FR2466471A1 - Antibiotique nouveau, son procede de production et composition pharmaceutique le contenant - Google Patents

Abstract

L'invention concerne un antibiotique nouveau appelé U-59 761, de formule C23H34O7. L'antibiotique de l'invention peut être produit par fermentation dirigée au moyen d'une culture biologiquement pure et du micro-organisme Saccharopolyspora hirsuta, souche 367, NRRL 12045. Cet antibiotique est actif contre divers micro-organismes tels que Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Sarcina lutea, Klebsiella pneumoniae, Mycobacterium avium et Bacteroides fragilis. Il peut être utilisé dans divers environnements pour supprimer ou combattre ces bactéries. L'invention concerne également le procédé microbiologique de production de cet antibiotique. (CF DESSIN DANS BOPI)

Description

La présente invention concerne un antibiotique nouveau appelé antibiotique

U-59 761 qui peut être produit par fermentation dans des conditions réglées au moyen d'une culture biologiquement pure du microorganisme nouveau appelé Saccharopolyspora hirsuta souche 367, NRRL 12045, déposé dans

la collection de cultures le 24 septembre 1973.

L'antibiotique U-59 761 est actif contre diverses bactéries. Par conséquent, cet antibiotique peut être utilisé pour désinfecter des ustensiles de cuisine lavés et empilés contaminés par S. aureus. Etant donné que l'antibiotique U-59 761 est actif contre Mycobacterium avium, on peut l'utiliser chez les oiseaux et les lapins pour combattre cet organisme dont on connaît l'aptitude à produire une tuberculose généralisée chez ces animaux. De plus, l'antibiotique U-59 761 peut être utilisé pour le rinçage bactériostatique de vêtements lavés en blanchisserie, et pour

l'imprégnation de papiers et d'étoffes. On peut aussi l'uti-

liser pour supprimer la croissance d'organismes sensibles

dans des épreuves en boîtes et dans des milieux microbiolo-

giques.

Propriétés chimiques et physiques de l'antibiotique U-

59 761:

- Poids moléculaire: 422,2269 (spectrométrie de masse) - Formule moléculaire: C23H3407 - Analyse élémentaire: C, 65,63 %; H, 7,97 % Rotation optique: (c)25+121o (C, 0,7575, MeOH)

- Absorption ultraviolette: absorption finale seulement.

- Solubilités: soluble dans le méthanol et dans l'éthanol moins soluble dans le chlorure de méthyle et dans le chlorure de méthylène; relativement insoluble dans l'éther de pétrole et dans le cyclohexane. - Point de fusion: 201-2061C - Spectre d'absorption infrarouge: L'antibiotique U-59 761 présente un spectre d'absorption infrarouge caractéristique en suspension dans l'huile minérale, comme indiqué par la figure 1 des dessins annexés. On observe des pics aux longueurs d'ondes suivantes, exprimées en centimètres réciproques: 2. Fréquence de bande (nombre d'ondes) Intensité S

M, ép.

W W M S S S S M W W S W

M, ép.

S W M M M M M M S M M M M W W W W M W M 3.

1111 S

1104 S

1089 M

1079 M

1057 M

1029 S

1017 S

1002 M

990 S

970 M

961 M

950 M

937 M

928 W

907 W

887 M

879 M

875 W

856 W

820 w

796 W

781 W

758 M

717 M

687 w

660 M

648 M

631 M

Clé: S = forte, M = moyenne, W = faible, ép. = épaulement.

- Spectre de résonance magnétique des noyaux de 13C (RMN): L'antibiotique U-59 761 a un spectre RMN-13C caractéristique, comme le fait apparaître la figure 2 des dessins. - Spectre antimicrobien de l'antibiotique U-59 761: L'antibiotique U-59 761 est actif contre divers microorganismes, comme l'indiquent les tableaux suivants: 4. Diffusion sur gélose

Organisme Diamètre de la zone d'inhibition {mm)-

B. subtilis UC 564 0 B. subtilis UC 6033 0 S. aureus UC 70 traces S. aureus UC 3665 17 S. aureus UC 6029 traces S. lutea UC 130 35 S. lutea UC 3383 34 S. lutea sens. 38 K. pneumoniae UC 58 27 E. coli UC 51 0 S. schottmuelleri UC 126 0 P. vulgaris UC 93 0 P. aeruginosa UC 95 0 M. avium UC 159 26 P. oxalicum UC 1268 0 S_. pastorianus UC 1342 0 R. sphaeroides UC 3238 20 S. pyogenes UC 6055 0 B. fragilis UC 6513 33 C. perfringens UC 6509 33 disques de papier "704" Schleicher et Schuell Inc., (12,7 mm)

plongés dans une solution méthanolique à 1 mg/ml de l'anti-

biotique, séchés et appliqués sur des plateaux de gélose ensemencés. La zone d'inhibition est évaluée après 16 heures d'incubation.

On prépare une solution de l'antibiotique U-

59 761 dans l'éthanol, on la dilue au bouillon dilué "BHI"

(Difco) et on détermine les concentrations inhibitrices mini-

males en utilisant la méthode classique de dilution au bouil-

lon en boîtes de petites dimensions.

Organisme UC Concentration inhibitrice minimale (îI9/ml) S. aureus 76 125

570 125

746 250

S. fecalis >1000 5. S. pyogenes 152 500 D. pneumoniae 41 1000 E. coli 45 1000 K. pneumoniae 58 1000 P. vulgaris 93 1000 Ps. aeruginosa 95 1000 S. schottmuelleri 126 1000 "UC" est une marque déposée de la collection de cultures de la firme The Upjohn Company. Ces cultures sont obtenues sur demande auprès de la firme The Upjohn Company,

de Kalamazoo, Michigan.

Le microorganisme utilisé pour la production de l'antibiotique U-59 761, comme décrit dans le présent

mémoire, est une culture biologiquement pure de Saccharo-

polyspora hirsuta souche 367, NRRL 12 045.

Une culture de repiquage de ce microorganisme peut être prélevée dans la collection permanente du Northern Regional Research Laboratory, Ministère de l'Agriculture des Etats-Unis d'Amérique, Peoria, Illinois, E.U.A. Son numéro de dépôt auprès de cet organisme est NRRL 12 045. Il y a lieu de remarquer que le fait que la culture est disponible n'autorise pas pour autant à mettre en pratique la présente

invention par dérogation aux lois sur les brevets.

Le microorganisme de l'invention a été étudié et caractérisé par Alma Dietz et Grace P. Li des laboratoires de

recherche de la firme The Upjohn Company.

Un actinomycète isolé au laboratoire d'études des sols de la firme Upjohn a été identifié et a présenté les

propriétés macroscopiques et microscopiques et les proprié-

tés d'hydrolysat cellulaire entier du genre Saccharo-

polyspora (A. Iwasaki, N. Itoh et T. Mori, 1979. A new broad-

spectrum aminoglycoside antibiotic complex, sporaricin. II.

Taxonomic studies on the sporaricin producing strain Saccha-

ropolyspora hirsuta subsp. kobensis nov. subsp., J. Antibiotics. 32: 180186.), (J. Lacey et M. Goodfellow,

1975, A novel actinomycete from sugar-cane bagasse: Saccha-

ropolyspora hirsuta gen. et sp. nov., J. Gen. microbiol. 88:

-85). Une comparaison avec la culture type de Saccharo-

6. polyspora hirsuta ATCC 27 875 est donnée sur les tableaux I

et II. Une comparaison avec la culture type et avec la sous-

espèce Saccharopolyspora hirsuta ssp. kobensis ATCC 20501 (A.

Iwasaki, ci-dessus) basée sur des données publiées pour ces souches, est reproduite sur le tableau III.

Les propriétés remarquables du genre Sacchar0-

polyspora sont sa croissance végétative du type butyreux ou gélatineux, sa croissance aérienne éparse qui s'étudie le mieux après vingt-et-un jours d'incubation, sa croissance végétative allant du jaune à l'orangé et au brun-orangé et la production de pigment, les cha!nes de spores se développant dans une gaine présentant des touffes remarquables de poils à bases tronquées et avec des aires lisses entre les touffes, la présence d'acide mésodiaminopimélique, d'arabinose et de galactose dans les hydrolysats cellulaires entiers et dans les préparations de parois cellulaires. La présence d'acide L-diaminopimélique a été décelée en plus de celle de l'acide méso-DAP dans les préparations de parois cellulaires de la

présente invention.

Aucune production d'antibiotique n'a été indi-

quée pour la culture typique; la sous-espèce kobensis produit

le complexe antibiotique appelé sporaricine (KA-6606) (A.

Iwasaki, ci-dessus). L'organisme nouveau isolé se distingue

par la production de l'antibiotique U-59 760. La seule diffé-

rence importante parmi les souches réside dans leur aptitude à produire un antibiotique. En conséquence, la souche nouvelle est nommée Saccharopolyspora hirsuta souche 367. Les méthodes taxonomiques utilisées dans le présent mémoire sont

celles qui sont indiquées dans les ouvrages de Dietz (A.

Dietz, 1954, Ektachrome transparencies as aids in

actinomycete classification, Ann. N.Y. Acad. Sci. 60: 152-

154), (A. Dietz, 1967, Streptomyces steffisburgensis sp. n., J. Bacteriol. 94: 2022-2026), de Dietz et Mathews (A. Dietz et J. Mathews: 1971, Classification of Streptomyces spore surfaces into five groups, Appl. Microbiol. 21: 527-533), de

Becker et collaborateurs (B. Becker, M.P. Lechevalier et H.A.

Lechevalier, 1966, Chemical composition of cell wall prepara-

tions from strains of various form-genera of aerobic actino-

7. mycetes, Appl. Microbiol. 13 236-243), de Lechevalier et Lechevalier (B.A. Lechevalier et M.P. Lechevalier, 1970, A critical evaluation of the genera of aerobic actinomycetes, p. 393-405, In H. Prauser (ed.), The Actinomycetales, Gustav Fisher, Jena.), (M.P. Lechevalier et H.A. Lechevalier, 1970, Chemical composition as a criterion in the classification of

aerobic actinomycetes, Int. J. Syst. Bacteriol. 20: 435-

443), et de Shirling et Gottlieb (E.B. Shirling et D. Gottlieb, 1966, Methods for characterization of Streptomyces

species, Int. J. Syst. Bacteriol. 16: 313-340).

- Caractéristiques de couleur: Mycélium aérien gris à rose-

gris (très épars après 14 jours). Recherche de la mélanine négative. L'aspect sur ".l.ctachrome" est indiqué sur le tableau I. La détermination des couleurs en surface de la croissance végétative a eu pour résultat la couleur rouge (R) ou la couleur jaune (J) par comparaison avec les secteurs des disques de couleurs de Tresner et Backus [H.D. Tresner et E.J. Backus, 1963, System of color wheels for streptomycete

taxonomy, Appl. Microbiol. 11: 335-338).

- Caractéristiques microscopiques: Des masses de spores et des chaînes de spores, intactes et fragmentées, et des chaînes flexueuses ou en spirales lâches, à l'examen au microscope électronique à balayage, se développent dans une gaine qui est au début presque lisse; ensuite, des touffes

remarquables de poils (triangulaires à la base) sont formées.

La surface entre les touffes est lisse. Finalement, la gaine se recouvre de longs poils fins. Les gaines longues sont emmêlées et semblent provenir de pseudosporanges ou se confondre pour former des pseudosporanges. Lorsque les chaînes entrent en contact avec le substrat, les spores sont lisses à la périphérie et ont un aspect déprimé ou strié. Des

hyphes "vides" se remarquent dans les chaines développées.

Les caractéristiques microscopiques s'apprécient le mieux après 21 jours d'incubation à 28-37 C. On peut observer une

fragmentation nocardioforme dans des cultures de 21 jours.

- Croissance sur composés carbonés: Dans les conditions expérimentales de Shirling et Gottlieb (ci-dessus), la croissance est bonne sur le témoin positif (milieu de base 8. plus D-glucose), le saccharose, le D-mannitol, le D-fructose

et le raffinose. La croissance est douteuse sur le L-

arabinose et le D-xylose. Il n'y a pas de croissance sur le témoin négatif (milieu de base seulement), l'inositol, le rhamnose et la cellulose. Analyse des cellules entières: On détecte la présence

d'acide méso-diaminopimélique, d'arabinose et de galactose.

- Analyse des parois cellulaires: On trouve de l'acide méso-

diaminopimélique, de l'acide L-diaminopimélique, de l'arabi-

nose et du galactose.

- Caractéristiques culturales et biochimiques: voir

tableau II.

- Température: La croissance est nulle à très faible à 18 C sur gélose de Bennett et gélose au-maltose-tryptone et la croissance est médiocre sur la gélose au saccharose de Czapek. La croissance est bonne à 24-45 C. Il n'y a pas de

croissance à 55 C.

9.

TABLEAU I

Caractéristiques(*) de couleur de Saccharopolyspora hirsuta ATCC 27875 et de S. hirsuta souche 367 sur "Ektachrome" Milieu gélose

Déter-

mina- tion S. hirsuta

ATCC 27875

S. hirsuta Souche 367 Tranche Couleur Tranche Couleur Bennett S 71 Jaune orangé modéré R Saccharose de Czapek

Maltose-

- tryptone Peptone-fer 0,1 % de tyrosine Caséine I S 74 Brun jaunâtre vif R 72 Jaune orangé foncé S 71 Jaune orangé modéré R S 68 Jaune orangé vif R n S 73 Jaune orangé pâle R S q R m 71 Jaune orangé modéré 67 Jaune orangé brillant 67 Jaune orangé brillant 71 Jaune orangé modéré il 68 Jaune orangé vif i 71 Jaune orangé modéré il Jaune orangé clair 73 Jaune orangé pale (*) La couleur a été déterminée par comparaison avec les échelles de couleurs NBS (SP 440. "Color: Universal Language and Dictionary of Names", U.S. Government Printing Office, Washington, DC 20402. SRM 2106, ISCC-NBS Centroid Color Charts. Office of Standard Reference Material, Room B311, Chem. Building, National Bureau of Standards, Washington, DC

20234. S = Surface, R = Revers.

2466471!

10.

TABLEAU II

Caractéristiques culturales et biochimiques de souches de Saccharopolyspora hirsuta

Milieu gélosé Déter-

mina- tion S. hirsuta

ATCC 27875

S. hirsuta Souche 367 Peptone-fer S R P Malate de calcium Incolore (V) Jaune pâle O Mélanine négative S Traces de blanc (A) R Crème P

Glucose-

asparagine Lait écrémé Tyrosine Xanthine Amidon nutritif Extrait de levure-extrait de malt Malate solubilisé S Incolore à tan clair (v) R Orangé P Orangé S R p S R P S R P Tan (V) Tan-orangé Tan-orangé Caséine solubilisée Tan (V) Orangé Orangé Tyrosine solubilisée Incolore (V) Jaune pâle Jaune pâle Xanthine solubilisée autour de la zone de croissance S Incolore (V) R Jaune pâle P Jaune très pâle O Amidon hydrolysé S Incolore (V) R Orangé P Orangé Incolore ou brun clair ridé (V) Tan-orangé Tan pâle à tan orangé Mélanine négative Traces de gris (A) Crème-gris pâle Malate légèrement solubilisé Tan clair (V) Tan-orangé Tan-orangé Brun orangé (V) Tan orangé foncé Tan-orangé vif Caséine solubilisée Tan-orangé (V) Orangé Orangé Tyrosine solubilisée Tan pâle (V) Tan pâle Pêche-tan pâle Xanthine solubilisée Tan pâle (V) Tan pâle Tan très pâle Amidon hydrolysé Tan pâle (V) Tan-orangé pâle Orangé i1.

Peptone-

extrait de levure-fer

(ISP-6)

S Incolore (V) avec de très légères traces de blanc (A) R Tan-jaune O Mélanine négative Mr Incolore (V) Tan-orangé clair à tan Mélanine négative Tyrosine

(ISP-7)

Gélatine Sans addition Nutritive S Traces de blanc (A) Orangé très pâle(v) R Tan-jaune O Mélanine négative S Traces de blanc (A) sur la pellicule superficielle incolore P Néant O Gélatine liquéfiée S Traces de blanc (A) sur pellicule jaune (V) P Néant O Gélatine liquéfiée Orangé très pâle Mélanine négative Incolore à jaune pâle (V) Néant à traces de jaune pâle Gélatine liquéfiée Traces incolores (v) à traces de blanc (A) sur (V) Néant Gélatine liquéfiée Bouillon Nitrate synthétique S Pas de croissance Traces de blanc (A) en surface sur fond incolore (V) P Néant Néant O Croissance Croissance compacte compacte à la base à floculante à la Pas de réduction base; pas de réduction Nitrate nutritif S Traces de blanc sur pellicule superficielle incolore P Néant O Lait au tournesol

Croissance flocu-

lante à la base; pas de réduction S Gris pâle (A)- sur anneau superficiel tan-jaune P Néant O Pas de réduction du tournesol pH

6,7-7,3

(A)Traces de blanc (A)

sur anneau super-

ficiel incolore Néant Croissance médiocre incolore et compacte à la base; pas de réduction Anneau superficiel gris-bleu Tan-rouge intense Peptonisation pH 7,6-7,8 S = surface; O (V) = croissance aérienne. = autres caractéristiques; R = revers; végétative; P = pigment; (A) = croissance 12.

TABLEAU III

Comparaison de souches de Saccharopolyspora hirsuta S. hirsuta souche 367 S. hirsuta

ATCC 27875

S. hirsuta kobensis

ATCC 20501

Propriétés physiologiques Température Croissance de 18 à 450C Croissance de 25 à 45 C Croissance de 18 à 45'C Température optimale Liquéfaction de la gélatine Hydrolyse de l'amidon Action sur le lait Production de pigment mélanoide Réduction des nitrates

28-450C

Totale Positive

37-40'C

37-42oC Positive à 27 CPositive à 27 C Positive Pas de Pas de coagulation coagulation Peptonisation Peptonisation Négative Négative Négative Négative Positive Pas de coagulation Peptonisation Négative Positive Utilisation des sources de carbone L-arabinose D-xylose L-rhamnose Dglucose D-fructose Saccharose Raffinose Inositol D-mannitol + + + + + ++ + ++ + + + + + + + +

++ + +

Essais + 13. Le composé du procédé de l'invention est produit lorsque l'organisme qui l'élabore est cultivé dans un milieu nutritif aqueux dans des conditions aérobies en immersion. Il y a lieu de remarquer également que pour la préparation de quantités limitées, on peut utiliser des cultures en surface

et des flacons. L'organisme est cultivé dans un milieu nutri-

tif contenant une source de carbone, par exemple un glucide assimilable, et une source d'azote, par exemple un composé azoté ou une matière protéinique assimilable. Des sources appréciées de carbone comprennent le glucose, la cassonade, le saccharose, le glycérol, la fécule, l'amidon de mais, le

lactose, la dextrine, les mélasses, etc. Des sources appré-

ciées d'azote comprennent l'extrait soluble de mais, la

levure, le produit d'autolyse de la levure de bière, addi-

tionné de lait en poudre, la farine de soja, la farine de graines de cotonnier, la farine de mais, le lait en poudre, le produit de digestion pancréatique de la caséine, la farine de poisson, les matières sèches de distillerie, les liqueurs peptonées animales, les déchets de viande et d'os, etc. On peut utiliser avantageusement des mélanges de ces sources de

carbone et d'azote. Des métaux à l'état de traces, par exem-

ple le zinc, le magnésium, le manganèse, le cobalt, le fer, etc., n'ont pas à être ajoutés aux milieux fermentescibles parce qu'on utilise l'eau de ville et des ingrédients non purifiés comme composants du milieu avant la stérilisation de

ce dernier.

La production du composé par le procédé de l'invention peut être effectuée à toute température favorable à une croissance satisfaisante du microorganisme, par exemple entre environ 18 et 400C et, de préférence entre environ 20 et 280C. Ordinairement, la production optimale du composé s'obtient en une période d'environ 3 à 15 jours. Le pH final

de la fermentation dépend en partie des tampons éventuel-

lement présents et en partie du pH initial du milieu de culture. Lorsque la culture est conduite dans des récipients et des cuves de grande capacité, il est préférable d'utiliser

la forme végétative plutôt que la forme de spores du micro-

organisme en vue de l'inoculation pour éviter un retard 14.

prononcé de la production du composé et par conséquent l'uti-

lisation inefficace de l'appareillage. En conséquence, il est désirable de produire un inoculum végétatif dans une culture en bouillon nutritif par inoculation de ce bouillon de culture avec une portion aliquote d'un sol, un tampon de

gélose conservé en azote liquide ou une culture inclinée.

Lorsqu'un inoculum végétatif actif jeune a été établi de la sorte, il est transféré dans des conditions aseptiques dans des récipients ou des cuves de grande capacité. Le milieu dans lequel l'inoculum végétatif est produit peut être le même que celui qui est utilisé pour la production du composé ou peut en être différent, du moment que l'on obtient une

bonne croissance du microorganisme.

Divers modes opératoires peuvent être utilisés pour isoler et purifier le composé produit conformément à

l'invention à partir de bouillons de fermentation. L'isole-

ment peut être effectué par extraction avec des solvants tels

que le chlorure de méthylène, l'acétone, le butanol, l'acé-

tate d'éthyle, etc.; et une chromatographie sur gel de silice peut être utilisée pour purifier des préparations

brutes de l'antibiotique.

Dans une opération appréciée de séparation, le composé produit par le procédé de l'invention est recueilli dans le milieu de culture par séparation des mycéliums et des matières solides non dissoutes par des moyens classiques, par exemple par filtration ou par centrifugation, et extraction

au solvant tant du gâteau mycélien que du bouillon clarifié.

Le bouillon clarifié peut être extrait avec un solvant conve-

nable tel que le chlorure de méthylène (préféré), l'acétate

d'éthyle, le butanol et la méthylisobutylcétone. On peut éva-

porer l'extrait sous pression réduite pour former un concen-

tré et on peut recueillir l'antibiotique de ce concentré en soumettant ce dernier à une chromatographie sur du gel de silice et à une élution avec du méthanol et du chlorure de

méthylène.

Le procédé de l'invention est illustré par les exemples suivants, donnés à titre non limitatif. Tous les pourcentages sont exprimés en poids et toutes les proportions 15. des mélanges de solvants sont exprimées en volume, sauf

spécification contraire.

EXEMPLE 1

Partie A. - Fermentation

Une culture biologiquement pure de Saccharo-

polyspora hirsuta souche 367, NRRL 12045, est utilisée pour inoculer des fioles d'Erlenmeyer de 500 ml destinées à l'ensemencement, contenant 100 ml d'un milieu stérile renfermant les ingrédients suivants: - Glucose monohydraté 25 g/l - Pharmamedia(*) 25 g/l - Eau de ville, quantité suffisante pour 1 1 (*) Pharmamedia est une qualité industrielle de farine de graines de cotonnier produite par la firme Traders Oil Mill

Company de Fort Worth, Texas.

Le pH de préstérilisation du milieu d'ensemence-

ment est égal à 7,2. L'inoculum d'ensemencement est cultivé pendant 3 jours à 28 C sur une secoueuse rotative "Gump" fonctionnant à 250 tours par minute et ayant une course de

6,35 cm.

Après incubation pendant 3 jours, le milieu

d'ensemencement est utilisé pour inoculer (à un taux d'inocu-

lation de 5 ml d'inoculum d'ensemencement par 100 ml de milieu fermentescible) une série de fioles d'Erlenmeyer de 500 ml contenant un milieu de fermentation stérile renfermant les ingrédients suivants: Glucose monohydraté 10 g/l - Dextrine 20 g/l - Extrait soluble de mais 2, 5 g/l -NH4NO3 3,0 g/l - NaCl 2,0 g/l - CaCO3 5,0 g/l - pH 7,2 (préstérilisation) On fait incuber les fioles de fermentation à une température de 28"C sur une secoueuse rotative "Gump" fonctionnant à 250 tours par minute et ayant une course de 6,35 cm. La récolte est habituellement effectuée après une 16. durée de fermentation d'environ 5. jours. Après une durée

normale de fermentation de 5 jours, le bouillon de fermenta-

tion renferme les titres en antibiotique suivants: Jour - Epreuve avec S. lutea, UB/ml

2 8,0

3 10,4

4 10,4

11,2

Dans les résultats de cette épreuve, une unité biologique (UB) est définie comme étant la concentration de l'antibiotique qui donne une zone d'inhibition de 20 mm dans les conditions normales de l'épreuve. Par conséquent, si, par exemple, un bouillon de fermentation doit être dilué au

centième pour donner une zone d'inhibition de 20 mm, l'acti-

vité de ce bouillon est de 100 UB/ml.

B. - Séparation et purification Le bouillon entier (environ 5000 1) provenant d'une fermentation, comme décrit ci-dessus, est additionné de NaOH pour ajuster son pH à 7,3 et filtré sur un filtre-presse de 76,2 cm en présence de terre de diatomées, utilisée comme auxiliaire de filtration. Pendant l'opération de filtration, de l'eau est versée sur le résidu du filtre. L'opération de filtration permet de recueillir 5500 litres d'un bouillon clair de fermentation que l'on extrait ensuite deux fois avec 1400 litres de chlorure de méthylène à chaque fois pour

former un volume total de 2800 litres d'extrait au solvant.

Cet extrait au solvant est concentré sous vide- à un volume de litres. Une épreuve classique en boîte de Pétri sur S.

lutea donne une valeur de 2424 UB/ml.

Le concentré d'extraction indiqué ci-dessus (9 litres) est chromatographié sur une colonne contenant 9 kg de gel de silice (gel de silice "7734 de E. Merck"). La colonne est éluée de la façon suivante: - 20 litres de chlorure de méthylène; ensuite 40 litres de méthanol à 2 % dans le chlorure de méthylène; ensuite litres de méthanol à 5 % dans le chlorure de méthylène; ensuite 100 litres de méthanol à 10 % dans le chlorure de méthylène. On recueille des fractions de 4 litres après une 17.

fraction de tête de 80 litres. Les fractions 10 à 19 contien-

nent l'antibiotique U-59 761.

On obtient 41,4 g d'antibiotique U-59 761 cristallin par concentration des fractions 10 à 19. On obtient encore 12,8 g d'antibiotique U-59 761 cristallin par chromatographie des liqueurs-mères sur du gel de silice, en

utilisant l'acétate d'éthyle comme éluant.

18.

Claims (8)

REVENDICATIONS

1. - L'antibiotique U-59 761, qui est actif contre divers microorganismes et qui présente sous sa forme essentiellement pure les caractéristiques suivantes: (a) poids moléculaire de 422,2269 (spectrométrie de masse) (b) analyse élémentaire: C = 65,63 %; H = 7,97 %; (c) rotation optique: ( D) 25 1210 (c +0,7575, MeOH) (d) soluble dans le méthanol et dans l'éthanol; moins soluble dans le chlorure de méthyle et le chlorure de méthylène; et relativement insoluble dans l'éther de

pétrole et le cyclohexanne.

(e) point de fusion de 201-206WC (f) spectre d'absorption infrarouge caractéristique à l'état dissous dans une suspension d'huile minérale comme indiqué sur la figure 1 des dessins annexés et

(g) spectre de résonance magnétique des noyaux de 3C carac-

téristique comme indiqué sur la figure 2 des dessins annexés.

2. - Procédé de préparation de l'antibiotique U-

59 761, caractérisé en ce qu'il consiste à cultiver la souche - 367 de Saccharopolyspora hirsuta ayant les caractéristiques d'identification de NRRL 12045, dans un milieu nutritif

aqueux dans des conditions aérobies jusqu'à ce qu'une acti-

vité notable en antibiotique U-59 761 ait été conférée audit

milieu.

3. - Procédé suivant la revendication 2, carac-

térisé en ce que le milieu nutritif aqueux contient une

source de glucides assimilables et une source d'azote assimi-

lable.

4. - Procédé pour retenir l'antibiotique U-

59 761 dans un bouillon de fermentation, caractérisé en ce qu'il consiste: (a) à filtrer ledit bouillon de fermentation pour obtenir un bouillon limpide;

(b) à extraire le bouillon limpide avec un solvant convena-

ble pour l'antibiotique U-59 761 de manière à obtenir

une phase d'extraction au solvant contenant ledit anti-

biotique; 19.

(c) à réduire le volume de l'extrait pour obtenir un concen-

tré; (d) à chromatographier le concentré sur du gel de silice; et à recueillir l'antibiotique U-59 761 essentiellement pur par cette opération de chromatographie.

5. - Procédé suivant la revendication 4, carac-

térisé par le fait que le bouillon de fermentation est

extrait au chlorure de méthylène.

6. - Procédé suivant la revendication 4, carac-

térisé en ce que la colonne chromatographique est éluée avec

du méthanol et du chlorure de méthylène.

7. - Une culture artificielle biologiquement pure du microorganisme Saccharopolyspora hirsuta souche 367, ayant les caractéristiques d'identification de NRRL 12045, capable de produire l'antibiotique U-59 761 en une quantité pouvant être recueillie, par fermentation dirigée dans un milieu nutritif aqueux contenant des sources assimilables de

carbone, d'azote et de substances inorganiques.

8. - Composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle est constituée par ou en ce qu'elle contient

l'antibiotique U-59 761 suivant la revendication 1.