NO136756B - - Google Patents

Description

Fremgangsmåte for fremstilling av rifamycin B.

Foreliggende oppfinnelse angår for-bedringer ved fremstilling av rifamycin B ved neddyppet fermentering og angår mere spesielt bruken av barbiturater som hjelpemidler ved slik fermentering.

Som beskrevet i patent nr. 103 127 ut-føres fremstillingen av en gruppe av antibiotika ved neddyppet fermentering av Streptomyces mediterranei i et vanlig næringsmedium som inneholder maisstøp, ammoniumsulfat, soyabønnemel, jordnøtt-mel etc. eller kombinasjoner av disse som nitrogenkilder og gluokse, sucrose, stivelse, dextrin etc, eller kombinasjoner av disse som karbonkilder samt fosfater og andre mineralelementer. Den samtidige fremstilling av en familie av antibiotika medfører atskillelse av den ønskede fraksjon ved hjelp av forskjellige fremgangsmåter slik som kromatografi, motstrømsfordeling etc, som både er vanskelig å utføre i stor målestokk og resulterer i meget lave utbytter. Ved studium av bruken av forskjellige hjelpemidler er det blitt funnet at barbiturater kan anvendes for fremstillingen av rifamycin B slik at krystallinsk rifamycin B kan utvinnes i gode utbytter.

Rifamycin B fremstilles ved kultive-ring under spesielle betingelser av mange stammer av Streptomyces mediterranei slik som f. eks. både den opprinnelige stamme ME/83 isolert fra jord, samt mange varianter eller mutanter som oppnås ved vanlige fremgangsmåter som er vel kjent på dette område.

Streptomyces mediterranei som fremstiller rifamycin er blitt deponert ved uni-versitetet i Pavia under samlingsnr. P/3615, og i American Type Culture Col-lection med nr. 13.685. Beskrivelsen av Streptomyces mediterranei var angitt i ovennevnte patent.

Hensikten med foreliggende oppfinnelse er å skaffe et næringsmiddel eller som det kan kalles et hjelpemiddel som vil stimulere mikroorganismen til å produ-sere økede utbytter av det ønskede stoff, dvs. rifamycin B, uten samtidig fremstilling av de andre fraksjoner av rifamycin.

I en biologisk fremgangsmåte slik som i en hvilken som helst kjemisk fremgangsmåte er øket virkningsgrad ved overføring av råmaterialer til det ønskede sluttpro-dukt av primær betydning. Hvis utbyttet i slike fremgangsmåter er små og omkost-ningene ved utvinning av det ønskede pro-dukt fra et stort volum er høye, blir utbyttet en kontrollerende faktor for pro-duksjonen. En hvilken som helst faktor som fremmer fremstilling av det ønskede stoff er derfor av stor økonomisk verdi.

Kultiveringen av mikroorganismene for fremstilling av rifamycin B kan utfø-res enten ved overflatevekst eller ved neddyppede vekstmetoder. I en teknisk fremgangsmåte dyrkes Streptomyces mediterranei vanligvis i neddyppet kultur, idet fremstillingen av rifamycin B fremmes ved et effektivt luftningssystem.

Utbyttet av rifamycin B påvirkes av mange faktorer, prinsippielt av konsentrasjon av næringsmidler, balansen mellom nitrogen og karbonkilder og mineraltilset-ninger, og av de fysikalske betingelser slike som omrøring og luftning av kultur-mediet samt av temperaturen.

Ved fremgangsmåten til fremstilling av rifamycin B kan de egnede mikroorga-nismer kultiveres i et vandig medium som inneholder stoffer av følgende klasse: a) En kilde for organisk nitrogen slik som maisstøp, pepton, kjøttekstrakt, gjær-ekstrakt, vegetabilsk proteinstoff, kasein, maltekstrakt, oppløselige stoffer fra destil-leringsrester etc. og/eller anorganisk nitrogen slik som ammoniumsulfat, ammoni-umnitrat, kaliumnitrat etc. b) En karbonkilde slik som stivelse, dextrin, glukose, sucrose, laktose etc. c) Mineralske tilsetninger slik som kalsiumkarbonat, kaliumfosfat, magnesi-umsulfat, kaliumklorid, sinksulfat, ferro-sulfat, mangansulfat, koboltklorid, ammo-niummolybdat etc, eller kombinasjoner av disse. d) Et hjelpemiddel fra den klasse som består av barbitursyrer med formel

hvori R og Rt er de samme eller forskjellige og betyr hydrogen, lavere alkyl-, lavere alkenyl- og enkjernede arylradikaler eller alkalimetallsalter av disse.

Det skal forstås at disse hjelpemidler er effektive ved økning av utbyttet for rifamycin B i fermenteringsfremgangsmå-ter, hvor det anvendes Streptomyces mediterranei (ATCC 13.685) som fremstiller det ønskede antibiotikum og i nærvær av et hvilket ^som helst medium som underhol-der fremstillingen av slike stoffer. Disse hjelpemidler er effektive når de anvendes i mediet i en konsentrasjon fra 0,01 pst. til 5,0 pst., fortrinnsvis fra 0,1 pst. til 0,5 pst.

Det anvendte hjelpemiddel kan tilsettes fullstendig ved begynnelsen av fermenteringen eller kan tilsettes gradvis under fermenteringen.

Utvinningen av rifamycin B fra fermenteringsvæsken utføres ved hjelp av en av fremgangsmåtene som er vanlig for utvinning av antibiotika. F. eks. kan væsken filtreres ved en pH mellom 5,0 og 8,0, skjønt ved ennu lavere pH-verdier passerer det meste av antibiotikumet inn i filt-ratet. Det er imidlertid ikke tilrådelig å filtrere ved en pH-verdi som er lavere enn 5,0 på grunn av den lille oppløselighet av antibiotikum i den sure form. Fra den filtrerte væske frigjøres antibiotikumet ved ansyring og ekstraheres deretter med et oppløsningsmiddel som er i stand til å oppløse antibiotikumet og hvori hjelpemidlet har en lav oppløselighet. For eksempel kan den filtrerte væske ekstraheres med en mengde kloroform som ligger i om-rådet fra 1/10 av volumet til like stort volum av væsken eller mere således at alt rifamycin B bringes over i oppløsningsmid-let og bare en liten prosent av fermente-ringshjelpemidlet. Fra kloroformen ekstraheres rifamycin B igjen inn i en vandig oppløsning ved en pH mellom 5,0 og 9,0, idet det fortrinnsvis anvendes fosfatpuf-fere ved en pH ca. 7,5. Volumet av den vandige fase kan være ca. 1/10 av volumet av kloroformen. Alt rifamycin B passerer inn i den vandige fase som dinatriumsalt og ekstraheres igjen etter ansyring med et hensiktsmessig oppløsningsmiddel, slik som kloroform, eller ennu bedre etylacetat. Bu-tanol, benzol og forskjellige estere, slik som amyl- og butylacetat er også brukbare. Ved konsentrering i vakuum til et lite volum krystalliserer rifamycin B i form av vakre oransje-gule krystaller. Rifamycin B frafiltreres, vaskes med etylacetat og etyleter. Etter tørking viser rifamycin B egenskaper som er beskrevet i ovennevnte patent. Rifamycin kan hensiktsmessig kry-stalliseres fra etylacetat, benzol eller metanol etc.

Som et alternativ kan rifamycin ekstraheres fra den filtrerte væske etter ansyring med et oppløsningsmiddel hvori også overskudd av hjelpemiddel er oppløse-lig. Imidlertid byr denne fremgangsmåte på problemer med å fjerne hjelpemediet, hvilke kan løses på forskjellige måter. For eksempel kan den rå blanding behandles med et oppløsningsmiddel hvori en av de to komponenter er oppløselig. Den fore-trukne fremgangsmåte er imidlertid den som er beskrevet ovenfor.

Følgende eksempler vil tjene til å il-lustrere oppfinnelsen.

Eksempel 1.

En kultur av Streptomyces mediterranei ble podet i 500 ml rystekolber som inneholdt 100 ml medium av følgende sam-mensetning: kjøttekstrakt 5 g, gjærauto-lysat 6 g, pepton 5 g, kaseinhydrolysat 3 g, glukose 20 g, NaCl 1,5 g, H20 destil. 1000 ml, pH 7,3.

Etter 24 timers vekst i en frem- og til-bakegående rystemaskin (100 slag pr. min ved 80 mm amplitude) ved 28° C ble inn-holdet av kolbene helt i 10 liters glass-fermenteringskar med 4 1 av samme medium. Vegetativ vekst fant sted under om-røring (800 omdreininger pr. min) og luftning (vol/vol/min) ved 28° C. Etter 24 timer var det 4—5 volum-pst. økning i mycelievekst. pH-verdien var 6,0—6,8. 10 pst. podemateriale fra det vegetative trinn ble innført i en annen glassfermenteringsbe-holder som inneholdt 4 1 av fermenteringsmediet, bestående av

pH korrigert til 7,0 med konsentrert NaOH. Sterilisering 30 min. ved 121° C.

Vekst av organismene fant sted med omrøring (800 omdreininger pr. min.) og luftning (1,5 vol/vol/min) ved 28° C. Øk-ningen i mycelievekst var ca. 25—35 volum-pst. Maksimum antibiotisk aktivitet ble oppnådd mellom 48 og 72 timer og ut-byttene var ca. 100—200 |xg. rifamycin B pr. ml mesk. Hvis det utføres en identisk fermentering, men uten tilsetning av Na-barbituren fås en blanding av alle fraksjoner A til E av rifamycin. I denne for-bindelse vises til eksempel 1 i patent nr. 103 127 som er identisk med foreliggende eksempel med unntagelse av at det ikke er tilsatt noe barbiturat.

Eksempel 2.

En rystekolbekultur av Streptomyces mediterranei ble fremstilt som i eksempel 1. Vegetativ vekst ble utført som før, idet det ble anvendt følgende medium:

Etter 24 timers vegetativ vekst opp-nåddes en 4—5 volum-pst. mycelievekst. pH var 4,0—4,5.

En 10 pst. podning av den vegetative vekst ble anvendt for fermenteringstrin-net (fermenteringskar som ovenfor).

Fermenteringsmediet besto av:

Fermenteringen ble utført i likhet med eksempel 1. Maksimum aktivitet på ca. 400 —500 |ig/ml. rifamycin B ble oppnådd etter 72—96 timer.

Fermenteringsvæsken (4 1) som ved avslutningen har pH på 6,0 ble regulert til pH 7,5 med fortynnet natriumhydroksyd og filtrert ved tilsetning av et egnet filter-hjelpemiddel.Myceliet kastes etterat det er blitt vasket med vann (1 liter) og de sam-menslåtte filtrater regulert til pH 2,1 med 10 pst. saltsyre. Den ansyrede væske ekstraheres to ganger med 1,5 liters porsjoner kloroform. Kloroformekstraktet (2,95 1) ekstraheres igjen to ganger med 750 ml porsjoner av fosfatpuffer ved pH 8,0. Puf-feroppløsningen ansyres til pH 2,0 med 10 pst. saltsyre og ekstraheres med etylacetat (500 ml). Oppløsningsmidlet avdestilleres til et lite volum (ca. 50 ml). Under kon-sentreringen utfeltes rifamycin B og etter avkjøling i flere timer ved 0° C oppsam-les og vaskes med liten mengde etylacetat og med etyleter. Rifamycin B viser etter tørking en mikrobiologisk aktivitet på 980 l_ig/mg mot en standardrifamycin B. Det spaltes ved ca. 160° C og smelter ikke under 300° C. (a) <20> —11° (c = 1, metanol).

D

Eksempel 3.

Fermenteringsfremgangsmåten ble ut-ført i likhet med eksempel 1, og fermenteringsmediet ble forsterket med 20 g pr. 1 bønnemel. Hjelpemidlet var dimetylbarbi-tursyre ved konsentrasjon på 0,5 pst. Mak-simumsaktivitet på 500—700 |xg/ml rifamycin ble oppnådd etter 48—72 timers fermentering.

Eksempel 4.

Samme fermenteringsfremgangsmåte som i eksempel 2. Følgende fermenterings-medium ble anvendt i det endelige trinn:

samt tilførsel av mineraler som eksempel 2. Maksimumutbytter på 200—300 (ig/ml rifamycin B ble oppnådd etter 72—96 timer.

Eksempel 5.

Fermenteringsfremgangsmåte som i eksempel 4, med Na-dietylbarbiturat som

hjelpemiddel, Maksimumutbytter på 1500 —2000 j.ig/ml rifamycin B ble oppnådd etter 96—120 timers fermentering.

Claims (1)

1. Fremgangsmåte til fremstilling av rifamycin B ved dyrkning av stammen Streptomyces mediterranei ATCC 13.685 under neddyppede aerobiske betingelser i et næringsmedium som inneholder en kilde for organisk nitrogen, en assimilerbar karbonkilde og mineralsalter, karakterisert ved at næringsmediet tilsettes fra 0,01 til 5,0 pst. av en barbitursyre med den generelle formel

   hvor R og Rl er hydrogen, lavere alkyl-, lavere alkenyl- eller enkjernet arylradikal, eller alkalimetallsalter derav.