CH639693A5 - Procede pour l'obtention de souches de microorganismes convenant notamment pour la production de biomasses. - Google Patents
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Description
La présente invention a pour objet le procédé défini dans la revendication 1, pour l'obtention de souches de microorganismes convenant notamment peur la production de biomasses.
L'espèce Trichoderma Album mise en œuvre dans un procédé pour l'obtention de protéines alimentaires qui fait l'objet d'un autre brevet, est une espèce nouvelle de champignons filamenteux qui a été sélectionnée dans les laboratoires de l'Institut National de la Recherche Agronomique. Le procédé de sélection de la souche, qui sera décrit ci-après, fait partie du cadre de l'invention. Il peut également être mis en œuvre avec des bactéries, des streptomyces et d'autres champignons, notamment les phycomycètes (Rhizopus); les basidiomycètes (Ustilago, Corticium, Fomes, Taphrina, Sclerotinia, Rhabdocline, Phacidiella, Epichloe, Nectria, Ophio-bolus, Endothia); les adelomycètes (Phoma, Ascochyta, Sep-toria, Colletotrichum, Gloeosporium, Monilia, Sterigmato-cystis, Gliocladium, Geotrichum, Acrostalagmus, Trichoderma, Botrytis, Cephalosporium, Verticilium, Trichothe-cium, Aspergillus, Pénicillium, Fusarium, Cladosporium, Pullularla, Torula, Thiealaviopsis, Alternaria, Cercospora, Sporodesmium, Helminthosporium, Epicoccum, Graphium).
Les milieux de culture sélectifs mis en œuvre dans le procédé de l'invention sont choisis en fonction des critères gênants de la souche sauvage que l'on1 eut faire disparaître.
Sous un aspect plus détaillé, le procédé selon la présente invention consiste:
1) à inoculer les milieux sélectifs choisis avec une souche sauvage;
2) à incuber chaque culture dans les conditions ci-après:
a) à 27°C pendant un jour,
b) à 37°C pendant 2 jours à l'obscurité puis pendant 2 jours à la lumière,
c) à 27°C pendant 2 jours;
3) à exposer ensuite aux rayons ultraviolets (250 nm) les souches blanches et vigoureuses provenant de chaque culture effectuée sur les milieux sélectifs, pendant 2 heures à 4°C.
4) à repiquer les souches sur le milieu «STARON»,
5) à incuber les cultures résultantes deux jours à 37°C plus deux jours à 27°C après avoir éliminé, avant la diminution de température de 37 à 27°C, les souches qui poussent;
6) à cultiver lesdites souches sur le milieu liquide et agité de STARON pendant 2 jours à 25°C,
7) à procéder à des prélèvements stériles,
8) à mixer en présence d'acridine orange les souches les plus performantes riches en protéine, pauvres en glycosa-mine et antibiotiques;
9) à incuber les souches résultantes sur le milieu STARON pendant 2 jours à 27°C,
10) à procéder à des microisolements et
11) à incuber 2 jours les souches résultantes à 27°C; les souches ainsi obtenues sont soumises à nouveau au cycle défini ci-dessus, (étapes 1 à 11), pendant un nombre de cycles suffisant pour obtenir une souche possédant les caractéristiques souhaitées.
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Il est également possible de faire subir aux souches un cycle partiel.
En effet, les critères gênants que l'on veut éliminer disparaissent en général les uns après les autres; il n'est donc pas nécessaire de maintenir dans le cycle de sélection l'étape visant à éliminer ledit critère; il est à la portée de l'homme de l'art de déterminer, grâce aux contrôles effectués au cours de chaque cycle, les etapes à maintenir et celles à supprimer.
Dans le procédé selon l'invention, mis en œuvre pour former le Trichoderma Album, on utilise un lot de 11 milieux de culture; huit milieux sont constitués d'une solution minérale à pH = 6.8 contenant les constituants ci-après:
KH2PO4 = 1 g; MgSC>4, 7H20 = 0,5 g;
KCl = 0,2 g; CaCh = 0,2 g;
FeSO-t, 7H:0 = 0,03 g; ZnSC>4,7H:0 = 0,01 g;
CuSOj, 5H2O = 2 mg;
eau distillée: quantité suffisante pour 100 ml; gélose 20 g, à laquelle on a ajouté les composés suivants:
Milieu 1 ): 30 g de glycérol + 2 g d'urée
Milieu 2): 20 g de saccharose + 3 g d'allantoïne
Milieu 3): 20 g d'amidon + 5 g de sulfate d'ammonium
Milieu 4): 20 g de glucose + 7 g de tyrosine
Milieu 5 j: 5 g de pectine de pommes + 7 g d'acide anthrani-lique
Milieu 6): 20 g d'amidon + 5 g de nitrate de sodium Milieu 7): 10 g de mannitol + 8 g de caséine lactique.
Milieu 8):20gd'acidegluconique + 10 g de gélatine.
Le milieu 9 est le «milieu STARO N» contenant du glucose = 20 g; de la peptone = 6 g; de l'extrait de levure = 1 g; du Corn-Steep = 4 g; du NaCl = 0,5 g: MgSCh, 7 H2O = 0,5 g; KH2PO4 = 1 g; FeSC>4,7H2O = 10 m g; eau distillée, quantité suffisante pour 11; gélose = 20 g pour milieux solides.
Le milieu 10 est constitué de pommes de terre nutritives et le milieu 11 est du lactosérum à 40 g/1.
Comme on l'a indiqué précédemment, on peut soumettre les cultures à des cycles partiels; par exemple, dans le cas de Trichoderma Viride, on peut soumettre chaque culture effectuée sur chacun des onze milieux aux étapes 1 à 4, procéder ensuite à une incubation pendant 2 j ours à 27°C, puis à des microisolements pour sélectionner *es souches blanches et vigoureuses, et ensuite à une incubation, pendant encore 2 jours à 27°C, de ces souches blanches et vigoreuses; les souches ainsi obtenues sont ensuite inoculées aux onze milieux sélectifs et on recommence les cycles partiels ou complets; les cycl-'s complets comprenant les étapes 1 à 11 ).
Les cycles partiels ou complets du procédé selon la présente invention sont représentés schématiquement sur la figure 1.
Les méthodes de contrôle effectuées tout au long des cycles représentés sur la figure 1 sont notamment:
- le titrage de la glycosamine après hydrolyse du mycélium dans HCl 6 N et résolution dans un auto-analyseur connu sous la dénomination commerciale «Technichon TSMi»;
- le titrage microbiologique des peptides antibiotiques, de la trichodermine et de la gliotoxine après extraction par le n-butanol;
- la mesure de l'intensité de la Plasmolyse (séchage à 60°C, broyage et détermination de la fraction soluble dans l'eau à pH = 8);
- la pesée de la matière sèche produite et la détermination de son taux de protéines par microkjeldahl;
- la détermination pondérale de la quantité de matière sèche consommée dans le milieu.
Les incubations effectuées à 27°C selon le procédé de l'invention sont toujours réalisées à la lumière naturelle. Lorsqu'il est précisé que les incubations sont réalisées à 37°C à la lumière, il s'agit d'une lumière blanche d'une intensité de 2 à 300 watts au mètre carré.
Les microisolements effectués au cours du procédé selon la présente invention consistent à séparer les hyphes à l'aide d'un microscope optique.
Le nombre de cycles à effectuer dépend de la souche originelle et des caractéristiques souhaitées. Les méthodes de contrôle permettent de déterminer si ces caractéristiques sont atteintes.
Selon le procédé de sélection de la présente invention, on peut obtenir des souches nouvelles possédant des caractères intéressants, exploitables dans de nombreux domaines, notamment pour la production de biomasses alimentaires.
Le procédé a été notamment appliqué avec succès à Trichoderma Viride, Fusarium roseum, Bauveria Tenella, Trichoderma polysporum, Aspergillus oryzae et est illustré par les exemples ci-après.
D'autres exemples d'application du procédé de sélection ont été mentionnés précédemment.
L'invention va être maintenant décrite plus en détail dans les exemples illustratifs non limitatifs qui sont donnés ci-après:
EXEMPLE I
Sélection de la souche Trichoderma Album
Par le procédé de sélection selon la présente invention, on a isolé, à partir de Trichoderma Viride, la nouvelle espèce Trichoderma Album qui est mise en œuvre dans le procédé d'obtention des protéines selon la présente invention.
L'espèce Trichoderma Album possède peu de parois; elle ne produit pas d'antibiotiques ni de pigments diffusibles contrairement à l'espèce Trichoderma Viride dont elle dérive. Elle ne possède pas d'hyphes colorés et thermophiles.
Le genre Trichoderma appartient à la classe des champignons filamenteux imparfaits (adélomycètes = hyphomy-cètes), à l'ordre des Moniliales et à la famille des Moniliacae.
Le mycélium, cloisonné, ramifié, est de couleur blanche à vert clair. Les conidies, généralement vertes, sont isolées, rondes, monocellulaires; elles sont portées par des conidio-phores verticilliés.
Les Trichoderma sont des organismes saprophytes des sols. On considère qu'ils sont bénéfiques, car ils sont fréquemment antagonistes de champignons phytopathogènes. Ils produisent de nombreuses enzymes et des antibiotiques.
Cette nouvelle espèce a été obtenue par le procédé de sélection selon l'invention.
Après 1400 cycles (partiels ou complets) réalisés selon le cycle représenté sur la figure 3, on a abouti à une souche de Trichoderma polyphage performante, inoffensive, dont le mycélium possède une valeur nutritionnelle élevée pour les animaux.
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L'élimination des caractères gênants recélés par la souche originelle et la sélection très poussée des performances et des qualités alimentaires confirment très bien les potentialités génétiques exceptionnelles que possèdent les champignons.
L'espèce Trichoderma Album isolée possède, comme cela 5 apparaît clairement dans le tableau VI ci-après, une vitesse de multiplication et une efficience énergétique élevées. Cette nouvelle espèce possède peu de parois cellulaires, un indice de Plasmolyse à chaud élevé. Par ailleurs, elle ne possède pas d'hypes producteurs de peptides antibiotiques, de gliotoxine, 10 de trichodermine et de pigments; elle ne comporte pas d'individus thermophiles et à mycélium coloré. Par ailleurs, elle s'hybride très mal avec son ancêtre, ce qui confirme qu'il y a eu restructuration génétique.
Dans le tableau VI, on a indiqué les résultats d'analyse réa- 15 lisés sur les cultures au bout de 100,300,1000 et 1400 cycles selon le procédé, ainsi que les résultats d'analyses effectuées sur la couche Trichoderma Viride originelle.
La souche Trichoderma Album peut être conservée par repiquages. 20
EXEMPLE II
Application du procédé de sélection selon l'invention aux souches Fusarium roseum, BauveriaTenella, Trichoderma polysporum, Aspergillus orizae. 25
Le procédé de sélection des microorganismes selon l'invention est applicable à l'amélioration d'autres microorganismes (champignons, levures, bactéries); il a permis de sélectionner des germes possédant des propriétés spécifiques bien définies. Dans chaque cas, il suffit de bien choisir les critères de 30 sélection, les milieux de culture, et d'utiliser les techniques de contrôle adéquates.
Par ce procédé, on a obtenu:
- un Trichoderma polysporum antagoniste des champignons phytopathogènes,
- un Fusarium roseum systémique, non pathogène et amenant une protection des plantes contre les fusariums phytopa-4(1 thogènes,
- des Aspergillus flavus ne produisant pas d'Aflatoxines,
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- un Pénicillium coconeum producteur d'arômes du fromage de chèvre,
- des Streptomyces producteurs d'antibiotiques hybrides,
- des bactéries et des Streptomyces producteurs d'endo-peptidases,
- des Acrostalagmus aphidum hyperpathogènes pour les pucerons.
Le tableau VII illustre quelques résultats.
Les résultats du tableau VII montrent qu'à partir de matériel biologique de différentes provenances, il est possible d'atteindre des objectifs très divers et très précis. La sélection des caractères intéressants choisis et l'élimination des propriétés gênantes sont plus ou moins longues selon les microorganismes sauvages essayés. Quelque fois, les obstacles sont importants, et il sera préférable de changer la souche originelle pour atteindre le but fixé. Dans tous les cas des résultats intéressants sont obtenus.
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TRICHODERMA POLYSPORUM Protection du haricot contre Colletothri-cum, Lindemuthianum nombre de plantules protégées en %
ASPERGILLUS FLAVUS mg d'aflatoxines produites par litre de milieu de culture
FLUSARIUM ROSEUM Protection du pois contre les fusariums pathogènes nombres de plantules protégées en %
STREPTOMYCES AUREUS mg d'endopeptidase produite par litre de milieu de culture
STREPTOMYCES GR1SEUS producteur de nigéricine mg de la grisorixine et de nigéricine produites par litre
Claims (2)
1 ) plasmodial chez les myxomycètes,
1) à inoculerdes milieux sélectifs avec une souche sauvage;
2) à incuber chaque culture dans les conditions ci-après:
a) à 27°C pendant un jour,
b) à 37°C pendant 2 jours à l'obscurité puis pendant 2 jours à la lumière,
c) à 27°C pendant 2 jours;
3) à exposer ensuite aux rayons ultraviolets (250 nm) les souches blanches et vigoreuses provenant de chaque culture effectuée sur les milieux sélectifs, pendant 2 heures à 4°C.
4) à repiquer les souches sur un milieu contenant du glucose = 20 g; de la peptone = 6 g; de l'extrait de levure = 1 g, du Corn Steep = 4 g; du NaCl = 0,5 g; MgS04,7H2O = 0,5 g; KH2PO4 = 1 g FeSC>4,7H2O = 10 mg; eau distillée: quantité suffisante pour 1 1;
5) à incuber les cultures résultantes deux jours à 37°C puis deux jours à 27°C, après avoir éliminé, avant la diminution de température de 37 à 27°C, les souches qui poussent;
6) à cultiver les dites souches sur un milieu comme défini dans l'étape 4, liquide et agité, pendant 2 jours à 27°C;
7) à procéder à des prélèvements stériles;
8) à mixer en présence d'acridine orange les souches les plus performantes riches en protéines, pauvres en glycos-amine et antibiotiques;
9) à incuber les souches résultantes sur un milieu comme défini dans l'étape 4), pendant 2 jours à 27°C;
10) à procéder à des microisolements; et
11) à incuber 2 jours les souches résultants à 27°C; les souches ainsi obtenues sont soumises à nouveau au cycle défini ci-dessus, étapes 1) à 11), pendant un nombre de cycles suffisants pour obtenir une souche possédant les caractéristiques souhaitées.
4. Procédé selon la revendication 1, de sélection de Tricho-derma Album à partir de Trichoderma Viride, caractérisé en ce que les milieux sélectifs mis en œuvre sont au nombre de 11 parmi lesquels huit milieux sont constitués d'une solution minérale à pH = 6,8 contenant les constituants ci-après: KH2PO4 = 1 g; MgS04,7H2O = 0,5 g; KCl: 0,2 g; CaCk = 0,2 g FeS04,7H2O = 0,03 g: ZnSC>4,7H2O = 0,01 g; CuSCU, 5H2O = 2 mg; eau distillée: quantité suffisante pour 1000 ml; gélose = 20 g, à laquelle on a ajouté les composés suivants:
milieu 1) 30 g de glycérol + 2 g d'urée milieu 2) 20 g de saccharose + 3 g d'allantoïne milieu 3) 20 g d'amidon 4- 5 g de sulfate d'ammonium milieu 4) 20 g de glucose + 7 g de tyrosine milieu 5) 5 g de pectine de pommes + 7 g d'acide anthrani-lique,
milieu 6) 20 g d'amidon + 5 g de nitrate de sodium milieu 7) 10 g de mannitol + 8 g de caséine lactique milieu 8) 20 g d'acide gluconique + 10 g de gélatine,
le milieu 9 contient du glucose = 20 g; de la peptone = 6 g; de l'extrait de levure = 1 g, du Corn Steep = 4 g; du NaCl = 0,5 g; MgS04,7H2O = 0,5 g; KH2PO4 = 1 g FeSÛ4,7H2O = 10 mg; eau distillée: quantité suffisante pour 1 1; gélose = 20 g pour milieux solides; le milieu 10 est constitué de pommes de terre nutritives et le milieu 11 est du lactosérum à 40 g/1.
5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que les cultures sont soumises à des cycles partiels qui comprennent les étapes 1 à 4 définies dans la revendication 2, suivies des étapes qui consistent à procéder ensuite à une incubation pendant 2 jours à 27°C, puis à des microisolements pour sélectionner les souches blanches et vigoureuses et ensuite à une incubation, pendant encore 2 jours à 27°C, de ces souches blanches et vigoureuses, les souches ainsi obtenues étant ensuite inoculées aux onze milieux sélectifs et soumises à un cycle complet ou partiel.
6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que les souches sauvages sont choisies parmi les bactéries, les streptomyces et les champignons, notamment les phycomycètes: Rhizopus; les basidiomycètes: Ustilago, Cor-ticium, Fomes, Taphrina, Sclerotinia, Rhabdocline, Phaci-diella, Epichloe, Nectria, Ophiobolus, Endothia; les adelo-mycètes: Phoma, Ascochyta, Septoria, Colletotrichum, Gloeosporium, Monilia, Sterigmatocystis, Gliocladium, Geotrichum, Acrostalagmus, Trichoderma, Botrytis, Cepha-losporium, Verticillium, Trichothecium, Aspergillus, Pénicillium, Fusarium, Cladosporium, Pullularia, Torula, Thiela-viopsis, Alternaria, Cercospora, Sporodesmium, Helmin-thosporium, Epicoccum, Graphium.
7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que les souches sauvages sont choisies parmi: Trichoderma Viride, Fusarium roseum, Bauveria Tenella, Trichoderma polysporum et Aspergillus orizae.
8. Microorganisme obtenu par le procédé selon la revendication 1.
9. Microorganisme selon la revendication 8, obtenu par le procédé selon l'une des revendications 2 à 7.
10. Microorganisme selon la revendication 8 ou 9, caractérisé en ce qu'il est Trichoderma Album.
Les champignons appartiennent au monde des végétaux cryptogames, eucaryotes, thallophytes, non chlorophylliens.
Plus de 100 000 espèces de champignons sont connues;
elles se caractérisent par une très grande pluralité de formes, qui va de la cellule individualisée (levures) jusqu'à l'organisation complexe des carpophores (cèpes). Il y a des différences considérables de taille, d'aspect, de structure, d'activités métaboliques, de mode de vie.
On distingue des champignons saprophytes, des champignons pathogènes, des champignons symbiotiques, des champignons mycorhiziens.
Chez les microorganismes, on distingue cytologiquement un noyau, des mithochondries, des vacuoles, des globules lipidiques, du glycogène. Les parois cellulaires sont consti2
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tuées de cellulose, pectines, callose, chitine. Le protoplasme fongique est doué de motilité, il se déplace de la partie centrale, qui se vacuolise, vers la périphérie.
Le thalle édifie des éléments reproducteurs (les spores), à genèse parfois très simple: fragmentation, (arthrospores) ou bourgeonnement (chez les levures).
Les spores peuvent aussi être élaborées par des organes de fructification très différenciés tels que le chapeau des agarics ou le périthèce des pyrénomyeètes.
Les spores, dont la formation implique la fusion préalable de deux noyaux compatibles, suivie d'une division réduction-nelle, assurent la reproduction sexuée ou parfaite.
La classification des champignons est basée sur la nature du thalle végétatif, qui peut être:
1. Procédé pour l'obtention de souches de microorganismes convenant notamment pour la production de biomasses, caractérisé en ce qu'il consiste à cultiver une souche sauvage sur des milieux de culture sélectifs, à incuber les cultures dans des conditions de température et d'éclairement spécifiques, à les exposer ensuite aux rayons ultraviolets, à procéder à des microisolements et à mélanger les souches améliorées.
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on mélange les souches améliorées en présence d'acridine orange.
3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il consiste:
2) cellulaire ou filamenteux chez les eumycètes
Dans ce deuxième groupe, on distingue:
a) les champignons inférieurs (siphomycètes ou phycomy-cètes) chez lesquels il n'y a qu'une cellule filamenteuse géante multinuclée. Les filaments s'allongent et se ramifient sans se cloisonner et en général sans s'anastomoser. La masse cyto-plasmique et les noyaux s'écoulent librement à l'intérieur des parois tubulaires.
Les phycomycètes se reproduisent par des oeufs enkystés ( oospores, zygospores) formés sur le mycélium à la suite d'une conjugaison entre gamètes libres ou entre organes sexuels filamenteux plus ou moins différenciés.
b) Les champignons supérieurs ou septomycètes (ascomy-cètes, hémiascomycètes, basidiomycètes, champignons imparfaits).
Ces champignons possèdent un mycélium constitué par des filaments microscopiques (les hyphes). Les hyphes ramifiés, juxtaposés, anastomosés, mais jamais organisés en tissus, sont divisés en segments uni - et plurinuclées, par des cloisons transversales. Ces diaphragmes, souvent incomplètement fermés, permettent la circulation du protoplasme et des noyaux d'une cellule à l'autre. Les anastomoses sont fréquentes entre hyphes d'une espèce ou d'espèces affines, ce qui favorise l'hétérocaryose. L'hétérocaryose consiste en la réunion dans un même mycélium de noyaux porteurs de potentialités génétiques différentes soit parce qu'ils résultent de mutations, soit parce qu'ils proviennent d'organismes différents.
Les champignons supérieurs produisent généralement leurs spores sexuées dans ou sur des organes de fructification localisés. La différenciation de leurs éléments sexuels est généralement faible et la fécondation tend à se manifester simplement par la conjugaison de noyaux appariés dans des filaments non spécialisés; elle conduit à la formation d'ascos-pores contenues dans des asques ou de basidiospores produites sur des basides. Chez les champignons imparfaits, la reproduction est asexuée, faute sans doute de partenaire compatible: la multiplication se fait par conidies.
Le monde des champignons est moins vaste que celui des plantes. Toutefois, les caractères biologiques de ces microorganismes leurs confèrent une étonnante plasticité et l'on a observé que de très nombreux individus recèlent les potentialités génétiques d'une nouvelle race ou espèce. Chez ces individus, on a trouvé qu'il est possible de soustraire les inconvénients et d'extraire des caractères intéressants, exploitables dans de nombreux domaines, notamment pour les productions de biomasses alimentaires.
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