NO119308B - - Google Patents

Description

Fremgangsmåte til fremstilling av amfotericyner eller salter derav.

Denne oppfinnelse angår fremstilling

av nye og nyttige antibiotika, samt fermentering, konsentrering, rensing og fremstilling av salter av dem. I fri form er det

blitt isolert to nye antibiotika, av hvilke

det ene er blitt kalt amfotericyn A og det

annet amfotericyn B, og i det følgende be-tegner uttrykket amfotericyn generelt begge disse antibiotica og blandinger eller

forbindelser av disse med andre stoffer.

Antibiotika i henhold til oppfinnelsen

dannes ved at man under regulerte betingelser dyrker en hittil ukjent art av streptomyces.

Mikroorganismen.

Den mikroorganisme som anvendes til

fremstilling av amfotericyn er en nyopp-daget art av streptomyces som er blitt isolert fra en materialprøve som skriver seg

fra Templadora, ved elven Orinoco i Sør-Amerika. En kultur av den levende organisme er blitt undersøkt ved Rutgers In-stitute of Microbiology (New Brunswick,

New Jersey) og har fått nummeret 3694 i

Waksman collection, og kalles i det føl-gende Streptomyces sp. 3694.

Oppfinnelsen er ikke begrenset til an-vendelsen av den der beskrevne spesielle

organisme, men omfatter blant annet mu-tanter som er dannet av den beskrevne organisme ved hjelp av mutasjonsbevirkende

midler som f. eks. røntgenstråler, ultrafiolette stråler og kvelstoffholdige senneps-forbindelser.

For isolering og karakterisering av mi-

kroorganismen iblir en prøve av vedkommende jord rystet med destillert vann og anbrakt på et medium av Henrici-agar. Dette medium inneholder:

Blandingens pH reguleres til 7,0 og den steriliseres i 20 minutter i en autoklav ved 121° C. Etter 7—10 dagers inkubasjon ved 25° C blir kolonier av Streptomyces sp. 3694 isolert fra underlaget. Disse isolerte kolonier blir deretter dyrket på et agar-medium som inneholder:

15 minutter.

Når mikroorganismen deretter under-søkes, ved strekplantemetoden, på gjær-kjøtt-agar, med hensyn på antibiotisk aktivitet i forhold til såvel bakterier som sopper, hindrer den ingen av testbakteriereak-sjonene, men derimot reaksjonene av Saccharomyces cerevisiae, Rhodotorula glutin-is, Candida albicans og Aspergilus niger

I det følgende gis det en beskrivelse av kolonier som er blitt inkubert i forkjellig lange tidsrom og på forskjellige medier:

Skråttskåret potetsylinder.

Etter 15 dager er det fått en meget tung, fuktig, seig vekst som sprer seg og har omtrent samme farge som poteter, med sporer som dekker over skråpartiet.

Lakmusmelk:

I løpet av 7 dager er vekstringen på overflaten blitt fargeløs. Melken blir blå til purpurfarget, og blir gradvis klarere fra toppen mot bunnen, hvilket antyder pro-teolyse uten koagulering.

Czapek- Dox Agar:

NaNO.i, 3 g; KH2PO4, 1 g; KC1 0.5 g; MgS04. 7H2O, 0,5 g; FeSO-i, 7H20, 0,01 g; glukose 40 g; agar 15 g; destillert vann til 1,000 liter.

Ingen vekst av blandingen i løpet av 15 dager, til tross for to inokuleringer.

Glukose- næringsmiddel- brom- kresol-purpur- skråagar: Kjøtt-ekstrakt 3 g, proteosepepton 10 g, glukose 10 g, NaCl 5 g, agar 20 g, brom-kresolpurpur 0,15 g, destillert vann til 1000 ml. pH = 7,0.

(Moderat ikraftig vekst i 51 dager, rynket, glinsende, asporogen. Rynkingen på alle agarer er meget karakteristisk. Ryn-kene er parallelle, det forkommer rettlin-jede «hakk» i kulturene innbyrdes slik at det fåes et «stenveggliknende» utseende, med rektangler av forskjellige størrelser.

Sabouraud skråagar:

Glukose 40 g; neopepton 10 g; agar 15 g, destillert vann 1000 ml.

Etter 4 dager er kulturen gul, blir brunaktig i løpet av 7 dager, og helt brun i lø-pet av 15 dager. Den vokser sterkt, først glinsende, blir så matt, rynket med et brunt diffuserbart pigment som blir synlig i lø-pet av tre til fire dager.

Glukose- Asparagin- skråagar : Glukose 10 g; K2HPO4, 0,5 g; asparagin

0,5 g; agar 15 g; destillert vann 1000 ml.

Etter syv og femten dager er veksten moderat stor, uten rynker, fargeløs med hvite sporer som1 blir grå og et gult diffuserbart pigment, som blir brunaktig. Dessuten avsettes det et i vann uoppløselig, dypgult stoff ved kantene av skråagaren ved denne basis. Dette stoff er oppløselig i metanol, propanol og i dimetylformamid.

Mikroorganismene er videre 'karakterisert ved at svovelvannstoff ikke frembrin-ges, hvilket fremgår ved at blyacetatpapir forsøkes anvendt i et medium som inneholder: proteosepepton 20 g, glukose 1 g, NaaHPOi 2 g, agar 2 g, og destillert vann til 1 liter. Dessuten blir Difcogelatin brakt i flytende tilstand. Kulturen vokser og får på sin overflate et lysebrunt, asporogent utseende. Når det anvendes difco-nitrat-kjøttsuppe vokser kulturen som en lysebrun asporogen hinne. Kjøttsuppen blir mørkere og det opptrer et brunt pigment. Nitrat blir sterkt redusert til nitritt. Dessuten tolir stivelse hydrolysert av kulturen når det ar-beides i et medium som inneholder stivelse.

For å bestemme kullstoff- og kvelstoff-ernæringen av Streptomyces sp. 3694 blir det utført følgende forsøk: Det ble fremstillet fire serier med rør som inneholdt mineralsaltagar med 1 mg pr. ml av føl-gende fire kvelstofforbindelser: (NH4)2S04, NaNO:i, asparagin og kaseinhydrolysat. I hver serie ble hvert rør forsterket med 10 mg/l av en blant 16 mulige kullstoff- og energikilder. Disse er stivelse, mulm, dekstrin, raffinose, maltose, laktose, sukrose, sortoose, glukose, dulcitol, inositol, sorbitol, mannitol, xylose, aratoinose og glyserin.

Agaren i rørene (10 ml) stilles skrått og skråagarene strekes med en suspensjon av Strepotmyces sp. 3694 i destillert vann. Etter 9 dagers inkubering tole veksten un-dersøkt og resultatet er angitt i den føl-gende tabell I:

Resultatene viser at mikroorganismen er i stand til å assimilere kullstoff fra stivelse, dekstrin, maltose, glukose og mannitol, uansett kvelstoffkilden. Sammen med de organiske kvelstoffkilder kan det også anvendes laktose, sukrose, inositol og glyserin, selv om vekst med disse kullstoffkil-der kan være lettere enn med glukose og dennes polymere. Nitrater kan ikke anvendes som kvelstoffkilde sammen med noen av (kullstoff- og energikildene, mens asparagin- og kaseinhydrolysat kan benyttes som eneste kilder for kullstoff, kvelstoff og energi.

Antibiotikaene.

Streptomyces sp. 3694 gir en blanding av antibiotika. Selve blandingen, såvel som de spesifikke antibiotika som kan isoleres fra blandingen, har mange antifungiside egenskaper, men ingen betydelige antibak-terielle egenskaper.

For fremstilling av amfotericyn blir Streptomyces sp. 3694 dyrket ved en temperatur av 23—30° C, fortrinsvis ca. 25° C under neddykkede aerobe betingelser i et vandig næringsmedium som inneholder en assimilerbar, fermenterbar kullvannstoff-kilde og en assimilerbar kvelstoffkilde. Blant egnede kuUvannstoffkilder kan nev-nes stivelse, dekstrin, sukkerarter som maltose, laktose og glukose, glyserin osv. Blant egnede kvelstoffkilder er asparagin, kaseinhydrolysat, soyabønnemel, kjøttek-strakt, gjærekstrakt, osv. Fermenteringen skjer i ca. 24 til 150 timer. Ved slutten av denne periode er det blitt dannet en betydelig mengde amfotericyn (bevist ved bio-forsøk) som det tydeligere fremgår av følgende eksempler.

Etter at dyrkningen er fullført blir amfotericyn skilt fra kulturen ved hjelp av en hvilken som helst av de tre nedenfor angitte, alternative metoder: (1) Myceliet skilles fra resten ved filtrering eller sentrifugering, og amfotericyn ekstraheres fra myceliet, etter at myceliets pH er blitt nedsatt til ca. 2—3 ved toehandling med en syre. Ekstraheringen skjer med et oppløs-ningsmiddel som f. eks. en lavere alkanol (f. eks. isopropanol, n-propanol eller n-butanol). Ved fordampning av alkanolen utfelles det rå amfotericyn. (2) Hele dyrk-ndngsmassen alkaliseres til en pH på 11—12 ved hjelp av en hase som for eksempel natrium- eller kaliumihydroksyd. Deretter omrøres og filtreres massen og filtratet nøytraliseres med en syre til en pH på ca. 7, f. eks. med en nuinerals<yr>e (eksempelvis saltsyre, svovelsyre eller fosforsyre), hvorved det rå amfotericyn utfelles. (3) Den hele massen pH innstilles på en verdi av 2—3 (ved behandling med en syre) eller på en verdi av 10—11 (ved behandling med en base), idet amfotericyn er mere opplø-selig i disse pH-områder. Deretter ekstraheres massen med et passende ekstrahe-ringsmiddel, f. e!ks. de foran angitte alka-noler, hvoretter man filtrerer og atskiller fasene (hvis det anvendes n-butanol). Det rå amfotericyn blir deretter direkte utfelt fra filtratet ved at dette nøytraliseres til en pH av ca. 7, og at en del av ekstra-heringsmidlet fjernes ved destillasjon i vakuum.

Ved videre rensning av det rå amfotericyn som er blitt isolert på en av disse måter oppnår man å fraksjonere amfote-ricynet i dets to komponenter amfotericyn A og amfotericyn B. Denne fraksjonering utføres på den ene eller den annen av de to følgende måter. (1) Utfeiningen av rått amfotericyn slemmes opp i en alkohol, f. eks. en lavere alkanol, (som metanol, n-propanol, isopropanol eller 'butanol) ved lav pH (oppnådd ved å behandle oppslemmingen med en sy-re, f. eks. en mineralsyre) hvoretter man filtrerer. Det uoppløselige stoff ibestår hovedsakelig av amfotericyn B. Filtratet nøy-traliseres med en base, f. eks. natriumhydroksyd, hvorved det fåes en utfelning av renset krystallinsk stoff, hovedsakelig bestående av amfotericyn A. (2) Utfelningen av rått amfotericyn oppslemmes i et oppløsnlngsmiddel, f. eks. i et di (lavere alkyl) lavere—alkansyreamid, (eksempelvis dimetylformamid, dimetyl-acetamdd eller dietylformamid), og filtreres. Det uoppløselige stoff består i hoved-saken av rått amfotericyn B. Ved å behandle amidoppløsningen med en blanding av vann og et organisk polart oppløsnings-middel, f. eks. en vandig alkohol (eksempelvis en metanol-vann-oppløsning) eller med et vandig keton (f. eks. en vann-aceton-oppløsning) får man en krystallinsk utfelning som hovedsakelig består av amfotericyn A.

Amfotericyn A og B er amfotære stoffer som lett danner salter ibåde med baser og med syrer. Hvis amfotericyn behandles med en anorganisk base, f. eks. en alkali-metallbase (som f. eks. natrium- eller ka-liumhydroksyd) eller med en jordalkalime-tallbase, dannes det tilsvarende metallsalt. Behandles amfotericyn med et jordalkali-salt (f. eks. kalsiumklorid eller magnesium-klorid) i en alkohol som f. eks. metanol dannes det komplekse forbindelser. Lar man amfotericyn reagere med ammonium-hydroksyd eller med en organisk kvel-stoffbase dannes det tilsvarende ammo-nium- eller aminsalt.

Begge amfotericynene reagerer med både mineralske og organiske syrer under dannelse av det tilsvarende syresalt. Eksempelvis kan amfotericyn bringes til å reagere med mineralsyrer som saltsyre, svovelsyre eller fosforsyre med dannelse av det tilsvarende hydroklorid, sulfat eller fosfat, eller det ;kan -bringes til å reagere med organiske syrer, som eddiksyre, citronsyre eller vinsyre, med dannelse av de tilsvarende salter.

De følgende eksempler viser egnede metoder til fremstilling, fraksjonering og rensning av amfotericyn.

Eksempel 1.

Fermentering av Streptomyces sp. 3496

i en tank.

En porsjon på 3000 1 Streptomyces sp. 3496 fermenteres i et inokuleringsmedium under de nedenfor angitte forhold:

Inokuleringstilberedelse.

A. Første trinn.

Inokuleringskulturkilde Streptomyces sp. 3694, dyrket på Gould-skråagar.

Medium: 3 pst.'s Stanleys nærings-stoff 48

2 pst. glukose

0,005 pst. C0CI2.6H2O

0,1 pst. CaCO-,

pH innstillet på 7,0—7,2

Sterilisasjon på 30 min. ved 121° C. Volum — 100 ml i 500 ml kolbe. Temperatur 25° C.

Inkubasjon 72 timer i et frem og tilbake gående rysteapparat (170 sykler pr. minutt.

B. Annet trinn.

Inokuleringskilde 10 pst. fra det første trinn.

Medium det samme som i det første trinn.

Sterilisering 40 min. ved 121° C. Volum 480 ml i en 2000 ml kolbe. Temperatur 25° C. Inkubasjonstid 48 timer i det frem og tilbake gående rysteapparat (120 sykler pr. minutt).

F er menter ing sbeting eiser.

Medium1-. 3 pst. Stanleys næringsmiddel 48 2 pst. glukose 0,25 pst. CaCO::

0,1 pst. NaCl

0,0005 pst. C0CI2

Steriliseringstid 15 min. ved 121° C, fullstendig fortynning. Temperatur 25° C.

Omrøring 2 HK/387,5 1.

Lufting, 60 cm/min. overflateliuft-hastighet.

Fermenteringssyklus 144 timer. Defcamer brenner som brenner olje (ca. 0,5 pst. av porsjonen). Inokuleringsmengde 480 ml, fra annet trinn (4 pst.)

Volum 12000 ml.

Resultatene av fermenteringen er angitt i den følgende tabell for to porsjo-ners vedkommende:

<*>) Prøver ble sentrifugert (de øverste partier er kalt «suppe») og sentrifugatet ble ekstrahert med et volum butanol som

var likt volumet av den opprinnelige ma-terialprøve (resultatet av denne ekstrahering kalles «ekstrahert»).

Eksempel 2.

Et passende inokuleringsmedium, som er blitt fremstillet på den i eks. 1 (beskrevne måte, tole innført i et fermenterings-medium som inneholder:

Mediet steriliseres ved å opphetes i 20 minutter i en autoklav ved 121° C før inokuleringsstoffet innføres. Etter 4 dagers forløp tole det foretatt sammenlikninger med forsøk hvor det var anvendt Saccha-roviyces cerevisia hvor en del av kjøttsup-pen var blitt lyofilisert og tilsatt vann til ca. 2 1/3 ganger den opprinnelige konsentrasjon (både på den klare overliggende kjøttsuppe og på butylalkoholakstrakten av de vaskede celler, tilbakeført til det opprinnelige volum av prøven) hvilket ga føl-gende .resultater:

Fermenteringen foregikk i 5 dager og ved slutten av denne tid viste et forsøk at suppen var aktiv mot Candida albicans; forsø-ket ble utført på tallerken.

Amfotericyn ,kan ekstraheres fra den hele 'kulur på den måte som er angitt i de følgende eksempler:

Eksempel 3.

Ekstrahering med isopropa- nol fra hele suppen.

Ekstrahering av amfotericyn som er blitt fremstilt 1 henhold til eksempel 1 skjer ved at det tilsettes 80—170 pst. av suppens volum av isopropanol og at man med svovelsyre regulerer pH til 2.0. Etter ca. 1/2 times omrøring filtreres blandingen, fortrinsvis under anvendelse av et filter-medium. Filtratets pH reguleres til ca. 7 ved hjelp av natriumhydroksyd og isopro-panolen avdestilleres i vakuum ved en temperatur ikke over 35° C. Deretter anbringes blandingen i et koldt rom natten over,

og den dannede utfelning filtreres fra. vaskes med aceton og tørkes i vakuum. Det

fås en blanding av amfotericyn A og amfotericyn B, med et utbytte av ca. 40 pst.

Blandingen svarer til ca. 1500—2500 du/mg (Saccharomyces cerevisia) (du/mg betyr fortynningsenheter pr. miligram).

Eksempel 4.

Butanolekstrahering fra hele kulturen.

Til 9,4 1 av hele kulturen med 3000 du/ml settes det en fjerdedel av dets volum av butanol. Med H2SO1 senkes blandingens pH til 2,0, og blandingen omrøres godt i en halv time. Deretter tilsettes Hyflo (5 pst. volumvekt) eller et annet filtr e-ringshjelpemiddel, og blandingen filtreres. Filtratet anbringes i en skilletrakt og bu-tanollaget skilles fra og oppbevares. Deretter destilleres ibutanoloppløsningen til en 1/3 av dens opprinnelige volum i vakuum og ved en temperatur som ikke går over 35° C. Det dannes en utfelning som filtreres fra, vaskes med aceton og tørkes i vakuum. Produktet som fås med ca. 22 pst. utbytte, er en blanding av amfotericyn A og amfotericyn B, og måler ca. 1600 du/mg

sammenliknet med Saccharomyces cerevisia

og ca. 960 du/mg sammenliknet med Candida albicans.

Eksempel 5.

Ekstrahering av amfotericyn fra mycelium.

En liten amfotericynholdig helkultur blir sentrifugert for å skille filtrat fra mycelium. Den fuktige myceliumkake omrøres med 200 ml n-propanol, dens pH reguleres til 2,0—3,0 med svovelsyre, og får stå natten over i et koldt rom. Propanolen fra-skilles ved sentrifugering, og myceliumka-ken ekstraheres tre ganger, med 100 ml n-propanol hver gang. De forente propanol-ekstrakter konsentreres i vakuum til så litet volum som ca. 130 ml, ved hvilket punkt det dannes en utfelning. Denne sen-trifugeres fra og tørkes i vakuum. Det fås ca. 1,114 g produkt, som har en potens av ca. 1176 Candida du/mg. 820 mg av dette faste stoff finmales og løses opp ved å oppvarmes i en blanding av 80 ml n-butanol og 16 ml metanol, mens 80 ml vann tilsettes etterhvert. Til denne oppløsning settes 48 ml heksan, og blandingen omrø-res og får stå ved romtemperatur natten over. Det dannes en del lysegule krystaller av amfotericyn, som filtreres fra og tørkes i en desikkator. Videre mengder av mindre rent stoff kan fås ved å konsentrere moder. luten i vakuum.

Eksempel 6.

Ekstrahering fra basisk helkultur.

Til en 500 ml prøve av amfotericynholdig helkultur, som måler 11,000 du/ml, settes det Saccharomyces cerevisiae i et like stort volum isopropylalkohol. Denne blan-dings pH heves deretter til 10,5 ved anvendelse av 20 pst.'s natriumhydroksyd. Den erholdte blanding omrøres 1/2 time, det tilsettes 2 pst. hyflo og man filtrerer. Filtratets pH senkes til 7 ved anvendelse av 20 pst.'s svovelsyre, og isopropylalkohol-en fjernes i vakuum ved en temperatur ikke over 35° C. Etter henstand natten over blir utfellingen filtrert fra, 'vasket med vann, så med aceton, og tørket i vakuum. Utbyttet er ca. 1,22 g (77 pst.) av en blanding av amfotericyn A og amfotericyn B, som måler ca. 3400 du/mg ( Saccharomyces cerevisiae).

i Amfotericynblandingen kan fraksjo-neres til dens enkelte bestanddeler, amfotericyn A og amfotericyn B, ved den fremgangsmåte som er beskrevet i de følgende eksempler: Eksempel 7.

Krystallisering ved anvendelse av alkohol.

Det i eksempel 6 erholdte amfotericyn fordeles i en blanding av 70 pst. isopropylalkohol og 30 pst. vann så det fås et slam med en konsentrasjon av 32.000'—35.000 u/ml. (u = du/mg). Candida albicans tilsettes under omrøring, og pH senkes til 2 med saltsyre. Det uoppsøselige materiale (rått amfotericyn B) filtreres fra og filtratets pH heves til ca. 7,5. Etter henstand natten over filtrerer man fra den krystallinske utfelning, som hovedsakelig består av renset amfotericyn A, vasker den med aceton og tørker i vakuum, Utbyttet av amfotericyn A er ca. 50 pst., beregnet etter bioaktivitet.

Eksempel 8.

Krystallisering ved anvendelse av dimetylformamid.

Det i eksempel 6 erholdte amfotericyn røres ut i dimetylformamid (1 g/20 ml). Under omrøring nedsettes pH til 7 ved anvendelse av konsentrert saltsyre. Etter en halv times omrøring tilsettes hyflo (1 pst. w/v) og blandingen filtreres. Til filtratet settes et volum metanol og deretter langsomt et volum vann. (Selv om metanol-vann-oppløsning foretrekkes kan det også anvendes aceton eller dioksan i vann). Blandingen får deretter stå natten, over, og dens pH blir da 4,5. Det dannede bunnfall filtreres fra, vaskes med aceton og tør-kes. Det består av 85—90 pst. amfotericyn B, 5—10 pst. amfotericyn A og en liten mengde av andre forurensninger.

Ved tilsetning av natriumhydroksyd heves deretter pH i moderluten fra hvilken amfotericyn B ble isolert til 8, og det tilsettes 3 volumdeler vann. Etter henstand natten over filtreres bunnfallet fra, vaskes med aceton, og tørkes. Dette tounnfall består av 80—85 pst. amfotericyn A, 5—10 pst. amfotericyn B og en liten mengde av andre forurensninger.

Oet samlede utbytte utgjør 90—95 pst. Fraksjonen som hovedsakelig inneholder amfotericyn B kan renses videre ved at den utslemmes i 70 pst.'s vandig isopropanol, i en konsentrasjon av 1 g pr. 100, ved pH 2 i en halv time. Deretter blir blandingen filtrert, filtratet oppvarmet til 45°C og pH langsomt hevet til 5 ved tilsetning av natriumhydroksyd. Den således erholdte blanding avkjøles langsomt til romtemperatur og får stå natten over. Det krystallinske produkt (ca. 50 pst. utbytte) filtreres deretter fra, vaskes med aceton og tør-kes. Det består praktisk talt bare av rent amfotericyn B.

Fraksjonen som hovedsakelig inneholder amfotericyn A kan renses videre ved oppslemming i dimetylformamid, i en konsentrasjon av 1 g pr. 20 ml, omrøring i en time, frafiltrering av det ikke oppløste og langsom tilsetning av filtratet til et like stort volum av 50 pst.'s vandig metanol. Det krystallinske bunnfall filtreres fra etter henstand natten over, vaskes med aceton og tørkes. Det fås praktisk talt rent amfotericyn A med et utbytte på ca. 70— 80 pst.

Fraksjonering og krystallisasjon av de i eks. 1—5 erholdte produkter kan også foregå ved de i eks. 7 eller 8 beskrevne metoder, av hvilke den siste foretrekkes fordi det oppnås større utbytte av den rene fraksjon.

Salter og komplekser av amfotericyn kan fremstilles på de i følgende eksempler beskrevne måter.

Eksempel 9.

Fremstilling av alkalisalter av amfotericyn.

Amfotericyn, såvel i form av den rå blanding som i form av rensede krystaller av amfotericyn A eller B, danner lett salter, og den nedenfor 'beskrevne fremgangsmåte er like effektiv for fremstilling av natrium- som ikaliumsalter av blandingen eller av de rensede A- og B-komponenter: Krystallinsk amfotericyn A suspenderes i metanol slik -at antibiotikaets konsentrasjon er ca. 250.000 enh./ml. ( Saccharomyces cerevisia). Det tilsettes to ekvivalenter IN metanolisk natriumhydroksyd og blandingen omrøres i 15 minutter for at antibiotikaet skal bli helt oppløst. Oppløsnin-gen filtreres og til filtratet settes 10 volumdeler aceton. Det dannes da en utfelning som filtreres fra, vaskes med aceton og tørkes i en desikkator. Utbyttet av na-triumsalt er ca. 90 pst. av det opprinnelige amfotericyn, beregnet etter dets biologiske aktivitet (in vitro).

Natriumsaltet er langt mere oppløselig i vann (50—60 mg/ml) enn det krystallinske amfotericyn A man gikk ut fra. Det er også godt oppløselig i metanol og i dimetylformamid. Det er litt oppløselig i etanol og isopropanol, men uoppløselig i eter, aceton, butanol, kloroform, bensol, heksan og dioksan.

Eksempel 10.

Fremstilling av kalsiumkloridkomplekset.

Et kalsiumkloridkompleks av amfotericyn kan fremstilles ved å løse opp enten krystallinsk amfotericyn A eller B (eller en blanding derav) i 1 pst.'s metanolisk kalsiumklorid (1 g/20ml), filtrere fra det som ikke oppløses og sette 5 volumdeler aceton til filtratet. Den dannede utfelning filtreres fra, vaskes med aceton og tørkes. Kal-siumkloridkompleksets oppløselighet i organiske oppløsningsmidler tilsvarer syre-saltenes oppløselighet. I vann, derimot, blir komplekset hydrolysert, og dets oppløselig-het er lik oppløseligheten av utgangs-amfotericynet.

Eksempel 11.

Fremstilling av et salt av en syre.

Krystallinsk amfotericyn A eller B (eller en Iblanding derav) løses opp i dimetyl-

formamid (lg/25 ml) og det tilsettes en ekvivalent av konsentrert saltsyre. Blandingen filtreres og det settes to volumdeler aceton til det nøytrale filtrat. Den derved dannede utfelning filtreres fra, vaskes med aceton og tørkes i en vakuumdesikkator. Produktet, som fås med ca. 90 pst.'s utbytte, inneholder 1 ekvivalent syre og har in vitro en bioaktivitet som e;r lik det krystallinske amfotericyns. Det er litt mere opplø-selig i vann og langt mere oppløselig i metanol, etanol, isopropanol og butanol enn det krystallinske amfotericyn. Derimot er syresaltet uoppløselig i aceton, kloroform, eter, toensol, etylacetat og heksan.

Sulfatet er blitt fremstilt på samme måte ved å anvende en ekvivalent mengde svovelsyre i stedet for saltsyre. Dets egenskaper likner hydrokloridets.

Amfotericyns kjemiske og fysikalske

egenskaper.

Krystallinsk amfotericyn A har følgen-de karakteristika: Smeltepunkt: Det blir mørkere ved 180—185° C, blir forunt og krymper sammen ved 198—200° C, og smelter under spaltning ved ca. 210° C.

Elementæranalyse:

C = 59,28 %

H = 8,43 %

N = 1,81 %

O = 30,48 % (.beregnet ved differense)

Ingen andre elementer til stede. Ingen metoksy- eller acetylgrupper. Spesifikk optisk rotasjon: [a] D + 163° (pyridin); + 93"

(eddiksyre) + 136° (dimetylformamid);

+ 28° (O.lNiHCl i metanol).

Oppløselighet:

Godt oppløselig i iseddikk og i dimetylformamid. Oppløselig i en mengde av lmg/ ml i metanol, vandig isopropylalkohol og våt butanol, og langt mere oppløselig i disse oppløsningsmidler hvis de er tilsatt syre eller er gjort sterkt alkaliske. (Eksempelvis er oppløseligheten av amfotericyn A ca.

1 mg/ml ved pH mellom 3 og 8, mens dens

ved pH lik 2, 9 og 10 er 3 mg/ml og ved pH = 11 er 8—10 mg/ml).

Antibiotikaet er uoppløselig i vann ved nøytrale eller sure pH-forhold, men er opp-løselig ved pH 10 eller derover. I fortynne-de oppløsninger kan dog antibiotikaet løses op i en vandig oppløsning ved at man øker en suspensjon av stoffets pH til 11, f. eks. ved tilsetning av natriumhydroksyd, Den således dannede oppløsning kan deretter nøytraliseres med en syre uten at det dannes noen utfelning.

Amfotericyn A er 'uoppløselig i eter, dioksan, etylacetat, amylacetat, kloroform, bensol, heksan, absolutt etanol, isopropanol og ibutanol.

Ultrafiolett spektrum:

De ultrafiolette absorpsjoinsmaksima av krystallinsk amfotericyn A i metanol er:

Noe av adsorpsjonen i området 362— 405 kan skyldes tilstedeværelse av amfotericyn B.

Infrarødt spektrum:

Det infrarøde absorpsjonsspektrum av amfotericyn A suspendert i Mujol viser topper (og avsatser ibetegnet med «sh») ved følgende frekvenser og bølgelengder:

Nøtral ekvivalent av krystallinsk amfotericyn A:

!929 titrert som base.

989 titrert som syre.

pH-stabilitet.

Stabil ved alle pH-verdier mellom 3 og 11, iallfall i 24 timer. Ved så lav pH-verdi som 2 er amfotericyn A stabilt i 3 timer, idet bare liten spaltning foregår i løpet av denne tid.

i Varmestabilitet:

Stabil opp til ca. 70° C i en nøytral oppløsning av 50 pst.'s isopropanol.

Kjemiske prøver:

Gir gul farge med ferriklorid.

Krystallinsk, amfotericyn B har følgen-de egenskaper: (Smeltepunkt: Intet bestemt smeltepunkt; det blir mørkere og forkulles.

Elementæranalyse:

C = 56,70

H = 7,72

N = 1.87 %

O 33,71 %

Ingen andre elementer tilstede. Ingen metoksy- eller acetylgrupper.

Spesifikk optisk rotasjon

24 ° C [a] D + 238° (dimetylformamid);

52.2 (0,1N HC1 i metanol).

Oppløselighet:

Godt oppløselig i dimetylformamid og i iseddik. Oppløselig i en mengde av 0,5 mg/

ml i metanol, vandig isopropylalkohol og våt butanol, og meget mere oppløselig i disse oppløsningsmidler hvis de er syret eller er gjort sterkt alkaliske.

Ultrafiolett spektrum:

/De ultrafiolette maksima av krystallinsk amfotericyn B i metanol er:

Infrarødt spektrum:

Det infrarøde spektrum av amfotericyn B suspendert i nujol null viser topper (og trinn som er toetegnet med «sh») ved følgende frekvenser og bølgelengder:

Nøytralt ekvivalent av krystallinsk amfotericyn B: 760 titrert som base.

Amfotericyn B's pH-stabilitet og ter-miske stabilitet svarer til de tilsvarende stabiliteter hos amfotericyn A.

Amfotericynenes biologiske egenskaper.

Amfotericyn, i form av blandingen resp. som renset amfotericyn A og amfotericyn B er virksom mot en mengde forskjellige sopper, ihvilket fremgår av den nedenstående oppstilling, hvor MIC betyr minimums intrlbiterende konsentrasjon.

Den ovenstående oppstilling gir ikke noe helt riktig billede av aktiviteten av

Iamfotericyn B da dette antibiotikum er overordentlig Iltet oppløselig, og følgelig

dets effektivitet i det agar-medioim som ble anvendt ved de undersøkelser som ga de nedenfor nevnte resultater er i høy grad nedsatt. Således vil man finne, -hvis det foretas reagensglassprøver i 'kjøttsuppe, og effektiviteten av amfotericyn B og av blan-det amfotericyn like over for Candida albicans og Saccharomyces cerevisiae sam-menliknes, at amfotericyn B er 8,10 resp. 6,17 ganger mere effektiv enn de blandede amfotericyner.

Det er blitt utført også med egg og med mus for å bestemme effektiviteten av amfotericyn, som blanding og som rent A og rent B, like over for Candida albicans. Ar-beidsbetingelsene og resultatene når det gjelder egg (tabell II og mus (tatoell III) var som følger: I begge forsøk var de anvendte antibiotika: (1) en blanding av amfotericyn A og amfotericyn B oppløst i dimetylacetamid og deretter fortynnet med vann slik at det endelige forhold av antibiotika til oppløsningsmiddel var 1 : 10 (i det følgen-de kalt «basis»); (2) en blanding av na-triumsalter av amfotericyn A og amfotericyn B oppløst i dimetylacetamid og deretter fortynnet med vann slik at det endelige forhold antibiotikum: oppløsningsmiddel var lik 1 : 10 (i det følgende kalt Na-salt) og (3) en blanding av klorvannstoffsaltene av amfotericyn A og amfotericyn B oppløst i dimetylacetamid og deretter fortynnet med vann slik at det endelige forhold av antibiotikum: oppløsningsmiddel var 1 : 10 (i det følgende kalt «HCl-salt»). /Giftigheten av amfotericyn er angitt i tabell IV, som er resultatet av forsøk utført med amfotericyn-tolanding. Amfotericyn, anvendt som blanding eller som individuelt amfotericyn, kan med fordel anvendes til å bekjempe patogene sopper, som bevirker dermatomycosis eller generelle mycosis. Spesielt er det effektivt ved behandling av «athlete's foot», cocci-diomycosis, monilrases, blastomycosis, osv. Således kan man for profylakse og terapi ved monilial og annen soppinfeksjon gi mennesker amfotericyn i form av tabletter som inneholder 1/2—1 g av antibiotikumet, og det kan på denne måten benyttes sammen med andre antibakteriske antibiotika som f. eks. oksytetracyklin, klortetracyklin eller tetracyklin, istedet for nystatin, for å overvinne den resulterende fungale over-makt.

Sammenlikning mellom amfotericyn og andre antibiotika.

Da amfotericyn, både som blanding og individuell, viser visse egenskaper som likner andre antibiotikas, er det /blitt foretatt fysiske og biologiske sammenliknende for-søk for å påvise at amfotericyn er nye, hittil ikke fremstilte eller erkjente antibiotika.

Amfotericyn 'har en meget stor grad av aktivitet sammenliknet med nystatin og rimocidin. En sammenlikning mellom virk-somheten av en renset blanding av amfotericyn A og B og en renset porsjon nystatin, like over for to test-organismer gir følgende resultat:

Da rimocidin har et antifugalt spektrum som likner nystatin's og amfotericyn^ tole det — i form av dets sulfat — testet sammen med amfotericyn og nystatin like over for S. cerevisiae. Det var på vektbasis mindre aktivt enn nystatin og amfotericyn hvilket fremgår av følgende tabell:

Disse resultater viser at amfotericyn er overlegen like over for nystatin og rimocidin når det gjelder å motvirke Saccharomyces cerevisia og Candida albicans.

Videre sammenlikninger mellom nystatin og amfotericyn er blitt utført ved å sammenlikne deres /virkning mot Candida albicans. En blanding av amfotericyn A og amfotericyn B ble løst opp i rent dimetylacetamid i forholdet 1 del amfotericyn til 10 deler dimetylacetamid. Deretter ble opp-løsningen fortynnet med destillert vann. Til forsøket tole han-mus, som veiet 19—23 g, infisert intravenøst med Candida albicans, slik at hver mus fikk 2x10''' celler, av-lest på Kolorimeter. Så ble forsøksdyrene behandlet, enten suibkutant (s. c.) eller per os (p. o.) to ganger daglig i to dager med det stoff som er angitt i den nedenstående tabell V. Musene tole studert i 10 dager (240 timer), og de dyr som overlevet 240 timer ble tilordnet verdiangivelsen >240 timer, for at man ut derfra skulle kunne be-regne den midlere overlevelsestid. Resultatene er oppstillet i tabell V.

Bortsett fra de ovenfor angitte biolo-

giske forskjelligheter atskiller amfotericyn seg fysisk fra nystatin, rimocidin og asco-

sin, som det fremgår av den nedenstående oppstilling som angår spesifikk optisk drei-

ning og ultrafiolett adsorpsjonspektrum.

Hvis de i denne tabell anførte data betraktes i forbindelse med de kjente ultrafiolett-adsorpsjonsdata for de to amfoteri-

cyner er det tydelig at amfotericyn A, selv om det har et ultrafiolett spektrum som likner det ultrafiolette spektrum som er blitt rapport for nystatin og rimocidin, at-

skiller seg fra disse ved de respektive spe-

sifike rotasjonsverdier, og på liknende må-

te finner man at selv om amfotericyn B

har et ultrafiolett spektrum som er meget likt ascosins så /atskiller de to seg dog ved

forskjellen i deres respektive spesifike ro-tasjoner.

Den lutning man ;kan trekke av disse sammenlikninger blir derfor at amfoteri-

cynene er forskjellige fra nystatin, rimoci-

din eller ascosin både hva angår biologiske virkninger og fysikalske egenskaper.

Claims (2)

1. Fremgangsmåte til fremstilling av amfotericyn, eller salter derav, /bestående i

at man lunder submers aerob betingelse, dyrker en stamme av Streptomyces sp. 3694 i et vandig næringsmedium, som inneholder en kilde til assimilertoart, fermenterbart kullstoff og energi samt en kilde til assi-milerbart kvelstoff, inntil det nevnte medium har fått en betydelig anti-fungal aktivitet, hvoretter amfotericyn utvinnes fra mediet, eventuelt etterfulgt av en fraksjonering i de enkelte bestanddeler, som om det ønskes, omdannes til salt.

2. Fremgangsmåte ifølge påstand 1, for fraksjonering av amfotericynblandingen i dens komponenter, karakterisert ved at blandingen behandles med et di (lavere alkyl)-alkanosyreamid, f.eks. dimetylformamid, hvorved den ene komponent oppløses og den annen ikke, hvoretter blandingen filtreres og filtratet behandles med en vandig lavere alkanol.