CN102822191B - 晶体代谢物回收 - Google Patents
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/30—Extraction; Separation; Purification by precipitation
-
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Abstract
一种用于从连续离心过程中的细胞发酵液简单而有效地产生晶体和/或无定形代谢物悬液的方法,其包括:(a)在离心机单独的入口添加包含细胞和感兴趣的代谢物的发酵液,其中所述代谢物部分或完全为晶体和/或无定形形式;(b)在离心机另一个入口添加包含盐和/或糖的水性液体,所述液体具有相对于细胞较高的密度和相对于沉淀形式的感兴趣的代谢物较低的密度。(c)在离心机单独的出口移出细胞;和(d)在离心机另一个出口移出包含感兴趣的无定形代谢物和/或晶体的悬液。
Description
技术领域
本发明涉及非常有效的用于从连续离心过程中的发酵液获得晶体和/或无定形代谢物悬液的方法。
背景技术
工业代谢物的发酵产量最近几年急剧增加。代谢物如蛋白酶的产量如此之高,以致于发酵液中超过60%的蛋白酶可作为晶体和/或无定形沉淀存在。
已应用多种方法以供解决该以最有效的方式回收感兴趣的代谢物的问题,参见例如WO 2008/110498,其中公开的方法包括用水稀释发酵液,添加二价盐,并将发酵液的pH值调整至低于pH 5.5的pH值。
公开于WO 2008/110498的方法需要许多水。因此本发明的目的是对上述问题提供有效的、需要较少水的方法。
发明内容
令人惊讶地发现了可在包含两个入口和两个出口的连续离心过程中产生从发酵液简单而有效地产生晶体和/或无定形代谢物悬液的方法。所述方法包括:
(a)在离心机单独的入口添加包含细胞和感兴趣的代谢物的发酵液,其中所述代谢物部分或完全为晶体和/或无定形形式;
(b)在离心机另一个入口添加包含碳水化合物和/或盐的水性液体,所述液体具有相对于细胞较高的密度和相对于沉淀形式的感兴趣的代谢物较低的密度。
(c)在离心机单独的出口移出细胞;和
(d)在离心机另一个出口移出包含感兴趣的无定形代谢物和/或晶体的悬液。
附图说明:
图1显示FEUX 510型Alfa Laval Separator Centrifuge。该离心机通过安装9个外周喷嘴(peripheral nozzle),并去除UX型配对管夹具(paring tube holder)而修饰为MBQX 510型。
发明详述
本发明提供了简单而有效的用于从发酵液产生晶体和/或无定形悬液的方法。
本发明的方法可应用于未经处理的发酵液,即,应用于不经稀释,不添加任何化学品且无温度调整而从发酵器直接取出的发酵液。本发明的方法亦可应用于首先进行了例如pH调整和/或温度调整和/或稀释的发酵液。
感兴趣的代谢物
根据本发明的感兴趣的代谢物可为商品化学品如柠檬酸或氨基酸。该代谢物亦可为蛋白质,例如,治疗蛋白如胰岛素或酶。该酶可为水解酶、转移酶、裂合酶、异构酶、氧还酶或连接酶。
在一个优选实施方案中,所述方法应用于蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、纤维素酶、甘露聚糖酶和氧还酶。
蛋白酶
在一个优选实施方案中,所述蛋白酶是枯草杆菌蛋白酶或金属蛋白酶。
枯草杆菌蛋白酶是使用包含Asp32、His64和Ser221(枯草杆菌蛋白酶BPN’编号)的催化三元组(triad)的丝氨酸蛋白酶。其包括任何属于NC-IUBMB酶分类:EC 3.4.21.62的酶。
枯草杆菌蛋白酶可根据肽酶分类描述为:宗族(clan)SB,家族S8,MEROPS ID:S08.001。
枯草杆菌蛋白酶描述于例如Barrett等1998.Handbook ofProteolyticEnzymes.Academic press,p.289-294。
对于本发明蛋白酶的来源和/或根据本发明的用途并无任何限制。因此,术语蛋白酶不仅包括天然或野生型蛋白酶,还包括其呈现蛋白酶活性的任何突变体、变体、片段等,以及合成的蛋白酶,如改组的蛋白酶和共有蛋白酶(consensusprotease)。此类遗传工程改造的蛋白酶可如本领域中一般已知的方式制备,例如通过定位诱变,通过PCR(在PCR反应中使用含有所需突变的PCR片段作为一个引物),或通过随机诱变。共有蛋白的制备描述于,例如EP 897985。
优选的枯草杆菌蛋白酶是选自下组的枯草杆菌蛋白酶:枯草杆菌蛋白酶Carlsberg,枯草杆菌蛋白酶BPN’,枯草杆菌蛋白酶147,枯草杆菌蛋白酶309和枯草杆菌蛋白酶I168。
优选的商业上可获得的蛋白酶包括NEUTRASETM,ALCALASETM,SAVINASETM,ESPERASETM,EVERLASETM,OVOZYMETM,CORONASETM,POLARZYMETM,和KANNASETM(Novozymes A/S);MAXATASETM,MAXACALTM,MAXAPEMTM,PROPERASETM,PURAFECTTM,PURAFECTOXPTM,FN2TM,FN3TM和FN4TM(Genencor International Inc.);以及BLAP XTM(Henkel)。
淀粉酶
合适的淀粉酶(α和/或β)包括细菌来源的那些。包括化学修饰或蛋白质工程的突变体。淀粉酶包括例如从芽孢杆菌属(Bacillus),例如在GB 1,296,839中更详细描述的地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)的特定菌株获得的α-淀粉酶。
可用的淀粉酶的实例为描述于WO 94/02597,WO 94/18314,WO 96/23873和WO 97/43424中的变体,特别是在一个或多个下述位置具有取代的变体:15,23,105,106,124,128,133,154,156,181,188,190,197,202,208,209,243,264,304,305,391,408和444。
商业上可获得的淀粉酶为DuramylTM,TermamylTM,NatalaseTM,TermamylLCTM,Termamyl SCTM,Liquizyme-XTM,BANTM,StainzymeTM,和StainzymePlusTM,(Novozymes A/S),RapidaseTM,PurastarTM,和PoweraseTM(fromGenencor International Inc.)。
纤维素酶
合适的纤维素酶包括细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰或蛋白质工程的突变体(包括取代、插入和/或缺失)。合适的纤维素酶包括来自芽孢杆菌属(Bacillus),假单胞菌属(Pseudomonas),腐质霉属(Humicola),镰孢属(Fusarium),梭孢壳属(Thielavia)和枝顶孢霉属(Acremonium)的淀粉酶,例如,US 4,435,307,US 5,648,263,US 5,691,178,US 5,776,757和WO 89/09259中公开的由特异腐质霉(Humicola insolens),嗜热毁丝霉(Myceliohthorathermophila)和尖镰孢(Fusarium oxysporum)产生的真菌纤维素酶。
氧化还原酶
根据本发明的可处理的氧化还原酶包括过氧化物酶(EC 1.11.1.7)和氧化酶如漆酶和过氧化氢酶(EC 1.11.1.6)。
细胞发酵液
根据本发明的发酵液包含产生感兴趣的代谢物的细胞,且感兴趣的代谢物部分地作为晶体和/或无定形沉淀存在。
根据本发明,至少40%的感兴趣的代谢物作为晶体和/或无定形沉淀存在;优选至少45%的感兴趣的代谢物作为晶体和/或无定形沉淀存在;优选至少50%的感兴趣的代谢物作为晶体和/或无定形沉淀存在;优选至少55%的感兴趣的代谢物作为晶体和/或无定形沉淀存在;优选至少60%的感兴趣的代谢物作为晶体和/或无定形沉淀存在;优选至少65%的感兴趣的代谢物作为晶体和/或无定形沉淀存在;优选至少70%的感兴趣的代谢物作为晶体和/或无定形沉淀存在;优选至少75%的感兴趣的代谢物作为晶体和/或无定形沉淀存在;优选至少80%的感兴趣的代谢物作为晶体和/或无定形沉淀存在;优选至少85%的感兴趣的代谢物作为晶体和/或无定形沉淀存在;优选至少90%的感兴趣的代谢物作为晶体和/或无定形沉淀存在;特别是至少95%的感兴趣的代谢物作为晶体和/或无定形沉淀存在。
可使用任何本领域中已知的细胞。所述细胞可为微生物或哺乳动物细胞。根据本发明的微生物可为任何属的微生物。
在一个优选实施方案中,感兴趣的代谢物可从细菌或真菌来源获得。
举例而言,感兴趣的代谢物可从革兰氏阳性细菌如芽孢杆菌属菌株,例如嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、环状芽孢杆菌(Bacilluscirculans)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis);或链霉菌属(Streptomyces)菌株,例如浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)和鼠灰链霉菌(Streptomyces murinus)获得;或者从革兰氏阴性细菌例如大肠杆菌(E.coli)或假单胞菌属菌种(Pseudomonas sp)获得。在一个优选实施方案中,所述细胞是芽孢杆菌属细胞。
感兴趣的代谢物可从真菌来源获得,例如从酵母菌株如假丝酵母属(Candida)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)或西洋蓍霉属(Yarrowia)菌株,例如卡尔酵母(Saccharomyces carlsbergensis)、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)、道格拉氏酵母(Saccharomyces douglasii)、克鲁弗酵母(Saccharomyces kluyveri)、诺地酵母(Saccharomyces norbensis)或卵形酵母(Saccharomyces oviformis)菌株获得。
感兴趣的代谢物可从丝状真菌菌株如枝顶孢霉属(Acremonium)、曲霉属(Aspergillus)、短梗霉属(Aureobasidium)、隐球菌属(Cryptococcus)、Filibasidium、镰孢属(Fusarium)、腐质霉属(Humicola)、梨孢菌属(Magnaporthe)、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、新考玛脂霉属(Neocallimastix)、脉孢菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、瘤胃壶菌属(Piromyces)、裂褶菌属(Schizophyllum)、踝节菌属(Talaromyces)、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)或木霉属(Trichoderma)菌株获得,特别是感兴趣的多肽可从棘孢曲霉(Aspergillusaculeatus)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillusniger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、杆孢状镰孢(Fusariumbactridioides)、禾谷镰孢(Fusarium cerealis)、库威镰孢(Fusariumcrookwellense)、大刀镰孢(Fusarium culmorum)、禾本科镰孢(Fusariumgraminearum)、禾赤镰孢(Fusarium graminum)、异孢镰孢(Fusariumheterosporum)、合欢木镰孢(Fusarium negundi)、尖镰孢(Fusarium oxysporum)、多枝镰孢(Fusarium reticulatum)、粉红镰孢(Fusarium roseum)、接骨木镰孢(Fusarium sambucinum)、肤色镰孢(Fusarium sarcochroum)、拟分枝孢镰孢(Fusarium sporotrichioides)、硫色镰孢(Fusariumsulphureum)、圆镰孢(Fusariumtorulosum)、拟丝孢镰孢(Fusarium trichothecioides)、镶片镰孢(Fusariumvenenatum)、特异腐质霉(Humicola insolens)、疏棉状腐质霉(Humicolalanuginosa)、米黑毛霉(Mucor miehei)、嗜热毁丝霉(Myceliophthorathermophila)、粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)、产紫青霉(Penicilliumpurpurogenum)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、康宁木霉(Trichodermakoningii)、长枝木霉(Trichodermalongibrachiatum)、里氏木霉(Trichodermareesei)或绿色木霉(Trichoderma viride)菌株获得。
这些种的菌株在许多培养物保藏中心对于公众能够容易地取得,所述保藏中心如美国典型培养物保藏中心(the American Type Culture Collection)(ATCC)、德意志微生物和细胞培养物保藏中心(Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH)(D SM)、真菌菌种保藏中心(Centraalbureau Voor Schimmelcultures)(CBS)和农业研究机构专利培养物保藏中心北区研究中心(Agricultural Research Service Patent Culture Collection,Northern Regional Research Center)(NRRL)。
就本发明而言,用于本文与给定的来源相联的术语“从…获得”,意思是感兴趣的代谢物由所述来源产生,或由其中插入了来自所述来源的基因的细胞产生。
细胞可通过本领域中任何已知的方法发酵。发酵培养基可为包含复合氮源和/或碳源的复合培养基,如大豆粉,棉籽粉,玉米浆,酵母提取物,酪蛋白水解物,糖蜜等。所述发酵培养基可为化学限定的培养基,例如,如WO98/37179中限定的。
发酵可作为补料分批、重复的补料分批或连续发酵工艺进行。
在一个优选实施方案中,本发明的细菌为单细胞。一些真菌可产生为酵母样形式。对真菌细胞亦可如WO 2005/042758中所述进行破碎和/或破坏。
pH的调整
亦可在连续离心过程之前将发酵液的pH调整至最适pH,在最适pH下代谢物最稳定或具有最低溶解度。
一种寻找该最适pH的方法是进行试验,通常以pH 11开始,然后在pH 10进行测试,然后在pH 9,然后在pH 8,然后在pH 7,并接着一直降低至pH 3进行测试,并且若最适pH例如为pH 4-pH 5,则在发现最适pH的该范围内进行测试。最适pH通常在pH 4至pH 11的范围。
对于pH的调整,事实上可使用任何酸或碱。该酸可为无机或有机的。一些实例为盐酸、硫酸、亚硫酸、亚硝酸、磷酸、乙酸、柠檬酸和甲酸。优选的酸为磷酸、甲酸、柠檬酸和乙酸。优选的碱为氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙和氢氧化铵,特别是氢氧化钠。
温度的调整
可在连续离心过程之前调整发酵液的温度以寻找最适温度,在最适温度下代谢物最稳定和/或具有最低溶解度。
一种寻找该最适温度的方法是进行试验,通常以5℃开始,然后在10℃,然后在20℃,然后在30℃,然后在40℃,然后在50℃,然后在60℃,且然后在70℃进行测试;且若发现例如最适温度为30℃-40℃,则在发现最适温度的该范围内进行测试。
分离装置
根据本发明,合适的分离装置的实例是连续离心过程,例如两相离心机,特别是连续淤泥放料离心机(continuous sludge de-charging centrifuge)。所述离心机可购自例如Alfa Laval或Westfalia Separators。
本发明包括具有下述步骤的方法:
(a)在离心机单独的入口添加包含细胞和感兴趣的代谢物的发酵液,其中所述代谢物部分或完全为晶体和/或无定形形式;
(b)在离心机另一个入口添加包含盐和/或碳水化合物(糖)的水性液体,所述液体具有相对于细胞较高的密度和相对于感兴趣的代谢物较低的密度。
(c)在离心机单独的出口移出细胞;和
(d)在离心机另一个出口移出包含感兴趣的无定形代谢物和/或晶体的悬液。
具体而言,本发明包括具有下述步骤的方法:
(a)在离心机单独的入口添加包含细胞和感兴趣的代谢物的发酵液,其中所述代谢物部分或完全为晶体和/或无定形形式;
(b)在离心机另一个入口添加包含盐和/或碳水化合物(糖)的水性液体,所述液体具有相对于细胞较高的密度和相对于沉淀形式的感兴趣的代谢物较低的密度。
(c)在离心机单独的出口移出细胞;和
(d)在离心机另一个出口移出包含感兴趣的无定形代谢物和/或晶体的悬液。
图1显示了使用FEUX 510型Alfa Laval Separator Centrifuge的优选实施方案。该离心机通过安装9个外周喷嘴,并去除UX型配对管夹具,并使用浓缩物出口管(concentrate outlet pipe)作为较重液体入口管(heavier liquid inletpipe)而修饰为MBQX 510型。
在一个优选实施方案中,发酵液液体和水性较重液体之间的界面(e)(参见图1)在水性较重液体的内部入口半径点(internal inlet radius point)(f)和发酵液液体的入口半径(g)之间形成。
在优选实施方案中,所述离心机配置有盘叠(disc stack),其中主要进料添加至盘中的外周槽。因此,确保界面(e)不进入盘碟,在此较小的界面面积可减少容量。对于图1中图示的离心机,这已通过将在盘中内部地具有上升通道(rising channel)的标准盘碟替代为具有槽的较小直径的盘来实现。
在一个优选实施方案中,包含感兴趣的无定形代谢物和/或晶体的悬液相对于细胞培养液浓缩1.1-20倍;优选包含感兴趣的无定形代谢物和/或晶体的悬液相对于细胞培养液浓缩1.2-20倍;优选包含感兴趣的无定形代谢物和/或晶体的悬液相对于细胞培养液浓缩1.3-20倍;优选包含感兴趣的无定形代谢物和/或晶体的悬液相对于细胞培养液浓缩1.4-20倍;优选包含感兴趣的无定形代谢物和/或晶体的悬液相对于细胞培养液浓缩1.5-20倍;优选包含感兴趣的无定形代谢物和/或晶体的悬液相对于细胞培养液浓缩1.6-20倍;优选包含感兴趣的无定形代谢物和/或晶体的悬液相对于细胞培养液浓缩1.7-20倍;优选包含感兴趣的无定形代谢物和/或晶体的悬液相对于细胞培养液浓缩1.8-20倍;优选包含感兴趣的无定形代谢物和/或晶体的悬液相对于细胞培养液浓缩1.9-20倍;优选包含感兴趣的无定形代谢物和/或晶体的悬液相对于细胞培养液浓缩2-20倍;特别是包含感兴趣的无定形代谢物和/或晶体的悬液相对于细胞培养液浓缩2-10倍。
在一个优选实施方案中,将包含感兴趣的无定形代谢物和/或晶体的来自离心机的出口物重新循环至液体入口(步骤(b))。该重新循环可进行视需要的次数。2或3次重新循环通常是足够的。
感兴趣的代谢物的溶解部分可在首先分离沉淀级分后,通过常规手段回收。
盐
所述水性液体可包含盐。优选的盐为:盐酸、柠檬酸、乙酸、甲酸或硫酸的镁、钠、钾、铵或钙盐,例如MgCl2,CaCl2,NaCl,KCl,NH4Cl,MgSO4,Na2SO4,K2SO4或(NH4)2SO4。
碳水化合物(糖)
所述水性液体可包含碳水化合物(糖)。
如John F.Robyt:Essentials of Carbohydrate Chemistry,p.2(1998)中定义的任何碳水化合物(糖):“碳水化合物(糖)的现代定义为:其为多羟基醛或酮,或通过几种手段中的任一种可由它们衍生的化合物,所述手段包括:(a)还原以得到糖醇;(2)氧化以得到糖酸;(3)由多个化学基团取代一个或多个羟基,例如,可用氢[H]取代以得到脱氧糖,和用氨基[NH2或乙酰NH]取代以得到氨基糖;(4)用多种模块使羟基衍生化,例如用磷酸得到磷糖(phosphor sugar),或用硫酸得到磺基糖(sulfo sugar),或将羟基与醇反应得到糖(saccharide)、寡糖和多糖”。
本发明涵盖的碳水化合物(糖)具有四个或更多个碳原子,优选4至12个碳原子;特别是4至6个碳原子。
根据本发明,优选多羟基醛或酮。
具体而言,优选选自下组的单糖:葡萄糖,果糖,甘露糖和半乳糖。
在取代糖中,优选甲基糖苷,N-乙酰葡糖胺,N-乙酰半乳糖胺及它们的脱乙酰形式。
在另一个优选的实施方案中,优选选自下组的二糖:乳糖,麦芽糖,异麦芽糖,海藻糖,麦芽酮糖,纤维二糖和蔗糖。
在寡糖中,优选糊精,极限糊精,环糊精和支链淀粉。糖酸可包括“糖醛酸(uronic)”和“糖酸(onic)”如葡糖酸、葡糖醛酸和半乳糖醛酸。
多元醇
可使用任何多元醇。然而优选选自来源于具有至少三个碳原子的碳水化合物(糖)的多元醇。它们具有通式CnH2n+2On,其中n为3至8个碳原子,特别是n为3至6个碳原子。
多元醇包括但不限于山梨醇,甘露醇,赤藓糖醇,核糖醇和木糖醇。在另一个优选实施方案中,所述多元醇为甘油或1,3-丙二醇或1,2-丙二醇(亦通常称作单丙二醇或MPG)。
衍生物
根据本发明可使用的衍生物包括甲基糖苷,葡糖醛酸,氨基糖或N-乙酰葡糖胺。
具有相对于细胞较高的密度和相对于感兴趣的代谢物较低的密度的水性液体
所述水性液体可包含盐;或碳水化合物(糖);或多元醇,或其任何组合如盐和糖;或盐和多元醇;或盐和糖和多元醇。
根据本发明,确定代谢物和细胞的密度,其后找出对于水性液体适当的密度。
细胞或细胞碎片和代谢物的密度可使用密度梯度并通过重力分离这些颗粒来确定。
所述密度梯度可如许多文献如Brock,R.M.和Ling,N.-S.,Anal.Chem.Vol.26,第1543页,1954中所述并进一步由Morris,C.J.O.R和Morris,P.,SeparationMethods in Biochemistry,Pitman Publishing第2版1976综述而制备。
重相密度可通过碳水化合物(糖)溶液例如蔗糖,或盐溶液如CaCl2溶液制备。当应用糖溶液时,应考虑沉淀的代谢物可重新溶解于此类溶液。当应用盐溶液时,应注意盐可引起细胞和细胞碎片的凝集,而影响密度和粒径。
根据本发明,优选主要是碳水化合物(糖)的组合溶液以增强密度,并添加低离子强度的钠或钾盐以防止沉淀的代谢物的溶解。
为了测试重相密度液体在分离过程中使用的pH和温度是否对于沉淀的代谢物(例如蛋白质)具有溶解作用,可进行简单的溶解性测试,即,将沉淀的感兴趣的代谢物(例如蛋白质)的样品添加至具有所需密度的不同碳水化合物(糖)和/或多元醇和/或盐的溶液中,然后测试代谢物(例如蛋白质)在温育30分钟后是否溶解。溶解度可通过,例如目视检查,或者测量例如可溶相中酶活性的增加来追踪。
根据本发明,包含盐和/或碳水化合物(糖)的水性液体具有1050kg/m3至1300kg/m3的密度,优选所述包含盐和/或碳水化合物(糖)的水性液体具有1055kg/m3至1275kg/m3的密度,优选所述包含盐和/或碳水化合物(糖)的水性液体具有1060kg/m3至1250kg/m3的密度,优选所述包含盐和/或碳水化合物(糖)的水性液体具有1065kg/m3至1225kg/m3的密度,优选所述包含盐和/或碳水化合物(糖)的水性液体具有1070kg/m3至1200kg/m3的密度,特别是所述包含盐和/或碳水化合物(糖)的水性液体具有1075kg/m3至Q1150kg/m3的密度
水性液体应优选与产物输出中不希望的颗粒材料相比,具有高5-250g/L的密度,并与期望通过本发明的分离回收的沉淀代谢物相比,具有低10-200g/L的密度。
晶体和/或无定形悬液
根据本发明获得的悬液可为最终产物,或可将所述悬液如本领域中已知进行浓缩和/或纯化,例如通过使用研磨、筛选、干燥、过滤、离心、重结晶、层析方法、吸附过程、两相提取(萃取)、超滤、微滤和/或蒸发。
本发明进一步在下述实施例中说明,所述实施例不意欲以任何方式限制所要求保护的本发明的范围。
实施例1
从发酵液收获蛋白酶晶体
在地衣芽孢杆菌宿主细胞中产生含有蛋白酶变体的发酵液。蛋白酶变体(Y167A+R170S+A194P)可如EP 0583339中所公开的产生。
原理:
作为连续离心分离步骤的模型,将传统的实验室离心机用于分批模式,其中用所需的溶液将盐和/或碳水化合物(糖)溶液的等分试样转移至离心管,并在该溶液的上部小心地放置含有微生物细胞和部分沉淀形式的代谢物的发酵液的等分试样,确保两种液体不混合。然后将管放置于离心机中,并在所选择的条件组下离心。在离心后,分离所得的相并确定每相中代谢物的浓度。
实验A:从发酵液分离蛋白酶变体
将使用50mL离心管的实验室规模分离用于说明本发明的原理。
发酵液表征为在20-25℃的环境室温具有1074g/L的液体密度(该密度通过将测量玻具中的100mL样品称重来确定)。
使用蔗糖梯度及5%w/w硫酸钠的粗密度分离在环境室温将细菌细胞表征为具有液体密度至1100g/L范围的密度,并将大量(bulk)沉淀的蛋白酶表征为具有1250至1300g/L范围的密度。
将25mL 5%w/w硫酸钠和35%w/w蔗糖(组合密度为1150g/L)(20-25℃的环境室温)添加至离心管(高密度液体)。
在该液体的上部,小心地层叠25mL含有(部分)沉淀形式的感兴趣的蛋白酶变体和地衣芽孢杆菌宿主细胞的发酵液。
将样品在环境温度在Heraeus Multifuge 3SR离心机中以4500rpm离心6分钟。
该条件等同于连续流产生离心机(continuous flow production centrifuge)中每1000面积当量100L/h的生产规模加载量。面积当量基于首先由C.M.Ambler,The evaluation of centrifuge performance,Chem.Eng.Prog.Vol.48(3),1952,p 150-158提出的理论计算。
在离心之后,样品分离为下述三相:
含有细胞的上层相(25mL),
含有高密度液体(最初的10mL)的中间相,和
含有含沉淀蛋白酶的高密度液体的底层相。
通过从顶部移液分离这些相。
每个相的体积分数通过容量读取(volumetric reading)确定,并通过称重确认,并对上清、中间相和底层相(收获级分)分析蛋白酶活性。
结果:
所得的从发酵液的蛋白酶的移出为95.2%。
仅在钠蔗糖溶液的顶部10mL发现了0.8%的蛋白酶丧失,这得到在底部15mL中最小浓度因子(minimum concentration factor)为1.58。
将蛋白酶通过底层相(15mL)以4500rpm次级离心10分钟来进一步浓缩。在离心之后,可见两相。具有大约6mL的体积的底层相含有的沉淀的蛋白酶的量对于该具体发酵对应于4的浓缩因子。
实验B
将分离规模放大到使用1L管的较大的实验室离心机Sorval RC-3B。
首先添加300mL的具有1233g/L的密度的25%w/w硫酸钠,并在该液体的上部小心地层叠此液体500mL发酵液。
将管在20-25℃的环境室温以3000rpm离心8分钟,等同于连续流产生离心机中每1000面积当量170L/h的生产规模加载量。
从发酵液的蛋白酶的移出是94.6%。
在硫酸钠溶液的顶部200mL发现了9.4%的总活性,且底部100mL产物显示3.2倍的活性浓度增加。
实验C
使用300mL具有1158g/L的密度的60%w/w甘油(用于收获)进行的类似实验B的实验显示从发酵液移出91.2%的感兴趣的蛋白酶。
在顶部200mL发现7.5%的总活性,且在底部100mL发现3.6倍的产物浓度增加。
实施例2
在连续离心过程中从发酵液收获蛋白酶晶体
在地衣芽孢杆菌宿主细胞中产生含有蛋白酶的发酵液。该蛋白酶(Y167A+R170S+A194P)公开于例如WO 98/20115。蛋白酶与实施例1中使用的相同。
发酵液的预处理
将包含地衣芽孢杆菌宿主细胞和感兴趣的蛋白酶的发酵液用12%氯化钠溶液按重量计稀释20%。
氯化钠的添加在培养液给料中提供了高(1.5%)含量的氯,这可在收获液体中作为液体不纯物示踪(trace)。
代谢物/沉淀的蛋白质的表征
沉淀的蛋白酶蛋白为晶体,并具有2x 2x 8-15微米大小的特征性平均矩形形式。小部分达到5x 5x 50微米大小的尺寸。
粒度分布使用来自Mettler Toledo、具有IC FBRM软件版本4.1969的D600R型FBRM Probe记录。
将10mL的样品使用自来水稀释至200mL中。将探针浸没在仪器中。在30秒内记录了1-1000微米范围的特征粒度分布。粒度分布在数分钟内保持恒定。
发酵细胞,即地衣芽孢杆菌,具有1x 1x 2微米的特征形式。
活芽孢杆菌属细胞的含量使用一般的活计数确定方法来确定。通过在整个试验中反复取样确定活计数为22-24x 109。
沉淀的蛋白质和其他较大尺寸的颗粒的体积确定通过将5mL培养液样品施于10mL离心管中的重相液体(12%硫酸钠或38%甘油)之上,并以3600RPM将该样品旋转6分钟(在Heraeus Biofuge Primo Centrifuge中)来进行。
其后,去除顶部级分(5mL),并将底部级分(5mL)中收获的颗粒以3600RPM压紧(compact)10分钟。
记录的固形物体积与起始样品体积相关,并记录为体积%。体积含量确定为10-11%。
部分稀释的培养液给料的密度确定为1062g/L,且不含沉淀的蛋白质和较大颗粒,液体密度通过内部的(inline)质量流量计确定为1057-1060g/L。
将图1中图示的Alfa Laval Separator Centrifuge MBQX配置9个0.8mm大小的外周喷嘴,并在6600RPM的速度操作。在所述操作速度,这提供了40,000m2的理论分离面积。
A1:使用具有1097-1099g/L的密度的约12%硫酸钠溶液作为较重的水性液体。在测试喷嘴流速(2600L/h)的85-102%的流速范围时,鉴定重液体的最适流速。重液体和喷嘴流之间的流速差限定了定义为回收流的来自给料至喷嘴的发酵液的颗粒和液体的相对体积流速,且该流速可与实际的培养液给料流速相对地关联。测试的流速范围等于2000L/h的培养液给料流速的20至-2%的回收流。
然后选择给料流的5%的回收流用于下述试验。
使用2000,4000和6000L/h的不同培养液流速的较长期间的试验阐明了对该产物连续过程的完整规模应用。
试验的结果列于表1。产量、蛋白浓度因子和氯含量的减少因子与施用的给料体积相关。固形物体积%和活芽孢杆菌计数的减少基于绝对测量结果。
A2:将具有1098-1100g/L的密度的大约38%甘油溶液用作重水性液体。在测试在2000L/h的培养液给料流速下喷嘴流速的85-102%流速范围时,鉴定重液体的最适流速。再次,将给料流的5%的回收流显示为产量和纯度之间最佳的折衷(compromise)。
表1:
实验 | A1 | A1 | A1 | A1 | A2 |
给料流速L/h | 2000 | 2000 | 4000 | 6000 | 2000 |
重液相 | 12%Na2SO4 | 12%Na2SO4 | 12%Na2SO4 | 12%Na2SO4 | 38%甘油 |
回收的蛋白质% | 83.1 | 87.9 | 90.2 | 88.4 | 89.2 |
蛋白浓度因子 | 0.62 | 0.66 | 1.45 | 2.2 | 0.67 |
蛋白质的固形物体积 | 9 | 9 | 14 | 20 | 6 |
活芽孢杆菌细胞的减少因子 | 4400 | 3600 | 3000 | 2900 | n.a. |
给料氯含量的减少因子 | 21 | 18.6 | 19.9 | 20.2 | 20.9 |
评论:
当使用相同方法与在培养液中测量的大小相比时,回收的沉淀蛋白质的粒度测量结果未显示大小上的显著差别。
活计数显示细胞含量超过2000倍的减少(从大约220亿至约5-7百万)。
氯示踪显示相对于收获的液体携带了大约5%液体不纯物。
Claims (19)
1.一种用于从连续离心过程中的细胞发酵液产生晶体和/或无定形代谢物悬液的方法,其包括:
(a)在离心机单独的入口添加包含细胞和感兴趣的代谢物的发酵液,其中所述代谢物部分或完全为晶体和/或无定形形式;
(b)在离心机另一个入口添加包含碳水化合物和/或盐的水性液体,所述液体具有相对于细胞较高的密度和相对于沉淀形式的感兴趣的代谢物较低的密度;所述盐选自下组:钠、钾、铵、钙和镁的水溶性盐;所述碳水化合物是单糖、二糖或多元醇;
(c)在离心机单独的出口移出细胞;和
(d)在离心机另一个出口移出包含感兴趣的无定形代谢物和/或晶体的悬液。
2.权利要求1的方法,其中所述代谢物是蛋白质。
3.权利要求2的方法,其中所述蛋白质是酶。
4.权利要求3的方法,其中所述酶是水解酶、转移酶、裂合酶、异构酶、或连接酶。
5.权利要求3的方法,其中所述酶是蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶、淀粉酶、甘露聚糖酶或氧化还原酶。
6.权利要求5的方法,其中所述酶是蛋白酶。
7.权利要求6的方法,其中所述蛋白酶是枯草杆菌蛋白酶或金属蛋白酶。
8.权利要求7的方法,其中所述蛋白酶是选自下组的枯草杆菌蛋白酶:枯草杆菌蛋白酶Carlsberg,枯草杆菌蛋白酶BPN’,枯草杆菌蛋白酶147,枯草杆菌蛋白酶309和枯草杆菌蛋白酶I168。
9.权利要求1的方法,其中所述细胞是细菌或真菌细胞。
10.权利要求9的方法,其中所述细菌细胞是芽孢杆菌属(Bacillus)细胞。
11.权利要求1的方法,其中所述盐选自下组:MgCl2,CaCl2,NaCl,KCl,NH4Cl,MgSO4,Na2SO4,K2SO4或(NH4)2SO4。
12.权利要求1的方法,其中所述碳水化合物是单糖或二糖。
13.权利要求12的方法,其中所述碳水化合物选自下组:葡萄糖、蔗糖和麦芽糖。
14.权利要求1的方法,其中所述碳水化合物是选自下组的多元醇:甘油、山梨醇和单丙二醇(MPG)。
15.权利要求1的方法,其中所述包含盐和/或碳水化合物的液体具有1050kg/m3至1300kg/m3的密度。
16.权利要求1的方法,其中将来自离心机的包含感兴趣的晶体和/或无定形代谢物的出口物重新循环至液体入口。
17.权利要求1的方法,其中所述包含感兴趣的无定形代谢物和/或晶体的悬液相对于细胞发酵液浓缩1.1-20倍。
18.权利要求1的方法,其中所述细胞是酵母。
19.权利要求1的方法,其中至少45%的感兴趣的代谢物作为晶体和/或无定形沉淀存在。
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