NO116283B - - Google Patents

Description

Fremgangsmåte for fremstilling av et nytt antibiotikum. 11072 R P.

Nærværende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte til fremstilling av et hittil ukjent antibiotisk produkt i det følgende betegnet 11072 RP. Dette nye produkt er særlig aktivt mot mycobakterier og mange andre gram-positive mikroorganismer. Det er i besiddelse av samme aktivitet mot mycobakterier som er motstandsdyktige overfor andre antibiotika, slik som strepto-mycin, neomycin og kanamycin, som det er mot mycobakterier følsomme overfor disse antibiotika.

Dette nye antibiotiske produkt fremstilles ved dyrking under kunstige betingelser av en mikroorganisme i det følgende mere fullstendig identifisert og som hører til slekten Streptomyces.

Krystallinsk 11072 RP er oppløselig i methanol, ethanol, aceton, kloroform, methylenklorid, ethylacetat, dioxan, pyridin, dimethylformamid og diethylether det er svakt oppløselig i vann og diisopropylether og uoppløselig i petrolether. Det særmerker seg ved å være i besiddelse av en høy oppløselighetsgrad i mange organiske oppløsningsmidler. Særlig er fordelingskoeffi-sienten for antibiotikum 11072 RP mellom de med vann ikke blandbare organiske oppløsnings-midler, ethylacetat og diklorethan og kulturfilt-ratet (vandig fase) alltid over 20.

Antibiotikum 11072 RP gir negative resultater i de følgende reaksjoner, biuretreaksjon, Sakaguchi-reaksjon, ninhydrinreaksjon, Mo-lisch-reaksjon, Tollens-reaksjon, Ehrlich-reaksjon og reaksjon med 2,4-dinitrofenylhydrazin. Det gir positive resultater ved de følgende reaksjoner: ninhydrinreaksjon etter sur hydrolyse, reaksjon med kaliumpermanganat, reaksjon med Fehling's oppløsning, Seliwanoff-reaksjon og Dische-reaksjon. Disse prøver viser at antibiotikum 11072 RP inneholder aminosyrer, men ikke aromatiske ringer. Aminosyrene tilstede i mole- kylet for det nye antibiotikum er blitt under-søkt ved papirkromatografi etter hydrolyse i 24 timer i 6 n saltsyre, og glycin, prolin, leucin og isoleucin er blitt spesielt identifisert.

Antibiotikum 11072 RP inneholder carbon, hydrogen, oxygen og nitrogen. Elementær-ana-lysen er som følger: Cpst. = 61,85—61,90; H pst. = 8,9—8,95; Opst. 16,7—17,0; Npst. = 12,25—12,35.

Analyse av funksjonelle grupper.

-0-CH,t1,25 % -CO-CH., 5,10 % -CH;i(bundet til carbon) 24,45 % -CE, (bundet til nitrogen) 13,30 %

Dets fysikalske egenskaper er som følger: Utseende: hvitt mikrokrystallinsk pulver. Smeltepunkt: 222—223°C.

Optisk dreining: [a]<2>Dn - —100° ±5°

(c = 1, methanol).

Ultrafiolett spektrum (bestemt på oppløs-ninger inneholdende 10 ^g/cc og 100 (xg/cc i methanol).

— svak absorbsjon ved lav bølgelengde

— ingen maksimumsadsborsjon mellom 200 og 400 m|x.

Infrarødt spektrum (bestemt på tabletter av

blandinger med KBr).

Dette spektrum gjengis på vedføyede teg-ning på hvilken absissen betyr bølgelengder uttrykt i mikron (nedre skala) og bølgetallene i cm—i (øvre skala) og ordinaten betyr prosentan-del transmisjon.

Tabell I angir de vesentligste infrarøde ab-sorbsjonsbånd for produktet.

Antibiotikummet 11072 RP kan identifiseres ved papirkromatografi. Antibiotikummet kroma-tograferes på Arches nr. 302 papir ved synkende utvikling med forskjellige oppløsningsmidler eller oppløsningsmiddelblandinger. Kromato-grammene utvikles ved bioautografi på nærings-agarplater podet med Mycobacterium 607 eller Sarcina lutea. Rf-verdiene som ble oppnådd er gitt i tabell II:

Dissekromatografiske resultater viser at antibiotikum 11072 RP består av en enkel aktiv substans. Den bakteriostatiske aktivitet for antibiotikum 11072 RP i forhold til visse mikroorganismer er blitt bestemt ved en av fortynnings-metodene for tiden brukt for dette formål. For hver mikroorganisme finnes den laveste konsentrasjon av stoffet som forebygger all synlig utvikling i et egnet næringssubstrat. Resultatene av de forskjellige bestemmelser er satt sammen i tabell III nedenfor i hvilken de laveste bakteriostatiske konsentrasjoner er uttrykt i mikrogram stoff pr. cm:! prøvemedium.

Disse forskjellige bestemmelser viser at aktiviteten for antibiotikummet 11072 RP rettes prinsipielt mot mycobakterier, inklusive virulente stammer. Dessuten viser det seg også aktivt mot stammer som er motstandsdyktige overfor andre antibiotika såvel som ikke motstandsdyktige stammer, slik som vist i tabell IV.

Antibiotikum 11072 RP har også vist seg aktivt mot tallrike stammer isolert fra patologiske prøver fra pasienter, slik som vist i tabell V.

Til slutt, en konsentrasjon av 11072 RP på 4000 |_ig/cm<:i>gir ikke ved diffusjon i et agar-medium noen inhiberingsring på veksten av de følgende mikroorganismer: Pestalezzia palmarum, Saccharomyces pas-terianus, Candida albicans, Botrytis cynerea, Tricophyton mentagrophytes, Aspergillus fumi-gatus, Fusarium oxysporum og Penicilium digi-tatum.

11072 RP er således inaktiv overfor sopp og

gjær.

In vitro antibiotisk aktivitet for antibiotikum 11072 RP overfor mycobakterier er blitt be-kreftet in vivo ved laboratorieforsøk på dyr infi-sert med mikroorganismer, slik som tuberkulose-basiller (virulente stammer Vy og Br). Det er blitt vist å være særlig aktivt i mus ved sub-kutan og oral administrasjon dessuten er det blitt vist å være aktivt ved oral administrasjon mot tuberkulose i marsvin.

Antibiotikum 11072 RP er et polypeptid-antibiotikum og er forskjellig fra andre kjente polypeptid-antibiotika, særlig de som fremstilles ved å dyrke kjente stammer av Streptomyces griseus. Blant disse sistnevnte antibiotika finnes amycetin, aspartocin, capreomycin, etamycin, grisein, griseoviridin og viomycin. Tabellen som følger viser resultatene fra elementæranalyser av disse kjente antibiotika sammenlignet med resultatene fra analyse av 11072 RP.

Organismen som produserer antibiotikum 11072 RP, tilhører slekten Streptomyces og be-tegnes S. caelicus. En prøve av S. caelicus er blitt deponert i the Northern Regional Research Labo-ratory ved Peoria (Illinois), USA under registre-ringsnummer NRRL 2957. S. caelicus ble isolert 'fra et jordfragment tatt nær Madras i India. Iso-lasjonsmetoden var som følger: jordprøven ble suspendert i sterilt destillert vann og suspensjo-nen fortynnet til forskjellige konsentrasjoner. Et lite volum av hver fortynning ble spredt ut på overflaten av petriskåler inneholdende Emer-son^ næringsmedium eller et annet egnet medium. Etter inkubasjon i flere dager ved 26°C ble koloniene av mikroorganismer som det var Ønsket å isolere overført på skråagær for å oppnå større kulturer.

Ifølge klassifiseringen etter Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 7. utgave (1957) for slekten Streptomyces, er ingen beskrivelse blitt funnet for arter hvis kulturkarakteristika og biokjemiske egenskaper stemmer overens med dem for den Streptomyces som anvendes ifølge oppfinnelsen. Av denne grunn må organismen betraktes som en ny art, hvilken er blitt gitt navnet Streptomyces caelicus, på grunn av farven av dens luftsporer og dens evne til å danne et blått pigment i visse kulturmedia.

Det følgende er en beskrivelse av dens ka-rakteristika: Streptomyces caelicus danner sporer av oval til sylindrisk form med meget runde ender som måler 0,6—0,8 til 0,9—1,2^, båret på lange spor-bWrende filamenter som ruller seg opp i tette spiraler av forlenget form, som ofte kan inneholde 10 til 15 omganger. De slik dannede sporo-forer bæres på lufthyfer, 0,3 til 0,5[i i diameter. Deres feste er monopodial. Denne type spore-dannelse plasserer S. caelicus i seksjonen «Spira» ifølge klassifiseringen av Streptomyces av Pridham [Applied Microbiology,6, 52—79 (1958)]. D^n er blitt iakttatt og funnet å være identisk på de følgende kulturmedia, anbefalt for dette formål av Pridham: Czapek's syntetiske agar, Hickey og Tresners' agar, tomatekstrakt og hav-remelagar, agar .med stivelse og mineralsalter, Bennetfs agar.

Streptomyces caelicus har som særlige ka-rakteristika på den ene side blåfarvede luftsporer og på den annen side en rikelig dannelse av et blått pigment av vedholdende intensitet i et! visst antall av kulturmedia, særlig i visse syntetiske media i hvilke det særlig kan iakttas. Oftest begynner pigmentet å dannes fra de første dager av kulturen som gir en lys blåfarve til disse media. Dettes produksjon er deretter så livlig at dets akkumulering meget hurtig gir en meget sterk mørkeblå til sort farve til agaren. I jvisse organiske media er dette blå pigment mere eller mindre formørket av et sort pigment uavhengig produsert.

I Streptomyces caelicus kan skilles fra alle allerede beskrevne arter av Streptomyces som produserer blått pigment av de følgende grun-ner: j A. S. caelicus produserer et pigment hvis farve er gjenstand for variasjon i overensstem- melse med surhets- eller alkalitetsgraden for mediet og blir rødt i et surt medium, slik som pigmentet produsert av Streptomyces coelicolor. Hvis artene beskrevet i Bergey's klassifisering (7. utgave) sammenlignes med S. caelicus er det S. coelicolor (S. violaceoruber av Waksman og Curtis) som ligner mest på grunn av denne produksjon av pigment. Den skiller seg imidlertid fra disse arter på følgende punkter: a) Farven på det sporebærende luftlegeme hos S. caelicus er svakt grønt lyseblå, mens den

for S. coelicolor (S. violaceoruber) er grå. Sammenlikning av samtidige kulturer av de to arter gir ingen tvil med hensyn til forskjellen i farven.

b) S. caelicus danner meget lange sporebærende filamenter som ruller seg i lange, tette

spiraler som ofte inneholder opp til 10 til 15 omganger, og adskiller seg herved fra S. coelicolor (S. violaceoruber) som danner løse spiraler med et mere begrenset antall omganger.

c) S. caelicus i kontrast til S. coelicolor (S. violaceoruber) er en kromogen stamme, som gir

et sortaktig pigment, særlig på Williams og McCoys maltose-trypton-agar.

B. En tabell over artene av Streptomyces som gir et blått pigment har vært fremstilt av Kutsner og Waksman (J. of Bact. 78, 528—538, 1959). Blant dem har bare to blått luftmycelium: S. caeruleus av Baldacci og S. cyaneus av Kras-silnikov. S. caeruleus, som ikke har spiralformede sporebærende filamenter, kommer ikke i den samme klassifikasjonsseksjon som S. caelicus. Som for S. cyaneus er dets pigment av en forskjellig natur i forhold til pigmentet av S. caelicus, og farven er ufølsom for variasjoner i pH for mediet.

Kulturkarakteristika og biokjemiske egenskaper for Streptomyces caelicus er blitt under-søkt i de vanlige næringsagar og -supper an-vendt for å bedømme utseendet av stammer av Streptomyces. Iakttagelsene er satt opp i den følgende tabell VI. Med mindre annet er angitt vedrører de kulturer inkubert i 2 til 3 uker ved 26°C som har nådd en god tilstand for utviklingen. Majoriteten av de anvendte kulturmedia ble fremstilt ifølge formelen gitt i «The actino-mycetes», S. A. Waksman, s. 193—197, Chronica Botanica Company, Waltham, Mass., USA (1950). I dette tilfelle er de idenfisert ved bokstavet W fulgt av nummeret tildelt dem i «The Actino-mycetes». De øvrige henvisninger er gitt ved slutten av tabell VI.

Ved å følge metoden av Pridham og Gottlieb, (J. of Bact., 56, 107—114, 1948) er det blitt bestemt at Streptomyces caelicus anvender lett som kilde for carbon de følgende stoffer: xylose, arabinose, rhamnose,' fructose, glucose, galactose, mannose, lactose, maltose, sucrose, trehalose, cellobiose, raffinose, dextrin, stivelse, glycerin, adonitol, mannitol og inositol. Den gjør ikke bruk av sorbose, erythritol, dulcitol eller sorbitol.

Som nitrogenkilder anvender Streptomyces caelicus lett de følgende stoffer: (NH,)2SO,, adenosin, urea, asparagin, glycin, alanin, valin, glutaminsyre, arginin, lysin, threonin, fenylal-anin, tyrosin, prolin, histidin, NaNO.,, NaNO.„ sarcosin og hydroxyprolin. De følgende er mode-rat godt brukbare: adenin, uracil og acetamid. De følgende er ikke brukbare: methionin, crea-tin, creatinin og taurin.

I

Ref. A — Jones, K. L. — Journal of Bacteriology 57, 142, 1949.

Ref. B — Williams, A. M og McCoy, E. — Applied I Microbiology 1, 307, 1953.

Ref. C — Pridham, T. G. et al. — Antibiotics Annual, 1956—57, s. 947.

Ref. D — «Plain gelatine» — fremstilt etter in-struksjonene gitt i «Manual of meth-ods for Pure Culture Study of Bac-teria» av the Society of American

Bacteriologists (II 50—18).

Ref. E — Grundy et al. — Antibiotics and Che-motherapy, 2, 401 (1952).

Produksjonen av hydrogensulfid med Streptomyces caelicus har vært studert av (a) på et organisk medium Et medium fremstilles som inneholder:

pH justeres til 7,1 med natriumhydroxyd og

mediet steriliseres.

En sort-brunlig farvning av agaren viser seg fra den annen inkubasj onsdag for Streptomyces caelicus ved 26°C på dette medium. Farvningen er først svak, men blir deretter mer intens. Ingen farvning iakttas på kontrollmediet som ikke inneholder natriumthiosulfat og på andre organiske media opptrer ikke brunfarvningen,

og (b) på et syntetisk medium

Et medium fremstilles som inneholder:

pH justeres til 7,1 og mediet steriliseres.

Ingen sort-brunlig farvning iakttas på dette medium.

Veksten av Streptomyces caelicus på et medium av skummet melk har også vært studert. Mediet fremstilles i dette tilfelle fra oppløst tør-ret skummet melk («Gayleord Hauser» brand). Ved 26°C er utviklingsgraden god og Streptomyces caelicus danner en meget mørk brun ring på overflaten av mediet. Intet luftmycelium danner seg, et brunlig-grått pigment utvikler seg fra overflaten. Etter 1 måned endrer pH seg fra 6,3 til 6,0—6,2, men koagulering og peptonisering opptrer ikke. Etter mellom 1 og 2 måneder peptoniseres melken og mediet farves brun-sort.

Ved 37 °C er utviklingsgraden god og en mørk brun, nesten sort, ring dannes på overflaten av mediet. Intet luftmycelium danner seg, et grålig-brunt pigment utvikler seg fra overflaten. I løpet av 1 måned forandrer pH seg fra 6,3 til 6,2. Svak koagulering skjer i løpet av 2 uker, fulgt av langsom peptonisering som fremdeles bare er svak etter 1 måned, men nesten fullstendig etter 2 måneder.

Ifølge oppfinnelsen er det fremskaffet en fremgangsmåte for produksjon av antibiotikumet 11072 RP som består i å dyrke Streptomyces caelicus NRRL 2957 i et næringsmedium som inneholder en kilde for assimilerbart karbon, en kilde for assimilerbart nitrogen, mineralsalter og eventuelt vekstfaktorer og skille det dannede antibiotikum 11072 RP fra kulturen.

Dyrkningen kan utføres etter alle metoder for overflate- eller neddyppet aerob kultur, men det siste er foretrukket av hensiktsmessige grun-ner. For dette formål kan de forskjellige typer av apparater som nå er i vanlig bruk i fermen-teringsindusrien brukes.

Særlig kan den følgende arbeidsrekke anvendes.

Fermenteringsmediet skal inneholde i det vesentlige en assimilerbar kilde for carbon og en assimilerbar kilde for nitrogen, uorganiske salter og hvis ønsket vekstfremmende midler. Alle disse elementer kan inkluderes i form av veldefinerte stoffer eller som komplekse blandinger slik som de finnes i biologiske stoffer av forskjellig opprinnelse.

Som assimilerbare kilder for carbon kan carbohydrater, slik som glucose, dextriner eller stivelse, eller andre carbon-, hydrogen- og oxygenholdige stoffer slik som sukkeralkoholene, f. eks. glycerol og mannitol, eller visse organiske syrer f.eks. melkesyre, sitronsyre og vinsyre brukes. Visse animalske eller vegetabilske oljer, slik som talg og soyaolje kan med fordel erstatte disse forskjellige carbon-, hydrogen- og oxygenholdige stoffer eller tilsettes til dem.

Egnede kilder for assimilerbart nitrogen kan variere sterkt. De kan være meget enkle kjemiske stoffer, slik som nitrater, uorganiske og organiske ammoniumsalter, urea og aminosyrer. De kan også tilføres i form av komplekse stoffer som inneholder nitrogen, hovedsakelig i form av protein, f. eks. kasein, laktalbumin og gluten og deres hydrolysater, soya, jordnøtt- og fiskemel, kjøttekstrakter, gj ærekstrakter, «Dis-tillers' solubles» og maisstøp.

Blant de uorganiske stoffer som er tilsatt kan visse ha en pufrende eller nøytraliserende effekt, slik som alkalimetall- og jordalkalime-tallfosfater eller calcium- og magnesiumcarbo-nater. Andre bidrar til den ionelikevekt som er nødvendig for utviklingen av Streptomyces og dannelsen av antibiotikummet, slik som alkalimetall- og jordalkalimetallklorider og sulfater. Dessuten virker visse av dem mer spesielt som aktivatorer for de metaboliske reaksjoner av Streptomyces, og dette er salter av sink, ko-bolt, jern, kopper og mangan.

pH for fermenteringsmediet ved begynnel-sen av kulturen skal være mellom 6,0 og 7,8, fortrinnsvis 6,5 til 7. Den optimale temperatur for fermenteringen er 25—27°C, men en til-fredsstillende produksjon oppnåes ved tempera-turer mellom 23 og 35°C. Luftingen av mediet, kan varieres mellom temmelig vide grenser. Det er dog blitt funnet at luftningshastigheter på 0,3 til 2 liter luft pr. liter suppe pr. minutt gir særlig gode resultater. Det maksimale utbytte av antibiotikum oppnåes etter 2 til 5 dagers dyrkning, og tiden er avhengig av i det vesentlige det anvendte medium.

Fra de foranstående anførsler vil det sees at de generelle betingelser for dyrkningen av Streptomyces for fremstillingen av antibiotikum 11072 RP kan varieres sterkt og tilpasses de til enhver tid spesielle omstendigheter.

Antibiotikumet 11072 RP kan isoleres fra fermenteringsmediene ved forskjellige metoder. Fermenteringsmediet kan først filtreres i nær-vær av et filtreringshj elpemiddel og ved en pH mellom 2 og 9 da aktiviteten i filtratet er prak-tisk talt uavhengig av pH. For å gjøre de etter-følgende behandlinger lettere er det imidlertid vanligvis foretrukket å filtrere kulturen ved en pH mellom 4 og 6.

Antibiotikumet kan derpå ekstraheres fra filtratet ved hjelp av en med vann ikke bland-bar alifatisk alkohol inneholdende fire eller fem carbonatomer slik som n-butylalkohol eller en blanding av amylalkoholer, en aromatisk alkohol slik som benzylalkohol, et keton slik som methylisobutylketon, en ester slik som ethyl-eller amylacetat, eller et klorert oppløsnings-middel slik som kloroform eller diklorethan. Denne ekstraksjon kan også utføres ved en pH på mellom 2 og 9, men det er fortrinnsvis foretrukket å arbeide ved en pH mellom 2 og 6 for å oppnå de beste betingelser for industriell praksis. Den organiske oppløsning som inneholder antibiotikum 11072 RP konsentreres derpå til et lite volum. Tilsetningen av et dårlig oppløs-ningsmiddel, slik som hexan- eller diisopropylether, gir da den delvise eller fullstendige bunn-felling av det rå antibiotikum i overensstem-melse med konsentrasjonsgraden og de anvendte oppløsningsmidler.

I Når bunnfellingen av det rå antibiotikum ikke er fullstendig kan modervæskene føres gjennom en'kolonne av aluminiumoksyd, fortrinnsvis, men ikke nødvendigvis, inneholdende ca. 1 kg aluminiumoxyd pr. liter oppløsning. Etter vasking av kolonnen med et dårlig oppløs-ningsmiddel for antibiotikumet, slik som hexan-eller diisopropylether, elueres antibiotikumet som blir tilbake i kolonnen med et eller flere a'v de gode oppløsningsmidler nevnt foran, slik slom methanol, ethanol, kloroform og ethylacetat. Den organiske oppløsning som inneholder Antibiotikumet konsentreres derpå til et lite volum som gir hvis ønsket etter tilsetningen av et dårlig oppløsningsmiddel, slik som diisopropylether, bunnfellingen av resten av det rå antibiotikum.

Det rå antibiotikum oppnådd ved forangå-ende behandlinger er ikke alltid direkte krystal-liserbart. Det er derfor fordelaktig først å un-derkaste det en rensning som kan under visse betingelser lede direkte til det rene krystallinske Antibiotikum. Rensningen kan utføres ved hjelp av enhver av de anvendte klassiske metoder, særlig ved kromatografi på forskjellige adsor-beringsmidler eller ved motstrømsfordeling. Det er særlig fordelaktig å utføre en kromatografi, i kloroform, over aluminiumoxyd. Det rensede antibiotikum kan krystalliseres eller omkrystalli-s^res ved oppløsning i et oppløsningsmiddel, fortrinnsvis kloroform, under svak oppvarmning og derpå avkjøling for å fremkalle krystallisering, eller ved oppløsning i en stor mengde av et dårlig oppløsningsmiddel, fortrinnsvis diisopropylether og langsom krystallisering ved omgivelsestemperatur. Det skal forståes at de forskjellige metoder beskrevet foran kan anvendes suksessivt i yariert rekkefølge eller gjentas flere ganger i overenssttemmelse med de produksjonskrav som stilles for å oppnå antibiotikum 11072 RP i en form egnet for de tilsiktede anvendelser.

De følgende eksempler viser hvordan dyrkning og utvinning kan utføres i praksis. I det følgende ble aktiviteten gjennomgående bestemt\jed en dif fusjonsmetode, med Mycobacterium sp. ATCC 607 som prøveorganisme, i sammenlikning med en ren krystallinsk prøve av produktet som standard. Denne aktivitet er derfor uttrykt i mikrogram (ug) av standard krystallinsk produkt pr. mg for faste produkter og i av standard krystallinsk produkt pr. cm:! for oppløsninger.

Eksempel 1.

Et 170 liters fermenteringskar ble satset med:

Denne kultur har en pH på ca. 6. Den steriliseres ved gjennomledning av damp ved 122°C i 40 minutter. Etter sterilisasjon og avkjøling til 27°C er det endelige volum for suppen 120 liter og pH 6,85. Mediet podes derpå med 200 cm' av en i en Erlenmeyerflaske under rystning fremstilt kultur av Streptomyces caelicus.

Kulturen i fermenteringskaret luftes med steril luft med en hastighet på 5 m-ytime og røres om med en omrører som roterer med en hastighet på 350 omdreininger pr. minutt. Tem-peraturen opprettholdes ved 26—27°C. pH for mediet forblir tilnærmet ved dets utgangsverdi under kulturen. Utvikling av soppen begynner ved ca. den 20. time. Kulturen er egnet for pod-ning av produksjonskulturen 48 timer etter spi-ring.

Produksjonskulturen utføres i et 800 liters

fermenteringskar satset med følgende:

pH for det slik oppnådde medium justeres til 7,6 med konsentrert natriumhydroxydoppløs-ning (400 cc). Mediet steriliseres ved å lede damp igjennom ved 122°C i 40 minutter og etter sterilisasjon avkjøles til 26—27°C. Volumet av suppen er 400 liter og pH ca. 6,5. Mediet smittes derpå med 40 liter av den foran angitte kultur i 170 liters fermenteringskaret, røres om med en propell som roterer med 205 omdreininger pr. minutt, luftes med 15 mytime steril luft og holdes ved 26—27°C. pH faller langsomt fra 6,5 til 5,95 i løpet av 24 timer og stiger derpå til 8,35 etter dyrkning i 90 timer. Produksjonen av antibiotikumet begynner ved ca. den 40. time. Fermenteringen stoppes etter 90 timer når mengden antibiotikum til stede i mediet er 410 Hg/CC

Eksempel 2.

Fermenteringssuppen (170 liter) oppnådd i eksempel 1 (aktivitet 410jig/cc) anbringes i et kar utstyrt med omrører og røres om en time mens pH justeres til 5 med 5 n saltsyre. Et filtreringshjelpemiddel (10 kg) tilsettes, og blandingen filtreres på en filterpresse og kaken vaskes med vann (70 liter). Filtratet (205 liter) justeres til pH 3 med 5 n saltsyre og ekstraheres to ganger med ethylacetat (60 og 40 liter). De organiske ekstrakter forenes og konsentreres under redusert trykk til 1 liter. Konsentratet behandles med hexan (10 liter) og det slik oppnådde bunnfall frasepareres, vaskes og tør-kes, og gir et rått produkt (86 g) som har en aktivitet på 488[xg/mg.

Moderlutene føres gjennom en aluminiumoxydkolonne som derpå vaskes med hexan. Produktet som blir tilbake i kolonnen elueres derpå med methanol. Methanoloppløsningen som oppnåes konsentreres under redusert trykk og et annet utbytte av det rå produkt (9 g) med aktivitet 415 (xg/mg oppnåes.

Eksempel 3.

Det rå produkt (50 g) isolert i eksempel 2 (aktivitet — 488 (.ig/mg) oppløses i kloroform (500 cc). Den oppnådde oppløsning filtreres og føres derpå gjennom en aluminiumoxydkolonne (1 kg). Antibiotikumet elueres derpå med kloroform (2,5 liter), og forurensningene forblir bundet til aluminiumoxydet. Den oppnådde kloro-formoppløsning konsentreres til tørrhet i va-kuum, og gir et renset produkt (29,5 g) som har en aktivitet på 781 |xg/mg. Dette produkt (25 g) oppløses i diisopropylether (1,25 liter) ved omgivelsestemperatur og den oppnådde oppløsning røres om i 15 minutter med avfarvende trekull (5 g). Etter filtrering, henstand for å krystalli-sere i 3 dager ved omgivelsestemperatur, sepa-rering, vasking og tørking oppnåes et rent produkt (15,8 g) som har en aktivitet på 1000 mg.

Eksempel 4.

En fermenteringssuppe (1000 liter) som er det forenede produkt av flere behandlinger ut-ført som beskrevet i eksempel 1 og som har en aktivitet på 390 |ig/cc og en pH på 7,8, anbringes i et kar utstyrt med en omrører. Denne suppe justeres til pH 5 med saltsyre og røres om i 30 minutter med et filtreringshjelpemiddel (45 g). Blandingen filtreres på en filterpresse og kaken vaskes med vann (200 liter). Filtratet (1040 liter) ekstraheres med diklorethan (400 liter) etter justering av pH til 3 med saltsyre. Ekstraktet konsentreres derpå under redusert trykk til 2 liter. Konsentratet behandles derpå med diisopropylether (8 liter) og det oppnådde bunnfall filtreres fra, vaskes og tørkes og gir således et rått produkt (154 g) som har en aktivitet på 456H<g>/m<g.>

Modervæsken fra bunnfallet føres gjennom

en kolonne av aluminiumoxyd (8 kg). Kolonnen vaskes med hexan (4 liter) og produktet som forblir i kolonnen elueres med kloroform (30 liter). Kloroformoppløsningen slik oppnådd konsentreres under redusert trykk til 500 cc og av-kjøles til -f- 5°C hvilket fremkaller en begyn-nende krystallisasjon. Diisopropylether (500 cc) tilsettes derpå for å fullende krystallisasjonen. Krystallene frasepareres, vaskes og tørkes og gir et renset produkt (192 g) som har en aktivitet på 960ug/mg. Etter omkrystallisasjon fra diisopropylether som beskrevet ved slutten av eksempel 3 oppnåes et rent produkt (168 g) som har en aktivitet på 1000 |ig/mg.

Eksempel 5.

Det rå produkt fra eksempel 4_med aktivitet 456 (.ig/mg (100 g) oppløses i kloroform (1 liter). Oppløsningen føres gjennom en aluminiumoxydkolonne (1 kg) og antibiotikumet elueres derpå med kloroform (2 liter). Kloroformopp-løsningen oppnådd konsentreres under redusert trykk til krystallisasjonspunktet. Krystallene filtreres derpå av, vaskes og tørkes og gir et rent produkt (62 g) som har en aktivitet på 1000H<g>/m<g.>

Claims (1)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av et antibiotikum betegnet 11072 RP, karakterisert v e d at Streptomyces caelicus NRRL 2957 dyrkes i et næringsmedium som inneholder en kilde for assimilerbart karbon, en kilde for assimilerbart nitrogen, mineralsalter og eventuelt vekstfaktorer, hvoretter antibiotikumet skilles fra kulturen.