NO159119B - Virvelluftrenser med duggeliminator. - Google Patents

Description

Fremgangsmåte til fremstilling av et nytt antibiotikum, alanosin.

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte til fremstilling av et nytt antibiotikum, alanosin.

Alanosin er et hvitt krystallinsk stoff som er lite oppløselig i vann, ikke opp-løselig i vanlige organiske oppløsningsmidler, oppløselig i syrer ved pH under ca. 3,5, oppløselig i alkalier ved pH over 7,0. Det kan krystalliseres fra vann.

Den empiriske formel for alanosin er C3H7N304 med molekylvekt 149,1. Elementæranalyse ga følgende verdier: beregnet C 24,18, H 4,70, N 28,15, O 42,92, funnet C 24,07, H 4,86, N 28,15, O 42,92 (som differense). Strukturformelen som er enestående for et antibiotisk stoff er følgende;

dvs. L (-)-2-amino-3-nitrosohydroksylaminopropionsyre.

Alanosin smelter ved 190°C. Det er optisk aktivt, har en spesifikk dreining [oil ^ = -37,8° (c = 0,5 vann). Det oppviser i ultrafiolett lys et maksimum ved 250 mu, E 630, i fosfatpuffer pH7,0 i 0,1 saltsyre skiftes maksimum til 228 mu, E ^ ^m 504. pK verdien for den kromofore gruppe er beregnet spektrofotometrisk som 4,8.

I det infrarøde spektrum opptatt i nujol viser alanosin følgende hovedband ut-trykt i cm"1 3160, 2925 (nujol), 2850 (nujol), 2720, 2630, 2500, 2000, 1870, 1650, 1594, 1500, 1465, 1433 (nujol), 1394, 1380 (nujol), 1340, 1277, 1237, 1160, 1087, 1070, 980, 967, 915, 860, 814, 734, 663.

Den potentiometriske titreringskurve oppnådd med natriumhydroksyd viser to skuldere ved pK 4,7 og pK 8,6 og ekvivalentvekter 152 og 162 respektive. En titrer-ing utført med NaOH etter tilsetning av formaldehyd viser en enkeltskulder med pK 4,7 og e.v. 75.

Med ninhydrin gir alanosin en fiolett farge, ved svak oppvarmning med sul-fanilsyre og a-naftylamin gir det en intens rødfiolett fargning som antyder nærvær av en nitrosogruppe.

Alanosin gir salter med alkali- og jordalkalimetaller og generelt med uorganiske og organiske basiske stoffer. Idet det har to forskjellige sure grupper kan det danne både nøytrale og sure salter.

Alanosin har en antimykotisk aktivitet mot forskjellige prøveorganismer. Føl-gende tabell gir minimumsinhiberende konsentrasjon i y/ m\. overfor noen repre-sentative stammer.

Alanosin har antiviral aktivitet i en høy grad både in vitro og in vivo. Det er

aktivt både mot DNA og RNA virus, og dette er en enestående egenskap som ikke finnes hos noe annet syntetisk eller naturlig produkt. In vitro gir det cytopatisk beskyttelse mot vaccinia-(DNA), polio-(RNA) og coe-(RNA) virus endog i mikrogramnivåer. In vivo gir det beskyttelse mot vaccinia både via topisk og systemisk administrasjon.

Virkningen av alanosin på sarcoma fra virus SV-40 ble prøvet. For dette for-mål ble det anvendt 12 hamstere for transplantasjon med tumorvev. 24 timer etter transplantasjon påbegyntes behandling med alanosin, idet det begyntes med subkutan-administrering av 20 mg/kg alanosin en gang om dagen for 8 av dyrene og varte 21 dager etter den første tilsynekomst av tumor hos kontrolldyrene. De 4 dyr som tjente som kontroll fikk 1 ml fysiologisk saltoppløsning pr. diem subkutant og utviklet en følbar tumor etter 15 dagers inkubasjon. Ved slutten av forsøket kunne det ikke iakttas noen tumorvekst for de behandlede dyr, mens hos kontrollene var tumorene på en størrelse fra 1/3 til l/2-parten av størrelsen av dyret.

I et annet forsøk ble det anvendt hamstere med vel utviklet tumor for å under-søke innvirkningen av alanosin på tumorreduserbarheten. Således ble det foretatt måling av tumorstørrelsen på 12 dyr med tumor, og det ble oppsatt et omtrentlig dia-gram for hver tumor. 4 dyr ble behandlet med 2 ml saltlake pr. diem subkutant. 8 andre dyr ble behandlet med 30 mg/kg alanosin pr. diem subkutant. Behandlingen varte i to uker og i løpet av dette tidsrom ble det utført regulær undersøkelse av stør-relse og form for tumoren. Det ble bemerket at hos de behandlede dyr var det ved omtrent 10. dag etter administrering en reduksjon fra 50% til en størrelse som ikke var stor nok til å kunne måles. Endog blant disse dyr som hadde følbar tumor, var konsistensen av tumorvevet meget forskjellig fra kontrolldyrene. De behandlede tumor var myke, mens kontrollene var meget hårde. En gjentagelse av ovenstående forsøk bekreftet disse iakttagelser.

Antibiotikumet viser meget lav toksisitet. LD5Q for mus er 600 mg/kg intra-peritonalt og 300 mg/kg intravenøst.

Alanosin fåes ved dyrkning av en ny art Actinomyces av slekten Streptomyces som opprinnelig ble definert som Streptomyces sp. V/119 og senere kalt Streptomyces alanosinicus n. sp. Denne mikroorganisme ble isolert fra jord fra Brasil og ble innlevert til American Type Culture Collection under kodenr. ATCC 15710. Karakteristikken for mikroorganismen hvilken er forskjellig fra noen annen kjent art av slekten Streptomyces, er angitt i følgende beskrivelse.

For å undersøke veksten for Streptomyces alanosinicus n. sp. ble organismen dyrket på forskjellige standardmedier, inkubert ved 28°C i to uker før endelig under-søkelse.

På Benetfs agar danner mikroorganismen kolonier vanligvis 3 til 5 mm i dia-meter med godt definerte grenser, kompakt, hevet senter og fløyelsaktig overflate og dekket med gråhvitt luftmycelium som senere ble svakt brunt, når det er fullt sporeutviklet. Et stort antall kolonier på agar danner ikke luftmycelium, idet de " bare utvikler vegetativt mycelium som er brunt til mørkt i farge. I tabell 1 er angitt de fysiologiske og kultur-karakteristikker for Streptomyces alanosinicus n. sp. Optimumtemperatur for utvikling av koloniene er ved 28 - 37°C, idet det ikke oppstår noen vekst ved 50°C og bare meget lite ved 22°C.

Når sporedannelse finner sted, fremkommer sporene i monopodialt forgrenede sporoforer med tett snodde spiraler som har ellipsoide sporer (1 x 1,3 u). Ifølge klassifikasjonen av Pridham, Hesseltine og Benedict ville Streptomyces alanosinicus n. sp. da bli inkludert i "gråseriene" av seksjonen "spira".

Strept. alanosinicus n. sp. ble sammenlignet med et antall allerede beskrevne Streptomyces-arter med lignende karakter: Streptomyces platensis, Str. parvulus, Str. filipinensis og Str. albogriseolus. Det finnes imidlertid noen bestemte forskjeller i kulturkarakteristikk samt i biokjemiske egenskaper mellom disse stammer og foreliggende isolerte Str. alanosinicus. Noen forskjeller er angitt i det følgende: Str. platensis. Fargen av luft-mycelium på glukose-asparagin-agar er angitt å være hvitt og blir nesten sort. Dannelse av grønlig-gult pigment på kalsium-malat-agar, nitrater redusert, inulin ikke utnyttet, og sorbitol og dulcitol metabolisert.

Str. parvulus. Gult, oppløselig pigment dannes på glukose-asparagin-agar, nærings-agar, og gelatin, HgS negativ. Gir actinomycin D.

Str. filipinensis. Denne stamme gir gult pigment på glyserol-asparagin agar, Gelatin hydrolyseres meget langsomt. Angitt å danne filipin, et polyent, antifungalt antibiotikum.

Str. albogriseolus. Nitrat reduseres til nitrit. HgS dannes. Vekst på potet skitten-grålig hvit til svakt rosa, luft-mycelium og sporer dannet på nærings-agar, men ingen pigmenter. Denne arten er angitt å gi et "neomycin-kompleks". Streptomyces alanosinicus n. sp. utnytter når det dyrkes ved den teknikk som er angitt av T.G. Pridham og D. Gottlieb, J. Bacteriology 56, 107 (1948) ved bruk av forskjellige karbon-kilder, praktisk talt alle forbindelser som er undersøkt unntatt rhamnose, sorbitol, dulcitol og sorbose. Dette fremgår av følgende tabell 2.

For å fremstille alanosin dyrkes en stamme av Streptomyces alanosinicus

n. sp. aerobt i et vandig næringsmedium som inneholder en assimilerbar karbonkilde, slik som karbohydrater, en assimilerbar nitrogenkilde slik som kj øtt ekst rakt, pepton, maisstøpvæske o.s.v. og uorganiske salter, slik som klorider, nitrater, karbonater, sulfater, alkalimetall eller jordalkalimetaller, sink, mangan, jern, magnesium, inntil oppløsningen viser en vesentlig antibiotisk og antiviral aktivitet og det dannede antibioticum isoleres fra dyrkningsfiltratet.

Som angitt ovenfor utføres fermenteringen aerobt fortrinnsvis under rystning eller omrøring ved en temperatur innen området 20 - 40°C i 72 timer til 5 dager og lenger. En vesentlig antimykotisk og antiviral aktivitet i næringsmediet er generelt til stede etter 1-3 dager!

Isoleringen av antibiotikumet fra dyrkningsfiltratet etter utskilling av myceliet kan utføres på flere måter. F. eks. kan det klare filtrat helles i et oppløsningsmiddel som er blandbart med vann, hvori antibiotikumet ikke er oppløselig. Det utfelte antibioticum oppsamles deretter og renses. Som et alternativ kan det anvendes kromato-grafiske fremgangsmåter som vanligvis anvendes for isolering av antibiotiske stoffer.

Det kan også utføres en rensning over mellomproduktdannelse av vannopp-løselig alkali- og jord-alkalimetallsalter og utfelling ved regulering av pH-verdien mellom ca. 3,5 og 7,0.

Alanosin kan anvendes praktisk i mennesketeråpi ved topikal eller parenteral administrering. Ifølge den måte som velges kan det inkorporeres i salvebaser med en mengde på f.eks. 0,5 - 10% eller i fortynningsmidler og bærere for tabletter i enhetsdoser på f. eks. 10 mg til 500 mg og mere. På grunn av dets lave toksisitet er antibioticumet helt sikkert for mennesketeråpi.

Følgende eksempler viser fremstilling, isolering og rensning av alanosin. Eksempel 1.

Rysteflaskefermentering av Streptomyces alanosinicus n. sp. ATCC 15710.

Fremstilling av podekultur.

Havremelskråagar podet med Streptomyces alanosinicus n. sp. ble inkubert ved 20°C i 7 til 10 dager og deretter anvendt for å inokulere 100 ml av et pepton-agar-glukosegjærekstraktmedium som inneholdtes i en 500 ml Erlemeyerkolbe. Sam-mensetningen av dette fermenteringsmedium er:

Mediet reguleres til pH-verdi 7,2 før sterilisering i 20 min. ved 121°C og et damptrykk på 10,5 kg/cm^. Spiringskolbene inkuberes ved 28°C i 48 timer på en roterende rystemaskin med et slag på 50 mm og som gjør 240 omdr/min. Fermenteringsbetingelser.

Det ble gjort en 3%'s overføring fra spiringskolben til 500 ml Erlemeyer fermenteringskolber inneholdende 100 ml medium TVF/5 med følgende sammen-setning:

Mediet reguleres til pH-verdi 7,0 før sterilisering i 20 min. ved 121°C. Fermenteringskolbene inkuberes og rystes under lignende betingelser som spiringskolbene. Etter 72 timer ble myceliet utskilt ved sentrifugering og den ubehandlede buljong undersøkt ved utstryknings-fortynningsmetoden.

Resultatene er som følger:

Eksempel 2.

Fermentering i begerglass av Streptomyces alanosinicus n. sp.

Porsjonsfermentering av 4 liters glassfermenteringsinnretning ble utført i mediene og under driftsbetingelser som angitt i det følgende.

Fremstilling av podemateriale.

Første trinn - inokuleringskilde: Kultur av Streptymyces alanosinicus n. sp. dyrket på havremel-agar, eller en skål av lyofilisert sporesuspensjon. Medium og betingelser for vekst identisk med det som allerede er beskrevet i eks. 1.

Annet trinn - inokuleringskilde: 2,5% fra første trinn. Medium: samme som første trinn. Mediet, 4 1 i en glassfermenteringsinnretning, reguleres til pH 7,2 før sterilisering i 30 min. ved 121°C, inokuleres og inkuberes ved 28°C i 2 timer. Under inkuberingen luftes buljongen med en mengde på 1 liter luft /liter /min. og omrøres ved 800 omdr/min.

F e r ment er ingsbetingel ser.

Inokuleringskilde: 200 ml ( 5%) fra annet pode-trinn. Medium: samme som

i første eksempel (TVF/5). Mediet reguleres til pH 7,0 før sterilisering i 30 min. ved 121°C. 4 liter av dette medium inneholdende inokulum inkuberes i 72 til 96 timer ved 28°C. Under inkubering luftes porsjonen og omrøres som i det første eksempel. Resultatene av fermenteringen er angitt i følgende tabell.

Ekstrahering og rensning av produktet utføres ifølge følgende eksempel. Eksempel 3.

Ekstrahering.

30 liter buljong sentrifugeres og 6% "Darco G-60" trekull tilsettes for å klare oppløsningen som omrøres i 30 minutter og deretter frafiltreres kullet og gir en nesten fargeløs oppløsning som konsentreres i vakuum ved 45 - 50°C til 1,5 1. Den konsentrerte oppløsning helles under omrøring i 5 liter metanol og det dannede bunn-fall .frafiltreres, vaskes med meget aceton og tørkes i vakuum. Utbytte 230 g råprodukt som utgjør ca. 10%.

Rensning.

Det ovenstående råprodukt suspenderes i 400 ml vann og suspensjonen som avkjøles til 4°C og holdes omrørt, tilsettes svovelsyre til pH 2,0 - 2,5. Det uopp-løste residium frafiltreres, oppløsningen fortynnes videre med 400 ml vann, og 1,6 liter metanol tilsettes for å utfelle antibiotikumet. Blandingen holdes ved 4°C i noen timer for å fullstendiggjøre utfelling, deretter filtreres den, vaskes med aceton og tørkes i vakuum over i^^S' Utbytte 62 g av et produkt som utgjør 27%. Det tørkede produkt suspenderes i vannfri metanol og blandingen holdes omrørt, og det tilsettes perklorsyre (75%) ved ca. 4°C for å nå en pH på 3,0. Den uoppløste del frafiltreres og antibiotikumet utfelles ved regulering av pH-verdien til 5,5 med natrium-metoksyd. Suspensjonen står for å dekantere i noen timer ved 4°C, deretter frafiltreres og bunnfallet vaskes med dietyleter. Utbytte 30 g (titer 43%). Det oppløses en mengde på 3,2 av det erholdte antibiotikum i 60 ml HgO og pH-verdien reguleres til 8. Den uoppløste del frafiltreres og ved tilsetning av iseddikk reguleres pH-verdien til 4 - 4,5. Ved avkjøling til 4°C fåes 1,2 g antibiotikum i krystallinsk form (som utgjør 75%).

En mengde på 2,9 g av det krystallinske antibiotikum oppløses i 900 ml vann og oppløsningen oppvarmes til 70 - 80°C, deretter filtreres, konsentreres til 200 ml og står i 8 - 10 timer ved 4°C og deretter filtreres og vaskes med kaldt vann. Utbytte 1,45 g (dvs. 97%). Ved videre konsentrering av oppløsningen til 100 ml fåes enn videre mengde antibiotikum: 1 g (80%).

Eksempel 4.

En mengde på 15 g av det ikke krystalliserte antibiotikum som utgjør 34%, erholdt som beskrevet i eks. 3, suspenderes i 100 ml HgO. Suspensjonen avkjøles og konsentrert svovelsyre tilsettes for å nå en pH-verdi på 2. Oppløsningen om-røres i 15 min. ved 4°C, deretter frafiltreres det utfelte kalsiumsulfat og oppløsningen reguleres til pH 4,5 ved tilsetning av natriumhydroksyd. Suspensjonen står i 10 til 12 timer ved 4°C, deretter filtreres og vaskes med vann. Utbytte 6,5 g (72%). En videre rensning kan utføres ved krystallisering fra vann som beskrevet i foregående eksempel.

Claims (1)

1. Fremgangsmåte til fremstilling av et nytt antibiotikum, alanosin, karakterisert ved at Streptomyces alanosinicus n. sp, (ATCC 15710) dyrkes i vandig næringsmedium som inneholder en assimilerbar karbonkilde, en assimilerbar nitrogenkilde og mineralsalter, under aerobe neddykkede betingelser inntil mediet har fått en vesentlig antibiotisk aktivitet, og alanosin utvinnes fra mediet.