fettsäuren, verfahren für deren herstellung und die verwendung derselben
US5731165A (en) * 1995-06-02 1998-03-24 Gist-Brocades, B.V. Process for the production of 7-ADCA via expandase activity on penicillin G
SI9500238A (en) * 1995-07-27 1997-02-28 Krka Tovarna Zdravil Procedure for the production of lovastatin
US5989877A (en) * 1995-08-03 1999-11-23 Gist-Brocades B.V. Selective process for the deacylation of acylated compounds
US6255505B1 (en) * 1996-03-28 2001-07-03 Gist-Brocades, B.V. Microbial polyunsaturated fatty acid containing oil from pasteurised biomass
US20030143659A1 (en) * 1996-03-28 2003-07-31 Hendrik Louis Bijl Process for the preparation of a granular microbial biomass and isolation of a compound thereform
CN100351386C (zh) * 1997-02-20 2007-11-28 Dsm公司 用化学上确定的培养基以工业规模发酵生产有价值的化合物
EP2175031A3 (de) * 1997-03-04 2010-07-07 Suntory Holdings Limited Verfahren zur Herstellung hoch ungesättigter Fettsäuren und Fette mit hoch ungesättigten Fettsäuren

Also Published As

Publication number Publication date
ES2262228T3 (es) 2006-11-16
JP4469401B2 (ja) 2010-05-26
KR100576576B1 (ko) 2006-05-04
EP2256211A2 (de) 2010-12-01
CN100351386C (zh) 2007-11-28
PL335227A1 (en) 2000-04-10
JP2008200053A (ja) 2008-09-04
JP4217277B2 (ja) 2009-01-28
EP2345734A3 (de) 2012-03-21
AU6400098A (en) 1998-09-09
EP2345734A2 (de) 2011-07-20
WO1998037179A2 (en) 1998-08-27
EP0970236B1 (de) 2006-05-24
WO1998037179A3 (en) 1999-01-14
DE69834630D1 (de) 2006-06-29
ID23995A (id) 2000-06-14
KR20000075487A (ko) 2000-12-15
EP2256211A3 (de) 2011-02-16
EP1690945A3 (de) 2009-06-03
ATE327340T1 (de) 2006-06-15
EP0970236A2 (de) 2000-01-12
JP2014087365A (ja) 2014-05-15
CZ295499A3 (cs) 2000-04-12
CZ299290B6 (cs) 2008-06-11
PT970236E (pt) 2006-08-31
JP2009195254A (ja) 2009-09-03
RU99120113A (ru) 2002-12-27
JP2001512970A (ja) 2001-08-28
US20140342396A1 (en) 2014-11-20
US20020039758A1 (en) 2002-04-04
EP1690945A2 (de) 2006-08-16
CN1248294A (zh) 2000-03-22
SI0970236T1 (sl) 2006-10-31
BR9807362A (pt) 2000-04-18
US20070092955A1 (en) 2007-04-26
CN1127571C (zh) 2003-11-12
CN1495259A (zh) 2004-05-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE69834630T2 (de) Fermentative herstellung von wertstoffen in industriellem umfang durch verwendung von chemisch definierten media
DE69422161T3 (de) Verfahren zur Gewinnung einer Biomasse und Brottreibmittel
DE4480132C2 (de) Verfahren und Rhodococcus rhodochrous-Stamm zur Herstellung von Amiden aus Nitrilen
DE2452502A1 (de) Verfahren zur zuechtung aethanolassimilierender hefen
DE60307403T2 (de) Bakterien und Verfahren zur Herstellung von Riboflavin durch Fermentation
DE69422159T3 (de) Verfahren zur Gewinnung einer Biomasse aus einem Medium von Getreide, Verwendung der erhaltenen Produkte und Brottreibmittel
DE60213374T2 (de) Fermentative Herstellung von mikrobieller milchgerinnender Protease
RU2096461C1 (ru) Штамм дрожжей yarrowia lipolytica - продуцент лимонной кислоты и способ получения лимонной кислоты
EP1613759B1 (de) Fermentationsprozesse mit niedrigen Konzentrationen an Kohlenstoff- und Stickstoffhaltigen Nährstoffen
EP0930367B1 (de) Pilz der Gattung Ashbya zur Herstellung von Riboflavin
EP2024489B1 (de) Verfahren zur produktion von hefe
US6440708B1 (en) Fermentation of clavulanic acid at a controlled level of ammonia
JP2766874B2 (ja) 新規酵母、該酵母を含有する冷凍パン生地、及び該生地の製造方法
DE19840709A1 (de) Ein- oder mehrzellige Organismen zur Herstellung von Riboflavin
SU553283A1 (ru) Способ получени алкогольдегидрогеназы
EP1117820A1 (de) Fermentation von clavulansäure bei einem kontrollierten gehalt von ammoniak
BRPI9816369B1 (pt) Fermentative production of useful industrial compounds using chemically defined media
MXPA99007691A (en) Fermentative production of valuable compounds on an industrial scale using chemically defined media
DE102004035347A1 (de) Verfahren zur Herstellung von L-Lysin

Legal Events

Date Code Title Description
8364 No opposition during term of opposition
8339 Ceased/non-payment of the annual fee