NO154349B - Fremgangsmate for fremstilling av naeringsproteiner ved dyrking av en sopp av slekten trichoderma - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for fremstilling av næringsproteiner fra sopp eller fra andre fler-cellede organismer, spesielt ved at man anvender en ny flercellet organisme.

Mikroorganismer som bakterier, gjær og sopp spiller en viss rolle ved fremstillingen av matvarer både for mennesker og dyr, ved at de virker gjennom sine enzymer og de brukes for industriell produksjon av organiske forbindelser såsom etanol, eddiksyre, sitronsyre, glycerol, lysin, glutaminsyre, askorbinsyre etc.

Helt fra Pasteurs tid har forskjellige typer mikroorganismer vært dyrket på forskjellige substrater såsom melasse, bagasse, laktoserum, bisulfittvæske etc, for å anrike biprodukter og derved øke produktets biomasse. Nevnte biomasse har spesielt vært anvendt i dyrefor som supplement for å øke innholdet av vitaminer, mineralsalter og proteiner.

Av forskjellige grunner har utviklingen av slike fremgangsmåter vært relativt begrenset. En årsak til den begrensede utviklingen har vært uregelmessig kvalitet, vanskeligheter med å styre dyrkingen og opprettholde velegnede raser av de brukte mikroorganismer, man fikk etterhvert billigere kilder både for proteiner og vitaminer, industriell restrukturering, etter at man oppdaget fossilt brensel som igjen skapte større utvikling innen landbruket.

Imidlertid har man i de siste 20 år igjen fått en opp-blomstring av industriell fremstilling av biomasse. De primære årsaker til dette har vært den siste tids utvikling med hensyn til molekylær biologi, oppdagelsen av mikroorganismer som er istand til å bruke uvanlige energikilder som paraffiner, et økende behov for å rense store mengder indu-strielle væsker eller avløpsvann fra landbruket, et voksende behov for proteiner, utvikling av ny teknologi hvor man prøver å redusere energiforbruket etc.

Det har således siden 1960 vært utført et ganske intensivt arbeid med kultivering av biomasser. Man har anvendt gjær som bruker alkaner, bakterier som oksyderer metanol, spiruliner som vokser på karbonholdige media, forskjellige typer sopp som er istand til å metabolisere forskjellige typer avfallsvæsker.

En rekke prøver med hensyn til næringsinnhold har vært utført på de fremstilte produkter og vist at disse har høy næringsverdi og er helt ufarlige.

Mikroorganismer som er istand til å produsere proteiner er bakterier og sopp (da spesielt gjærsopp og trådformede sopp) og de må ha følgende egenskaper hvis de skal kunne anvendes i industrien:

- god spesifisitet i forhold til substratene,

- kort doblingstid (20 min. til 5 timer),

- høy utnyttelse av energien (100 g karbohydrater =

25 - 32 g proteiner),

- vekst ved de forønskede temperaturer (fra 20 - 50°C),

- vekst ved ekstreme pH-verdier,

- vekst ved lav eller høy konsentrasjon av substratene, - de må ha evnen til maksimalt å uttømme mediet for brukbare substrater (reduksjon av COD og av BOD fra 90 - 98%),

- oppsamling og tørking av biomassen må være enkel,

- proteininnholdet må være høyt (40 - 65%),

- nukleinsyrene og cellevegginnholdet må være lavt,

- de anvendte mikroorganismer må ikke ha patogene egenskaper (virulens og utvikling av toksiner) og de må ikke produsere bakteriociner eller frigjøre uønsket eller ubehagelig lukt, - protein-effekt-kvotienten (P.E.C.) i biomassen må være høy.

Man har nå funnet at også trådformede mikroorganismer kan brukes som matvarer.

Skjønt bakterier og trådformede sopp hittil har vært brukt

i matvareteknologien og for fremstilling av forskjellige metabolitter, såsom vitaminer, aminosyrer, antibiotika, enzymer etc, så er det bare gjær som har vært dyrket for siden å bli brukt som matvarer. Disse gjærtypers evne til å produsere store mengder biomasse er blitt bekreftet ved at man har oppdaget at gjær har evne til å vokse på alkaner. Forskjellige arbeider og undersøkelserhar vært publisert over næringsinnholdet i slike gjærmatvarer.

Den trådformede mikoorganisme som brukes i foreliggende oppfinnelse hører til slekten Trichoderma.

Man har nå funnet at også en slik trådformet mikroorganisme er istand til å øke verdien av visse proteiner, da spesielt proteinsubstrater, med et høyt proteininnhold hvis anvendelse har vært begrenset på grunn av at de inneholder f.eks. tok-siske forbindelser og/eller forbindelser som qj_r dem en viss bitterhet.

Foreliggende fremgangsmåte gjør det således mulig å frem-stille matvareproteiner ved hjelp av denne trådformede mikroorganisme som arbeider på proteinsubstrater. Oppfinnelsen angår også de proteinprodukter man får fremstilt, idet disse består av proteiner som er blitt modifisert (renset, gjort giftfrie eller bitterfrie) i blanding med proteiner fra de trådformede mikroorganismer eller bare proteiner fra disse mikroorganismer.

Foreliggende fremgangsmåte for fremstilling av matproteiner innbefatter at man kultiverer under betingelser som er nevnt nedenfor, en polyfag, trådformet mikroorganisme som er istand til å metabolisere spesielt landbruksprodukter og avfallsprodukter fra matvareindustrien, eller som er istand til å rense, gjøre giftfrie eller eliminere bitterheten i proteinsubstrater.

Foreliggende oppfinnelse angår i henhold til dette en fremgangsmåte for fremstilling av næringsproteiner ved dyrkning av en sopp av slekten Trichoderma i et næringsmedium avledet fra jordbruksprodukter fra biprodukter eller avfallsvæske fra næringsmiddelindustrien eller fra proteinsubstrater som skal økes i verdi, og denne fremgangsmåte karakteriseres ved å dyrke en sopp av arten Trichoderma album, fortrinnsvis soppen med deponeringsbetegnelsen (1-032) ved en temperatur under 28°C idet næringsmediets pH-verdi holdes mellom 3,7 og 4,8, nitrogeninnholdet (atomisk N) justeres til en verdi på 4-5% beregnet på tørrstoffet, og innholdet av oppløst oksygen er fra 6-10 mg/l, og hvor dyrkingen utføres under omrøring som ikke forårsaker lysering av soppen og under betingelser slik at skumming unngås.

Nevnte sopp Trichoderma album som brukes ved fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse er en ny mikroorganisme som nå er deponert ved National Collection of Micro-Organism Cultures ved Pasteur-instituttet i Paris under nr. 1-032, 2. juni 1977. Denne soppen såvel som fremgangsmåten for fremstilling av proteiner vil bli mer detaljert beskrevet i det etterfølgende.

De næringsmedia som kan brukes ifølge foreliggende oppfinnelse består av flytende media inneholdende proteinnitro-gen, aminonitrogen eller uorganisk nitrogen (ammoniakalsk eller nitratnitrogen) som vanligvis er å betrakte som avfallsstoffer. De vil vanligvis være fremstilt ved landbruksprosesser, og forefinnes i forskjellige typer produkter eller biprodukter eller i form av avfallsstoffer fra næringsmiddelindustrien. Disse media kan også være proteinsubstratene hvis verdi det er ønskelig å øke.

Blant egnede landbruksprodukter som kan brukes er mel,

både av hvete, rug, mais, bygg, havre, erter, etc, røtter såsom poteter, artisjokker, maniokk, søtpoteter, sukkerroer,

mV

rødbeter, melasse, gulrøtter, etc, fruktmasser såsom bananer, ananas, appelsiner, epler og forskjellige andre typer frukter, fibrøse produkter som bagasse, ved eller halm. Disse media kan brukes som de er eller de kan pasteuriseres eller steriliseres på forhånd.

Avfallsvæsker fra næringsmiddelindustrien som kan brukes ifølge foreliggende oppfinnelse innbefatter forskjellige typer gjødselsvæsker, avfallsvæsker fra husholdningen, residualt vann, væsker fra hermetikkindustrien, protein-anlegg, destillerier, diffusjonsvann fra sukkeranlegg, produkter fremstilt fra marine organismer, da spesielt fisk og skalldyr (såsom krill). Godt egnet er f.eks. pressvæsker eller konsentrater av oppløselige fiskeproteiner.

Som eksempel kan man nevne proteinsubstrater såsom masser etter rødbeter eller oppløselige fiskeproteinkonsentrater.

Man kan også bruke blandinger av de ovennevnte produkter.

Når proteinsubstratene er slik at man ønsker å øke deres verdi, blir nevnte Trichoderma album dyrket under tidligere angitte betingelser inntil man får eliminert de uønskede egenskapene ved substratene.

Når f.eks. et oppløselig fiskeproteinkonsentrat skal brukes som et næringsmedium og som vanligvis innbefatter bitre stoffer, så kan foreliggende fremgangsmåte brukes inntil proteinsubstratet ikke lenger har noen bitterhet. Proteinsubstratet vil selvsagt også innbefatte Trichoderma album-mycel, og dette kan etter ønske fjernes ved vanlig separering.

Oppløselige fiskeproteinkonsentrater vil vanligvis inneholde ca. 90% protein som har en viss næringsverdi. Det er således ikke nødvendig å omdanne disse fiskeproteinene til Trichoderma album-proteiner. Når man bruker slike substrater, så lar man kun soppen virke så lenge at man får eliminert bitterheten, og dette tidsrom kan lett bestemmes med enkle forsøk i industrien. Undersøkelser har vist at det er tilstrekkelig til å la Trichoderma album utvikle seg i slike media under de ovennevnte betingelser i tidsrom fra 3-5 timer.

Andre proteinsubstrater som kan brukes ifølge foreliggende oppfinnelse er sukkerroe-masse. Sukkerroe-masse har vanligvis ca. 90% vann og dette vann er vanskelig å fjerne og ved de tidligere kjente fremgangsmåter fikk man masser eller presset sukkerroe som inneholdt ca. 80% vann. Man har funnet at det er mulig å la Trichoderma album virke på nevnte masse og man vil etter pressing få masser som kun inneholder 50% vann. Slike produkter kan brukes som for for dyr, da spesielt for storfe.

Man antar at i dette tilfelle vil Trichoderma album ved den hydrolytiske virkning av enzymene eliminere pektiner som finnes i sukkerroe-massen og som i vesentlig grad holder pa vannet.

Det kan være fordelaktig når man bruker et proteinsubstrat av lav kvalitet og ønsker å oppnå et proteinsubstrat med bedret proteinverdi, å gjøre dette ved hjelp av foreliggende oppfinnelse ved først å la Trichoderma album utvikle seg i mediet slik at det først blir renset, gjort giftfritt og siden befridd for sin bitterhet ved hjelp av nevnte sopp, hvoretter man ekvilibrerer mediet ved å tilsette karbohydrater og nitrogen. Man vil derved få et proteinprodukt som består av det modifiserte substrat og en større eller mindre mengde av proteiner fra Trichoderma album alt etter hvor langt man lot soppen utvikle seg og etter hvor meget karbohydrater og andre forbindelser som ble tilsatt mediet.

Når man som næringsmedium bruker media uten næringsverdi, så lar man soppen vokse i dette medium slik at man får ekstra-hert dette maksimalt. Man oppnår deretter proteiner i Trichoderma album. Det er i slike tilfeller viktig å ekvi-librere mediet.

Mengden av tørrstoff i det flytende næringsmediet som brukes ifølge foreliggende oppfinnelse vil vanligvis være betinget av hvor sterkt man ønsker å utnytte mediet. Hvis man får et fullstendig uttømt medium, så vil tørrstoffinnholdet være høyt, men en begrensende faktor er at det oppløste innhold av oksygen må holdes mellom 6 og 10 mg/l i mediet. Uttømningsforholdet for hvert medium kan bestemmes ved veiing, idet man sammenligner vekten av det fremstilte mycel i forhold til det gjenværende tørrstoff.

Nitrogeninnholdet (atomisk N) i næringsmediet må være fra

4 - 5% av tørrstoffet. Teoretisk er 5 g nitrogen nødvendig for å få forbrukt 100 g karbohydrater og få fremstilt ca. 32 g proteiner, og det er følgelig nødvendig å justere nitrogeninnholdet i mediet til en verdi som ligger nær denne teoretiske verdi. Hvis nitrogeninnholdet i næringsmediet er for høyt, må man tilsette karbohydrater, og hvis nitrogeninnholdet er for lavt, så må det tilsettes mer i form av ammoniumsulfat eller NH^nitrat i tilstrekkelig mengde til at nitrogeninnholdet kommer i nevnte område.

De flytende næringsmedia kan oppnås fra forskjellige landbruksprodukter, biprodukter eller fra næringsmiddelindustrien hvor man kan bruke avfallsvæsker, f.eks. ved den fremgangsmåte som er vist på fig. 1 som illustrerer fremstillingen av Trichoderma album-proteiner.

For at oppfinnelsen lettere skal kunne forstås er et apparat til bruk ved fremgansmåten ifølge oppfinnelsen mer detaljert beskrevet med henvisning til de vedlagte tegninger hvor: Fig. 1 viser et strømningsdiagram for en utførelse av fore-liggende fremgangsmåte for fremstilling av proteiner fira Trichoderma album.

Fig. 2 viser diagrammessig et fermenteringsapparat.

Fig. 3 viser en annen utførelse av fermenteringsapparatet.

Ifølge denne fremgangsmåte blir produktene, biproduktene eller avfallsstoffende underkastet én eller flere oppmalinger eller én eller flere homogeniseringer og forskjellige separasjoner. De resulterende faste fraksjoner kan så behandles på vanlig kjent måte for innvinning av humusstof-fer som kan brukes som gjødningsmidler. De flytende fraksjoner oppsamles, konsentreres og hvis nødvendig pasteuriseres eller steriliseres og deres nitrogeninnhold justeres til mellom 4 og 5% av tørrstoffet før de underkas-tes foreliggende fremgangsmåte. Det innvundne mycel tørkes og behandles slik at man får et proteinmel inneholdende 50 - 65% proteiner, og de resulterende væsker brukes som gjødnings-stoffer eller som enzymsupplering.

pH-verdien i kulturmediet må ligge mellom 3,7 og 4,8 og holdes på denne verdi under hele kultiveringen. Det har vist seg at en uttømning av mediet vanligvis ikke overstiger 50% hvis det er et raskt fall i innholdet av oppløst oksygen og betydelig variasjon med hensyn til pH-verdien. Det er således meget viktig å holde pH-verdien innenfor de nevnte områder for å oppnå optimal kultivering. pH-verdien opprettholdes automatisk ved dosering eller ved andre til-førselsanordninger som gjør det mulig å tilsette næringsmediet enten en base eller en syre alt etter hvilken pH-verdi man har, og man kan f.eks. bruke natriumhydroksyd, saltsyre, svovelsyre eller en annen egnet syre eller base.

På samme måte er det nødvendig at innholdet av oppløst oksygen ligger mellom 6 og 10 mg/l, fortrinnsvis ca. 8 mg/l.

Trichoderma album-kulturen produseres ved temperaturer

under 28°C, fortrinnsvis mellom 24 og 28°C. Trichoderma album vil ikke lenger utvikle seg ved temperaturer over 28°Cf mens man på den annen side får meaet lav vekst ved temperaturer under 24°C. Det er følgelig fordelaktig å anvende en temperatur innenfor området fra 24 - 28°C.

Dyrkningen må utføres med forsiktig røring, dvs. én røring som ikke hemmer veksten av mikroorganismen og hvor man ikke får en oppløsning av denne.

Trichoderma album-kulturene kan fremstilles i rørte kar eller i fermenteringskar, så lenge man opprettholder de ovennevnte driftsbet.ingeIser. Det skal imidlertid be-merkes at vekslen av mikroorganismene ved nedsenkede kulturer i fermenteringskar vanligvis er meget rask og man får en mer komplett ekstraksjon av media hvis man får en skikkelig gjennomluftning, en god røring og eller god forøkning på soppen.

De typer fermenteringskar som brukes for å dyrke bakterier og gjær er ikke effektive for utvikling av trådformede sopper. Det vanskeligste problem er røring, gjennomluftning og forøkning.

Mens gjær og bakterier tåler kraftig røring, så vil veksten av Trichoderma album i vesentlig grad bli hemmet ved røre-hastigheter over 150 omdr./min., og mikroorganismen løser seg opp ved 400 omdr./min. Dette er en meget viktig begrensende faktor ettersom det vanligvis ikke er mulig å opprettholde innholdet av oppløst oksygen ved 4 mg/l ved en røring som er mindre enn 100 omdr./min.

Betydelig gjennomluftning (fra 1 til 3 liter luft pr. liter medium pr. minutt) kan i seg selv ikke opprettholdes for

mer enn 3-6 timer ved et innhold av oppløst oksygen på

5 mg/l. Foruten at man trenger store luftvolum, vil en videre forøkning av soppen være meget vanskelig under slike forhold.

Under fermenteringen vil også skumdannelse være et problem.

I slike tilfeller må man tilsette antiskumningsmidler, men disse må ikke være av silikontypen.

Blandinger av vegetabilske oljer og fettsyresalter har bare gitt passe gode resultater.

Det er følgelig nødvendig å modulere røringen, gjennomluftningen og tilsetningen av antiskumningsmidlet for å få

et tilfredsstillende kompromiss.

For å oppnå dette tilfredsstillende kompromiss, har man ut-viklet et nytt fermenteringsapparat.

Fermenteringsapparatet består av følgende elementer: en fermenteringsanordning, tilførselsanordninger for oksygen og anordninger for å hindre en videre forøkning av soppen. Videre innbefatter apparatet reguleringsanordning for temperaturen, pH-verdien og innholdet av oppløst oksygen.

Fermenteringsanordningen må innbefatte et langsomt system

for blanding av myclet og dyrkningsmediet, og et slikt blande-system kan f.eks. være en gruppe av perforerte trau hvor mycelet finnes og hvor nevnte trau plasseres parallelt og forbundet ved hjelp av et system som gjør at trauene kan beveges i dyrkningsmediet.

Oksygentilførselsanordningen må være egnet for tilførsel av oksygen til mediet, og fordelaktig kan man bruke en kammersentrifuge som gjør at man kan tilføre oksygenet utenfor selve fermenteringsanordningen. Videre kan man bruke andre apparater såsom sentrifugepumper, ventureblandere eller statiske blandere eller oksygenkolonner når man bruker forskjellige resirkuleringssystemer, noe som vil være avhengig av substratene og deres konsentrasjon.

Antiformeringsanordningene må tillate en resorbsjon av det skum som dannes, f.eks. i en kammersentrifuge. Disse anordninger må muliggjøre dannelsen av en væskekolonne som ligger over den anordning man bruker for å tilføre oksygen, og hvis det er nødvendig, kan den kompletteres med vanlige kjemiske og mekaniske anordninger.

Anordningen kan brukes for dyrking av bakterier av gjær og for trådformet sopp. Hvis man dyrker sistnevnte organismer, er det nødvendig å anvende anordninger for å hindre tetning, og disse kan bestå, f.eks., av et ekspansjonskar eller pneumatiske anordninger eller et kontinuerlig ytre filter f.eks. under vakuum. De utskilte mikroorganismer blir i et slikt tilfelle igjen tilført fermenteringsanordningen ved hjelp av en pumpe eller et transportbelte. Skjønt slike anordninger vanligvis ikke er nødvendig ved dyrkning av gjær og bakterier, så er det ofte fordelaktig å plasere et ekspansjonskar mellom fermenteringsanordningen og anordning-ene for tilførsel av oksygen.

En utførelse av et fermenteringsapparat hvor man, dyrker trådformede sopp vil nå bli beskrevet detaljert med henvisning til fig. 2, som er en diagrammessig skisse av apparatet, og til fig. 3, som er en spesiell utførelse med en modifikasjon.

Fermenteringsapparatet består av et sylindrisk kar 1 hvis bunn fortrinnsvis er traktformet og utstyrt med et uttaksrør 2. Karet 1 innbefatter gjennomluftningsanordninger 3 som muliggjør en gjennomlufting av dyrkningsmediet ved begynnelsen av dyrkningen. Videre inngår en gruppe perforerte trau 4 som er forbundet ved hjelp av et underlag 5 og støtteanord-ninger 6. Underlaget 5 er forbundet med et eksentrisk system 7 som drives av en motor 21 som gjør at trauene kan beveges opp og ned. Det eksentriske systemet og gruppen av perforerte trau utgjør en for for rører som gjør at mycelet kan heves over væskenivået. Det er selvsagt klart at dette røresystemet kan erstattes med et tilsvarende system. Det er f .eks. mulig, å bruke et røresystem som vist på fig. 3-. Dette systemet som utgjør en modifikasjon av det forannevnte system består av en gruppe trau 4 forbundet med en horisontal akse 5 som drives med en roterende bevegelse, f. eks. i den retning som er angitt med pulen.

Fermenteringskaret 1 innbefatter også et rør 8 for fjerning av gasser (luft og karbondioksyd). Dermenteringsanordningen er forbundet med et ekspansjonskar 9 via et rør 10 med stor diameter. Røret 10 er plasert slik at den ene enden er i forbindelse med fermenteringsanordningen og utstyrt med en sil 11 og en lukkeventil 12. Ekspansjonskaret 9 innbefatter en sil 13. Nevnte kar er forbundet med kammersentrifugen 14 ved hjelp av røret 15 som eventuelt har en bøy 20, hvor det i nevnte rør er plasert en sirkuleringspumpe 16

og et lufttilførselsrør 17. Kammersentrifugen 14 er forbundet med karet 1 gjennom rør 18 som løper inn i øvre del av kar 1.

Gjennom passasje 17 er det mulig å tilføre luft hvis dette er nødvendig.

Røret 18 må nødvendigvis ha større diameter enn tilførsels-røret til sentrifugen og må ligge over nevnte sentrifuge for å få dannet en væskekolonne for å unngå formering, og på denne måten blir det skum som eventuelt måtte være dannet resorbert i den oppstigende del av røret 18. Ved hjelp av forannevnte apparat kan en blanding av dyrkningsmediet og mikroorganismen Trichoderma album langsomt produseres ved en hastighet på ca. 15 - 30 bevegelser pr. minutt ved hjelp av nevnte system av perforerte trau 4

som hever mycelet over væskenivået.

Under de tre til fire første timene av dyrkningen ut-

føres gjennomluftningen gjennom bunnen av karet ved hjelp av gjennomluftningsanordningen 3, og dette utføres ved begynnelsen for å unngå passasje av den trådformede soppen og en vekst i ekspansjonskaret, og når mycelet har kommet i sin eksponensielle fase, åpnes ventil 12, sirkuleringspumpen 16 og kammersentrifugen 14 blir så startet, og man får en væskestrøm gjennom røret 18 som gjør at man får fjernet skum i den oppstigende del av væskekolonnen. Mediet tilført nytt oksygen føres inn i fermenteringskaret 1 ca. 30 cm over væskenivået, og det øvre trau i blandeordningen vil helle et svakt lag av skum over i mediet. De to silene 13 og 11 gjør at næringsmediet kan filtreres og at mycelet holdes i fermenteringsanordningen. Strømningshastighetene reguleres som en funksjon av oksygenkravet. Ved hjelp av denne anordning er det mulig å holde mediet på et egnet oksygennivå (fra 6-10 mg/l) og sikre optimal vekst av mikroorganismen og maksimal utnyttelse av kulturmediet.

Apparatet muliggjør en kontinuerlig dyrkning og i et slikt tilfelle er silene delvis åpne, og de mycel som oppsamles i sentrifugen fjernes ved vasking eller spyling, og den del av væsken som fjernes erstattes med nytt næringsmedium.

Apparatet, som muliggjør en effektiv oksygentilførsel til dyrkningsmediet og holder formeringen nede på et egnet nivå, er meget godt egnet også for dyrkning av bakterier og gjær. Fermenteringsapparatet er således et fermenterings-

apparat generelt for mikroorganismer.

Ved dyrkning av bakterier og gjær vil varierende mengder

av mikroorganismene føres over i sentrifugen ved begynnelsen: av dyrkningen og disse føres på ny inn i fermenteringsanordningen vev spyling, og under kontinuerlig dyrkning vil de bli oppsamlet og den væskemengde som fjernes kan erstattes med nytt dyrkningsmedium.

Fermenteringen ifølge foreliggende: oppfinnelse for fremstilling av proteiner kan utføres kontinuerlig eller por-sjonsvis.

Når fermenteringen utføres pors jonsvis., blir ca. 9/10

av kulturen tatt ut mellom 15 og 20 timer etter begynnelsen av dyrkningen, og disse 9/10 av kulturen blir erstattet med nytt ferskt pasteurisert medium. I mange tilfeller vil det være mulig å resirkulere væskene..

Det proteinprodukt som fremstilles ved hjelp av foreliggende fremgangsmåte kan fordelaktig oppsamles, eller høstes, som angitt på det nedenforstående diagram.

Etter uttak blir mycelet innvunnet ved filtrering, f ..eks. ved hjelp av en filterpresse eller annet egnet filtrer-ingsapparat. Etter filtrering blir kulturen p-resset til en mycelkake som1 inneholder fra 30 - 50 vek-% tørrstoff. Denne mycelkaken tørkes., males hvis nødvendig og opparbeides for konservering eller transport.

Torkingen av proteinproduktet, f.eks. ved frysetor-ring, forstovningstorking, fluidisering eller ved en bånd-torker eller en pneumatisk torker er meget rask. Disse torkeprosesser muliggjor en produksjon av matvarer med utmerket kvalitet hvor man ikke har noen levende celler.

På den annen side vil statiske torkeprosesser endre næringsinnholdet i produktet. Således vil plasmolyse frigjore aminosyrer og enkle glucidinstrukturer som reagerer ved hjelp av den såkalte "Maillard"-reaksjonen. Man må således unngå statiske torkeprosesser.

Ved uttaket av filterpressen vil proteinproduktet som inneholder Trichoderma album-mycel inneholde individuelle trådformede deler. Ved tørkning vil strukturen bli meget sprø og vil brekke spontant. Når proteinproduktet består bare av proteiner fra tørt og malt mycel, så vil dette være i form av hvitt pulver hvis tetthet varierer fra 0,6 - 0,9. Dette pulveret er meget lett fuktbart og er uten smak og lukt. Visse dyrkningsmedia kan imidlertid gi det en viss spesifikk smak eller lukt.

Mikroskopisk er ingen mycelstruktur mulig å observere. Man vil bare finne enkelttyper hvis dimensjoner varierer innen 5-50 yum i lengde.

Proteiner fra Trichoderma album fremstilt ved hjelp av foreliggende fremgangsmåte vil i form av et pulver inneholde fra 50 - 65% protein.

Prosentvis sammensetning av aminosyresammensetning i

mycelet fra Trichoderma album fremstilt ved hjelp av foreliggende oppfinnelse vil i tørket form ha den sammensetning som er angitt i tabellene I og II nedenfor.

I tabell II er det angitt sammensetningen av andre proteinprodukter fremstilt ved kjente fremgangsmåter. Proteinprodukter som består av en blanding av proteiner fira substratet og fra mycelet vil ha et proteininnhold som vil variere etter substratets utgangspunkt og mengden av mycel.

Som nevnt tidligere er den rasen av Trichoderma album som er brukt i foreliggende oppfinnelse en ny rase av trådformet sopp, og den er blitt utvalgt ved laboratoriet til "Institut National de la Recherche Agronomique". Fremgangsmåten for utvelgelse av rasen er detaljert beskrevet i norsk søknad nr. 834665. Den kan brukes både på bakterier, streptomyces og andre sopp, da særlig phycomyceter (Rhizopus); basidiomyceter (Ustilago, Corticium, Fornes, Taphrina, Sclerotinia, Rhabdo-cline, Phacidiella, Epichloe, Nectria, Ophiobolus, Endothia); adelomyceter (Phoma, Ascochyta, Septoria, Collectorichum, Gloeosporium, Monilia, Sterigatocytis, Gliocladium, Geotri-chum, Acrostalagmus, Trichoderma Botrytis, Cephalosporium, Verticilium, Trichothecium, Aspergillus, Penicillium, Fusa-rium, Cldosporium, Pullularia, Torula, Thielaviopsis, Alterna-ria, Cercospora, Sporodesmium, Helminthosporium, Epicoccum, Graphium).

Det vil i det etterfølgende bli gitt en viss oversikt over soppenes taksonomi og biologi.

Soppene hører til kryptogamene og er eukarotiske, thallofyt-iske og ikke-klorofyllhoIdige planter.

Det er kjent mer enn 100000 arter av sopp og de er karakterisert ved en rekke forskjellige former som varierer fra enkeltceller (gjær) til mer komplekse organiske fruktlegemer (cepes). Det er betydelige forskjeller med hensyn til størrelse og utseende, struktur, metabolitisk aktivitet og livsform.

Man kan vanligvis skille mellom saprofytiske sopp, patogene sopp, symbiotiske sopp og mykorhizasopp.

Hos mikroorganismene kan man cytolotisk utskille en kjerne, mitochondrier, vacuoler, fettkuler og glykogen. Celleveggen består av cellulose, pektin, callose og chitin. Sopp-protoplasmaet kan bevege seg og det kan således få fra den sentrale delen som kan bli vacuolisert, mot periferien.

På thallus vil det så etterhvert bygge seg opp reproduserende elementer (sporer), mens man i visse tilfeller får en enkel fragmentering (arthrosporer) eller knoppdannelse (som hos gjærsoppene).

Sporene kan også utvikles med sterkt differensierte fruktifi-kasjonsorganer såsom en hatt hos hattsoppene eller et perithecium hos pyrenomycetene.

Sporene, hvis dannelse innbefatter en foregående sammen-smeltning av to forenlige kjerner, følges av en reduksjons-deling som sikrer seksuell og en såkalt perfekt reproduksjon.

Klassifikasjon av sopp er basert på typen av vegetativt thallus, og kan være følgende:

1) plasmodialt som hos slimsoppene,

2) cellelært eller trådformet som hos de virkelige soppene.

I sistnevnte annen gruppe kan man skille mellom følgende to grupper: a) Lavere sopp (siphomyceter eller phycomyceter eller algesopp) hvor man bare har én flercellet lang trådformet celle. Trådene vokser og grener seg uten at de blir oppdelt og uten at det blir såkalt anastomose. Cytoplasmamassen og kjernene vil flyte fritt inne i den trådformede cellen.

Algesoppene formerer seg ved såkalte encystiske eggceller

(oosporer, zygosporer) som dannes på mycelet etter en konjugering mellom frie gameter eller mellom mer eller mindre differensierte trådformede seksuelle organer. b) Høyere sopp eller septomyceter (ascomyceter, hemi-ascomyceter, basidiomyceter og imperfekte sopper).

Disse soppene har et mycel som består av distinkte mikroskopiske tråder (hyfer). Grenede hyfer som ligger nær hverandre kan ofte ha anastomose, men er aldri organisert til et vev, og hyfene er oppdelt i segmenter ved hjelp av skillevegger, og nevnte celler kan ha én eller flere celle-kjerner. Disse tverrveggene har ofte en gjennomgang som gjør at man kan sirkulere protoplasma og kjerner fra én celle til en annen. Det skjer ofte at man får anastomose mellom hyfer fra samme art eller nærstående arter og dette letter såkalt heterocaryose. En heterocaryose vil være en forening i samme mycel av kjerner med forskjellige genetiske muligheter, enten på grunn av at de er dannet ved såkalte muteringer eller ved at de har oppstått på forskjellige organismer.

Høyere sopp vil vanligvis produsere sine seksuelle sporer i distinkte fruktlegemer. Differensieringen av de seksuelle elementene er vanligvis svak og man får kun en enkel konjugering av nærstående kjerner i ikke-spesialiserte hyfer, og dette fører til dannelsen av asco-sporer som finnes i asci eller til basidiosporer som produseres utenpå et basidium. Hos de imperfekte soppene vil reproduksjonen være a-seksuell og dette skyldes mangel på en forenlig partner, og formering utføres ved hjelp av canidisporer.

Selve formeringen hos sopp er således langt mindre komplisert enn hos de høyere planter. Imidlertid har sopp en over-raskende plastisitet og man har kunnet observere at tallrike individueller i en populasjon kan ha forskjellige genetiske muligheter. I slike individuelle organismer har man funnet det mulig å ta ut de individer som har interes-sante karakterer og som kan utnyttes på en rekke måter, spesielt er dette blitt utført ved fremstillingen av næringsholdige biomasser.

Indikasjoner på slektskapet mellom Trichoderma album og slekten Trichoderma er som følger.

Slekten Trichoderma hører til klassen imperfekt filamentøs fungi (adelomycetes = hyphomycetes), til ordenen Moniliales og til familien Moniliaceae.

Det forgrenede eller fordelte mycel er hvitt til lysegrønt

av farve. Konidiene, som vanligvis er grønne, er isolerte, runde og monocellulære; de bæres av verticilliar conidiophore.

Trichoderma er saprofytiske organismer i jordbunnen. De an-sees fordelaktige fordi de i mange tilfeller er antagonistiske mot phytopatogen fungi. De produserer mange enzymer og antibiotika.

Klassifiseringen av fungi er basert på makroskopiske og mikroskopiske morfologiske karakterer av isolerte individer, spesielt når de ikke har seksuelle former, og dette er tilfelle med slekten Trichoderma.

Den makroskopiske og mikroskopiske morfologi for parentale Trichodermaviride, dennes økologi og produksjonen av antibiotiske metabolitter klassifiserer den uten tvil til slekten Trichoderma.

Den mikroskopiske morfologi for Trichoderma album som er oppnådd ved seleksjon er identisk med den til Trichoderma viride, kun den hvite farve og fraværet av produksjonen av antibiotika skiller den fra forløperen. Prøver på hybridi-sering av desoksyribonucleinsyrer (DNA) fra Trichoderma album med de fra Trichodermaviride og Trichoderma polysporum viser således at man arbeider med beslektede mikroorganismer, den samme manipulering med verticillium alboatrum og Acrostalagmus aphidum er negativ.

De følgende eksempler illustrerer oppfinnelsen.

Eksempel I

Dyrking i en fermenteringsanordning

I dette eksempel bearbeidet man et flytende dyrkningsmedium inneholdende 60 eller 90% tørrstoff (gram pr. volum) og avledet henholdsvis fra melkeserum, fra alfalfasaft, fra hvetemel, proteinholdige væsker, potetsaft, maisvæske (macereringsvann fra stivelsesfabrikker hvor man fremstilte stivelse fra mais) og fra sukkerroemelasse.

Man brukte et fermenteringsapparat som beskrevet. I kar 1 tilførte man 100 1 medium og 10 1 Trichoderma album fremstilt ved dyrkning i et omrørt kar. Under de 3 - 5 første timene av dyrkningen ble karet gjennomluftet ved hjelp av gjennomluftningsanordningen 3 som i dette tilfelle bestod av et sirkulært rør med huller og en lufttilførselsanordning. Mengden av tilført luft var slik at mediet inneholdt mellom 6 og 10 mg oppløst oksygen pr. liter. Temperaturen i mediet ble holdt mellom 24 og 28°C og pH-verdien ble holdt mellom 3,7 og 4,8 ved hjelp av en syre eller en base.

Da mycelet var i sin eksponentielle fase ble ventil 10 åpnet og man startet sirkulasjonspumpe 15 og sentrifugen 12. Oksygentilførselen via sentrifugen ble regulert slik at man holdt oksygeninnholdet på samme verdi som nevnt ovenfor. Etter 15 - 20 timers dyrking ble mycelet oppsamlet ved frafiltrering og ble presset i en filterpresse og man fikk fra 7 - 9 kg mycelkake inneholdende 50% tørrstoff. Denne kaken ble så tørket på en "Hatmaker" valse og så fryse-tørret til et mel inneholdende 57 - 65% protein. Den prosentvise sammensetning av produktene som man fikk med hvert enkelt medium samt deres sammensetning i aminosyrer er som angitt i tabell I og II. Mengden av tørrstoff som ble fremstilt og som var igjen i mediet etter 10 og 20 timer er angitt i tabell IV.

Eksempel II

Dyrking med rører

Trichoderma album ble dyrket med en rører (150 omdr./min.) i Erlenmeyer-kolber på 500 ml som inneholdt 100 ml medium. Mediet innbefattet pr. liter fra 40 -70 g tørrstoff justert til 3% N, utgangs-pH-verdi var 4,5. Varigheten av dyrkingen var fra 20 — 40 timer ved 2 7°C. Mycelet ble høstet ved hjelp av en filterpresse og deretter frysetørket.

De midlere resultater er angitt i tabell III.

Under de ovennevnte driftsbetingelser var det ikke mulig å få en optimalisering av dyrkningen, men ikke desto mindre var utbyttet av mycel utmerket, men ekstraksjonen av mediet oversteg sjelden 50% pg grunn av at man fikk et raskt fall i mengden av oppløst oksygen og en betydelig variasjon i pH-verdien.

Ved hjelp av andre prøver som ble utført som nevnt ovenfor, men hvor man holdt pH mellom 3,7 og<!>4,8 og oppløst oksygeninnholdet mellom 6 og 10 mg/l, fikk man en god optimalisering .

Eksempel III

Sammenligning ved dyrking i en fermenteringsanordning som beskrevet og dyrking i et tradisjonelt fermenteringsapparat I dette eksempel ble dyrkingen av Trichoderma album utført

på det medium som er definert i eksempel I og under de driftsbetingelser som er beskrevet i eksempel II. Dyrkings-mediet inneholdt 60 og 90 o/oo tørrstoff, pH-verdien ble holdt på 4,5 og temperaturen på 27°C. Mengden av tørrstoff som ble fremstilt og som var igjen etter 10 og 20 timers dyrking ble målt. Resultatene er angitt i tabell IV.

Resultatene i tabell IV viser at man fikk utmerkede resultater ved hjelp av apparatet som beskrevet. På den annen side viste det seg at dyrking utført på tradisjonell måte, dvs. i et fermenteringsapparat tilpasset kultivering av bakterier, gjær eller lignende, for fremstilling av antibiotika, enzymer etc, bare ga gode resultater på to substrater, nemlig laktoserum og hvetemel.

Konklusjonen er følgelig at det ved hjelp av apparatet som beskrevet er mulig å oppnå en høyere produksjon av biomasse og en bedre ekstraksjon av mediet.

Eksempel IV

Næringsverdien i Trichoderma album- mycel

Næringsverdien i Trichoderma album-mycel fremstilt som beskrevet i eksempel I ble sammenlignet med næringsverdien i melkekasein, i soyakake, sesamkake, i sjampinjonger og i rå lupinfrø.

Forholdet mellom vektøkning og fruktprotein (CEP) ble bestemt på unge sultede hann-SPF-rotter av Sprague Dawleyrasen, varigheten av eksperimentet var 17 døgn og proteininn-

holdet i maten var 10%. Hver diett ble sammensatt slik at man fikk passende tilførsel av de begrensende essentielle aminosyrer. Hver eksperimentgruppe innbefattet 20 dyr.

Sammensetningen av dietten og de oppnådde resultater er vist

i tabell V.

Analyse av resultatene i tabell V viser at proteinene fra Trichoderma album har en næringsverdi som er lik melkekasein supplert med metionin og høyere enn det man fant i kokt soyakake og sesamkake.

Den lave proteinutnyttelseskoeffisienten i rå lupinfrø skyldes visse faktorer som motvirker oppsugningen i frøene. Med hensyn til den lave næringsverdien for sjampinjonger hos rotter, så skyldes dette det høye innhold av karpofor i celleveggene.

Eksempel V

Øking av verdien i oppløselige fiskeproteinkonsentrater Et oppløselig fiskeproteinkonsentrat ble brukt som ble titrert til en verdi på 90% proteiner i tørrstoffet. Dette konsentrat ble oppløst i 4 volumdeler vann (vekt/volum).

I apparatet som beskrevet tilsatte man 30 liter av den konsentrerte oppløsning som definert ovenfor og tilsatte fra 1-2 liter Trichoderma album oppnådd ved en dyrking under røring.

Temperaturen ble holdt på 24 - 28°C og pH-verdien ble holdt mellom 3,7 og 4,8.

Periodevis ble prøver tatt ut for å bestemme bitterheten i det oppløselige fiskeproteinkonsentratet. Reaksjonen ble stoppet da konsentratet ikke lenger hadde bitter smak, dvs. etter 3-5 timer.

Produktet var en blanding av konsentratet og mycelet som det var mulig å utskille ved filtrering eller sentifugering hvis ønskelig.

I ovennevnte laboratorieforsøk brukte man som utgangsmateri-ale et oppløselig fiskeproteinkonsentrat som ble oppløst i vann for å oppnå et flytende næringsmedium. I praksis er det mulig å la Trichoderma album virke direkte etter en papainhydrolyse etter utskillelse av uoppløselige stoffer. På denne måten unngår man et tørketrinn og et unødvendig oppløsningstrinn.

Eksempel VI

Rensing av sukkerdiffusjonssafter

Diffusjonssafter som var oppnådd fra tørre sikorirøtter vil vanskelig utkrystallisere seg på grunn av urenheter som f.eks. i fenoler og aminosyrer.

Hvis man i foreliggende fremgangsmåte bruker en slik diffusjonssaft, så vil man på den ene side få en renset saft som lett lar seg utkrystallisere og som følgelig forenkler den etterfølgende sukkerfremstillingsteknologi, og på

den annen side får man også Trichoderma album-proteiner. Den anvendte soppen vil forbruke alt nitrogen som er tilstede som urenheter i nevnte saft, og karbohydratene og mycelet man fikk har samme egenskaper som angitt i tabell I.

Hvis man f.eks. bruker eh diffusjonssaft som inneholder 17% tørrstoff og inneholder 1% nitrogen av det tørkede stoff, så er det mulig på den ene side å oppnå en renset saft som inneholder 15% tørrstoff, og på den annen side fra 15 - 20 g/l av diffusjonssaften av Trochoderma album-mycel som inneholder 50% proteiner.

Man kan også bruke melasse som er et biprodukt fra sukker-industrien, og man kan der oppnå en proteinfraksjon som inneholder fra 50 - 65% proteiner og en bedret utkrystal-lisering av sukker.

Claims (2)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av næringsproteiner ved dyrking av en sopp av slekten Trichoderma i et næringsmedium avledet fra jordbruksprodukter, biprodukter eller avfallsvæske fra næringsmiddelindustrien eller fra proteinsubstrater som skal økes i verdi, karakterisert ved å dyrke en sopp av arten Trichoderma album, fortrinnsvis soppen med deponeringsbetegnelsen (1-032),ved en temperatur under 28°C idet næringsmediets pH-verdi holdes mellom 3,7 og 4,8, nitrogeninnholdet (atomisk N) justeres til en verdi på 4 - 5% beregnet på tørrstoffet og innholdet av oppløst oksygen er fra 6-10 mg/l, og hvor dyrkingen utføres under omrøring som ikke forårsaker lysering av soppen og under betingelser slik at skumming unngås.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at temperaturen holdes mellom 24 og 28°C.