NO116412B - - Google Patents

Description

Fremgangsmåte for fremstilling av antibiotikum 11072 RP.

Nærværende oppfinnelse vedrorer en fremgangsmåte for fremstilling av antibiotikumet U072 RP. Antibiotikum 11072 RP identifiseres og dets egenskaper og karakteristika er angitt i norsk patent nr. 116.283 Fremgangsmåten beskrevet i nevnte patent for fremstillingen av det nye antibiotikum består i å dyrke Streptomyces caelicus NRRL 2957 på et næringsm edium som består av en kilde for as similerbart carbon, en kilde for assimilerbart nitrogen, mineralsalter og, eventuelt, vekstfaktorer, og skille antibiotikum 11072 RP som dannes, fra kulturen.

Det er funnet at 11072 RP også kan fremstilles ved å dyrke en fra S. caelicus forskjellig mikroorganisme, som i det folgende vil bli mere fullstendig identifisert, og som horer til slekten Streptomyces og er gitt navnet' Streptomyces griseus 20129-

En prove av Streptomyces griseus 20129 er blitt deponert i Northern Regional Research Laboratory i Peoria, Illinois, under reg. nr. NRRL 2986. Organismen ble isolert fra en jordprove funnet i Brasil. Isole-ringsmetoden var som folger: jordproven ble suspendert i sterilt destil-lert vann og suspensjonen fortynnet til forskjellige konsentrasjoner. Et lite volum av hver fortynning ble spredd på overflaten av Petriskåler som inneholder Emersons næringsmedium eller et annet egnet medium. Efter inkubasjon i flere dager ved 26°C ble mikroorganismekoloniene som det var Onsket å isolere, overfort på skråagar for å oppnå mere kraftige kulturer. Studiet av denne nye stamme har vist at den er i be-siddelse av morfologiske karakteristika som svarer til de karakteristika som er anfort for arten Streptomyces griseus av Waksman og Henrici i Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 7. utgave, 1957. Den skiller seg i realiteten ikke fra den sistnevnte annet enn med hensyn til noen få egenheter som bare tillater å skille den ut som en spesiell vari-etet.

De morfologiske karakteristika for Streptomyces griseus 20129 er blitt studert på folgende media:

Majoriteten av kulturmediene som anvendes, ble fremstilt ifålge formelen som er gitt i boken "The Actinomycetes" av S.A. Waksman, side 193 - 197, Chronica Botanica Company, Waltham, Massachusetts (1950).

Disse kulturmedia identifiseres med bokstaven W som folger av tallet gitt til dem i "The Actinomycetes". Henvisning D er til "Plain Gelatine" og "Nitrate Broth" fremstilt efter anvisningene gitt i "Manual of methods for Pure Culture Study of Bacteria" av Society of American Bacterio-logists (II 50~18). Observasjoner med hensyn til morfologiske karakteristika for S. griseus 20129 vedrorer kulturer inkubert i 2 - 3 uker ved 26°C. som har nådd god utviklingstilstand. Streptomyces griseus 20129 danner på alle forannevnte kulturmedia et gulaktig grått vegetativt mycelium ofte med en strek av gronngrått eller gronngråbrunt, særlig på organiske media. Dets luftmycelium som er kraftig og pulverlignende i utseende, er meget lyst gulgrått i farve, og går ofte i retning av gronnaktig. Den danner sfæriske til ovale sporer som måler 0,7 - 1,0 p x 0,8 - 1, 3 u. Disse sporer utvikles på filamenter som er rette eller svakt bolgeaktige og som aldri vikler seg opp til spiraler. De punkter på hvilke den adskiller seg fra arten Streptomyces griseus beskrevet i Bergey's Manual er de folgende: (a) Produksjon av gronnaktig grått til gronnaktig brunt pigment som farver mer eller mindre alle eller bare visse partier av det vegetative mycelium ved dyrkning på glucose-peptonagar eller skummet melk. (b) Dyrkning på potet gir dannelse av et gråaktig brunt eller sortaktig-brunt til olivenbrunt pigment som farver poteten. (c) I motsetning til stammen som er beskrevet av Waksman og Henrici, :reduserer ikke Streptomyces griseus 20129 nitrater til nitriter.

På alle andre media er den iakttatte opptreden for Streptomyces griseus120129 identisk med den for Streptomyces griseus som beskrevet i Bergey's Manual.

Ved å folge metoden til Pridham og Gottlieb (Journal of Bacteriology 56, 107 - 114, 1948), er det blitt fastslått at Streptomyces griseus 20129 anvender de folgende stoffer som carbonkilder: xylose, arabinose, glucose, galactose, fruktose, mannose, maltose, trehalose, cellobiose, dextrin, stivelse, glykogen, glycerin, adonitol og manitol. Ramnose, fukose, sorbose, sucrose, raffinose, inulin, arythritol, dulcitol, sorbi-tol og inositol utnyttes ikke. Lactose utnyttes moderat og gir bare en langsom og ufullstendig vekst av Streptomyces.

Som nitrogenkilder utnytter Streptomyces griseus 20129 de folgende stoffer: (NH^J^SO^, adenin, adenosin, urinstoff, aspargin, glycin, alanin, valin, glutaminsy re, arginin, lysin, threonin, - m ethionin, fenylalanin, tyrosin, prolin og histidin. Natriumnitrat, natriumnitrit, uracil, acet-amid, creatin, creatinin, taurin, sarcosin og hydroxyprolin utnyttes ikke.

Ifblge oppfinnelsen er det fremskaffet en fremgangsmåte for fremstilling av antibiotikumet 11072 RP som består i å dyrke Streptomyces griseus 20129 (NRRL 2986) på er næringsmedium som inneholder en kilde for assimilerbart carbon, en kilde for assimilerbart nitrogen, mineralsalter og, eventuelt, vekstfaktorer og skille antibiotikumet 11072 RP som dannes fra kulturen,.

Dyrkningen kan utfores efter alle metoder for overflate eller neddykket aerob kultur, men sistnevnte foretrekkes av hensiktsmessighetsgrunner. For dette formål kan de forskjellige apparattyper som nå almindelig anvendes i fermenteringsindustrien, anvendes.

Særlig kan den folgende behandlingsrekkefolge anvendes:

Fermenteringsmediet skal i det vesentlige inneholde en assimilerbar kilde for carbon og en assimilerbar kilde for nitrogen, uorganiske

salter og, hvis onsket, vekstfremmende midler. Alle disse elementer kan innarbeides i form av veldefinerte stoffer eller som kompleksblan-dinger slik som de finnes i biologiske stoffer av forskjellig opprinnelse.

Som assimilerbare kilder for carbon kan carbohydrater slik som glucose, dextriner eller stivelse eller annet carbon, hydrogen- og oxygenholdige stoffer slik som sukkeralkoholer, f. eks. glycerol og mannitol, eller visse organiske syrer, f. eks. melkesyre, sitronsyre og vinsyre, anvendes. Visse animalske eller vegetabilske oljer, slik som spekk og soyaolje, kan med fordel erstatte disse forskjellige carbon-, hydrogen-og oxygenholdige stoffer eller tilsettes til dem.

Hensiktsmessige kilder for assimilerbart nitrogen er meget varierte. De kan være meget enkle kjemiske stoffer slik som nitrater, uorganiske og organiske ammonium salte r, urinstoff og aminosyrer. De kan også tilfores ved komplekse stoffer som inneholder nitrogen hovedsakelig i form av protein, f. eks. kasein, laktalbumin og gluten og deres hydro-lysater, soya-, jordnbtt- og fiskemel, kjbttekstrakter, gjærekstrakter, "Distillers' solubles" og maisstdp.

Blant de uorganiske stoffer som tilsettes, kan visse ha en puffrende eller noytraliserende virkning slik som alkalimetall- og jordalkalimetall-fosfater eller calcium- og magnesiumcarbonater. Andre bidrar til den ionlikevekt som er nodvendig for utviklingen av Streptomyces og dannel-sen av antibiotikumet, slik som alkalimetall- og jo rdalkalimetallklorider og -sulfater. Dessuten virker visse av dem mere spesielt som aktiva-torer for de metaboliske reaksjoner av Streptomyces, og disse er sal-tene av zink, kobolt, jern, kobber og mangan.

pfi for fermenteringsmediet ved begynnelsen av dyrkningen skal være mellom 6,0 og 7,8, fortrinnsvis 6,5 til 7. Den optimale temperatur for fermenteringen er 25 - 27°C, men en tilfredsstillende produksjon oppnås ved temperaturer mellom 23 og 35°C. Luftningen av mediet kan varieres mellom temmelig vide grenser. Det er dog blitt funnet at luft-ningshastigheter på 0,3-2 liter luft pr. liter suppe pr. minutt gir særlig gode resultater. Det maksimale utbytte av antibiotikum oppnås efter 2-5 dagers dyrkning, og tiden er avhengig av i det vesentlige det anvendte medium.

Fra de foranstående anforsler vil det sees at de generelle betingelser for dyrkning av mikroorganismer for fremstilling av antibiotikum 11072 RP kan varieres sterkt og tilpasses enhver spesiell omstendighet.

Antibiotikumet 11072 RP kan isoleres fra fermenteringsmediene ved forskjellige metoder. Fermenteringsmediet kan forst filtreres ved en pH

mellom 2 og 9 i nærvær av et filtreringshjelpemiddel. Aktivitetsnivået i filtratet er praktisk talt uavhengig av pH. For å gjore de efterfolgen-de behandlinger lettere er det imidlertid vanligvis foretrukket å filtrere kulturen ved en pH mellom 4 og 6.

Antibiotikumet kan derpå ekstraheres fra filtratet ved hjelp av en me d vann ikke blandbar alifatisk alkohol som inneholder fire eller fem car-bonatomer slik som n-butylalkohol eller en blanding av amylalkoholer,

en aromatisk alkohol slik som benzylalkohol, et keton slik som methyl-isobutylketon, en ester slik som ethyl- eller amylacetat, eller et klo-rert opplosningsmiddel slik som kloroform éller diklorethan. Denne ekstraksjon kan også utfores ved en pH mellom 2 og 9, men det er vanligvis foretrukket å arbeide ved en pH mellom 2 og 6 for å oppnå de beste betingelser for industriell praksis. Den organiske opplosning som inneholder antibiotikum 11072 RP konsentreres derpå til et lite volum. Tilsetningen av et dårlig opplosningsmiddel for 11072 RP, slik som-hexan- eller diisopropylether, gir da den delvise eller fullstendige bunn-felling av det rå antibiotikum i overensstemmelse med konsentrasjons-graden og de anvendte opplosningsmidler.

Når bunnfellingen av det rå antibiotikum ikke er fullstendig, kan moder-væskene fores gjennom en kolonne av aluminiumoxyd som fortrinnsvis,

men ikke nødvendigvis, inneholder ca. 1 kg aluminiumoxyd pr. liter opplosning. Efter vaskning av kolonnen med et dårlig opplosningsmiddel •'for antibiotikumet, slik som hexan- eller diisopropylether, elueres antibiotikumet som blir tilbake i kolonnen, med ett eller flere av de gode opplosningsmidler som er nevnt foran, slik som methanol, ethanol, kloroform og ethylacetat. Den organiske opplosningen som inneholder antibiotikumet konsentreres derpå til et lite volum som gir, hvis onsket efter tilsetningen av et dårlig opplosningsmiddel, slik som diisopropylether, bunnfellingen av resten av det rå antibiotikum.

Det rå antibiotikum oppnådd ved de forannevnte behandlinger er ikke all-tid direkte krystalliserbart. Det er ofte fordelaktig forst å underkaste det en rensning som, under visse betingelser, kan lede direkte til det rene krystallinske antibiotikum. Rensningen kan utfores ved enhver av de anvendte klassiske metoder, særlig ved kromatografi på forskjellige adsorberingsmidler eller ved motstromsfordeling. Det er særlig fordelaktig å utfore en kromatografi i kloroform over aluminiumoxyd. Det rensede antibiotikum kan krystalliseres eller omkrystalliseres ved opplosning i et opplosningsmiddel, fortrinnsvis kloroform, under svak opp-varmning og derpå avkjoling for å fremkalle krystallisering, eller med opplosning i eri stor me ngde av et dårlig opplosningsmiddel, fortrinnsvis diisopropyle the r, o g langsom krystallisering ved om giv els e stemperatur. Det skal forstås at de forskjellige metoder som er beskrevet foran kan anvendes suksessivt i variert rekkefolge eller gjentas flere ganger ifolge produksjonskravene for å oppnå antibiotikum 11072 RP i en form egnet for de tilsiktede anvendelser.

Det folgende eksempel viser hvordan oppfinnelsen kan utfores i praksis. I det folgende ble aktiviteten bestemt ved en diffusjonsmetode, med Mycobacterium sp. ATCC 607 som prOveorganisme, ved sammenligning med en ren krystallinsk prOve av produktet som standard. Denne aktivitet uttrykkes' derfor i mikrogram (ug) for standard krystallinsk produkt pr. mg. for faste produkter.

Eksempel

Et 170 liters fermenteringskar satses med folgende:

pH for det slik oppnådde medium justeres til 6,95 med konsentrert natriumhydroxydopplosning (HO cm ). Mediet steriliseres ved å fore damp igjennom ved 122°C i 40 minutter. Efter avkjoling til 26 - 27°C er det endelige volum for suppen 120 liter og pH 6, 60. Mediet podes derpå med 200 cm^ av en kultur av stammen Streptomyces griseus 20129 i en omrort Erlenmeyerflaske. Kulturen i fermenteringskaret luftes med steril luft med en hastighet på 5 m^/time, rdres om med en omrorer med 250 omdreininger pr. minutt og holdes ved en temperatur på 2 6°C.

pH for mediet er mellom 6,40 og 6, 60 i de forste 16 timer og stiger derpå til 7, 50 efter 24 timers dyrkning. Utviklingen av soppen begynner ved ca. den 2Q. tim.e og kulturen er egnet for å pode produksjonskulturen 27 :-,m^r efter srr:tt;r-g.

Produksjonskulturen utfbres i et 800 liters kar som inneholder:

Det slik oppnådde medium med pH 6,45 steriliseres ved at damp av 122"C fb res gjennom i 40 minutter. Efter avkjoling til 26 - 27 C er volumet av suppen 400 liter og pH 6, 55. Mediet podes derpå med 40 liter av foranstående kultur i 170 liters fermenteringskaret og mediet rbres om med en omrbrer med 220 omdreininger pr. minutt, luftes med 15 m^/time steril luft og holdes ved en temperatur på 26 - 27°C.

pH stiger i suksessive trinn til en verdi på 8, 55 med et fbrste trinn til 7 fra 6 til 30 timer, et annet trinn til 7,3 fra 43 til 67 timer, og sti"ger derpå jevnt til 8,40 fra 78 til 115 timer. Til slutt'når pH 8,55 efter 139 timer og fermenteringen stoppes derpå. Produksjonen av antibiotikumet begynner ved ca. 67. time og når sitt maksimum ved 90 timer. Mengden antibiotikum tilstede i mediet er da 26 ug/cm .

Fermenteringssuppen oppnådd foran (380 liter), behandlet som beskrevet i eksempel II i norsk patent nr. 116.2836*r et r^tt produkt (6,8 g). Dette rå produkt (4, 8 g) opplbses i kloroform og renses ved kromatografi over aluminiumoxyd som beskrevet i eksempel III i norsk patent nr. II6.283°8gir et renset produkt (4 g) som, efter krystallisasjon fra diisopropylether som beskrevet i det samme eksempel III, gir rent krystallinsk antibiotikum 11072 RP (3 g) som har en aktivitet på lOOO ug /mg.

Claims (2)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av antibiotikumet 1107.
2. 2 RP, karakterisert ved at Streptomyces griseus 20129 (NRRL 2986) dyrkes i et næringsmedium som inneholder en kilde for assimilerbart carbon,

   en kilde for assimilerbart nitrogen, mineralsalter og eventuelt vekstfaktorer og fraskillelse av antibiotikumet 11072 RP som dannes, fra kulturen.