NO134752B - - Google Patents

Description

Oppfinnelsen angår en fremgangsmåte til frem-

stilling av et produkt med anticanser-virkning, hvilken fremgangsmåte er presisert i patentkravet.

Som anticansermidler er det kjent noen synte<-

tiske produkter, noen ekstrakter av dyr og planter og noen produkter frembrakt av mikroorganismer. Disse midler er imidlertid ikke tilfredsstillende, fordi de ikke bare påvirker cansercellene, men også skader det normale vev.

Det anticanserprodukt som fåes ved fremgangsmåten

i følge oppfinnelsen, er helt forskjellig fra alle de hittil kjente anticanser-stoffer ved sin biologiske virkning og ved sin kjemiske oppbygning, og det innvirker selektivt på canser-cellene.

Dette nye anticanser-produkt har en hemmende virkning på veksten av tumorer og samtidig en kraftig nekrotiserende virkning eller henfallsvirkning på tumorene. En intravenøs injeksjon av produktet kan frembringe en total nedbrytning av selv store tumorer, og ved forsøk har det fullstendig helbredet nær. halvparten av de behandlede dyr, mens de hittil kjente anticanser-stoffer ikke har evnen til å hemme veksten av tumorer med mindre de tilføres umiddelbart etter innpodningen av tumoren. Det nye anticanser-produkt stimulerer samtidig den infiserte organismes motstandskraft.

I canservev har man iakttatt forandringer allerede

8 timer etter den intravenøse injeksjon av det nye anticanser-, produkt. Mikroskopiske studier har vist at stoffet har en

selektiv virkning på kreftcellene, og at det overhodet ikke påvirker blodkarene eller andre normale vev. Produktet stimulerer benmargen og dens produksjon av blodlegemer, mens de kjente anticanser-stof f er hemmer denne.

Alt dette viser at anticanser-produktet som er-

holdes i følge oppfinnelsen, er vesentlig forskjellig fra de hittil kjente anticanser-stoffer, og dets kjemiske natur be-krefter dette.

Forskjellige mikroorganismers anticanser-egenskaper

er blitt undersøkt. Kulturer og ekstrakter av disse mikroorganismer er blitt injisert ad intravenøs vei på mus med velutviklede sarkomer 180 (Krocker-sarkomer) innpodet intradermalt. En anticanser-virkning er blitt iakttatt hos produkter fremstilt ut fra kulturer av Lactobacillus bulgaricus var. tumoronecroticans 51 isolert fra youghurt, og denne stamme er blitt deponert i "Statens Institut for Legemiddelkontroll", Sofia, Bulgaria, hvor den har fått deponeringsnummeret B 51-lm/65. Mellom 24 og 48 timer etter injeksjon av kulturer av denne stamme iakttar man for nesten alle tumorer en tydelig nekrose eller henfall, og noen dager senere er omkring 1/3 av de behandlede dyr fullstendig helbredet.

Lactobacillus bulgaricus stamme 51 består av basiller med en lengde på 5-7 um, de er gram-positive og ordnet i par eller i kjeder av forskjellig lengde alt etter næringsmediet.

I væskekulturer danner denne basille et marglignende sediment, mens den i agar-medier danner små fibrøse kolonier.

De morfologiske og biologiske egenskaper hos Lactobacillus bulgaricus var. tumoronecroticans 51 er angitt i den følgende tabell 1 sammen med egenskapene til noen andre Lactobacillus -arter som viser svak anticanser-virkning. Det kan i denne forbindelse vises til Bergey's Manual of Determinative Bacteriology av Robert S. Breed, 7. utgave, som dog ikke beskriver det produkt som erholdes i følge den foreliggende oppfinnelse, som er et produkt med en sterkt forbedret anticanser-virkning.

Dyrkningen av "varietas tumoronecroticans"-basiller av arten Lactobacillus bulgaricus og dannelsen av anticanser-produktet avhenger av næringsmediet. Man kan anvende næringsmedier som inneholder flere forskjellige næringsstoffer. Som nitrogenkilde kan anvendes pepton, kjøttekstrakt, mais, soya, gjær etc, og som karbonkilde kan det anvendes glucose, maltose, laktose, saccharose, melasse og lignende. Som fosforkilde kan man bruke gjærhydroly-sater, fosfater etc. Næringssubstratet skal inneholde minst én nitrogenkilde og minst én karbonkilde. Man har konstatert at anticanser-virkningen forsterkes ved tilsetning av små mengder uorganiske salter, så som natrium- og kaliumfosfat og magnesiumsulfat.

Dyrkningen utføres anaerobt, uten lufttilgang, ved en temperatur mellom 35 og 50°C, fortrinnsvis mellom 35 og 45°C, i en tidsperiode mellom 18 og 24 timer. Under fermenteringen faller kulturens pH-verdi til 3,8. I dette tidsrom er det ikke nødvendig å regulere pH-verdien.

Under fermenteringen dannes anticanser-produktet over-veiende i bakteriecellene.

I de tilfeller hvor det skjer autolyse av bakteriecellene, kan anticanser-virkningen også konstateres i dyrkningsvæsken. Anticanser-produktet kan ekstraheres med vann etter at bakteriecellenes membraner er blitt nedbrutt.

Anticanser-produktet har intet å gjøre med melkesyre, som også er blitt tilskrevet en anticanser-virkning (Boll. Inst. Siero-terap- Milanese 12: 205-220, 1933).

Anticanser-produktet som fremstilles i følge oppfinnelsen har ikke antimikrobielle egenskaper og er helt forskjellig fra de antimikrobielle stoffer som produseres av basiller av slekten Lactobacillus, og som er beskrevet av Bogdanov (Oeuvres scientifiques de ISUL, Institut de specialisation et perfectionnement de médecins 2, 1952, 131-139), Wheater, Hirsch and Mattick, (Nature 1952, vol. 168, 659), og James Vincent&Co. (J.Bacteriology, 78, 477-84, 1959).

Etter fermenteringen og nedbrytingen av bakteriecellene ekstraheres anticanser-produktet med fenol og/eller vann, hvoretter ekstrakten eventuelt opparbeides ved at et ribonucleinsyre-holdig produkt utfelles fra ekstrakten ved tilsetning av en syre til en pH-verdi på 1,5-4, et salt og/ellex et vannoppløselig organisk løs-ningsmiddel. Rensningen omfatter minst en ekstrakssjonsprosess og en fellingsprosess, hvilket kan utføres bare en gang eller flere ganger i forskjellige kombinasjoner, som

angitt ved det følgende skjema:

E- ekstraksjon E - F

F - felling E - F - E

E - F - E - F

E-F-E-F-E-F osv.

1. Ekstraksjonsprosessen

Ekstraksjonen av anticanser-produktet utføres ved hjelp av minst et av løsningsmidlene vann og fenol. Ved vandig ekstraksjon brukes et fast utgangsmateriale, mens det ved ekstraksjon med fenol kan brukes vandige løsninger av anticanser-produktet eller av de stoffer som inneholder det.

Som faste materialer inneholdende anticanser-produktet kan nevnes fuktige bakterieceller, tørre avfettede bakterieceller, bakterieceller fra hvilke uvedkommende materialer er fjernet ved ekstraksjon, og tørre materialer fremkommet som produkter av ekstraksjoner og utfellinger som beskrevet nedenfor.

Vandig ekstraksjon kan utføres ved at det materiale som inneholder anticanser-produktet, blandes med vann. Når det nevnte materiale består av bakterieceller, må disse nedbrytes, og i følge oppfinnelsen kan bakteriecellene hensiktsmessig nedbrytes ved hjelp av en homogenisator, en kolloidmølle, ultralyd eller behandling med eggehvite, eller det deri forekommende lysozym eller med proteolytiske enzymer, så som pepsin og trypsin.

Uoppløselige materialer kan fjernes ved filtrering eller sentrifugering. Deretter er den største del av anticanser-virkningen knyttet til den vandige ekstrakt. Ekstraksjonen med vann utføres hensiktsmessig ved en temperatur mellom 0 og 18°C. Vannets pH

er fortrinnsvis mellom,4 og 9. En lavere pH-verdi kan føre til utfelling, mens en høyere pH-verdi kan gjøre produktet uvirksomt. Tilsetning av fosfatpuffer og 0,01 mol magnesiumsulfat forbedrer

den vandige ekstraksjon.

Ekstraksjonen med fenol kan foretas enten ved ekstraksjon av faste materialer med 96% fenol eller ved tilsetning av et like stort volum 96% fenol til vandige løsninger eller suspensjoner inneholdende anticanser-produktet. I begge tilfeller kan man etter kraftig omrøring av blandingen sentrifugere for å skille fenollaget fra de uoppløselige rester og det vandige lag. Anticanser-produktet går over i fenolfasen og fraskilles ved den fremgangsmåte som er beskrevet nedenfor. Ekstraksjon med fenol kan utføres ved en temperatur" mellom 4 og 70°C.

2. Fellinqsprosessene

Når utfellingen foretas ved hjelp av en tilsetning av forskjellige salter, brukes fortrinnsvis ammoniumsulfat, ammonium-klorid, natriumsulfat, kalsiumklorid eller magnesiumsulfat. Når man anvender ammoniumsulfat, avhenger mengden av den metningsgrad man ønsker å oppnå, og som kan være mellom 0,1 og 0,8. Anticanser-produktet går over i bunnfallet. Resten av de utfelte salter kan fjernes ved fremgangsmåter som dialyse, filtrering under anvendelse av egnede filtreringshjelpemidler så som "Sephadex", eller oppløs-ning og gjenutfelling med syre.

Når utfellingen foretas ved hjelp av organiske vann-løselige løsningsmidler, kan man f.eks. anvende metanol, etanol, aceton og lignende. Man bruker fortrinnsvis et tre ganger så stort volum av det organiske løsningsmiddel som av utgangsløsningen.

Når utfellingen foretas ved hjelp av syrer, skal pH-verdien ligge mellom 1,5 og 4. Hertil kan anvendes uorganiske syrer, så som saltsyre, svovelsyre og fosforsyre og organiske syrer så som eddiksyre og oksalsyre.

Man kan som nevnt anvende eggehvite eller proteolytiske enzymer til nedbrytning av bakteriecellene før ekstraksjonen av anticanser-produktet, uten at enzymene reagerer kjemisk med det aktive stoff. Enzymene hjelper bare til å bortskaffe ballast-stoffene. Ved denne arbeidsmåte anvendes eggehvite eller det deri forekommende lysozym, pepsin og trypsin. Enzymene kan anvendes etter hverandre i forskjellige kombinasjoner alt etter det -ønskede sluttresultat, og i følge oppfinnelsen kan enzymene hensiktsmessig anvendes i rekkefølgen: eggehvite eller lysozym-pepsin-trypsin-pepsin.

Anticanser produktet som erholdes i følge oppfinnelsen, har følgende karakteristiske egenskaper: 1. Produktet er løselig i alkalisk eller nøytralt vann, men utfelles ved en pH under 4. 2. Produktet er praktisk talt uoppløselig i organiske væsker som alkoholer, aceton, etylacetat, eter, benzen, kloroform og petroleter. 3. Produktet kan ikke dialyseres i vann gjennom en film

av regenerert cellulose (cellofan).

4. Produktet taper sin anticanser-virkning når det oppvarmes til en temperatur på 120°C i 10 min. i nøytral vandig løsning. I alkalisk løsning taper det sin aktivitet ved romtemperatur. 5. Den mest karakteristiske egenskap ved produktet er dog dets biologiske anticanser-virkning. Når en passende dose injiseres intravenøst i mus med velutviklede intradermale sarkomer av Krocker-typen (sarkom 180) eller intradermale Erlih-carcinomer,

så finner man et meget betydelig henfall eller nekrose av tumoren i praktisk talt alle tilfeller,

og noen dager senere er nesten halvparten av dyrene fullstendig kurert.

En oversikt over anticanser-virkningen og dermed sikker-heten og uskadeligheten ved det ved fremgangsmåten i følge oppfinnelsen fremstilte produkt i sammenligning med to kjente produkter er anført i tabell II.

TABELL II

Anticanser-produktet fremstilt ved fremgangsmåten i følge oppfinnelsen sammenlignet med to kjente anticanser-produkter benevnt endoxan og mitomycin C.

Mus: Innpodning av sarkoma 180.

Det utvelges mus med velutviklede sarkomer den 8. dag etter innpodningen, og musene oppdeles i like store forsøksgrupper. Den 22. dag etter innpodning - Resultater

Av det omhandlede produkts oppførsel og egenskaper frem-

går at det har en komplisert molekylstruktur. Det skiller seg i sine egenskaper fra alle hittil kjente anticanser-midler. Den kjemiske analyse av det ved fremgangsmåten i følge oppfinnelsen fremstilte anticanser-produkt viser at det foreligger en komplisert kjemisk sammensetning, og at det inneholder ribonucleinsyre, hvis kjemiske og fysikalske egenskaper karakteriserer anticanser-produktet.

Det henvises nå til tegningen: Fig. 1 viser det ultrafiolette spektrum av anticanser-produktet fremstilt i følge oppfinnelsen, hvor ekstinksjonen er avsatt langs ordinaten og bølge-lengden i nm er avsatt langs abcissen. Fig. 2 viser det infrarøde spektrum av anticanser-produktet fremstilt i følge oppfinnelsen, hvor ekstinksjonen er avsatt langs ordinaten og bølgelengden i um er avsatt langs abcissen. Fig. 3 og 4 viser henholdsvis det ultrafiolette og det

infrarøde spektrum av ribonucleinsyre på samme måte som på fig. 1 og 2.

Som det vil sees av fig. 3, har ribonucleinsyre (konsentrasjon 0,0011%) i det ultrafiolette område et absorpsjonsmaksimum ved 258 nm, og dette maksimum ved 258 nm fremgår også av fig. 1 for anticanser-produktet fremstilt i følge oppfinnelsen. I det infra-røde spektrum på fig. 2 er båndene for ribonucleinsyrens funksjonelle grupper antydet. De skraverte maksima skyldes løsningsmidlet og

har intet å gjøre med selve ribonucleinsyrens spektrum.

Den i anticanser-produktet inneholdte ribonucleinsyre

ble isolert som natriumsalt og viste følgende sammensetning:

C = 33,35 N = 13,70

H = 4,43 P = 9,80

Etter hydrolyse av ribonukleinsyre-natriumsaltet viste

et kromatograirt av de i ribonukleinsyren inneholdte karbohydrater, ved bruk av et løsningsmiddelsystem bestående av butanol, propanol og vann i volumforholdet 1:1:1, en flekk med R^ = 0,35, hvilket svarer til ribose.

I tillegg til det som er anført ovenfor når det gjelder teknikkens stand, skal det nå spesielt nevnes at det fra Chem. Zentralblatt 136, 31-1169 (1965) er kjent at Antibiotikum Bul-garicum kan erholdes fra kulturer av Lactobacillus bulgaricus.

Det er imidlertid her bare tale om et råprodukt. I litteratur-stedet er det henvist til en artikkel av Bogdanov et al., hvorav det fremgår at det gjennom en rekke år er blitt utført forsøk rettet på fremstilling av et produkt med mikrobielle egenskaper. Artikkelen angir en fremgangsmåte til fremstilling av et råprodukt som inneholder et ukjent mikrobielt materiale med anti-canservirkning overfor Sarcom 180. Det var imidlertid først ved den foreliggende fremgangsmåte at man ble i stand til å opp-arbeide det virksomme stoff til effektive konsentrasjoner, idet man fant at det virksomme, stoff var ribonukleinsyre. Dermed ble man også i stand til å fremstille høykonsentrerte ekstrakter av det virksomme stoff i vesentlig renere form.

De følgende eksempler vil ytterligere belyse oppfinnelsen.

Eksempel 1

Lactobacillus bulgaricus tumoronecroticans 51 dyrkes i

200 ml næringsmedium bestående av 3% soyaekstrakt, 0,5% pepton,

0,5% kjøttekstrakt, 0,5% gjærekstrakt, 0,5 saccharose og 0,1% magnesiumsulfat. Dyrkingen pågår ved -37°C i 24 timer. Kulturens pH-verdi innstilles på 6,5, og den sentrifugeres så ved en akselerasjon på 5 000 g i 30 minutter.

Den væske (1) som ligger øverst, injiseres intravenøst i en mengde på 0,5 ml på mus med et velutviklet, subcutant implantert sarcom 180. Der er ingen tumornekrose i noen av de 20 behandlede mus. Sedimentet av bakterieceller (2) blandes med sand og behand-les i morter med pistill og ekstraheres med 100 ml destillert vann. Blandingen sentrifugeres ved 5 000 g, og den væske (3) som ligger øverst, injiseres intravenøst på mus med sarkom 180, 'med dose 0,5 ml. Etter 24 timer observertes nekrose av tumoren i 17 mus av de 20 behandlede, og 10 dager senere var 8 mus fullstendig helbredet.

Eksempel 2

a) Lactobacillus bulgaricus var. tumoronecroticans stamme 51 dyrkes i et næringsmedium på 1200 liter med følgende sammensetning: 3% soyaekstrakt, 0,5% kjøttekstrakt, 0,5% pepton, 2% melasse (beregnet som sukker), 0,1% magnesiumsulfat og 1200 liter ledningsvann. Kulturen ble dyrket ved 37°C i 24 timer. Kulturens pH-verdi ble innstilt på 6,5, hvorpå man sentrifugerte. Sedimentet ble vasket med 50 volumdeler fysiologisk saltoppløs-ning og sentrifugert på ny. Produktet var 14 200 g fuktige, rå bakterieceller.

5000 gram av disse bakterieceller fortynnes med 15 000 ml vann og desintegreres i en homogenisator. Det homogeniserte produkt sentrifugeres ved en akselerasjon på 5000 g, og den væske (1) som ligger øverst skilles fra. 10 ml av denne væske fortynnes med destillert vann til en konsentrasjon på 8 mg tørr-substans pr. ml, og en dose på 0,5 ml injiseres intravenøst på mus med velutviklede Krocker-sarkomer. Veldefinert nekrose av tumoren fant sted i 19 av de 20 behandlede mus, hvorav 12 ble fullstendig helbredet.

100 ml av væsken (1) ble lyofilisert, og en kjemisk analyse av produktet viste: Nukleinsyre 0,5% og proteiner 70%.

b) 3000 ml av væsken (1) under a) tilsettes til 6000 ml 96% etanol. Blandingen holdes ved 4°C i 2 timer og sentrifugeres

så.

Den øverstliggende væske fraskilles, og bunnfallet (3) oppløses i 600 ml vann, hvoretter man sentrifugerer for å fjerne den uoppløselige rest. Den rene oppløsning (4) deles i tre like deler.

200 ml av oppløsningen (4) surgjøres med saltsyre til pH 2. Bunnfallet (5) fraskilles ved sentrifugering. Den øverstliggende væske (6) fraskilles også. Bunnfallet vaskes med etanol og aceton og tørres. Produktet er 9,4 g tørt materiale. 30 mg av dette stoff oppløses i 15 ml vann og injiseres intravenøst på mus med sarkomer 180, dose 0,5 ml. Nekrose av tumoren opp-trådte i 17 av de 18 behandlede mus, og 10 mus ble fullstendig helbredet. De analytiske resultater viste nærvær av 13,7% nukleinsyre og 74% proteiner.

c) 200 ml av oppløsning (4) under b) blandes med ammoniumsulfat til en metningsgrad på 0,4 og kjøles i 2 timer ved 4°C.Blandingen sentrifugeres. Den væske som ligger øverst, skilles fra, og bunnfallet fortynnes i 50 ml vann ved pH 2, hvorpå det igjen sentrifugeres. Den øverstliggende væske fjernes og sedimentet løses i vann ved tilsetning av NaOH til en pH på 7. Opp-løsningen dialyseres gjennom cellofan med rennende vann i 18 timer. Den dialyserte væske sentrifugeres for å fjerne en liten uopp-løst rest og lyofiliseres. Det resulterende produkt er 7,4 g tørt stoff. Undersøkelse av anticanservirkningen, utført på samme måte som ovenfor, under b), viste nekrose av tumoren i alle de 20 behandlede dyr, hvorav 12 ble fullstendig helbredet. d) Til de siste 200 ml av oppløsning (4) under b) tilsettes 2 ml av en oppløsning av 20% kalsiumklorid. Bunnfallet

(5) skilles fra ved sentrifugering. Den øverstliggende væske

(6) surgjøres med saltsyre til pH 2. Det nye bunnfall skilles

fra ved sentrifugering, og den øverstliggende væske fjernes.Bunnfallet (7) løses i vann, idet NaOH tilsettes til en pH-verdi på 7, og løsningen lyofiliseres. Det resulterende produkt er 3,2 g tørt stoff. En dose på 1 mg pr. mus førte til fullstendig nekrose av tumoren hos alle de behandlede mus. Analyseresultater viste 14,3% nukleinsyre og 69% protein.'

Bunnfallet (5) fortynnes i 50 ml vann, og det tilsettes

3 g "Amberlite", en ionebytterharpiks med sulfonsyregrupper som funksjonelle grupper. Blandingen sentrifugeres, og den øverstliggende væske lyofiliseres. Det fås 7,4 g tørrstoff. En dose på 1 mg av dette stoff pr. mus ga særdeles markert nekrose av tumoren hos alle de 20 behandlede dyr, hvorav 11 ble helbredet.

Analyseresultatene viste 11,9% nukleinsyre og 70% proteiner. e) 1000 ml av den øverstliggende væske (1) under a) sur-gjøres med saltsyre til pH 2. Bunnfallet skilles ut ved sentrifugering og løses i 100 ml vann ved tilsetning av NaOH til en pH på 7. Oppløsningen blandes med 2 volumdeler 96% etanol. Bunnfallet skilles fra ved sentrifugering og vaskes med etanol og aceton, hvorpå det tørres. Resultatet er 7,2 g tørrstoff. En dose på 1 mg pr. mus ga nekrose av tumoren i 20 av de behandlede dyr, hvorav 13 ble fullstendig helbredet. Analyseresultatene viste 10,8% nukleinsyre og 74% proteiner i dette' stoff. f) Til 1000 ml av.den øverstliggende væske (1) under a) tilsettes ammoniumsulfat til en metningsgrad på 0,4. Bunnfallet sentrifugeres og oppløses i vann. Oppløsningen surgjøres med saltsyre til pH 2. Bunnfallet løses i vann, nøytraliseres til pH 7 og lyofiliseres. Resultatet er 8,2 g tørrstoff. En dose på 1 mg pr. mus ga nekrose av tumoren i alle de 18 behandlede mus, hvorav 12 ble fullstendig helbredet. Analysen viste 9,9% nukleinsyre og 77% proteiner. g) Til 1000 ml av den "øverstliggende væske (1) under a) tilsettes 10 ml av en 20% kalsiumkloridoppløsning. Bunnfallet

sentrifugeres og løses i 100 ml destillert vann. Til denne sus-pensjon settes 3 g "Amberlite". Etter kraftig røring sentrifugeres blandingen, og den øverstliggende væske lyofiliseres.

Det fås 6,8 g tørrstoff. En dose på 1 mg pr. mus ga veldefinert nekrose av tumoren i alle de 24 behandlede mus, hvorav 11 ble fullstendig helbredet.

Analysen viste 12% nukleinsyre og 69% proteiner.

h) 500 ml av den øverstliggende væske (1) under a) blandes med 500 ml 90% fenol. Blandingen omrøres kraftig i én time

ved 4°C og sentrifugeres ved en akselerasjon på 5000 g i 30 minutter. Vannfasen og fenolfasen skilles.

Vannfasen surgjøres med saltsyre til pH 2. Bunnfallet skilles fra ved sentrifugering, vaskes med etanol og aceton og tørres. Man fikk 1,8 g tørrstoff. En dose på 2 mg pr. mus ga nekrose av tumoren i bare 12 av de 20 behandlede mus, og bare 5 av disse ble til sist fullstendig helbredet.

Fenolfasen ble tilsatt natriumacetat til en konsentrasjon på 1%, hvorpå man tilsatte 4 volumdeler etanol. Bunnfallet sentrifugeres, vaskes med etanol og aceton og tørres. Utbyttet var 6,4 g tørrstoff. En dose på 1 mg pr. mus ga nekrose av tumoren i de 20 behandlede dyr, hvorav 12 til slutt ble fullstendig helbredet.

Analysen viste 7,9% nukleinsyre og 84% proteiner.

Eksempel 3

100 g fuktige, rå bakterieceller som fremstilt i eksempel 2 blandes med 1000 ml nydestillert 90% fenol. Blandingen omrøres i 1 time ved 10°C, såpass kraftig at tilstrekkelig desintegrering oppnås, hvoretter den sentrifugeres. Fenollaget fra-

skilles. Til 100 ml av dette tilsettes 1% natriumacetat og 4 volumdeler 96% etanol. Det erholdte bunnfall sentrifugeres, vaskes med etanol og aceton og tørres. Resultatet var 3,2 g tørrstoff. En dose på 2 mg pr. mus ga nekrose av tumoren i de 20 behandlede mus, hvorav 9 ble fullstendig helbredet.

Eksempel 4

500 g fuktige bakterieceller som angitt i eksempel 2, fortynnes med 1000 ml vann, og tilsettes så 1000 ml 90% fenol. Blandingen omrøres i én time ved 4°C, såpass kraftig at tilstrekkelig desintegrering oppnås, hvoretter den sentrifugeres i 30 minutter ved en akselerasjon på 5000 g. Vannfasen (1) og fenolfasen (2) skilles.

1% natriumacetat og derpå 2 volumdeler etanol tilsettes til vannfasen. Blandingen sentrifugeres. Den øverstliggende væske (2) fjernes. Bunnfallet (4) oppløses i 50 ml vann ved tilsetning av NaOH til pH 7. Oppløsningen surgjøres så med saltsyre til pH 2. Blandingen sentrifugeres. Den øverstliggende væske (5) skilles fra, og bunnfallet (6) løses igjen i 50 ml vann under tilsetning av NaOH, og det hele surgjøres så med saltsyre til pH 2, hvorpå sentrifugeres. Den øverstliggende væske fjernes, og bunnfallet (8) vaskes med etanol og aceton, løses så i 20 ml vann ved tilsetning av NaOH til pH 7, hvorpå lyofiliseres. Utbyttet er 0,8 g tørrstoff. En dose på 1 mg av dette stoff pr. mus gir fullstendig nekrose av tumoren i de 20 behandlede mus, hvorav dog bare 5 ble fullstendig helbredet.

Fenolfasen (2) felles med 4 volumdeler etanol. Bunnfallet vaskes med etanol og acetat og tørres. En dose på 1 mg av dette stoff pr. mus ga nekrose av tumoren i de 22 behandlede mus, hvorav 10 senere ble fullstendig helbredet.

Eksempel 5

10 g fuktige bakterieceller erholdt som i eksempel 1, kjøles til -40°C og tørres ved lyofilisering, hvoretter de fortynnes med 100 ml vann. 100 mg lysozym tilsettes. Blandingen røres kontinuerlig i 3 timer ved 37°C, og det oppnås fullstendig homogenisering. Blandingen sentrifugeres ved en akselerasjon på 1000 g i en time. Den øverstliggende væske (1) lyofiliseres. En dose på 2 mg pr. mus ga nekrose av tumoren i 17 av de 20 behandlede mus. Bunnfallet (2) oppløses igjen i vann som er sur gjort med saltsyre til pH 2, og 100 mg pepsin tilsettes. Dette system holdes ved 37°C i 2 timer, og blandingen sentrifugeres. Væsken (3), som ligger øverst,fjernes. Bunnfallet (4) oppløses

i vann som er nøytralisert til pH 7. Etter ny sentrifugering utskilles et bunnfall (5), og den øverstliggende væske (6) lyofiliseres.

Ved injeksjon på mus var resultatet fullstendig nekrose av tumoren hos alle de behandlede mus, som alle fikk en dose på

1 mg.

Eksempel 6

a) 4800 g fuktige, rå bakterieceller av Lactobacillus bulgaricus stamme 51 fortynnes med 2000 ml eggehvite, idet det

tilsettes en saltoppløsning som bringer totalvolumet til 14 000 ml. Suspensjonen oppvarmes til 37°C og rystes kontinuerlig i 3 timer, hvorpå blandingen (1) surgjøres med saltsyre til en pH-verdi på 2.

Til 1000 ml av blandingen (1) settes 1 g pepsin, mens det hele blandes kontinuerlig i 4 timer og holdes ved 37°C. Så tilsettes NaOH for å bringe pH-verdien til 7. Et gram trypsin tilsettes. Trypsinbehandlingen fortsettes i 12 timer ved 37°C, mens det røres kontinuerlig, og kloroform tilsettes.

500 ml av den således behandlede blanding sentrifugeres ved 8000 omdr/min. i 30 minutter. Residuet av ufullstendig om-satte rester (2) vaskes med alkohol og tørres. Resultatet er 5 g tørrstoff. Den øverstliggende væske (3) blandes med et like stort volum alkohol. Det erholdte bunnfall fra-sentrifugeres ved 2700 omdr/min. i 15 minutter, hvoretter det (4) oppløses i en liten mengde vann og lyofiliseres. Dette gir 3500 mg tørrsubstans. Analysen viser 62% proteiner og 13,54% nukleinsyre.

Doser på 4 mg, intravenøst injisert i mus med velutviklede 180-sarkomer, ga vidtgående nekrose av tumoren hos de 10 behandlede dyr.

Den overstående væske (5) blandes med samme volum alkohol. Man får en ny felling. Etter sentrifugering ved 2700 omdr/ min. i 15 minutter løses bunnfallet: (6) i en liten mengde vann og lyofiliseres. Man får 3300 mg tørrstoff, og analysen viser 29% proteiner og 30,03% nukleinsyre.

En dose på 4 mg injisert i mus med velutviklede 180-sarkomer ga vidtgående nekrose av tumoren hos alle de 10 behandlede dyr.

b) 13 000 ml av blanding (1) erholdt under a) sentrifugeres ved 8000 omdr./min. i 30 minutter. Den øverstliggende

væske (1) fraskilles. Bunnfallet (2) underkastes tre suksessive avfettingsoperasjoner med en blanding av like volumer alkohol og eter. Etter fordampning av oppløsningsmidlet fås 544 g tørr-stoff (3). 10 g av det stoffet (3) fortynnes med 100 ml salt-oppløsning. Etter at blandingen er surgjort med saltsyre til pH 2, tilsettes 100 mg pepsin. Blandingen holdes ved 37°C i 4 timer under stadig rysting. Den blir så sentrifugert ved 2700 omdr./min. i 15 minutter. Den øverstliggende væske (1) skilles fra. Bunnfallet (5) oppløses i det opprinnelige volum saltoppløsning, nøytraliseres til p"H 7, og sentrifugeres så ved 8000 omdr./min. i 30 minutter. Bunnfallet (6) vaskes med alkohol og tørres. Det fremkom 3900 mg tørrstoff. Den øverstliggende væske (7) lyofiliseres. Dette gir 3100 mg tørrstoff, og analysen viste 88% proteiner og 10,09% nukleinsyre. 2 mg doser injisert intravenøst på mus med velutviklede sarkomer 180 viste sterk nekrose av tumoren i 17 av de 20 behandlede dyr. 10 dager senere var 9 av dyrene fullstendig helbredet.

c) 10 g av stoffet (3) under b) fortynnes med 100 ml salt-oppløsning, idet pH innstilles på 7, og 100 mg trypsin ("Difco")

tilsettes. Blandingen bringes til 37°C og rystes kraftig i 4 timer, hvorpå den sentrifugeres ved 2700 omdr./min. i 15 minutter. Bunnfallet (1) vaskes med alkohol og tørres så. Det fremkom 2550 mg tørrstoff.

Den øverstliggende væske (2) blandes med samme volum alkohol. Det fremkom en voluminøs felning. Den øverstliggende væske (3) skilles fra etter sentrifugering, og felningen (4) løses i vann og lyofiliseres. Det fremkom 2800 mg tørrstoff, hvis analyse anga 92% proteiner og 7% nukleinsyre.

4mg-doser injisert intravenøst på mus med velutviklede sarkomer 180 ga sterk nekrose av tumoren i 18 av de 20 behandlede dyr. 10 dager senere var 10 dyr fullstendig helbredet. d) 10 g av stoffet (3) under b) fortynnes med 100 ml salt-oppløsning.<B>landingen surgjøres med saltsyre til pH 2, og det

tilsettes 100 mg pepsin. Etter 4 timers behandling ved 37°C nøytraliseres blandingen til pH 7, og 100 mg trypsin ("Difco")

tilsettes. Blandingen holdes igjen ved 37°C i 4 timer, og sentrifugeres ved 8000 omdr./min. i 30 minutter. Felningen (1) vaskes med alkohol og tørres. Resultatet var 1350 mg tørrstoff.

Den øverstliggende væske (2) blandes med samme volum alkohol og sentrifugeres. Den øverstliggende væske (3) skilles fra. Etter oppløsning i litt vann lyofiliseres felningen. Dette gir 2200 mg tørrsubstans, hvor analysen viser 68% proteiner og 8,84% nukleinsyre.

En 2 mg dose injisert intravenøst i mus med velutviklede sarkomer 180 ga sterk nekrose av tumoren i alle de 20 behandlede dyr. 10 dager senere var 8 av dyrene helbredet. e) 1500 mg av fraksjon (7) under b) løses i 45 ml salt-oppløsning, hvorpå tilsettes 15 mg omkrystallisert trypsin.Blandingen holdes ved 37°C under stadig rysting, og pH-verdien korrigeres periodisk til 7. Etter 20 timers behandling sentrifugeres blandingen. Bunnfallet (1) skilles fra. Den øverstliggende væske tilsettes natriumklorid til 12% konsentrasjon er nådd. Dette gir en utfelning, som sentrifugeres ved 2700 omdr./ min., hvorpå bunnfallet (3) løses i vann og lyofiliseres. Dette gir 400 mg tørrsubstans, og analysen viser 11% proteiner og 0,5% nukleinsyre.

Selv en 8 mg dose injisert intravenøst i mus ga ingen forandring i tumorene hos de 20 behandlede mus.

En halv volumdel alkohol tilsettes til den øverstliggende væske. Den fremkomne felning skilles fra ved sentrifugering, den løses så i litt vann og lyofiliseres. Dette gir 120 mg tørr-stoff (5), og analysen av dette viser 21% proteiner og 7,3% nukleinsyre.

En 4 mg dose injisert intravenøst i mus med velutviklede sarkomer 180 ga sterk nekrose i 18 av de 20 behandlede dyr, og 10 dager senere var 8 av dyrene fullstendig helbredet.

Eksempel 7

5 g lyofiliserte baktericeller av Lactobacillus bulgaricus stamme 51 erholdt som i eksempel 1 kjøles til -40°C og tørres ved lyofilisering, hvoretter de fortynnes med 50 ml salt-oppløsning med pH 7. 50 mg lysozym tilsettes. Behandlingen med lysozym utføres ved 37°C, mens det rystes kontinuerlig i 2 timer. Blandingen surgjøres med saltsyre til pH 2, og der tilsettes også 50 mg pepsin. Etter 4 timers behandling ved 37°C sentrifugeres blandingen ved 2700 omdr./min. i 30 minutter. Den øverstliggende væske skilles fra.

Bunnfallet (2) løses i saltoppløsningen med pH 7.

50 mg trypsin tilsettes. Etter 4 timers behandling ved 37°C

med stadig rysting sentrifugeres blandingen ved 2700 omdr./min.

i 30 minutter. Det faste stoff (3) vaskes med alkohol og tørres. Dette gir 640 mg tørrstoff.

Den øverstliggende væske (4) blandes med samme volum alkohol. Etter sentrifugering av blandingen løses det utfelte stoff (5) i litt vann og dialyseres gjennom én cellofan-membran i rennende vann, hvorpå den lyofiliseres. Dette gir 500 mg tørr-stoff, hvis analyse viser 37 proteiner og 11,36% nukleinsyre.

Den øverstliggende væske (6) blandes med samme volum alkohol og sentrifugeres. Bunnfallet (7) løses i litt vann og dialyseres i rennende vann i 24 timer, hvorpå det lyofiliseres. Dette gir 80 mg tørrstoff, og analysen viser 29% proteiner og 41,24% nukleinsyre.

Felningene (5) og (7) gir, når de tilføres til mus i

4 mg doser, meget markert nekrose av tumoren i de 20 behandlede dyr.

Claims (1)

1. Fremgangsmåte til fremstilling av et produkt med anti-canservirkning,karakterisert vedat mikroorga-nismen Lactobacillus bulgaricus var. tumoronecroticans 51 som er deponert under nr. B 51-lm/65 i det statlige institutt for legemiddelkontroll i Sofia, Bulgaria, dyrkes i et næringsmedium som inneholder en nitrogenkilde, en karbonkilde og anorganiske fosfater under anaerobe betingelser ved en temperatur mellom 35 og 50°C i et tidsrom mellom 18 og 24 timer, bakteriecellene i den erholdte masse nedbrytes og ekstraheres med fenol og/eller vann, hvoretter ekstrakten eventuelt opparbeides ved at et ribonukleinsyre-holdig produkt utfelles fra ekstrakten ved tilsetning av en syre til en pH-verdi på 1,5-4, et salt og/eller et vann-oppløselig organisk løsningsmiddel.