PT86451B

PT86451B - Processo para a preparacao de amicina e dos seus derivados bem como de composicoes farmaceuticas e de composicoes fungicidas que os contem

Info

Publication number: PT86451B
Application number: PT86451A
Authority: PT
Inventors: Burkhard Sachse; Gerhard Seibert; Carlo Giani; Peter Hamann; Susanne Grabley; Wolfgang Raether; Hartmut Voelskow
Original assignee: Hoechst Ag
Priority date: 1986-12-24
Filing date: 1987-12-22
Publication date: 1990-11-20
Also published as: DK684987D0; EP0272668B1; GR3005464T3; HUT49646A; DK684987A; US4914216A; AU8298687A; DE3779738D1; EP0272668A1; AU604814B2; PT86451A; US5158888A; HU203582B; ATE77089T1

Description

Alemã), para PROCESSO PARA A

PREPARAÇÃO DE AMICINA

Ξ DOS SEI S

DERIVADOS BEM COMO DE COMPOSIÇÕSS FARMACÊUTICAS E DE COMPOS

ÇÕES FUNGICIDAS QUE OS CONTÊM

Memória descritiva

A Patente Britânica 1 254 721 descreve a preparação do antibiótico macrolido nifimicina por fermentação de Streptomyces hygroscopicus. A nifimicina pode ser usada especialmente como agente antifúngico.

Verificou-se agora que a estirpe de Streptomyces parvullus depositada na Deutsche Sammlung von Mikroorganismen sob o número DSM 3816 sintetiza um novo antibiótico, a amicina, A amicina tem uma utiliza ção potencial muito ampla como substância activa farmacêutica. Se bem que a amicina seja semelhante à nifimi- 1 -

cina na sua fórmula estrutural, constatou-se surpreendeu temente que aquela é um antifóngicc significativamente mais poderoso. Cs derivados da amicina também podem constituir substâncias activas farmacêuticas.

A presente invenção refere-se por conseguinte a:

1. Um processo para a fórmula geral Ia reparação dc novos compostos cia

Ia em que, independentemente uns dos outros, ⁹ cada grupo R e R'' significa hidrogénio ou um grupo malonilo, sendo no máximo um substituinte R um grupo malonilo,

4 cada grupo R e R significa hidrogénio ou um grupo alquilo ^C2^C6 ou alilo, bem como de compostos da fórmula lia, os quais são insaturados na posição 22/23,

com excepcção das combinações de compostos da fórmula Ia nos quais

a)

é malonilo

génio,

b) R. é malonilo, todos e R é metilo,

c) R¹ e todos os grupos os grupos n

O / e R* são hidrogénio e R são hidrogénio e Σ-Γ' é me tilo, incluindo ainda um processo para a preparação dos compostos da fórmula Ib,

Ib em que R¹ e R^z possuem os significados anteriormente definidos, bem como de compostos da fórmula Ilb, os quais são insaturados na posição 22/23,

caracterizado por

a) cultivar Streptomyces parvullus D3n 3816 ou um seu variante ou mutante num meio de cultura até se v: .cácicar a acumulação do composto da fórmula Ia, em cpe o radical

R e um radical R significam malonilo e e R significam hidrogénio, ou do composto em. que .2.¹, todos os grupos

3 4 ,

R , R e R significam hidrogénio, e eventualmente

b) isolar e derivatisar estes compostos.

2. Um processo para a preparação de agentes antimicrobianos contendo um dos compostos da fórmula geral la, lia, Ib, ou Ilb.

Um seguida descreve-se a presen te invenção em pormenor, especialmente na sua forma preferida de concretização. para além disso, a presente invenção é definida nas reivindicações.

Num meio de cultura nutriente que contêm uma fonte de carbonato e uma fonte de azoto bem como os sais inorgânicos habituais, a estirpe Streptomyces parvullus DSlt 3816 produz o antibiótico amicina,

2 3 4 no qual R e um resíduo R significam malonilo e P. e R significam hidrogénio, ou o composto de desmalonilo em 1 2 3 ^z que R , todos os R , R e R são hidrogénio. C grupo _tR malonilo na amicina pode estar ligado num dos possíveis grupos hidroxilo livres na molécula. Em vez da es tirpe DSM 3816 podem, naturalmente, sor utilizadas as respectivas mutantes e variantes desde que estas sinteti zem pelo menos um destes compostos. Estes mutantes podem ser obtidos por métodos conhecidos em si por meio de técnicas físicas, por exemplo por meio de radiação, como radiação ultravioleta ou raios X, ou por meio de mutagénios químicos, como por exemplo etanossulfonato de metilo (SMS), ou 2-hidroxi-4-metoxi-benzofenona (KCB).

Consideram-se fontes de carbono apropriadas preferidas para a fermentação aeróbica hidra tos de carbono assimiláveis e açúcar-álcoois, como gluco se, lactose ou D-manitcl, hem como produtos naturais con tendo hidratos de carbono, como extracto de malte. Cs nutrientes contendo azoto considerados são: ácidos amina dos, peptídeos e proteínas bem como os produtos da decom posição destes, como peptona ou triptona, e ainda extrac to de carne, sementes moídas, por exemplo de milho, de trigo, de feijão, de soja ou do algodoeiro, resíduos de destilação da preparação ca álcool, farinha de carne ou

extracto de levedura, roas também sais cie amónio e nitratos. 0 meio nutriente pode conter também outros sais inorgânicos como, por exemplo, cloretos, carbonatos, sul fatos ou fosfatos de metais alcalinos ou alcalinoterrosos, de ferro, de zinco ou de manganês.

A foraiação da amicina decorre es necialmente bem soja e manitol,

1-1 'cialrnente de cada em relação ao peso total do me xo fermentação é levada balões cónicos ou em fermentadores, eventualment com na e 30 °·

GL e 3C entre cerca de °C, especialment entre

C PI do xo deve situer-se numa gama se

6,5 e 7,5 tas a ta em glX

Ci

X>S

É vantajoso efectuar a cultura em várias fases, isto é, levar a efeito uma ou várias pré -culturas num meio ca cultura líquido, cue são cm seguida utilizadas para inocular a cultura principal num meio apropriado para a produção, por exemplo numa proporção do 1:10 em volume. Foce obter-se t'ma pré-cultura, por exora pio, por inoculação dum meio nutriente com mic^lio esporulaco seguida de crescimento durante c-?rca de '8 a 72 horas. o micélio cenorulado podo ser obtido deixando crescer a °stirpe durante cerca ce 7 dias num meio nutriente sólido ou líquido, por exevn-lo em agar ce extracto de levedura e malte.

ão «ode sei seguido de açorou com o v? lox cío ρ'Ί da cultura ou cora o volume de micélio, por cror.i&tografia em camada fina cu

por verificação da actividade

1.jx amicina

respectivo composto de desmalonilo encontram-se tanto no micélio como também no filtrado da cultura.

isolamento dos compostos referi dos a partir do caldo de fermentação pode ser levado a efeito por métodos conhecidos tendo em consideração as propriedades químicas, físicas e biológicas dos produtos. A fim de se avaliar a concentração de antibiótico no ca., do de fermentação ou nas diferentes fases de isolamento pode utilizar-se a cromatografia em camada fina, por ex emplo em gel de sílica utilizando como eluente n-butano: /ácido acético/água, sendo conveniente comparar a quantidade de substância antimicrobiana formada com uma so lução padrão.

Para isolamento dos compostos extrai-se em primeiro lugar o caldo de cultura e o micélio com solventes orgânicos, como por exemplo clorofórmio, acetato de etilo, etc., a fim de eliminar as impurezas não polares. Em seguida extrai-se com um solvente polar, por exemplo com álcoois inferiores ou com misturas de clorofórmio ou de acetato de etilo com um álccol inferior.

A purificação é levada a efeito de preferên ia em meios adequados, como, por exemplo, gel de sílica, óxido de alumínio ou permutadores iónicos, e luindo em seguida o produto com solventes ou misturas de solventes orgânicos polares, como por exemplo acetato de etilo, misturas de acetato de etilo e dum álcool inferior eventualmente com água ou então com um gradiente sal;., no adequado para a permutação iónica, como por exemplo cloreto de sódio ou tris.HCl, reunindo por fim as fracções com actividade antibiótica.

A amicina pura é amorfa. 0 composto é solúvel em solventes polares, como, por exemplo, água, metanol e DMF, moderadamente solúvel por exemplo

em álcoois superiores e insolúvel em solventes não polares, como por exemplo em clorofórmio, acetato de etilo e éter.

A transformação da amicina nos de rivados é levada a efeito por métodos conhecidos em si. Por exemplo é possível preparar os compostos de R -alqui lo/alilo por tratamento da amicina com os álcoois respec tivos sob condições ácidas em solventes orgânicos. São álcoois adequados por exemplo alcanóis C^-Cg ou álcool alílico. Podem igualmente ser utilizados alcanóis de cadeia longa, obtendo-se no entanto rendimentos mais reduzidos do composto pretendido à mediãa que o comprimento da cadeia aumenta. De preferência utiliza-se o próprio álcool solvente. A reacção pode ser levada a efei to a uma temperatura entre -20 e 40 °C, sendo preferível no entanto trabalhar à temperatura ambiente. 0 tempo de reacção é função do álcool utilizado e varia em regra entre 10 minutos e 4 horas.

Uma eliminação do semi-éster do ácido malónico da amicina sob condições básicas, ácidas ou neutras em água ou em álcoois inferiores, como por ex emplo metanol, etanol, isopropanol, etc., dá origem ao com posto de desmalonilo. Obtêm-se também outros componentes, como o composto desidratado na posição 22/23 (fórmu la lia). A temperatura de reacção pode ser, neste caso, entre -30 e 40°C. No entanto é preferida igualmente a temperatura ambiente.

A derivatização do composto de des malonilo com o álcool correspondente sob condições ácidas dá como resultado os acetais R alquilo/alilo. Os álco ois utilizáveis são os mesmos já referidos em relação cori 3 a preparação dos compostos de R -alquilo. Nesta reacção obtém-se também o derivado R^/R^-dialquilo.

O hemi-cetal pode ser aberto por via redutiva, por exemplo com hidretos de boro e hidretos de alumínio, como o NaBH^ ou o hidreto de lítio e a lumínio em solventes polares, como água ou álcoois infe riores, etç..

Nos exemplos apresentados em seguida a presente invenção é elucidada em pormenor. Os dados em percentagem referem-se a peso e as proporções de misturas de líquidos referem-se a volume, sempre que não houver indicação em contrário

Exemplos

1.

a) Preparação duma suspensão de esporos de Strptomyces parvullus DSM 3816

Composição do meio de cultura

12,5	g de glicerina
1,0	g de arginina
1,0	g de NaCl
1,0	g de K₂HPO₄
0,5	g de MgSO_4<7H₂O
15,0	g de agar
2,5	ml de solução de oligoelementos
1	1 de H₂0 dest.

Composição da solução de oligoelementos

30	g	de	CaCl₂.2H₂O
1,0	g	de	citrato de ferro-III
0,2	g	de	MnS0₄
0,1	g	de	ZnCl₂
0,025	g de CuSO₄.5H₂O

0,02 g de Na₂B₄0_?.10H₂0

0,004 g de CaCl₂

0,01 g de Na₂Mo0₄.2H₂0 1 1 de H₂0 dest.

Incubaram-se com a estirpe DSM 3816 tubos em cunha com o meio nutritivo descrito e cultivaram-se durante 8 dias a 30 °C. Os esporos dos tubos foram arrastados com 3 ml duma solução de 0,9% de NaCl e 0,1% de Tween 80 e a suspensão de esporos foi con servada a 4 °C até ser usada para inoculação.

b) Preparação duma pré-cultura da estirpe DSM 3816 em balões Erlenmeyer

Em cada um de 5 Erlenmeyers de 300 ml de capacidade carregaram-se 100 ml dum meio de cultura (40 g de glucose, 30 g de farinha de soja, 2,5 g de NaCl, 2,5 g de CaCo₃, em 1 1 de água destilada a pH 7,5 antes da esterilização) e inoculou-se cada Erlen meyer com 1.5 ml da suspensão de esporos preparada de a cordo com 1 a) se possível recente. Λ incubação foi le vada a efeito num agitador oscilante (180 rpm) a 30 °C durante 72 horas.

Preparação duma cultura principal da estirpe DSM 3816

c) Um balão de Erlenmeyer de 300 ml contendo 100 ml de meio de cultura (20 g de farinha de soja. 20 g de manitol, 1 1 de água destilada a pH 7,5 antes da esterilização) foi inoculado com 3 ml da pré-cultura obtida de acordo com Ib e foi incubado num agitador oscilante (180 rpm) a 30 °C. 0 máximo de produção foi alcançado após um período de cerca de 48 h a 72 h. 0 rendimento foi de 200 a 300 mg/1.

8) cultura da estirpe DSM 3816 em fermentador

Efectuou-se uma fermentação num fermentador de 13 1 de capacidade nas seguintes condiçõe

A uma temperatura de incubação de 30 °C e com uma velocidade de agitação de 300 rpm fi zeram-se passar através do meio de cultura (meio com a composição definida no Exemplo lc) 7 1 de ar por minuto Inoculou-se o fermentador com 500 ml de pré-cultura (ver Ib). 0 nível óptimo de produção foi atingido depois de cerca de 48 a 76 h. Os rendimentos obtidos fo ram de cerca de 300 a 400 mg de amicina/1.

2. Processamento de 20 1 de caldo de fermentação caldo de fermentação foi filtrado. 0 micélio foi lavado com acetato de etilo (3 x 500 ml) e em seguida foi extraído com metanol (3 x 500 ml). 0 álcool foi eliminado por destilação sob vácuo e o resíduo obtido (27 g) foi cromatografado em duas co lunas de sílica gel (500 g) com acetato de etilo/metano;. /água (6;1:1; v;v;v) (cromatografia de média pressão). Obtiveram-se 8,4 g de amicina.

filtrado do caldo de cultura foi lavado com 2 x 20 1 de acetato de etilo e em seguida foi extraído com 3 x 20 1 de clorofórmio/metanol (1:1, v:v), As fases orgânicas reunidas foram concentradas sob vácuo até uma consistência de xarope (78 g). Ore síduo foi cromatografado em gel de sílica como descrito acima com acetato de etilo/metanol/água 6:1:1. Obtive ram-se 5,3 g de amicina e 450 mg do composto de desmaio

2 3 4 ~ nilo correspondente, no qual R , todos os R , R e R si gnificam hidrogénio.

Amicina:

EM (FAB)/MH⁺ = 1229 ¹³C-NMR (75 MHz) em CD₃0D: S = 176,9; 174,2; 174,1; 171,7; 171,3; 156,6;

99,1 ppm

IV (KBr) (cm’¹) = 3400, 2860, 1720, 1640, 1460, 1385

Composto de desmalonilo EM (FAB): MH⁺ = 1057 ^I3c-NMR (75 MHz) em CD^OD: b - 177,1; 156,6; 99,1 ppm;

3. Preparação do composto de desmalonilo (R , todos os

3 4

R,R eR = H) e do derivado desidrogenado em 22/23

Agitou-se durante 24 horas à temperatura ambiente uma mistura de 1 g de amicina (0,81 mmol) em 75 ml de metanol com 100 mg de hidreto de sódio. Após neutralização com ácido clorídrico 5 N eliminou-se o álcool por destilação sob vácuo. O xarope obtido fox cromatografado em 100 g de gel de sílica com acetato de etilo/metanol/água (15:2:1, 800 ml e 8:2:1; v:v:v). Por cristalização a partir de metanol/acetato de etilo obtiveram-se 720 mg (72 %) do composto de desmalonilo, Fo ram ainda obtidos 80 mg (8 %) do composto desidrogenado em 22/23 (Fórmula lia).

Composto desidrogenado em 22/23: EM (FAB): MH⁺ - 1039

4. Preparação de R -alquilamicina

Agitou-se durante 15 min. à tempe ratura ambiente 1 g de amicina (0,81 mmol) com uma mistura de 1,5 ml de cloreto de acetilo e 75 ml de metanol. Após neutralização com NaOH 5 N concentrou-se a mistura sob vácuo até uma consistência de xarope. Por cromato grafia com HPLC em RP-c-18 /”30 min., metanol/H^O: (6:4; v;v) e um gradiente de metanol/água de 6:4 até 99:1 em 10 min. seguido de 30 min, com metanol/água 99:l__/foram obtidos 760 mg (70 %) de metilamicina,

EM (FAB) : MH⁺ = 1243

A utilização neste procedimento de etanol, de n-butanol, de álcool alílico e de hexanol deu origem respectivamente aos compostos etilamicina,

butilamicina, alilamicina e hexilamicina.

1

5. Preparação do derivado R -alquilo-desmalonilo (R , to 2 4 3 dos os R e R = H; R = alquilo) e do composto de dieti lo (R¹ e todos os R² = H; R³ e R⁴ = alquilo)

Adicionaram-se 500 mg do compo£ to de desmalonilo obtido de acordo com o Exemplo 3 a uma mistura de 0,1 ml de cloreto de acetilo em 5 ml de etanol e agitou-se durante 20 min. à temperatura ambiente. A solução metanólica foi submetida directamente a cromatografia em gel de sílica com clorofórmio/metanol (8j2;

v:v). Foram obtidos 400 mg (80 %) do derivado R -etil-desmalonilo e 70 mg (14 %) do composto de dietilo.

'b

Derivado R -etil-desmalonilo: EM (FAB) MH = 1085 Composto de dietilo: EM (FAB) MH* = 1113

A utilização num procedimento a nálogo de propanol, de n-butanol, de álcool alílico e de n-hexanol deu origem respectivamente aos respectivos derivados.

6. preparação do composto da fórmula Ib

Fizeram-se reagir 500 mg do com posto de desmalonilo obtido de acordo com o Exemplo 3 em 50 ml de metanol com 500 mg de boro-hidreto de sódio e a gitou-se a mistura reaccional durante 24 horas â tempera tura ambiente. 0 excesso de boro-hidreto de sódio foi destruído por adição de ácido acético glacial. Por eli minação do solvente por destilação e cromatográfia em (r) dextrano ( Sephadex LH 20) com metanol como eluente ob tiveram-se 450 mg (90 %) do composto da fórmula Ib, na

2 qual R e todos os R significam hidrogénio.

EM (FAB) MH⁺ = 1159

Por redução de modo análogo de amicina foram obtidos 420 mg (84 %) do composto da fórmu 1 2 la Ib na qual R e um R significam malomlo e os restar. 2 tes R significam hidrogénio.

EM (FAB) MH⁺ = 1231

7. Utilização de amicina e do respectivo composto de der malonilo como fungicidas

a) Rodelas de papel de filtro de 6 mm de diâmetro foram uniformemente embebidas com 20 jul cada uma de uma das st bstâncias activas preparadas de acordo com os Exemplos 2 e 3 em diferentes concentrações e foram depositadas em diferentes meios de agar de acordo com os diversos tipos de fungos. Previamente tinham sido adicionados ao agax ainda no estado líquido em cada uma das cápsulas de Petri (10 ml de agar# 90 mm de diâmetro) 0,5 ml de uma cul 5 tura em suspensão do organismo de ensaio (cerca de 10 a 10⁶ conídios/ml). Em seguida as 10 placas de agar fç ram incubadas a 25 °C. Após 3 a 4 dias de incubação me diu-se a zona de inibição que se tomou como medida de inibição do crescimento dos fungos. Para valor MIC (minimal inhibition concentration = concentração mínima ini bitória) tomou-se a quantidade da substância activa em ppm que causa uma zona de inibição de 10 mm.

CM

QUADRO NS 1

Análise microbiológica quantitativa de amicina de acordo com o Exemplo Diâmetro da zona de bioactividade (mm)/20 em

E •H E H 3 r-| -P •ri (tí 0 -P •ri -ri β cn Φ -ri P< τ>

d •ri (0 P -P (0 (0

Φ d) -P -P r-i r—i <0 •rd

P

Í0 r-i β Φ O (0 •Η N

P ί>1 •ri P Ph O (0

P

O (0 & r-i ra o o o O ·Η P -P Φ Φ O Λ

Φ •P β

C0	φ
Φ	•P
P	ω
Φ	Η
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•ri	Φ
O	P
ω	r-i
•ri	Φ
+>	>
>1	*ri
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co	CM	CM	CM	r-i	H	rd

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CM	CM	rd	r-i	rd	r-i	H

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OJ

b) Cultivaram-se favas (tipos Herz Freya ou Frank's Ackerperle) a cerca de 26 a 28 °c e 60% de humidade re lativa no ar. 14 dias depois da sementeira (altura de crescimento 13 a 16 cm) as plantas estavam adequadas pa ra a experiência. Depois de preparação das plantas pa ra o ensaio aplicou-se a substância a ensaiar obtida de acordo com o Exemplo 2 em 3 concentrações dadas nos Quadros 3 e 4 com um pulverizador de vidro a uma sobrepres são de 0,3 a 0,5 bar sobre as folhas das faveiras. As plantas tratadas foram deixadas secar e cerca de 3 horas mais tarde foram inoculadas.

Prepararam-se suspensões de espo ros com os conídios frescos de Botrytis cinerea numa con centração de 4 x 10 esporos por 1 ml de suspensão. Em seguida aplicaram-se uniformemente com o auxílio de um pulverizador de vidro as suspensões de esporos sobre as plantas de Vicia faba, As plantas foram colocadas numa câmara de ambiente regulado a uma temperatura de 20 a 22 °C e a cerca de 99% de humidade relativa. A infec ção das plantas evidenciou-se sob a forma de manchas so bre as folhas e sobre os caules, e em caso de ataque gra ve causou a morte das plantas. A avaliação dos resulta dos foi levada a efeito durante 3 a 6 dias depois da ino culação.

A actividade das substâncias em ensaio foi calculada em % em comparação com plantas de comparação infectadas e não tratadas.

L
Quadro 3:
Concentração	Actividade da amicma de acordo com o
em ppm de	Exemplo 2 contra	Botrytis cinerea em ppm de
substância	substância activa	para estirpes sensíveis
activa	(s) e resistentes s	(r) a BCM e a Iprodion r
1000	95	95
500	90	95
2 50	90 - (85)	95
125	90	95
60	40	65
Comparação	0	0

Quadro 4;

Concentração em ppm de substância activa

Actividade /%_/ do composto de desmalonilo de acordo com o Exemplo 3 contra Botrytis cinerea em ppm de substância activa para es tirpes sensíveis (s) e resistentes a BCM e a iprodion

1000	70	90
500	65	85
2 50	65	80
125	40	65
60	0	0
Comparação	0	0

c) Macieiras jovens (EM IX) no estádio de crescimento de 4 folhas foram tratadas de modo uniforme com os compostos apresentados no quadro seguinte nas concentrações fi nais de 500, 250, 125, 60 e 30 mg de substância activa/ /litro de suspensão aplicada por pulverização.

Após secagem da camada de substância activa, as plantas foram fortemente inoculadas com conídios do pedrado da macieira (Venturia inaequalis) e encharcadas e colocadas numa câmara de ambiente regula da a uma temperatura de cerca de 22 °C e uma humidade re lativa no ar de cerca de 1CO%.

ção de 48 horas as plantas foram transferidas para uma estufa a cerca de 18 °C e com uma humidade relativa no a:r de 95 a 100%.

Após um período de incubação de 14 dias determinou-se o ataque do pedrado da macieira (Venturia inaequalis) sobre as plantas. O grau de ataque foi avaliado visualmente. A actividade das substân cias em ensaio sobre o pedrado da macieira foi calculada em % em comparação com plantas de comparação infectadas e não tratadas.

Quadro 7
Substância	de	Actividade % sobre o
acordo com	os	pedrado (Venturia inaequalis
Exemplos 2	e 3	em função da quantidade de

substância ppm

	500	250	125	60	30
Amicina	90	85	75	40	40
Derivado de desmalonilo	75	65	40	40	0
Plantas infectadas e não tratadas			0
8. Comparação da actividade	fungicida	da amicina e	do	compos

to de desmalonilo com a nifimicina

Seguiu-se o procedimento de acordo com o Exemplo 7a mas utilizando nifimicina como substância a analisar. Os resultados estão reunidos no Quadro

8.

Ê •η e Η 3 Η -P •rl íti ϋ -P •Η Ή c cn φ ·Η CU Ό

CM r—¹1

r-i X o r—1

QUADRO N2 8

Análise microbiológica quantitativa de nifimicina Diâmetro da zona de bioactividade (mm)/2O /il

Ê 3 •ri U (ti ω 2 fu <ti •H U (ti fi u d) P r-i (ti •ri u (ti r-l P u Ή U •ri Λ (ti

L

O (ti CU r-l ω o ο υ U ·Η J_| JJ Φ Φ Ο Λ

Φ -P c (ti Φ Φ -p q ω φ ·η tí ω •ri φ O í-l tQ r-i •rl Φ P > >1 M U » •P £ Ο Φ ffl W

O w o· (ti u P £ Φ U G O □ r—I E X r—I rd

CM

O CM

CM CM

	*
co	CM	O
rd	H	rd

<< oo cm

CM r-l r-i

O O r—i

	00	O	CM	O	o
OJ	H	rd	H

<#	O		o	* O	o
CM	CM	rd	r-i	r-1

o	O	o	O	m	o
o	O	o	tn	CM
o	O	m	CM	r-i
CM	rd

Claims

R Σ I vi ndicaçCes

- 1« Processo para a preparação de com postos da fórmula ia em que.

independentemente uns dos outros,

1
2 cada grupo R e R significa hidrogénio ou ura grupo malo2 nilo, sendo no máxirao um substituinte R um grupo malonilo,
3 4 cada grupo R e R significa hidrogénio ou um grupo alqui lo Cj.-Cg ou alilo, bem como de compostos da fórnula lia, os quais sSo insatu rados na posição 22/23, com excepção das combinações de compostos da fórmula la nos quais

1 2 3 4.

a) Ré malonilo e todos os grupos R , R e R são hidro génio,

1 2 4/

b) R é malonilo, todos os grupos R e R são hidrogénio e R é metilo ou

c) e todos os grupos R^ e são hidrogénio e R^ é metilo, incluindo ainda um processo para a preparação dos compostos da fórmula Ib, em que

1 2

R e R possuem os significados anteríormente definidos, sendo no máximo um substituinte R um grupo malonilo, bem como de compostos da fórmula Ilb, os quais são insaturados na posição 22/23,

Ilb caracterizado por

a) cultivar Streptomyces parvullus DSM 3816 ou um seu variante ou mutante num meio de cultura até se verificar a acumulação do composto da fórmula la, em que

1 2 o radical R e um radical R significam malonilo e

3 4 ,

R e R significam hidrogénio, ou do composto em que R¹, todos os grupos R², R³ e R^ significam hidrogénio, e eventualmente

b) isolar e derivatizar estes compostos.

Processo de acordo com a reivindi cação 1 caracterizado por no composto da fórmula la obti123 do R e um dos radicais R significarem malonilo e R e R^ significarem hidrogénio ou então R¹, todos os grupos 2 3 4,

R , R e R significarem hidrogénio.

-3« -

Processo de acordo com a reivindi cação 2 caracterizado por se fermentar a estirpe DSM 3816 numa solução nutriente contendo farinha de soja e manitol,

-4ã -

Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1, 2 e 3 caracterizado por a fermentação ser levada a efeito e uma temperatura entre 25° e 30°C

-5a -

Processo de acordo com uma ou várias das reivindicações 1 a 4 caracterizado por a fermente, ção ser levada a efeito a um valor de pH entre 6 e 8.

6 — ··

Processo para a preparação duma composição farmacêutica caracterizado por se incorporar como principio activo um composto Ia# lia, Ib ou Ilb quan do preparado de acordo com a reivindicação 1 em conjunto com um veículo apropriado.

- 78 processo para a preparação de uma composição fungicida caracterizado por se incorporar como principio activo um composto da fórmula la# lia, Ib ou Ilb quando preparado de acordo com a reivindicação 1 em conjunto com um veículo apropriado.

A requerente declara que os primeiros pedidos desta patente foram apresentados na República Federal Alemã em 24 de Dezembro de 1986 e em 8 de Janeiro de 1987, sob os números Ρ 36 44 374.3 e P 37 00 325.9, respectivamente.