NO120171B

NO120171B -

Info

Publication number: NO120171B
Application number: NO167386A
Authority: NO
Inventors: K Frisk; K Gustafsson
Original assignee: Tico Ab
Priority date: 1966-04-29
Filing date: 1967-03-21
Publication date: 1970-09-07
Also published as: GB1186447A; NL6705293A; US3476017A; FI47430C; FI47430B; SE310846B; DE1506487B1

Description

Fremgangsmåte for fremstilling av bromtetracyklin.

Foreliggende oppfinnelse vedrører en

fremgangsmåte til fremstilling av et nytt og terapeutisk nyttig bred-spektret antibiotikum, definert som bromtetracyklin, ved fermentering, og utvinning og rensning derav.

I overensstemmelse med foreliggende oppfinnelse har vi fremstilt bromtetracyklin ved kultivering av streptomyces auro-faciens av den såkalte scavenging stamme, i et næringmiddelinneholdende medium som inneholder assimilerbart kullstoff, assimilerbart kvelstoff og mineralske substanser og ved fremgangsmåten podes næringsmediet med mikroorganismer, og næringsmediet har et klor-ioneinnhold mindre enn 50 deler per million og fortrinnsvis mindre enn 10 deler per million og minst 50 deler per million bromioner og i det høyeste 1500 deler per million, hvorved dannelsen av klortetracyklin begrenses og i stedet begunstiges dannelsen av bromtetracyklin og om ønsket utføres fraskilling og eventuelt rensning av det dannete bromtetracyklin.

Med hensyn til det foran anvendte ut-trykk, mikroorganismer tilhørende en såkalt scavenging stamme, skal bemerkes: En mikroorganisme av denne art er en organisme som har en tendens til å utnytte eventuelle klorioner som er tilstede i mediet under dannelse av klortetracyklin. En «kloridscavenger» vil således danne klortetracyklin sålenge der er klorioner tilstede i mediet. Ved fravær av klorioner vil organismen ha en tendens til å danne bromtetracyklin hvis der er tilstede bromioner.

En scavenger mikroorganisme vil også

danne en liten mengde tetracyklin. Ikke-scavenger organismer vil ikke utnytte klorionene som er tilstede i mediet, og vil derfor danne tetracyklin i stedet for klortetracyklin. De vil ikke danne bromtetracyklin under noen forhold hva enten klorioner er tilstede eller ikke, selv om bromioner er tilstede i mediet. Moderate mengder av klortetracyklin dannes med de såkalte ikke-scavenger organismer.

Ved utførelsen av fremgangsmåten under de nevnte betingelser dannes det i gjæ-ringsmediet et høykonsentrert autibiotika som er forskjellig fra tidligere kjente og spesielt forskjellig fra det antibiotiske klortetracyklin som tidligere er produsert fra organismer av nevnte arter.

Ved utførelsen av oppfinnelsen har vi funnet at under særlige betingelser, innbefattende bruk av organismer av strepto-mycinarter eller mutanter herav, blir det i et fermenteringsmedium produsert et høy-konsentrert antibiotikum forskjellig fra de tidligere kjente, og spesielt forskjellig fra det antibiotiske klortetracyclin som tidligere er produsert av organismer av nevnte arter.

Substansen ble først fremstillet med godt utbytte og relativ høy konsentrasjon i et ellers alminnelig fermenteringsmedium, men som inneholdt kromioner og som var fortrinnsvis fri for klorioner, idet en som organisme brukte en stamme av Streptomyces aureofaciens funnet i jord.

Det nylig oppdagete antibiotikum er blitt kalt bromtetracyklin idet vi har funnet at det har en struktur som også har den molekylære del felles med klortetracyklin og oksytetracyklin (Brunings et al; J. A. C. S, 74; 4976—4977, 5. oktober 1952). Nærvær av brom adskiller det straks fra klortetracyklin og oksytetracyklin.

Bromtetracyklin har den kvantitative formel C22<H>23<N>2OsBr og følgende struktur-formel:

Bromtetracyklin har som fri base am-foter karakter og danner salter med både syrer og baser. F. eks. danner bromtetracyklin addisjonssalter med organiske og uorganiske syrer og kan utvinnes i form av hydroklorid, hydrobromid, sulfat, borat, nitrat, fosfat, ascorbat, citrat, succinat, ace-tat, sulfamat og andre addisjonssalter av lignende natur. Bromtetracyklin danner også mono- og dibasiske salter med baser som vist med alkali- og jordalkalibasene og som videre vist med ammonium og amin-basene. Spesifikke eksempler er salter av kalsium, barium, strontium, magnesium, etylendiamin, trietylamin, piperidin, kalium og litium. Salter eller riktigere kom-plekssalter blir også dannet av bromtetracyklin med basiske borsyresalter som vist ved natriumborat.

Salter av ovenfor beskrevne typer er verdifulle ved isolerings- og renseproses-ser, da de kan omdannes til fritt amfotert materiale, eller omdannes fra den ene form til den annen. Slike salter har også anti-septiske og terapeutiske egenskaper. Opp-løseligheten av bromtetracyklin i vann va-rierer med pH og blir større når pH er større eller mindre enn omkring 6. Den form som er minst oppløselig i vann ved en mellomliggende pH er referert til som iso-elektrisk eller amfotert materiale eller fri base. Det er blitt funnet ved in vitro prø-ver at disse sure og basiske salter så vel som det isoelektriske materiale eller fri base er effektive mot et stort antall bakterier innbefattende både Gram-positive og Gram-negative bakterier.

Bromtetracyklinets sure salter kan lett erholdes ved å oppløse den fri base i vann eller andre passende oppløsningsmidler som er gjort sure med en organisk- eller an-organisk syre. På samme måte dannes de basiske salter ved å tilsette en organisk eller uorganisk base til oppløsningen av den fri base.

Bromtetracyklin kan erkjennes like overfor tidligere kjente antibiotika på mange måter. En kjemisk analyse av den frie base viser at antibiotikumet inneholder følgende elementer: kullstoff, vann-stoff, kvelstoff, surstoff og brom. Da det ikke inneholder svovel eller klor er det forskjellig fra mange andre og særlig fra klortetracyklin som inneholder klor.

Hva som også er karakteristisk for mange organiske forbindelser er at krystal-linsk bromtetracyklins egenskaper er avhengig av renhetsgraden og på måten krystallene er dannet. Når det felles fra opp-løsninger som inneholder vann, felles den frie base.

Karakteristiske infrarøde absorbsjons-spektra tatt av den frie base i kullvann-stoffolje viser følgende trekk: O—H og/ eller N—H absorbsjonsbånd nær 3460 cm—i og 3320 cm—i, en svak fenyl C—H strekk-vibrasjon nær 3050 cm—i, mulig amid-kar-bonyl (C = O strekk) nær 1645—1, en mulig C = C strekkfrekvens nær 1610 cm—i, en mulig N—H bøyningsvibrasjon nær 1575 cm—i, en substituert fenyl med 2 C—H grupper ved siden av hverandre på ringen nær 1525 cm—i som kan tyde på to nabo C—H grupper på fenylringen (parasubsti-tusjon). Det infrarøde spektrum av for-bindelsen viser at tross likhet på mange måter med spektret av den frie base av klortetracyklin, slik som absorbsjonsbån-dene på begge sider av 950 cm—J, viser for-skjelligheter som ingen absorbsjonstriplett tilsvarende den som er tilstede for klortetracyklin nær 800 cm— 1, og forskjell i gra-den av absorbsjonsintensitet, slik som er ventet ved små molekylære forskjellig-heter.

Bromtetracyklinets antibiotiske spektrum er på mange måter lik klortetra-cyklinets.

Vi har funnet at ved fermenteringen er det ønskelig å dyrke organismen beskrevet her, under submerse aerobe betingelser med passende tilførsel av luft og rys-ting, f. eks. i en flaske på en rystemaskin, eller i et omrørt formenteringskar utstyrt med en innretning til å innføre en konti-nuerlig luftstrøm. Temperaturen synes ikke å være kritisk innenfor området 25—35° C, men området 30—33° C er å foretrekke. Mediets begynnelses pH skal være omtrent ved nøytral reaksjon, selvom noen av de antibiotiske substanser blir produsert i medier med en begynnelses pM så lav som 5,0 eller så høy som 8,5.

Et formenteringsmedium passende for fremstilling av bromtetracyklin inneholder en kilde av kullstoff, som et assimilerbart kullhydrat, en kilde av assimilerbart kvelstoff, anorganiske salter som fosfat, magnesiumsalter osv. og kilder av de sedvan-lige sporelementer. Puffere er sedvanligvis tilstede. Bromioner blir tilsatt således at minst 50 deler bromioner pr. million deler er tilstede, maksimumsmengden for tilfredsstillende virksomhet skal ikke overskride omtrent 1500 deler pr. million deler. Klorioneinnholdet skal være så lavt som mulig og ikke overskride 50 deler pr. million, fortrinnsvis 10 deler pr. million.

Kullstoffkildene kan enten være et oppløselig kullhydrat som rørsukker, eller et uoppløselig som stivelse f. eks. maissti-velse. Dekstrin kan også benyttes. Selvom rørsukker, et oppløselig sukker, er helt tilfredsstillende, er laktose og glukose mindre tilfredsstillende. Mengden av kullstoffkil-den kan variere meget, fra 0,5—10 pst. i vekts pst. av gjæringsmediets totalvekt.

Som assimilerbar kvelstoffkilde er de uorganiske ammoniumsalter egnet. Blant disse er ammoniumsulfat — fosfat osv. Det er også mulig å anvende organiske kvel-stof f kilder som aminosyrer og forskjellig naturlig proteinmateriale.

Blant de uorganiske salter er særlig fosfater fordelaktige og kan være tilstede enten som ammoniumfosfat eller som me-tallsulfat, f. eks. kaliumfosfat, magnesium-fosfat og en kilde av kalium, hvis dette ikke allerede er tilstede f. eks. som kaliumfosfat.

Tilsetning av små mengder tungmetal-ler er ønskelig hvis de ikke er tilstde i de andre stoffene. Blant disse sporelementer som kan være tilstede som forurensninger eller tilsetninger er Cu, Zn, Mn, Fe og Cr.

Som pufferstoffer kan anvendes kali-umkarbonat og salter av organiske syrer som f. eks. citrater, acetater og laktater som er egnet til å holde pH innenfor rime-lige grenser. Dessuten kan de organiske syrer tjene som kullstoff kilder i mikroorga-nismens stoffskifte. Bruken av skumhindrende midler er ønskelig i store fermenteringskar, om enn skumning ikke er et særlig stort problem ved gjæringen, idet den lett kan kontrolleres ved bruk av skumhindrende midler som oktådekanol i olje eller andre passende skumhindrende midler som er i handelen.

Mikroorganismer av Streptomyces aureofaciens kan deles i to alminnelige kate-gorier — «scavenging» og «nonscavenging» stammer

«Scavenging» stammer er egnet til å nyttiggjøre seg klorionene i mediet og frembringer klortetracyklin. I fravær av klorid bruker organismen bromioner hvis de er tilstede og danner bromtetracyklin. I alle tilfelle dannes noe tetracyklin også i nærvær av overskudd av klorioner. Antibiotikumet som dannes beror på betingel-sene i mediet. En «scavenging» stamme som S-77 i et medium som inneholder klorid, men ikke bromid vil produsere klortetracyklin og en liten mengde tetracyklin. I et kloridfritt medium som inneholder bromid, vil det dannes bromtetracyklin og tetracyklin, det siste i en større mengde enn ved kloridfermenteringen. Med hensyn til organismens affinitet er det slik at klortetracyklin fortrinnsvis produseres med tetracyklin på annen plass og bromtetracyklin på tredje.

I nærvær av begrensete mengder klorid og overskudd av bromid, vil organismen først nyttiggjøre seg klorid og derpå begynne å produsere bromtetracyklin. Også nu dannes noe tetracyklin. I nærvær av overskudd av klorid og bromid er ingen merkbar mengde bromtetracyklin tilstede, men brom har en kloridhemmende effekt med tendens til å forøke forholdet tetracyklin til klortetracyklin.

«Nonscavenging» stammer opptrer ganske forskjellig. De utvikler ikke bromtetracyklin under noen betingelser hverken om klorid er tilstede eller fraværende. Moderate mengder tetracyklin blir produsert, og hvis klorid er tilstede, blir noe klortetracyklin produsert i tillegg.

Av det foregående kan sees at betydelig bromtetracyklinproduksjon bare kan skje med en klorid «scavenging» stamme og bare i fravær av eller ved begrenset mengde klorid.

Det er forskjellige måter å kontrollere klorioneinnholdet. En måte er å avsondre kloridet som et inaktivt kompleks. Gode resultater er oppnådd ved bruk av destillert vann, og bruk av bestanddeler i mediet som ikke inneholder klorider. Såkalte syn-tetiske medier på hvilke eksempler gis nedenfor tjener til den hensikt. Mange naturlige materialer brukt til fermenter-ingsmediene inneholder klorider. Bruken av disse er bare mulig hvis de først er avionisert ved behandling med ioneutveks-lere eller andre passende midler til å fjerne klorioner.

Vi har oppfunnet et syntetisk medium som i det vesentlige er fritt for klorid, som gir fremragende utbytte, er lett å frem-stille, er billig og er konsistent i blanding. Dette medium inneholder i alminnelighet rørsukker som kullhydrat, ammoniumsulfat som kvelstoffkilde, kaliumfosfat som uorganisk salt, magnesiumsulfat, kalsiumkar-bonat, natriumcitrat og eddiksyre som puffere, og koppersulfat, sinksulfat og man-gansulfat i små mengder som sporelement-kilder. Det blir valgt i det vesentlige klorid-frie materialer og brukt destillert vann således at mediet ikke inneholder mer enn 1 del p. m. klorid. En bromionekilde blir tilsatt.

Inokulatet for fermenteringen kan fremstilles av skråkulturer oppnådd ved podning av Streptomyces aureofaciens. Et passende medium er Waksmanagar med følgende sammensetning:

Kulturene kan tilsettes rysteflasker som kan brukes som fermenteringskar ved fremstilling i laboratoriemålestokk, eller for fremstilling av inokulat til å pode større fermenteringer.

Luft i en mengde av 0,5—1,5 volumdel pr. volumdel av det flytende medium kan brukes avhengig av størrelsen på fermen-teringskaret. Skummingen kan kontrolleres ved steril tilsetning av et antiskum-mingsmiddel som olje tilsatt 2 pst. oktade-kanol.

Utvinning og rensning.

Produktet ved fermenteringen er en blanding av bromtetracyklin og tetracyklin, som kan utvinnes på forskjellige måter fra fermenteringsmediet. F. eks. kan det fer-menterte materiale direkte tilsettes dyrefor hvorved det fås et produkt som er særlig egnet til stimulering av veksten og/eller kontroll av sykdom. Når myceliet og det uoppløselige ikke er ønsket, kan fermenteringsmediet filtreres med eller uten syr-ning, og den klare væske kan tilsettes drik-kevann eller dyrefor i samme hensikt. Om ønsket, kan væsken inneholde bromtetracyklin og tetracyklin konsentreres under redusert trykk eller ved forstøvnings-tørking, og antibiotikumet brukes i urenset form til vekststimulering eller behandling av sykdommer hos mennesker, dyr eller fjærkre.

Når det er ønsket at bromtetracyklinet og tetracyklinet skal være i en mer ren form, kan de utvinnes fra fermenteringsmediet ved forskjellige måter som inklude-rer ett eller flere trinn ved absorbsjon, elu-ering, ekstraksjon med oppløsningsmidler med eller uten bærere, krystallisering, felning i form av uoppløselige salter som .f. eks. kalsium, barium, strontium eller mag-nesiumsalt ved pH over ca. 6,5, eller som uoppløselige salter med sulfater eller sul-fonsyrer av de overflateaktive midler eller azofargetypen, eller de kan ekstraheres i oppløsningsmidler med bærere som sulfater eller sulfonater av overflateaktive midler eller azofargetypen. Bromtetracyklinet og tetracyklinet kan fraskilles den urene masse ved å syrne til en pH på fortrinnsvis 3 eller mindre, og bromtetracyklinet og tetracyklinet vil gå over i det vandige lag og det uoppløselige faste stoff kan adskilles og fjernes. Bromtetracyklin og tetracyklin kan felles i vandig oppløsning som en jord-alkalifelning ved en pH over ca. 6,5. Denne felning kan ekstraheres med syrnet vann eller med organiske oppløsningsmidler som alkoholer, alkoksyalkanoler eller ketoner, Ekstraheringen kan skje under sure, nøy-trale eller alkaliske betingelser. På lignende måte kan den vandige oppløsning som inneholder bromtetracyklin og tetracyklin ekstraheres med organiske oppløsningsmidler som ikke er blandbare med vann, som de lavere alkoholer, alkoksy-alkanoler, estere og ketoner som ikke er blandbare med vann. Av kjente oppløsningsmidler som butanol, kloroform og etylacetat er butanol foretrukket til ekstrahering av tetracyklin. Visse alkoholer som isopropanol som er blandbar med vann, men som ikke er bland - bar med en saltoppløsning, kan også brukes. Tilsetning av et vannoppløselig salt, men som ikke er oppløselig i det organiske opp-løsningsmiddel, som et ammonium- eller amin- eller alkalimetallhalid og sulfat hjelper ved ekstraheringen.

Bromtetracyklin og tetracyklin kan utfelles fra vandige oppløsninger ved tilsetning av vannløselige salter som ammonium- eller amin- eller alkalimetallhalider og sulfater. Som hjelpemiddel ved utsalt-ningen kan brukes en liten mengde av et organisk oppløsningsmiddel.

Hvis klortetracyklin er tilstede i fer-menteringsvesken utvinnes det normalt sammen ved bromtetracyklin og tetracyklin ved disse fremgangsmåter.

Vi har også oppfunnet en ny utvinningsmetode som er meget effektiv både med hensyntilåoppnå et produkt fri for inaktive urenheter og med hensyn til å utvinne et produkt som er fri for andre antibiotiske substanser samtidig dannet i mediet. Denne utvinningsmetode gir et krystallisk produkt av stor renhet sett fra begge standpunkter. I sitt hovedtrekk medfører det å bruke kvarternære ammoniumsalter som selektivt utfeller tetracyklin fra væsken, ved en al-kalisk pH (8—11) som kvarternære ammoniumsalter av bromtetracyklin og tetracyklin. Et slikt salt blir så etter filtrering oppslemmet med en liten mengde vann og en relativt større mengde kloroform, hvorved de kvarternære ammoniumsalter av bromtetracyklin og tetracyklin blir oppløst i kloroformfasen. Vann og kloroformfasene blir så fortrinnsvis adskilt for å fjerne mulige urenheter som er oppløst i vannet. Bromtetracyklin og tetracyklin blir så ekstrahert med en vandig syreoppløsning med en pH på omkring 1 til 2,5, hvorved det dannes sure salter av bromtetracyklin og tetracyklin som går i oppløsning i vannfasen, hvorfra det utfelles som et krystallisk produkt ved økning av pH til området fra 3 til 7, idet utfellingen begynner ved den laveste verdi.

De kvarternære ammoniumsalter som er særlig nyttig ved denne utvinningsmetode er alkyltrimetylammoniumklorider og dialkyldimetylammoniumklorider, hvori alkylgruppen inneholder fra 8 til 18 (inklu-sive) kullstoffatomer.

For at oppfinnelsen skal forstås helt, vil den nu bli beskrevet med henvisning til de følgende spesifikke eksempler: Eksempel 1.

Et syrehydrolysert kasein dannes ved å hydrolysere 5 gram kasein med 0,85 ml. svovelsyre i 100 ml. vann ved røring ved 50° C i 60 minutter og ved 120° C i 120 minutter i en autoklav. Den hydrolyserte kasein blir nøytralisert til en pH på 6,0 ved en vandig ammoniakkopløsning, til dette trenges ca. 2,5 ml.

Et grunnmedium blir fremstillet som inneholder syrehydrolysert kasein av 5 gram kasein pr. liter og følgende bestanddeler:

Dette medium blir tilført kaliumbromid I i en mengde som vist, og følgende styrker blir oppnådd:

Prøveenheten er en antibiotisk virkning mot Staphlococcus aureus lik den av et mikrogram klortetracyklin pr. ml. Gjæringen er utført ved 27° i 72 timer med røring og lufttilførsel.

Eksempel 2.

Et lignende forsøk blir utført hvor materialene blir analysert etter 48 timers vekst. Følgende resultater ble oppnådd:

Eksempel 3.

Et medium med et minimumsinnhold av halogen og som har følgende sammensetning i mg pr. liter blir fremstilt: Oppløsningen ble fylt opp til det bestemte volum med vann destillert over NaOH. Alle forbindelsene unntatt CaC03 ble opp-løst, pH regulert til 6,2—6,3 med 3N am-moniakvann (ca. 3 ml/l) og CaC03 ble tilsatt. Mediet ga ikke bunnfall med salpetersyre og sølvnitrat, som viste at klor-ionekonsenetrasjonen var under 0,17 mg/l.

100 ml. alikvoter av det basiske medium ble anbragt i 500 ml. Erlenmeyerkolber, korket med vatt og opphetet i autoklav i 15 min. ved 120° C. 10 ml. sterilt destillert vann ble tilsatt hver av 4 skråagarkul-turer inneholdende Streptomyces aureofaciens i sporeform. Sporene ble forsiktig skrapet av med en trådløkke og sporesus-pensjonen forenet. Hver av kolbene ble podet med 5 ml. av denne suspensjon og rørt i 24 timer ved 27° C, og dannet et inokulat.

6,3 liter av mediet og 35 ml mineral-olje ble anbragt i et gjæringskar utstyrt med rører og en luftningsanordning og sterilisert. Syv 24 timers inokulatkolber og 50 ml. av en steril vandig oppløsning som inneholdt 0,07 KBr ble tilsatt gjærings-karet sterilt. Fermenteringen ble foretatt ved 27,4° C og med en omrøringshastighet på 350 o. p. m. og en lufttilførsel av 7 liter pr. min. Luften passerer først gjennom en salpetersyre og derpå gjennom en sølvnitratskrubber, så gjennom en vann-skrubber og et steriliseringsfilter. Et poly-mert siliconantiskummingsmiddel ble eventuelt tilsatt. (General Electric Silicon SS24).

Som veksten utvikles synker pH langsomt og fermenteringen ble fortsatt til pH opphører å falle og begynner å stige. Dette tar ca. 51 timer og resulterer i en slutt-oppløsning med en pH på 5,90. Den ende-lige masse gir 412 enheter antibiotisk aktivitet.

Fermenteringsmesken inneholder både bromtetracyklin og tetracyklin. For å ad-skille bromtetracyklin ble fermenterings-massen gjort sur til pH 1,5 med konsentrert saltsyre under omrøring. Massen ble så omrørt med 95 gram filtreringshjelpe-middel og blandingen filtrert.

Filterkaken ble oppslemmet i 1400 ml. destillert vann ved 50° C. Oppslemningen ble filtrert og filtratene slått sammen. 94,4 pst. av aktiviteten i mesken ble ut-vunnet i filtratet. Filtratets pH ble innstilt på 2,5 med 50 pst. natriumhydroksyd (32 ml.) og blandingen konsentrert i vacuum ved en temperatur mellom 25 og 30° C til et volum på 2070 ml. 83,6 pst. av meskens aktivitet er igjen. pH justertes til 1,5 med konsentrert saltsyre og 331 gram NaCl ble tilsatt. Oppløsningen ble ekstrahert to ganger med 311 ml. porsjoner av n-butanol og tre ganger med 207 ml. porsjoner av n-butanol. Ekstraktene ble forenet og pH justert til 2,5 med 50 pst. NaOH og blandingen destillert i vacuum under kvelstoff med vanntilsetning inntil all n-butanol var azeotropisk avdestillert. pH ble justert til 1,5 med konsentrert saltsyre, 5 g filtreringsmiddel ble tilsatt og blandingen ble filtrert i en filterdigel. Et sluttvolum på 1100 ml. som inneholdt 70,5 pst. av hele meskens aktivitet ble oppnådd.

Til dette filtrat ble tilsatt 41,5 g bari-umklorid-dihydrat opløst i 119 ml. destillert vann. Blandingen ble omrørt i iy9 time, pH justert til 8,5 med NaOH og blandingen sentrifugert. Det resulterende faste stoff ble vasket med 40 ml. destillert vann. Det vaskete stoff ble oppslemmet i 249 ml. destillert vann, pH justert til 2,5 med 50 pst. svovelsyre, og blandingen kraftig rørt i en time, pH justert til 1,5 med 50 pst. svovelsyre og igjen rørt i iy2 time og sentrifugert. Presipitatet ble vasket under sentrifugering med 15 ml. N/10 svovelsyre to ganger, første gang under rivning. De forenete væsker som målte 260 ml. inneholdt 62,5 pst. av aktiviteten av hele mesken.

Fremgangsmåten ovenfor ble gjentatt ag de to overliggende, væskemengder forenet. Blandingens pH ble justert til 3,5 med 10 pst. NaOH, blandingen rørt i 10 min. og

sentrifugert. Presipitatet ble vasket med

10 ml. vann og vaskevannet forenet med

væsken fra det tidligere sentrifugerte. De forenete oppløsningers pH ble justert til 1,5 med 10 pst. NaOH og presipitatet sam-let og vasket. Presipitatet ble frosset og det gjenværende vann fjernet ved sublimering. Det ble oppnådd 2,65 g av et produkt som viste en aktivitet på 490 enheter og som inneholdt 5,43 pst. brom.

Et Craig motstrøms fordelingsapparat inneholdende 30 rør fylles med et oppløs-lingssystem bestående av like volum-mengder destillert vann og n-butanol met-tet med hverandre og justert til en pH på 2,5 med konsentrert saltsyre. 1,55 g av det frosne og tørkete produkt ble oppslemmet med 160 ml. av den vandige fase, pH re-justert til 2,5, 160 ml. av n-butanolfasen ble tilsatt, og pH justert igjen til 2,5 under røring. Blandingen ble filtrert, en lot fasene adskilles og 50 ml. av hver fase ble tilsatt hvert av de første 4 rør i Craigapparatet, og resten av rørene ble fylt til 50 ml av den n-butanolmettete vandige fase, og fordelingen foregikk inntil den øverste fase, som i begynnelsen var i rør 2, var i like-vekt i rør 29. Fordelingen ble fortsatt inntil 18 øvre faseuttak er gjort fra rør 29. Dette bringer aktiviteten til rør 29.

En1 spektrofotometrisk undersøkelse viste to topper, den første konsentrert om rør 12 med et optisk maksimum ved 355 til 365 millimikron og den annen omkring rør 21 med et optisk maksimum ved 370—375 millimikron. Oppløsningene fra rørene 18 til 29 inneholdende hovedmengden av mate-rialet fra den annen topp ble forenet og destillert i vakuum under kvelstoff med vanntilsetning ved en pH av 2,5 til en en-delig n-butanolfri vandig oppløsning på 50 ml. Oppløsningens pH justertes til 1,5 med saltsyre, filtreringsmiddel tilsattes, og blandingen ble filtrert. Oppløsningens pH ble justert langsomt under omrøring til 5,0 med 10 pst. NaOH, blandingen ble rystet med glassperler og ble tillatt å stå over natten ved 4° C. Oppløsningen ble sentrifugert og den overstående væske frosset og tørket og ga et utbytte på 200 mg av et tørt produkt. 125 mg av dette produkt ble oppløst i 1,4 ml. tørt 2-etoksymetanol og filtrert. 0,14 ml. vann ble tilsatt og blandingen anbragt i et rysteapparat. Materi-alet krystalliserte og krystallene ble filtrert, vasket og tørket. Det første utbytte ble 49 mg bromtetracyklin.

Claims

1. Fremgangsmåte for fremstilling av et antibiotikum ved at et vandig næringsmedium som inneholder assimilerbart kullstoff, assimilerbart kvelstoff og mineralske substanser, podes med Streptomyces aureofaciens av en såkalt «scavenging» stamme og dyrking av mikroorganismen under aerobe forhold, karakterisert ved at det anvendes et næringsmedium som har et klorioninnhold mindre enn 50 deler pr. million og førtrinnsvis mindre enn 10 deler pr. million og minst 50 deler pr. million bromioner og i det høyeste 1500 deler pr. million, hvorved dannelsen av klortetra-

cyclin begrenses og i stedet begunstiges dannelsen av bromtetracyclin og om ønsket fraskilling og eventuelt rensning av det dannete bromtetracyclin.

2. Fremgangsmåte som angitt i på-stand 1, karakterisert ved at bestanddeler av næringsmediet som normalt inneholder tilgjengelige klorioner, behandles med et ioneutvekslingsharpiks for å redusere eller fjerne klorionene.

3. Fremgangsmåte som angitt i på-standene 1—2, karakterisert ved at næringsmediet bibringes et innhold av kalsium-, strontium-, barium- eller magnesium-ioner hvorved de tilsvarende salter av bromtetracyklinet utfelles etter hvert som det dannes.

4. Fremgangsmåte som angitt i på-standene 1—3, karakterisert ved at der om nødvendig tilsettes et bromtetracykin-opp-løsende middel, og derpå tilsettes en kva-ternær ammoniumforbindelse hvorved bromtetracyklinet utfelles som et salt herav, som eventuelt renses ved ekstrahering med oppløsningsmidler.

5. Fremgangsmåte som angitt i på-stand 4, karakterisert ved at den kvater-nære ammoniumforbindelse er alkyltrime-tyl-ammoniumklorid eller dialkyldimetyl-ammoniumklorid hvor hver alkylgruppe inneholder fra 8 til 18 kullstoffatomer.

6. Fremgangsmåte som angitt i på-standene 4—5, karakterisert ved at de ut-skilte salter ekstraheres med kloroform i nærvær av vann, kloroformekstrakten an-syres til en pH i området 1 til 2,5, og der tilsettes vann for å danne en kloroform-fase og en vandig fase som inneholder bromtetracyklinet, vannfasen fraskilles og dens pH reguleres til området 3—7, og den resulterende felning av bromtetracyklin fraskilles.

7. Fremgangsmåte som angitt i på-standene 1—6, karakterisert ved at utfel-ningen av kalsium-, barium-, strontium-eller magnesiumsalter av bromtetracyklinet skjer ved en pH av i det minste 6,0 sammen med myceliumet og andre faste stoffer i nevnte væske og ekstrahering av bromtetracyklinet fra de på denne måte ut-skilte faste stoffer.

8. Fremgangsmåte som angitt i på-stand 7, karakterisert ved at bromtetracyklinet ekstraheres fra de faste stoffer ved at disse bringes i kontakt med en an-syret vandig oppløsning ved en pH som ikke overskrider 3, og den resulterende vandige oppløsning som inneholder bromtetracyklinet, skilles fra de gjenværende uopp-løselige faste stoffer.

9. Fremgangsmåte som angitt i på-stand 8, karakterisert ved at bromtetracyklinet fraskilles den vandige oppløsning ved felning med kalsium-, barium-, strontium- eller magnesium-kationer ved en pH av i det minste 6 og ekstrahering av det utfelte produkt med et organisk oppløs-ningsmiddel og utvinning av bromtetracyklinet fra den resulterende ekstrakt.

10. Fremgangsmåte som angitt i på-stand 8, karakterisert ved at nevnte vandige oppløsning ekstraheres med et organisk oppløsningsmiddel, at oppløsnings-middelsjiktet atskilles fra det vandige sjikt, og at minst en del av oppløsningsmiddel-sjiktet fjernes for å utfelle bromtetra-, cyklin som fraskilles.

11. Fremgangsmåte som angitt i på-standene 1—9, karakterisert ved at gjær-ingsmediet gjøres surt til en pH av mindre enn 3, og hvis nødvendig bringes antibiotikumet i oppløsning og derpå filtreres, og bromtetratracyklinet utvinnes fra den resulterende vandige oppløsning.

12. Fremgangsmåte som angitt i på-stand 11, karakterisert ved at pH i den vandige oppløsning reguleres til mellom 6 og 10 i nærvær av kalsium-, barium-, strontium- eller magnesium-ioner, og de resulterende utfelte bromtetracyklinsalter fraskilles.