NO123738B - - Google Patents

Description

Fremgangsmåte til fremstilling av pimaricin.

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for biosyntetisk fremstilling av et nytt antibiotikum, som har fått navnet pimaricin, og ved hjelp av en hittil ukjent streptomycesart. I denne hensikt fremstilles en kultur av Streptomyces natalensis nov. spee, hvis egenskaper vil bli beskrevet i det følgende, ved den aero-biske metode og under passende betingel-

ser, og produktet pimaricin, hvis egenska-

per også vil bli beskrevet i det følgende, dannes i fermenteringsmediet. Det nye antibiotikum utvinnes på fordelaktig måte av-kulturvæsken og/eller myceliet ved ekstraksjon med en alkohol som bare delvis blander seg med vann, f. eks. butanol eller ved behandling med metanol (en metanol-oppløsning av kalsiumklorid), konsentre-ring av ekstrakten og rensning ved hjelp av et oppløsningsmiddel.

Mikroorganismen, som forårsaker dan-nelsen av det foreliggende antibiotikum ble isolert fra en jordprøve fra Pieter Maritz-burg, i provinsen Natal, Sydafrika. Det er en actinomycet av streptomycesslekten, og kalles Streptomyces natalensis. Den er de-ponert i Type Culture Collection of the Northern Regional Research Laboratories

at Preoria, U.S.A. under katalognr. NRRL 2051. Mikroorganismen har følgende morfologiske og fysiologiske egenskaper:

Morfologiske egenskaper:

Hyfene er forgrenet og ujevnt tvunnet, ofte praktisk talt rette og parallelle med hverandre i vekstsonen, har en tykkelse av 0,3 — 0,7 [x, har vanligvis jevn tykkelse, men ofte lokale fortykkelser. De sporedan- nende hyfer har form av sidegrener med feste ved luftmyceliet. Sporene har form av ujevne bølgeformede kjeder og danner sjelden løst tvundne spiraller. Sporene er atskilt fra hverandre med korte mellomlig-gende deler uten protoplasma og har oval, rund eller mandarinliknende form med en størrelse av 0,7 — 1,2 x 0,7 — 0,8 |x.

Kulturens egenskaper ved dyrking på

de nedenstående substrater (etter 7 dagers forløp ved 25° C, hvis ikke anderledes angis):

Uavreagar :

God vekst. Det vegetative mycelium og baksiden er fargeløs. Etter 28 dager noen få kolonier ved rørets bunn og topp. På baksiden graf arget («chamois»), etter 57 dager litt mørkere («warm buff»). Kolonien er praktisk talt flat, enkelte kolonier noe høyere på midten. Blekt musegrått («pale mouse gray») til lyst musegrått («light mouse gray») pulverformet og filtet luftmycelium, som etter 28 dagers forløp blir mellomgrått («one third gray») og etter 57 dager mørkere grått («drab gray»). Jordliknende noe sur lukt. Ingen oppløse-lige pigmenter.

Potetagar:

Moderat vekst. Det vegetative mycelium har en lys mineralgrå («light mineral gray») til blek brungul («pale olive buff») farge. Baksiden: kremfarge («cream color»), etter 57 dager mørkere («cream buff to chamois»). Koloniene er fuktige og delvis dekket av et svakt hevet, luftmycelium. Luftmyceliet, som etter 7 dager er hvitt og filtet, etter 28 dager mellomgrått («drab gray») dekker 30—70 pst. av kolonien. Ingen oppløselige pigmenter. Jordaktig ubehagelig lukt.

Potet:

God vekst. Det vegetative mycelium er fuktig og noe hevet og klumpet og har en blek rødlig brungul («pale pinkish buff») til rødlig brungul («pinkish buff») farge, som etter 28 dager går over til en mørk brungul farge som oliven («deep olive buff»). Etter 28 dager er glassveggens bak-side brunfarget («chamois»). Etter 7 dager intet luftmycelium. Etter 28 dager en god del luftmycelium, som først er hvitt, deretter blekt musegrått («pale mouse gray») og etter 27 dager mellomgrått («drab gray»). Poteten er ikke misfarget etter 7 dager, etter 57 dager er den på samme måte som væsken på rørets bunn misfarget og har fått en mørk brungul farge («buffy brown»).

Sabouraudglucoseagar:

Middels vekst. Vegetativt mycelium, klumpet, hevet, etter 7 dager en lysebrun olivenfarge («olive buff») som på baksiden, etter 28 dager er mørkere («deep olive buff to dark olive buff»). Baksiden nu leirfarget. Luftmyceliet er hvitt, kort og filtet og deretter blekt musegrått. Ingen synlige, opp-løselige pigmenter etter 7 dager, men etter 57 dager er fargen middels rødbrun («medium auburn»).

Emerson agar:

Meget god vekst. Vegetativt mycelium, olivenfarget («olive buff»). Baksiden mør-kere («cream buff to chamois»). Ingen oppløselige pigmenter. Luftmyceliet kort og filtet, hvitt. Ingen oppløselige pigmenter. Sterk jordaktig lukt.

Stivelse agar:

Middels vekst. Det vegetative mycelium og baksiden er blekt lysegul som oliven («pale olive buff»). Kolonien svakt hevet, omtrent halvparten dekket av filtet, hvitt luftmycelium. Ingen oppløselige pigmenter. Sterkt jordaktig lukt.

Glukosenitratagar:

God vekst. Runde, fuktige, grå kolonier, svakt hevet i midten, ca. 2 til 2,5 mm's diameter, fargen er blek olivenbrun («pale olive buff»). Luftmyceliet sparsomt, i form av punkter eller konsentriske ringer, filtet, hvitt. Ingen oppløselige pigmenter. Jordaktig lukt.

Natriumcitrat agar:

Meget sparsom vekst: Runde, fuktige, grå kolonier, svakt hevet i midten, ca. 1 mm i diameter. Lysere enn blek lysebrun olivenfarge («pale olive buff»). Baksiden blek lysebrun olivenfarge («pale olive buff»). Intet oppløselig pigment.

N æring sagar:

God vekst. Kolonien er fuktig, svakt hevet, meget liten, i form av meget små, våte knudrete og matte totter, med små og utydelige langaktige forhøyninger, hvit til lysegul kremfarge («cream color to cream buff»). Ubehagelig lukt. Intet oppløselig pigment.

Czapek agar ( 13 dager) :

Meget sparsom vekst. Klart gjennomsiktig vegetativt mycelium. Intet luftmycelium. Intet oppløselig pigment.

Bacto agar 2 % :

Meget sparsom vekst, først synlig etter 13 dager. Klart gjennomsiktig vegetativt

mycelium. Intet luftmycelium. Intet opp-løselig pigment.

Organismen som ifølge oppfinnelsen brukes for fremstilling av pimaricin til-hører streptomycesslekten og er ikke iden-tisk med noen hittil beskrevet streptomycesart. Som det fremgår av ovenstående i detalj angitte egenskaper tilhører den gruppe 1 i Waksmans gruppeinndeling i Bergey's Manual (se også S. A. Waksman «The Actinomycetes», 1950, side 30).

Streptomyces natalensis nov. spee. kan også klassifiseres i Baldacci's «Neo-Ingri» rekke (se Symposium Actinomycetales, VI Congr. Intern. Microb. Rom, 1953, side 31). Det bemerkes at navnet Streptomyces natalensis nov. spee. ikke utelukkende er be-grenset til actinomycetes, som på en stereo-typ og rigorøs måte svarer til den her gitte beskrivelse, men at uttrykket også omfatter alle beslektede stammer, som generelt har de samme spesifikke egenskaper og frembringer det nye antibiotikum, pimaricin. Det dekker også mutanter av Streptomyces natalensis, som kan fåes av denne ved hjelp av alle midler eller stoffer som bevirker mutasjon, f. eks. bestråling eller behandling med stoffer med giftvirkning.

Det nye antibiotikum, pimaricin, er hovedsaklig aktivt likeoverfor saprofytiske og parasitiske fungi og gjærsopper.

Tabell II gir en oversikt over pimaricins virkning på gjærsopper og fungi som er uten patoligisk virkning på mennesker. For hver av disse arter angis den pimaricin-konsentrasjon i mikrogram/ml i nærings-midlet som nettopp er istand til å stanse gjærsoppens vekst.

Tabell III angir på samme måte for-holdet likeoverfor et antall gjærsopper og fungi med patologisk virkning på mennesker.

Det fremgår av ovenstående tabeller bl. a. at pimaricin har en utpreget virkning på fytopatogene fungi, f. eks. Verti-cillium, Cladosporium og Fusarium .Virk-ningen på Candida albicans er også meget sterk.

Et annet meget viktig trekk ved det nye antibiotikum er at pimaricin har en meget liten fytotoksisk virkning, i mot-setning til de fleste andre hittil kjente fun-gicide antibiotika. Det nye antibiotikum er derfor meget egnet til bruk i aker- og hagebruk og for bekjempelse av plante-sykdommer, dette så meget mere fordi det dif funderer lett og virker systematisk.

Pimaricin vil således trenge inn i f. eks. erter (Pisum sativum) etter neddykking i en fortynnet vandig oppløsning. Dette fremgår av at pimaricin kan ekstraheres fra de behandlede erters cotyledoner og spirer.

Tabell IV a og b viser den indre desin-fiserende virking. Myceliumsopper (blant disse Ascochyta pisi) drepes i frøet.

Inngående prøver viste at primaricin i en konsentrasjon av 75 deler pr. million som er effektiv fungicid, ikke har noen skadelig innvirkning på ertenes spireevne og plantens vekst (se tabell IV c og d).

Alle data i disse tabeller angår erte-sorten Eminent, som er overordentlig føl-som overfor Ascochyta pisi.

Forsøk med rotter og mus viser en meget lav giftvirkning. For å bestemme pimaricins akutte giftvirkning på hvite rotter fikk rottene et materiale, som inneholdt 985 mikrogram/mg, og resultatet ble notert etter 7 dagers forløp.

Med pimaricin i vann fikk man f01-jgende resultater:

Pimaricin irriterer hverken hud eller slimhinner.

I en ren tilstand er pimaricin en hvit krystallinsk amfotær forbindelse, hvis salter kan fremstilles på vanlige måter. Med FeCl., gir det ingen fargereaksjon, men med kons. fosforsyre en lyserød ustabil farge. Konsentrert saltsyre og svovelsyre frembringer en blå og olivengrønn misfarg-ning. Bromvann avfarges. På grunn herav og også med henblikk på det infrarøde og det ultrafiolette spektrum (se nedenfor) må pimaricin betraktes som et av de såkalte polyene antibiotika. Det er meget lite oppløselig i vann, nemlig 8 mg i 100 ml ved 20° C. Det er lettere oppløselig i organiske oppløsningsmidler, særlig i alkoholer med 1 til 6 kullstoffatomer, f. eks. metanol og n-butanol og i celluloseoppløsningsmid-ler. Videre er det oppløselig i pyridin, dimetylformamid, dimetylacetamid, iseddik og alkalihydroksyd. I alifatiske kullvann-stoffer, som pentan, heksan, cykloheksan og liknende er det praktisk talt uoppløselig.

Ved værelsestemperatur er pimaricin en meget stabil forbindelse. En oppløsning i vann (15 mg i 100 ml) beholder sin fulle aktivitet i 7 dager ved pH — 7,0 ved 25° C. Ved pH = 2 mister samme oppløsning 50

pst. av sin aktivitet i løpet av 3 dager ved samme temperatur og ved pH = 10 i løpet

av 6 dager. Ved høyere temperaturer er oppløsningen mindre stabil. Således vil en oppløsning med ovenstående pimaricin-konsentrasjon i vann og pH = 2 og ved 90° C miste 90 pst. av sin aktivitet i løpet av 15 minutter, ved pH = 6,5 15 pst. og ved pH = 9 50 pst. av sin aktivitet. I metanol er pimaricin stabilt ved høyere (25° —60° C) temperaturer. Pimaricins antibiotiske virkning ble prøvet mikrobiologisk med Saccharomyces cerevisae — Hollands varietet .som prøveorganisme i forhold til et rent standardpreparat.

Pimaricin har intet smeltepunkt, men viser begynnende spaltning ved over 150° C.

Den spesifikke rotasjon

(c = 0,083 pst. i 100 pst. metanol). Stoffets molekylvekt er ca. 727, og antas å ha føl-gende empiriske formel C3.,H-0NOU. Ele-mentaranalysen var følgende: 57,7 pst. C, 7,27 pst. H, 1,95 pst. N og 33,01 pst. O.

Pimaricins ultrafiolette absorpsjons-spektrum har et maksimum ved 290, 304 og 318 m|A med en «topp» ved omtrent 280 og et minimum ved omtrent 250 rri|i (C = 3,93 mikrogram/ml i metanol). En prøve av pimaricin presset inn i en kaliumbromidplate (C = 0,5 pst.) viser følgende infra-røde absorpsjon (i cm-<1>): 3460, 2985, 1721, 1637, 1577, 1441, 1401, 1381, 1275, 1269, 1238, 1192, 1176, 1136, 1109, 1066, 1006, 988, 948, 887, 855, 844, 803, 794 (for de kurtiverte bølgelengder er absorpsjonen sterk til meget sterk.)

Fig. 1 viser grafisk pimaricins infra-røde spektrum i en kaliumbromidplate.

For fremstilling av pimaricin dyrkes Streptomyces natalensis aerobisk i stille-stående kulturer eller neddykket i et flytende næringsmedium under sterile betingelser i lukkete med omrøringsinnretnin-ger utstyrte kar, som under dyrkningen til-føres sterilt surstoff eller luft for luftning.

Dyrkningens varighet, temperaturen og de andre betingelser som må oppfylles for å oppnå gode utbytter av pimaricin be-stemmes eksperimentelt. De vil bli nær-mere diskutert i det følgende.

Næringsmediet kan bestå av de vanlige stoffer. Det må inneholde en kullstoffkilde og en fermenterbar organisk og/eller an-organisk kvelstoffkilde, men også mineralsalter, f. eks. fosfater, kalium- og natrium-salter og spormetaller, bør være til stede. Men utgangsstoffene som brukes ved opp-finnelsens utførelse er ofte forurenset med disse mineralsalter, så noen ekstra tilsetning ikke er nødvendig.

Som kullstoffkilde kan man bruke både oppløselige og uoppløselige kullhydrater, f. eks. glukose, sakkarose, laktose og stivelse. Sukkeralkoholer, f. eks. glycerol, kan også brukes. Mengden av kullstoffkilden i mediet kan variere sterkt og avhenger av det anvendte kullhydrats natur og mediets øvrige bestanddeler, og utgjør vanligvis omtrent mellom 0,15 og 5 pst. av mediets vekt.

Som kvelstoffkilde kan et stort antall stoffer finne anvendelse. Man kan her nevne hydrolysert eller ikke hydrolysert kasein, maisstøp, pepton, kjøttekstrakt, soyamel (avfettet eller ikke), peanøttmel, fiskemel og nitrater. Valget av kvelstoffkilde vil som oftest avhenge av mediets øvrige bestanddeler som igjen velges slik at det antibiotiske stoff kan fremstilles så økonomisk som mulig. I denne forbindelse kan det nevnes at små mengder kvelstoff-holdig utgangsmateriale, f. eks. gjæreks-trakt, «distillers' solubles», limvann etc. er i stand til å øke pimaricinutbyttet i visse media. Også lipoidholdige stoffer, som dyre-og plantefett, f. eks. soyaolje og fiskeolje) er i stand til å øke utbyttene i vesentlig grad.

Fermenteringstiden er sterkt avhengig av næringsmediets sammensetning. Den varierer vanligvis mellom 48 og 120 timer, men kan også fortsettes f. eks. inntil 14 dager, hvis de herved oppnådde større utbytter gjør en slik forlengelse berettiget, sett fra et økonomisk synspunkt.

Fermenteringstemperaturen kan prin-sippielt variere mellom 15 og 30° C, men man foretrekker temperaturer mellom ca. 26 og 28° C.

Ved optimal vekst av mikroorganismen og optimalt utbytte av pimaricin kan pH variere, særlig under den første fermen-teringsfase, f. eks. mellom 5,0 og 8,0. Etter sterilisering innstilles næringsmediets pH fortrinsvis på en verdi av mellom 6 og 7. Fermenteringen utføres fortrinnsvis ved en pH mellom 6,5 og 8, da man herved oppnår de beste utbytter. pH kan holdes konstant under fermenteringen ved tilsetning av alkalihydroksyd eller syre med jevne tids-mellomrom, og under sterile betingelser. Vanligvis anvendes imidlertid kalsiumkar-bonat som en slags puffer i mengder fra 0,2 til 1,0 vektprosent beregnet på mediet. Mengden av luft som under sterile betingelser ledes inn i mediet under fermenteringen avhenger i høy grad av karets form, hastig-heten og omrørernes form. Vanligvis varierer mengden mellom 0,1 og 4 liter pr. liter næringsmedium pr. minutt.

Som inokuleringsmateriale i hovedfermenteringskaret anvendes fortrinnsvis fra 48 til 72 timer gamle forkulturer av Streptomyces natalensis. For å få gode utbytter og unngå varierende resultater ut-føres okuleringen fortrinnsvis med kultur-mengder som utgjør fra 1 til 7 volpst. av næringsmediet i hovedfermenteringskaret. Det er klart at man med store fermenteringskar må man anvende noen få trin av for-kulturer. Men det er også mulig å lagre en del, f. eks. 10 pst. av kulturen i hovedfermenteringskaret for fremstilling av en ny kultur. Hele fermenteringen kan også utføres kontinuerlig.

Pimaricin kan fremstilles av kultur-væsken på mange måter. Ifølge oppfinnelsen kan man dra nytte av pimaricinets oppløselighet i organiske oppløsningsmid-ler, som bare til en viss grad kan blandes med vann, f. eks. butanol. Men kan f. eks. gå frem på følgende måte: Etter at man har fått en tilstrekkelig aktiv væske, innstilles denne på en pH av ca. 10 for å fri-gjøre det aktive stoff fra det såkalte mycelium, hvoretter dette frafiltreres. Væsken kan derpå ekstraheres, f. eks. med n-butanol, ved en pH mellom 3 og 10. Hvis væsken surgjøres, så gjøres dette helst med fosforsyre og det eventuelt herved dannede bunnfall fjernes og ekstraheres om nød-vendig, n-butanolekstrakten konsentreres ved azeotropisk destillasjon og den aktive råsubstans krystalliserer ut. Denne kan renses ved selektiv utfelling i f. eks. iseddik, pyridin, dimetylformamid o. 1. Ved fermen-tering med større utbytter enn 700 mikrogram/ml kan pimaricinutbyttet økes vesentlig ved ekstraksjon av myceliet. Ved denne ekstraksjon er det fordelaktig å fore-ta ekstraksjonen med metanol, hvori det er oppløst 1—3 pst. kalsiumklorid, for å øke oppløsningsevnen.

Eksempel 1.

(Fremstilling av inokuleringskulturen).

Fra et rør med en kultur av Streptomyces natalensis nov. spee. på f. eks. havre-melsagar på hvilken en god sporedannelse har funnet sted, overføres små mengder konidier under sterile betingelser til 2 liters rysteflasker, som er påfylt 500 ml flytende næringsmedium. Næringsmediet består av

Etter inkubering under stadig omryst-ning ved 26° C i 48 timer er kulturen ferdig til inokulering i hovedfermenteringsmediet.

Eksempel II.

(Fremstilling av kulturen)

En liter av den ifølge eksempel 1 frem-stilte inokuleringskultur overføres under sterile betingelser til et fermenteringskar, som er utstyrt med en omrører og en an-ordning for innblåsing av steril luft og inneholder 15 liter av et kulturmedium av følgende sammensetning:

Ovenstående kulturmedium innstilles på en pH-verdi av 6—9 med alkalihydroksyd. Etter 8 timers inkubering ved 27° C under stadig luftning og omrøring av kulturen viste det seg at den inneholdt 610 mikrogram pr. ml.

Andre kulturmedia med hvilke man kan oppnå like store utbytter kan ha føl-gende sammensetning:

Med dette medium fikk man med 4 pst. inokuleringskultur og 72 timers inkubering og luftning ved 26° C, 590 mikrogram pimaricin pr. ml væske.

Med dette medium fikk man etter inokulering med 5 pst. av inokuleringskulturen og 120 timers inkubering og luftning ved 27° C, 640 mikrogram pimaricin pr. ml fermenteringsvæske.

I dette medium dannet det seg etter inokulering med 3 pst. inokuleringskultur og 148 timers inkubering og luftning ved 26° C, 535 mikrogram pimaricin pr. ml. fermenteringsvæske.

I dette medium dannet det seg, etter inokulering med 3 pst. inokuleringskultur i en 15 liters fermenteringsballong og inkubering og luftning i 168 timer ved 28° C, 690 mikrogram pimaricin pr. ml. fermenteringsvæske. Etter behandling av myceliet, som var frapresset og omrørt i en del vann, med fortynnet alkalihydroksyd til pH = 10, fant man 20,4 g pimaricin i myce-liumfiltratet.

Eksempel III.

(Isolering av råpimaricin).

Fire liter av en ferdigfermentert kul-turvæske som inneholdt 590 mikrogram/ml pimaricin ble innstilt på pH = 10,0 med 10 pst.'s natronlut og deretter befridd for mycelium ved filtrering med kiselgur som filtreringsmiddel (2 pst.). Den filtrerte kultur, som hadde et volum av 3,7 liter og en aktivitet av 570 mikrogram/ml ble surgjort med fosforsyre til pH = 3,0. Det sur-gjorte filtrat ble ekstrahert med resp. 750, 350 og 350 ml n-butanol. Butanolekstråkten ble vasket tre ganger med 120 ml 4 pst.'s boraksoppløsning og til slutt to ganger med 120 ml vann. Butanolekstråkten inneholdt da 1400 mikrogram/ml. Etter azeotropisk inndampning av ekstrakten til 100 ml utskiltes 0,64 g ikke helt ren pimaricin i form av krystaller (aktivitet 900 mikrogram/ml). Av resten av ekstrakten fikk man ved fort-satt inndampning 1,42 g urent pimaricin (aktivitet 395 mikrogram/ml). Utbyttet var 48 pst., beregnet på den helt ferdigfermen-terte væskes totale aktivitet.

Eksempel IV.

(Isolering av råpimaricin).

15 liter helt ferdigfermentert kultur-væske, som inneholdt 610 mikrogram/ml pimaricin ble innstilt på pH = 10,3 med 35 pst.'s kalilut og deretter befridd for mycelium ved hjelp av 50 g Hyflo som filtreringsmiddel. Deretter ble filtratet surgjort tii pH = 2,8 med fosforsyre. Det utfelte bunnfall ble frafiltrert, denne gang med 10 pst. Hyflo. Bunnfallet ble omrørt i en halv time med 100 ml n-butanol. Etter henstand ble det som hadde avsatt seg på bun-nen vasket med 100 ml vann. Den hele mengde butanolekstrakt ble vasket tre ganger med 10 ml 4 pst.'s boraksoppløsning, deretter tre ganger med 10 ml vann og inndampet i vakuum til 40 ml ved 44° C. Etter avkjøling til 0° C, avsugning og tørking fikk man 0,51 g blekgult, krystallinsk pimaricin med en aktivitet av 850 mikrogram/mg. Det filtrerte kulturfiltrat ble deretter be-handlet på den i eksempel 3 beskrevne måte. Man fikk følgende to fraksjoner: 3,21 g (akt. 890 mikrogram/mg) og 6,8 g (akt. 223 mikrogram/mg.

Totalutbytte 51,5 pst.

Eksempel V.

(Isolering av rå pimaricin).

Ti liter fullstendig utfermentert kulturmedium (akt. 640 mikrogram/ml) ble

innstilt på pH = 10 med 15 pst.'s kalilut. Myceliet ble frasentrifugert og sentrifuga-tet innstilt på pH = 6,9 med 10 n saltsyre og deretter ekstrahert med resp. 2000, 1000 og 1000 ml isoamylalkohol. Isoamyleks-traktene ble slått sammen og vasket tre ganger med 300 ml 4 pst.'s natriumkarbo-natoppløsning og derpå med 300 ml vann. Den på denne måte behandlede ekstrakt ble inndampet azeotropisk til 100 ml. Herved utskiltes 2,62 g blekgul, krystallinsk pimaricin med en aktivitet av 900 mikrogram/ mg. Utbytte, 36,8 pst.

Eksempel VI.

(Isolering av rå pimaricin).

Tyve liter av en fullstendig utfermentert kultur av Streptomyces natalensis (akt. 700 mikrogram/ml) ble innstilt på pH = 10 med 20 pst. natronlut. Myceliet ble frafiltrert ved hjelp av Hyflo (200 g). Det klare kulturfiltrat ble ekstrahert med resp. 4000, 2000 og 1000 ml n-butanol. Ekstrakt-ene ble slått sammen og vasket to ganger med 500 ml 4 pst.'s boraksoppløsning og derpå to ganger med 500 ml vann. Etter innstilling av den på denne måte behandlede ekstrakt på pH = 6,8, ble den inndampet azeotropisk i vakuum til 250 ml. Herved utskiltes 9,85 g blekgul, krystallinsk pimaricin (akt. 913 mikrogram/mg).

Eksempel VII.

(Isolasjon av råpimaricin fra mycelium).

Femten liter av en fullstendig utfermentert kultur av Streptomyces natalensis nov. spee. ble innstilt på pH = 4,1 med iseddik. Oppløsningen ble tilsatt og omrørt sammen med 200 g Hyflo som filtreringsmiddel. Myceliet ble derpå presset for å fjerne mest mulig vann og veiet da 1700 g.

1 g av dette mycelium i denne tilstand ble

ekstrahert i en time med 40 ml metanol for å bestemme antall mikrogram pimaricin. Metanolekstraktens volum ble øket til

100 ml og deretter målt spektrofotometrisk.

Metanoloppløsningen inneholdt 120 mikrogram/ml.

Pimaricininnholdet i den hele mengde mycelium utgjorde 20,4 g. Det pressede mycelium ble ekstrahert i en halv time ved værelsestemperatur med 8 1 metanol, hvori 2 pst. kalsiumklorid var oppløst. Ekstrakten ble fortynnet med 1 1 vann og befridd for metanol i vakuum. Herved utskiltes krystallinsk pimaricin, som etter avsugning, vasking og tørking i vakuum veiet 14,73 g og hadde en aktivitet av 900 mikrogram/ mg = 65 pst. av det teoretiske utbytte.

Eksempel VIII.

(Rensing av pimaricin).

Ti gram uren pimaricin (akt. 890 mikrogram/mg) ble under forsiktig oppvarmning oppløst i 80 ml iseddik hvoretter uopp-løste forurensninger ble frafiltrert hurtigst mulig. Det klare gulbrune filtrat ble opp-løst i 1500 ml vann og oppløsningen innstilt på pH = 6,3 med 33 pst.'s natronlut. Etter avkjøiing ble de utskilte krystaller fracen-trigugert, vasket to ganger med ialt 500 ml vann og avsuget. Krystallene ble også vasket på filtret med 200 ml vann og tørket i vakuum over fosforpentoksyd. Det erholdte sterkt blekgule produkt veiet 7,07 g og hadde en aktivitet av 960 mikrogram/mg.

Ovenstående behandling ble gjentatt med 60 ml iseddik og 1000 ml vann. Stoffet ble vasket tre ganger med 200 ml vann. Produktet veiet da 5,35 g og hadde en aktivitet av 995 mikrogram/mg. Totalutbyttet 59,8 pst.

Eksempel IX.

(Rensing av pimaricin).

Ti gram urent pimaricin (akt. 890 mikrogram/) ble under svak oppvarmning oppløst i 100 ml dimetylformamid. De uopp-løselige forurensninger ble frafiltrert og filtret vasket med 30 ml dimetylformamid. Det brunfargede, klare filtrat ble tilsatt 250 ml vann, og det antibiotiske stoff skilte seg ut i form av krystaller. Produktet ble avsuget, filteret vasket med 100 ml vann og krystallmassen tørket i vakuum. Det erholdte produkt veiet 9,24 g. Etter gjentatt behandling på samme måte fikk man et blekgult krystallinsk produkt som veiet 7,9 g og hadde en aktivitet av 985 mikrogram/ mg. Totalutbytte 87,5 pst.

Eksempel X.

(Fremstilling av natriumsaltet).

2,5 g pimaricin (akt. 985 mikrogram/ mg) ble suspendert i 20 ml metanol ved omrøring og suspensjonen tilsattes 0,145 g natriumhydroksyd oppløst i 0,3 ml vann. Pimaricinet, som først oppløstes, krystal-lerte i løpet av få minutter i form av natriumsaltet. Etter 30 minutters omrøring og 24 timers henstand ved 0° C til krystallmassen frasuget og vasket med 5 ml eta-nol og 10 ml dietyleter. Etter tørkning i vakuum veiet natriumsaltet, som forelå i form av hvite, nålformete krystaller, 2,16 g (innhold 995 mikrogram/mg) = 87,3 pst. av den beregnede aktivitet.

Andre salter kan fremstilles på liknende måte.

Claims (5)

1. Fremgangsmåte til fremstilling av et antibiotikum, pimaricin, karakterisert ved at Streptomyces natalensis nova species dyrkes under aerobe betingelser, fortrinnsvis submerst, i et vandig næringsmedium, hvorfra utvinnes pimaricin, som er et stoff med antibiotiske egenskaper overfor saprofytiske og parasitiske fungi og gjærsopper, og som i ren tilstand er et hvitt krystallinsk stoff, som begynner å spaltes ved ca. 150° 25 C, har en spesifikk rotasjon a — = + 250° C (i en konsentrasjon av 0,083 pst. i 100 pst.'s metanol), og ikke gir noen fargereaksjon med ferriklorid, danner en lyserød ustabil farge med fosforsyre, avfarger bromvann, er lite oppløselig i vann, mer oppløselig i alkoholer og oppløselig i pyridin, dimetylformamid, dimetylacetamid, iseddik, og alkalihydroksyder og praktisk talt uoppløselig i alifatiske kullvannstof-fer, samt viser maksimal absorbsjon av ul-trafiolett lys ved 290, 300 og 318 m^i med en topp ved ca. 280 og et minimum ved ca. 250 mji, og i en kaliumbromidplate viser følgende infrarøde absorbsjon (i cm-<1>):

3460, 2985, 1721, 1637, 1577, 1441, 1401, 1381, 1275 1269, 1238, 1192, 1176, 1136, 1109, 1066, 1006, 988 948 887 855 844, 803, 794.

2. Fremgangsmåte ifølge påstand 1, karakterisert ved at dyrkningen finner sted ved en temperatur mellom ca. 15 og ca. 30° C, fortrinnsvis mellom ca. 26 og ca. 28° C i et tidsrom på fra ca. to til fem dager.

3. Fremgangsmåte ifølge påsfcand 1 —2, karakterisert ved at dyrkningen finner sted i en vandig, næringsmiddelholdig kull-hydratoppløsning med en pH-verdi på 6,5 til 8.

4. Fremgangsmåte ifølge påstand 1— 3, karakterisert ved at dyrkningen finner sted i et vandig medium som inneholder et oppløselig kullhydrat og en kilde av assimilerbart nitrogen.

5. Fremgangsmåte ifølge påstand 1— 4, karakterisert ved at utvinningen av pimaricin omfatter ekstrahering av anti-biotikumet med butylalkohol ved en pH-verdi på ca. 3.