SU503532A3 - Способ получени фермента дл лизиса клеток микроорганизмов - Google Patents

Description

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФЕРМЕНТА ДЛЯ ЛИЗНСА КЛЕТОК

МИКРООРГАНИЗМОВ водный сырой раствор сложного фермента может далее подвергатьс  обработке известным обессоливающим агентом, например сульфатом аммони , хлоридом натри , или же смешиваемым с водой органическим растворителем таким, как низшие алифатические спирты, например метиловый или этиловый спирт, или ацетон, с целью выделени  этого сложного фермента из сырого раствора. Дл  дальнейшей очистки осажденный сложный фермент может раствор тьс  в соответствуюш ,ем буферном растворе ацетата концентрацией 0,01 Al и ферментативный раствор может далее подвергатьс  диализу или процессу гель-фильтрации. Полученный таким ооразом очиш,енный ферментативный раствор может затем подвергатьс  сушке при температуре ниже 0°С, в результате чего получаетс  очиш,енный ферментативный препарат, состо щий в основном из желаемого сложного фермента. Этот сложный фермент, получаемый из Pellicularia sasakii, и сложный фермент, получаемый из Pellicularia filamentosa, согласно предлагаемому способу растворимы в воде, но нерастворимы в ацетоне и в этаноле. Все эти ферменты имеют общие характеристики: они  вл ютс  активными в отношении лизировани  живых и мертвых клеток бактерий, грибов, дрожжей, базидиомицетов и хлореллы; их активность в отношении лизировани  стенок клеток  вл етс  стабильной при величине рН 3-9, причем оптимальна  величина рН 5-7; они имеют оптимальную активность (активность в отношении лизировани  стенок клеток ) при 30-40 С, но эта оптимальна  температура слабо измен етс  в зависимости от природы микроорганизмов, клетки которых подвергаютс  лизированию; активность в отношении лизировани  стенок клеток  вл етс  стабильной в интервале низких температур, но эта активность снижаетс  нри температуре выше их активность в отношении разрушени  стенок клеток снижаетс  в результате присутстви  ионов Мп++, Ni++ или Zn++; обладают ферментативной активностью целлюлозы , глюканазы, хитиназы, протеазы, геми-целлюлазы и карбоксиметилцеллюлазы; они в основном состо т из компонентов ферментов , каждый из которых имеет молекул рный вес не менее 50 000. Можно полагать, что лизирующий стенки клеток сложный фермент, полученный из Pellicularia sasakii, и сложный фермент, полученный из Pellicularia filamentosa, представл ет собой смеси целлюлазы, глюканазы, хитаназы, протеазы, геми-целлюлазы и карбометилцеллюлазы в форме сложного соединени , и они имеют высокую активность в отношении лизировани  клеток различных микроорганизмов благодар  синергичному действию отдельных составл ющих ферментов, хотл можно полагать, что эти сложные ферменты , полученные из различных видов Pellicularia , имеют составы, которые в большей или в меньшей степени отличаютс  один от другого , поскольку эти сложные ферменты имеют различные свойства и различную ферментативную активность. Согласно изобретению предлагаетс  сложный фермент, лизирующий стенки клеток, выбранный из числа сложных ферментов, полученных при помощи известного штамма Pellicularia sasakii и из числа сложных ферментов, полученных из известного штамма Pellicularia tilamentosa, причем все эти сложные ферменты имеют следующие общие характеристики: активность в отношении лизировани  живых и мертвых клеток, по крайней мере таких организмов , как Aspergillus niger, Penicillium steckii, Saccharomyces cerevisial, Candida utilis , Candida albicans, Candida lipolytica, Lentinus edodes. Bacillus subtilis, Lactobacillus lactis и Chlorella; стабильна  активность в отношении лизировани  стенок клеток  вл етс  при величине рН 3-9, причем оптимальна  величина рН составл ет 5-7; оптимальна  активность в отношении лизировани  стенок клеток при 30-40°С, но оптимальна  температура измен етс  в зависимости от природы микроорганизмов, стенки которых подвергаютс  лизированию; стабильность активности в отношении лизировани  стенок клеток при низких температуpax и быстрое снижение ее нри температуре выше 50°С; снижение активности в отношении лизировани  стенок клеток в присутствии ионов Мп++, Ni++ или Zn++; ферментативна  активность равна  активности целлюлазы, карбоксиметилцеллюлазы, глюканазы, хитиназы, протеазы, геми-целлюлазы и амилазы; молекул рный вес компонентов ферментов в основном не менее 50 000. Сложный фермент, образуемый из Pellicularia sasakii, обладает активностью такой целлюлазы, котора  имеет оптимальный температурный предел 40-50°С и оптимальную величину рН 5,0, например активностью р-1,3-глюканазы, котора  имеет оптимальный температурный предел 40-50°С и оптимальную величину рН 5,0 и обладает активностью такой хитиназы, имеющей оптимальную температуру 35°С, и оптимальную величину рН 4,0-5,5. Сложный фермент, полученный из Pellicularia filamentosa, обладает, кроме того, такой активностью целлюлазы, котора  имеет оптимальный температурный предел 40-50°С, например активностью р-1,3-глюканазы , котора  имеет оптимальный температурный предел 40-50°С и оптимальную величину рН 5,0, и такой активностью хитиназы, имеющей оптимальную температуру 35°С и оптимальную величину рН 4,0-5,5.

Активности в отношении лизированй  стенок клеток, которые обозначаютс  как общеприн тые характеристики (Ь) - (1) сложных ферментов, соответствующих изобретению, определ ютс  следующим способом и в следующих масштабах.

Получаемое количество сложных ферментных препаратов химически реагирует с 5 мл суспензии клеток Candida utilis IFD -0,396, которые имеют исходную мутность, соответствующую оптической плотности (О. Д.), равной 1,и, измеренной при длине волны 660 нм. Эта реакци  осуществл етс  при 35°С в течение оО мин при величине рН 5,0. После завершени  реакции оптическа  плотность суспензии клеток, содержащей лизированные и нелизированные клетки, измер етс  при длине волн 660 нм. В случае, когда прореагировавша  суспензи  клеток тер ет 1 /о мутности (или величины О. Д.) по сравнению с исходной суспензией клеток, то указанное количество сложного ферментного препарата имеет активность в отношении лизированй  стенок клеток равную единице. Кроме того, активность целлюлазы, активность р-1,3-глюканазы и активность хитиназы в отношении указанных выше сложных ферментов, соответствующих изобретению, измер ютс  в соответствии с приведенным ниже описанием в примере 13.

В случае когда лизирование, а именно растворение стенок клеток микроорганизмов осуществл етс  при использовании сложного фермента, то этот фермент химически реагирует с клетками микроорганизмов, суспензированных в воде. Желательно, чтобы реакци  протекала при 20-60 и преимущественно при 30-40°С при рН 2-10, и лучше при рН 3,4-8,0. Температура реакции и величина рН могут быть заданы в соответствии с природой микроорганизма, стенки клеток которого подвергаютс  лизированию под воздействием сложного фермента. Клетки микроорганизма , подвергаемого лизированию, могут быть либо живыми, либо мертвыми, при их контактировании с ферментом. В любом случае почти все клетки могут раствор тьс  благодар  лизированию стенок клеток и содержимое (внутриклеточное вещество) клеток может удал тьс  в водную фазу суспензии клеток через 20 ч после начала реакции.

Дл  того чтобы осуществл лась реакци  сложного фермента с клетками микроорганизма , любой ферментный препарат в форме твердого порошка или его водного раствора, или питательного бульона культура, или экстракта этой культуры может быть добавлен в суспензию клеток в воде, величина рН которой доведена до оптимальной величины дл  осуществлени  ферментативной реакции. Нар ду с этим эти клетки могут быть введены в раствор ферментного препарата в воде или буферный раствор, величина рН которого доведена до оптимальной дл  осуществлени  ферментативной реакции.

Когда реакци  осуществл етс  до полного

ее завершени , то клетки полиостью раствор ютс , не оставл   никакого твердого осадка в растворе. Однако в некоторых случа х количество твердого остатка остаетс  даже после

полного завершени  реакции. Возможность растворени  клеток до желаемой степени может быть установлена путем определени  изменени  мутности суспензии клеток или концентрации растворимого компонента протоплазмы клеток или посредством микроскопического наблюдени  в услови х наличи  клеток в растворе. Таким образом, может быть получен водный раствор клеток, в котором вещество оболочек клеток и протоплазма клеток

раствор ютс  в воде вместе с используемым сложным ферментом.

По желанию полученный раствор клеток может быть отфильтрован дл  удалени  любого твердого осадка. Этот раствор может

быть также нагрет дл  деактивации оставшихс  ферментов в случае, если это необходимо. Далее раствор может подвергатьс  обработке путем простой дегидратации или выпаривани  Б вакууме, в результате чего получаетс 

сухой продукт. Раствор клеток может также обрабатыватьс  соответствуюшим образом, например путем экстракции или хроматографии дл  извлечени  из него любого ценного вещества или веществ.

Предлагаемые сложные ферменты способны лизировать клетки (стенки клеток) различных микроорганизмов таких, как бактерии, грибы, дрожжи, базидомицеты, а также хлореллу. Это свойство сложных ферментов  вл етс 

более положительным и более ценным, чем, например, свойства известных ферментов, которые извлекают из культуры Corticium rolfsii. Фермент, извлеченный из данной культуры Corticium rolfsii, имеет оптимальный предел

величины рН 2,0-2,5 и ограниченную активность , так что он может лизировать лишь стенки клеток дрожжей и хлореллы. Микроорганизмы разновидности Corticium могут быть отличимы от микроорганизмов разновидности

Pellicuiaria в том отношении, что первый образует такой сплошной спорообразующий слой плодового тела, в котором базидий расположен в непосредственной близости, в то врем  как последний образует спорообразующий слой плодового тела с разрывом сплошности , в котором базилии наход тс  на рассто нии друг от друга.

Согласно изобретению предусматриваетс  способ растворени  клеток микроорганизмов,

включающих бактерии, грибы, дрожжи, базидиомицеты и хлореллу, который заключаетс  в обработке суспензированных клеток в водной среде сложным ферментом, лизирующим стенки клеток,  вл ющимс  известным штаммом Pellicuiaria sasakii или Pellicularia filamentosa или питательным раствором культуры указанного штамма, или его экстракта.

Сложный фермент, лизируюший стенки клеток , может быть использован дл  экстракции

ценных внутриклеточных веществ из клеток, а также дл  получени  концентрированного экстракта, содержащего питательные вещества или другие ценные вещества, присутствующие в протоплазме клеток различных микроорганизмов таких, как дрожжи, хлорелла, бактерии и грибы, Дл  этих целей эти клетки обрабатывают сложным ферментом в воде дл  лизировани  стенок клеток и освобождени  протоплазмы, в результате чего получаетс  раствор клеток, который далее может быть частично дегидрирован или полностью дегидрирован с получением концентрата или сухого порошка. Кроме того, сложный фермент, лизирующий стенки клеток, соответствующий изобретению, может быть использован дл  предотвращени  порчи пищевых продуктов или напитков, путем введени  в них эффективно действуЕОщего количества сложного фермента и путем растворени  клеток бактерий или грибковых организмов , которые могут присутствовать или могут быть занесены в пищевые продукты или напитки, и дл  которых свойственно вызывать порчу пищевых продуктов или напитков. Таким образом, сложные ферменты наход т широкое применение во многих област х, папример в пищевой, фармацевтической промышленности , в производстве пестицидов и в приготовлении кормов. Пример 1. В коническую колбу емкостью 300 мл помещают 19 г пшеницы, 1 г высущенных дрожлчей и 18 мл воды. Затем эту колбу нагревают и содержимое ее перемешивают , в результате чего получают однородную пастообразную смесь. Эту среду подвергают обработке паром при 120°С в течение 20 мин с целью стерилизации. Исходную культуру Pellicularia sasakii подвергают инокулированию на стерильную культуральную среду. Выращивание в твердом состо нии щтамма Pellicularia осуществл ют в течение 120 ч при посто нной температуре равной 28°С. Полученную в результате культуру смешивают с 80 мл буферного раствора ацетата с рН 4,0 и эту смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 1 ч с тем, чтобы ферменты экстрагировались в жидкую фазу. Затем эту смесь фильтруют при посто нном давлении, и полученный фильтрат центрифугируют , в результате чего получают 70 мл прозрачного раствора, содержащего сложный фермент, полученный из Pellicularia sasakii. К этому раствору добавл ют 120 мл ацетона, в результате чего выпадает в осадок сложный фермент. Осадок фильтруют и высушивают, получают 700 мг ферментного препарата в порошкообразном состо нии. Фермеитный препарат  вл етс  активным в отношении лизировани  стенок клеток различных микроорганизмов, включающих бактерии , грибы, дрожжи, базидиомицеты и хлореллу . Пример 2. В коническую колбу емкостью 300 мл помещают 10 г отрубей пшеницы, 10 г отрубей риса, 2 г пептона и 20 мл воды. Колбу нагревают и содержимое колбы персмещивают , получа  однородную пастообразную смесь. Культуральную среду подвергают обработке паром при 120°С в течение 20 мин с целью стерилизации. Исходную культуру Pellicularia filamentosa инокулируют до стерильной культуральной среды. Выращивание в твердом состо нии щтамма Pellicularia осуществл ют при 28°С в течение 170 ч. Полученную культуру смешивают с 80 мл воды и тщательно перемешивают при комнатной температуре с тем, чтобы ферменты экстрагировались в водную фазу. Смесь фильтруют под давлением и полученный фильтрат центрифугируют, в результате чего получают прозрачный раствор, содержащий сложный фермент, полученный из Pellicularia filamentosa. К раствору добавл ют сульфат аммони  до достил ени  степени насыщени  70% и таким образом осаждают сложный фермент. Осадок фильтруют и сушат, получают 1 г ферментного препарата в порошкообразном состо нии. Этот препарат  вл етс  активным в отношении лизировани  стенок клеток различных микроорганизмов, включающих бактерии, грибы , дрожжи, базидиомицеты и хлореллу. Пример 3. В коническую колбу емкостью 1 л помещают 9 г сахарозы, 6 г отрубей риса, 0,6 г порошкообразного высушенного гриба шл почного (Continellus shutake), 1,5 г сульфата аммони , 1,5 г первичного кислого фосфорнокислого кали , 0,3 г хлористого кали , 0,3 г сульфата магни  и 0,003 г сульфата железа (двухвалентного). К содержимому колбы добавл ют 300 мл воды с целью растворени  растворимого вещества. Эту Культуральную среду в виде водного раствора стерилизуют путем обработки паром при 120°С в течение 20 мин. Исходную культуру Pellicularia filamentosa инокулируют на стерильную жидкую Культуральную среду. Выращивание при одновременном взбалтывании щтамма Pellicularia осуществл ют при 23°С в течение 120 ч. Получеиный таким образом питательпый раствор культуры фильтруют , удал   присутствующее в нем твердое ещество, выпаривают до получени  объема, составл ющего одну треть от исходиого объема , путем диализа через диализную мембрану. К концентрированному раствору добавл ют 00 мл водного 99%-ного раствора спирта, в езультате чего осаждают сложный фермент. садок фильтруют и сушат, получают 450 г ерментного препарата в порошкообразном осто нии. Ферментный препарат  вл етс  ктивным в отношении лизировапи  стенок леток различных микроорганизмов, включащих бактерии, грибы, дрожжи, базидиомиеты и хлореллу. Пример 4. В коническую колбу емкотью 300 мл помещают 5 г тонко измельченых отрубей пшеницы, 0,5 г сульфата аммои , 0,5 г первичного кислого фосфорнокислого кали , 0,1 г хлористого кали , 0,1 г сульфата магни , 0,001 г сульфата железа (двухвалентного ) и 100 мл воды. Содержимое колбы стерилизуют путем обработки паром при 120°С в течение 20 мин. Исходную культуру Pellicularia sasakii инокулируют на стерильную жидкую культивируемую среду. Инкубацию при одновременном встр хивании осуществл ют при 28°С в течение 24 ч посредством вращающего встр хивател , в результате чего получают жидкую семенную культуру.

На 5 дерев нных желобах помещают соответственно 200 г отрубей пшеницы, 5 г порошкообразного высушенного шл почного гриба (Cortinellus shutake) и 160 мл водного 5%-него раствора сульфата аммони . На каждом желобе эти материалы тщательно перемешивают один с другим, получа  однородную смесь, которую затем стерилизуют путем обработки паром. 20 мл полученной жидкой семенной культуры, указанной выше, инокулируют до получени  культивируемой среды на каждом желобе.

Стационаоное культивирование осушествл ют пои 28°С в течение 96 ч. Культупы на этих желобах смешивают одну с другой и соединенную культуру экстрагируют 4 л водного буферного раствора ацетата с рН 4,0.

Экстракт сЬильтруют под давлением и фильтрат центрифугируют, в результате чего цолуч ют 3.6 л прозрачного раствора, содержащего сложный (Ьермент, полученный из Pellicularia sasakii. К этому прозрачному раствору доб вл ют сульфат аммони  до степени насыщени  70%, осажда  сложный сЬермент.

Осадок собирают и ввод т в 900 мл воды. Водный раствор фермента лиофилизируют в вакууме, в результате чего получают 32 г ферментного препарата в виде порошка.

Ферментный препарат  вл етс  активным в отношении лизировани  стенок клеток различных микроорганизмов, включающих бактерии, . дрожжи, базидиомицеты и хлоре.ллу.

Пример 5. В каждлю из трех конических колб емкостью ЯОО м.  помещают 19 г отрубей пшеницы, 1 г высушенных дрожжей и 18 мл воды, и содержимое каждой колбы нагпевают и перемешивают, в результате чего получают однородную пастообразную смесь. ЭТУ питательную стерилизуют путем обработки паром при 190°С в течение 20 мчн. Исходные КУЛЬТУРЫ Pellicularia sasakii и Pellicularia filameutosa инокулируют соответственно в указанных колбах на стерильной среде. Выращивание в твердом состо нии осуществл ют в течение ч при посто нной температуре равной 28°С. После выращивар . получаемые культуры смешивают с поптш ми по 80 м.л буферного раствора ацетата , и смеси церемешивают при комнатной температуре в течение 1 ч с тем. чтобы сложные Аеоменты, получаемые из различных вилов Pellicularia, экстрагировались в жидкие Лазы. Эти смеси фильтруют под давлением получаемые фильтраты центрифугируют, в результате чего получают порции по 70 мл трех прозрачных растворов, содержаших сложные ферменты, соответственно.

С другой стороны, суспензии клеток грибов, дрожжей, бактерий и хлореллы в воде приготавливают из культур Aspergillus niger, Penicillium stecku. Saccharornyces cereyisiae IFO0209 , Candida utieis IFO-0396. Candida albicans , Candida lipolytica и Lentinus edodes,

каждую из которых инкубируют в мальтовой среде; культуры Bacillus subtilis и Lactobacillus bactis инкубируют в бульонной среде, и культуру Chlorella pyrenoidosa - в среде Nakamura, соответственно. Каждую из этих

суспензий клеток, приготовленную указанным способом, помещают в три испытательные трубки. Затем в эти трубки, кажда  из которых содержит суспензию клеток, ввод т порции по 20 мл указанных выше трех прозрачных растворов соответствующих сложных ферментов. Содержимое каждой испытательной трубки осторожно взбалтывают в течение 20 ч в вод ной бане при посто нной температуре равной 35°С, так что эти ферменты химически реагируют со стенками клеток, раствор   эти клетки в суспензии. Суспензии этих клеток наблюдают под МИКРОСКОПОМ с целью определени  в какой степени эти клетки раствор ютс  или перевариваютс  под воздействиом сложных ферментов Pellicularia и Pellicularia filamentosa.

Степень растворени  этих клеток определ ют согласно шкале: символ ++ означает, что происходит растворение всех клеток. Символ

-.растворение большей части клеток; символ ± - растворение меньшей части клеток; символ - означает, что не происходит растворени  никаких клеток. Полученные результаты испытани  показапь в табл. . Дл  сравнени  испытание ПОВТОРЯЮТ , лобавл   2 м- буферного раствора ацетата при величине рН 4,0 вместо указан ых выше прозрачных ферментных растворов. В испытании, проведенном дл  сравнени , не наблюдаетс  растворени  клеток.

Пример 6. Суспензии клеток в физиологическом водном СОЛЯ1ТОМ растворе приготав .гпв ют из КУЛЬТУР Candida utilis IFO-0396, .Sf-charomyces cereyisiae lFO-0209 и Hansinulie anomalie IFO-0122. каждую из которых получают путем выращивани  со взбалтыванием микроорганизма в жи.п:кой питательной cperie. содержаптей. вес. %: глюкоза - 3; (NH.V.SO. - 0.8: КНзРОл - 0.5: NaCl - 0,2;

M.eSO.--7HjO - 0.2 и дрожжевой экстракт- 0.1 с величиной рН 5.2. в течение 20 ч при взбалтывании посредством вращающегос  взбалтывател (скоростьвращени 

200 об/мин).

ОДНУ каплю каждой суспензии клеток, приготовленной таким образом, помещают на ппедметное стекло, и одну каплю прозрачного раст ора сложного фермента Pellicularia . данного в примере 1. добавл ют к одной капле суспензии клеток на предметном

И

12

Таблица 1

стекле. Эти жидкие капли быстро перемешивают друг с другом и затем их покрывают покрывной стекл пной пластиной. Это предметное стекло помещают в комнатные услови  при 30°С и изменени  клеток в жидкой массе на предметном стекле наблюдают под микроскопом в течение определенного периода времени. Эти клетки постепенно раствор лись с течением времени.

Степень растворени  клеток определ ют соответственно следующей шкале: символ + означает , что происходит растворение стенок

Пример 7. В коническую колбу емкостью 300 мл помещают 20 г отрубей пшеницы, 0,5 г порошкообразного высушенного гриба шл почного (Cortinellus shutake) и 16 мл 5%ного водного раствора сульфата аммони  и содержимое этой колбы нагревают и перемешивают , в результате чего получают однородную пастообразную смесь. Эту питательную среду стерилизуют путем обработки паром

клеток; - растворение клеток ускор етс ; + означает, что растворение всех клеток завершаетс ; символ - означает, что никакого изменени  с клетками не происходит.

Результаты испытани  представлены в табл. 2. Дл  сравнени  провод т дополнительное испытание, добавл   одну каплю буферного раствора ацетата с величиной рН 4,0 вместо одной капли ферментного раствора. При проведении сравнительных испытаний никакого растворени  клеток не происходит.

Таблица 2

при 120°С в течение 20 мин. Исходную культуру Pellicularia filamentosa инокулируют на

стерильной питательной среде, и выращивание в твердом состо нии осуществл ют при 25°С в течение 144 ч. Получаемую культуру перемешивают с 80 мл деионизированной воды, и смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 1 ч с тем, чтобы сложный фермент , полученный из Pellicularia filamentosa.

13

экстрагировалс  в жидкостный слой. Далее смесь фильтруют под давлением и фильтрат выпаривают, в результате чего получают 65 мл прозрачного раствора, содержаш.его сложный фермент. К раствору добавл ют сульфат аммони  до достижени  степени насыщени  70%, происходит осаждение сложного фермента. Осадок фильтруют и ВЫСУШИВ   ют. в результате чего получают 1,7 г ферментного препарата в виде порошка.

Ферментный препарат раствор ют в буферном растворе ацетата с величиной рН 5,0, получа  ферментный раствор, содержащий 1% указанного ферментного препарата. 10 мл ферментного препарата помещают в изогнутую трубку в виде буквы L, и 1 г высушенных дрожжей (дрожжи представл ют собой разновидность Candida, которые инкубируют, использу  питательнуго среду, содержащую фракцию парафинового углеводорода нефт ного дистилл тного масла в качестве источника углерода) или 1 г высушенной хлореллы дополннтельно поменлают в L-образную трубку . Трубку встр хивают при посто нной температуре 40°С, в результате чего ферменты химически реагируют с клетками дрожжей Пример 8. На данном примере показано , что сложный фермент, соответствующий изобретению, используетс  дл  предотвращени  порчи различных пищевых продуктов и напитков таких, как томатный, картофельный и апельсиновый соки. Порции по 10 мл томатного, картофельного или апельсинового сока помещают в небольшие сосуды. Одновременно энзим, полученный по примеру 1, очищают при помощи ионообменной смолы. 0,1, 1 и 10 мг конечного очищенного энзима добавл ют в указанные сосуды . Несколько сосудов, содержащих продукты или напитки, оставл ют без добавлени  энзима в качестве контрол . Сосуды выдерживают на воздухе при 28°С в течение некоторого времени и затем наличие загр знени  провер гот наблюдением обесцвечивани  вида и запаха соков. Результаты испытаний показаны в табл. 4 (символ + обозначает загр знени , символ - отсутствие загр знени ).

14

или хлореллы, так что происходит лизирование стенок клеток. По прошествии 1 ч или 3 ч реакции к реакционной смеси, наход щейс  в изогнутой трубке, добавл ют 3 мл водного раствора гидрата окиси натри , повыша  величину рН до 7. Смесь гнова встр хивают еще в течение 15 мин и цептоиф тир ют дл  удалени  из нее твердых веществ. Получаемый прозрачный раствор апплизируют на содержание Сахаров и протеинов, которые выдел ютс  из клеток. Сахаров определ ют колориметричегким способом при длине волны света 530 ммк, использу  в качестве про вл ющего агента 3,5-динитросалициловую кислоту, и содержание Сахаров выражаетс  в количестве глюкозы. Количество потеинов рассчитывают, определ   содержание азота в протеинах при помощи известного способа Кьендал -нингидрина, и умножа  найденное содержание азота на 6,25.

Результаты испытани  показаны в табл. 3. Дл  сравнени  эту процедуру повтор ют, добавл   10 мл буферного раствора ацетата с величиной рН 5,0 вместо упом нутого выше ферментного раствора.

Таблица 3 Пример 9. К 100 г высушенных клеток дрожжей Candida lipolytica добавл ют 1 л водного раствора (рН 5,0) ферментного препарата (концентраци  0,5%), который получают в примере 1. Смесь выдерживают при 35°С в течение 30 мин, в результате чего протекает ферментативна  реакци , реакционную смесь затем смешивают с 1 л 0,2 н. раствора гидрата окиси натри . Затем смесь нагревают при 50°С в течение 30 мин дл  того, чтобы протеин дрожжевых клеток экстрагировалс  в водную фазу. Водиый экстракт центрифугируют с целью удалени  уплотненных клеток и величину рН всплывщего сло  раствора довод т до 4,0 путем добавлени  6 н. сол ной кислоты, протеин осаждаетс  при изоэлектрической точке. Количество осажденного и извлеченного протеина соответствует 76% от общего содержани  протеина дрожлсевых клеток.

15

В случае, когда эту процедуру повтор ют, мину  использование ферментного препарата, то количество осажденного и извлеченного поотеина соответствует лишь 15% от общего сотеожани  ппотеина дрожжевых клеток.

Пример 10. 10 г корм , состо щего из высушенных клеток Candida utilis, лобавл ют к 100 мл водного раствооа СрН 6.0), солеожащего 0,5% ферментного препарата, котооый получают по примеру 3. Эту смесь вытепживают при 35°С в течение I ч, так что Ьепменты химически реагируют со стенками плеток дрожжей. Далее Deaкциoннvю cMetb пм 7шивают при температуре ниже 0°С, в чего получают порошкообразный копм. состо щий из обработанных сЬерментов .пожжей Candida. ЭТУ процедуру повтор ют без использовани  (Ьеоментного ппеп рата, R результате чего получают порошкообразный КОРМОВОЙ продукт, состо щий nnof-To из вы ушенных при температуре ниже 0°С дрожжей Torula. Исходные необработанные высушенные ДРОЖЖИ Candida, обработанные фепментом ДРОЖЖИ Candida и просто высушенные ПРИ температуре ниже 0°С дрожжи обрабатывают пепсином с целью определени  их спосо ности перевариватьс .

Ниже приведены данные по спо обности перевариватьс  пепсином образцов, %: Высушенные необработанные ппожжи Candida (сравнительт-ьтй ппимеп 58 .4

ПРИ тPмпenpт - 0°С ттпожж Candida (сравт-тите . ьный ппм рр)60.2

ДРОЖЖИ Candid. обработанные г.пожным гЬс п -т-пм, соответствующим изобретрнчю97,7

Пример 11. V позрачномл ПТ ТВОРУ, содержащему сложный фермент Pellicularia sasakii , полученный по приглеру 5, добавл ют двукратный объем ацетона, в результате чего выдел ют сложный Леомент. Осадок собирают и высушивают, R результате чего получают порошкообразный ферментный препарат. 20 г

503532 Таблица 4

влажной спекшейс  массы (содержание твердого вещества 48 вес. %, состо щей из клеток Candida utilis, добавл ют к 100 мл водного раствора (рН 4,0), содержащего 1% указанного порошкообразного ферментного препарата . Получаемую смесь осторожно встр хивают при 35°С в течение 1 ч, в результате чего протекает ферментативна  реакци . После этой реакции реакционную смесь центрифугируют , удал   оставшиес  твердые вещества . Всплывший на поверхность слой раствора лиофилизируют, в результате чего получают 7,8 г сухого порошкообразного экстракта растворимого внутриклеточного вещества клеток Candida utilis. В результате анализа обнаружено , что этот порощкообразный экстракт содержит , %: сырые протеины 54,3; сырые масла 4.0; сырые волокнистые материалы 1,7; зола 6,4 и растворимые азотистые вещества 33,6. Процедуру цовтор ют с добавлением 100 мл буферного раствора ацетата с величиной рН 4,0, вместо ферментного раствора, получают лишь 1,7 г сухого порошкообразного продукта после лиофилизации всцлывшего на поверхность сло  раствора.

Пример 12. Инокулум Candida albican.s патогенных дрожжей пр тт плич ют пУтем ПРИВИВКИ культ фы на скошрт-ном  г пе .чтих

дрожжей к 100 мл картоЛр ьро-глюкозной среды, инкубировани  при 30°С в 24 ч и последующего разбавлени  этой водой до получени  объема, который в дес ть раз превыш ет исходный объем. ПОРЦИИ приготовленного таким обр зом инокулума объемом 1 мл, содержащие 6X10 колоний клеток дпожжей на 1 мл. добавл ют к порци м по 10 мл картофельно-глюкозной среды (рН 6,0), содержащей 0,5; 1.2; 4: 8: Ifi и

0 32 мг/мл ферментного препарата Pellicularia ,sasakii. полученного по примеру 1, соответственно . Инoкyлиpoвaнн пo кубируют в стационарных услови х ппи 35°С в течение 24 ч и пос.не этого определ ют количе тво лизиров нрых к.петок C ndid   1Ьir п«;. Полученные результаты представлены ниже.

ir

Число клеток колоний на 1 мл среды

Отсутствует2X10

0,51X10

17X10

24X10 42X10 8О

16О

32О

Пример 13. Определ ют ферментативные активности сложных ферментов, которые получены из культур Pellicularia sasakii и Pellicularia filamentosa по способам, описанным в примерах 4 - 2, соответственно. Определение ферментативных активностей осуществл ют следующим образом, (t) Активность целлюлазы

б мл ферментного водного раствора (рН 4,0), содержащего 1% ферментного препарата (сухое порошкообразное состо ние) помещают в L-образную трубку и в раствор, наход щийс  в этой трубке, погружают 2 кусочка фильтровальной бумаги (1 смХ1 см). Этот раствор встр хивают при 40°С посредством встр хивател , совершающего возвратнопоступательное движение. Измерение осуществл ют до тех пор, пока вс  фильтровальна  бумага полностью не разрушитс . Активность целлюлазы рассчитывают согласно уравнению

150

1000,

Активность -: (А ) ( П

где X означает врем  (мин), продолжаюСвойства сложных ферментов, полученных из Pellicularia sasakii Свойства сложных ферментов, полученных из Pellicularia filamentosa

18

щеес  до tex пор, пока кусочкй филы-ровальной бумаги полностью не разрушаютс ; Y - объем (мл) используемого ферментного раствора .

(и) Активность р-1,3-глюкозы

0,5 мл раствора ламинарина концентрации 1 % помещают в испытательную трубку и затем добавл ют 0,5 мл разбавленного ферментного раствора (рН 5,0), эту смесь нагревают при 40°С в течение 30 мин. После этого определ ют количество глюкозы, присутствующей в реакционной смеси, использу  колориметрический способ. 1 мг глюкозы, образующейс  в реакционной смеси, считают соответствующей единице активности р-1,3-глюканазы на 0,5 мл указанного разбавленного ферментного раствора. (Hi) Активность хитиназы Эту активность измер ют, использу  1 мл

суспензии 1%-ного порошкообразного (фракци  100 меш) пoли-N-aцeтилглюкoзaминa (рН 5) и при протекании химической реакции меладу 1 мл разбавленного ферментного раствора при 40°С в течение 2 ч.

Образование 1 мкг/мл N-ацетилглюкозамина в реакционной смеси рассматриваетс  соответствующим одной единице активности хитиназы на 1 мл указанного ферментного раствора .

Оптимальную температуру и оптимальную величину рН соответствующих ферментных активностей также измер ют дл  ферментных препаратов, полученных из Pellicularia sasakii и Pellicularia filamentosa.

Полученные результаты представлены в табл. 5 и 6.

Таблица 5

Claims (3)

1. Таблица 6 Характеристика используемых микроорганизмов . Согласно таксономии, разновидность Pellicularia относитс  к семейству Corticiaceal пор дка Aphyllophoralls, принадлежащего к подклассу Homolasidiae класс Basidomycetes. Разновидность Pellicularia sasakii, который, как известно, вызывает заболевание рисовых растений. Разновидность Pellicularia filamentosa, который , как известно вызывает заболевание картофел , называемое черной коростой. Известны некоторые штаммы разновидности Pellicularia filamentosa, выделенные согласно методике АТСС (сбор культуры американского типа) AWo 14701, 14702, 14703 и 20206, а также штамм Pellicularia sasakii, выделенный согласно АТСС № 13289 1. Штамм Pellicularia sasakii выделен из пораженных участков рисового растени , зараженного заболеванием, вызывающим гниение «Shecth blight и этот щтамм был выделен согласно методике F.R.I 1170  понского научно-исследовательского института 2. Был выделен также штамм Pellicularia filarnentosa из поврежденных растений картофел , зараженных черной коростой, и этот штамм был выделен согласно методике F. R. I. № 1171, с той же датой. Тем не менее не было возможности отделить штаммы согласно F.R.I. №№ 1170 и 1171 от известных штаммов Pellicularia sasakii и Pellicularia filamentosa соответственно описанию, приведенному в  понской публикапии 3. Морфологические свойства, характерные дл  упом нутых выще щтаммов Pellicularia sasakii и Pellicularia filamentosa кратко описаны ниже. (i) Вегетативный мицелий находитс  в волокнистом виде или имеет форму шл пки гриба , и вначале бесцветный, он превращаетс  в желтовато-коричневый в процессе созревани , (ц ) Этот мицелий обычно имеет диаметр 8-12 мкм. (Ш) Образуетс  склероций (ш) Базидий имеет форму цилиндра или обратную  йцевиднуЕО форму и несет четыре или восемь ответвлений. (о) Получаютс  бесцветные споры с гладкой поверхностью. (vi) Гимений (спорообразующий слой плодового тела)  вл етс  плоским. (уи) Плодовое тело образует сетчатую оболочку . Штаммы Pellicularia sasakii и Pellicularia filamentosa могут различатьс  один от другого тем, что Pellicularia sasakii вызывает заболевание рисовых растений, св занное с гниением , а Pellicularia filamentosa вызывает заболевание черную коросту растений картофел  и заболевание черную ножку баклажанов; кроме того, Pellicularia sasakii образует склероций , окрашенный в черновато-бурый цвет, размером 5-13 мм, базидий размером 8X9 мкм и споры размером 9X7 мкм; а Pellicularia filamentosa образует склероций, окрашенный в бурый цвет размером 1X3 мм, базидий размером 15X8 мкм и споры размером 9X7 мкм. Однако некоторые- таксономеры показали, что Pellicularia sasakii  вл етс  естественной разновидностью filamentosa. Формула изобретени  1. Способ получени  фермента дл  лизиса клеток микроорганизмов путем культивировапи  их продуцентов на питательной среде, содержащей источники углерода и азота с последующим выделением фермента из среды, отличающийс  тем, что, с целью получени  фермента с более высокой литической активностью, в качестве продуцентов используют микроорганизмы рода Pellicularia. 2. Способ по п. 1, отличающийс  тем, что из рода Pellicularia используют вид Pellicularia sasakii. 3. Способ по п. 1, отличающийс  тем, что из рода Pelliculari используют вид Pellicularia filamentosa. Псточники информации, прин тые во внимание при экспертизе: 1.«Сбор культуры американского типа, Каталог Штаммов, изд. 9, 1970, с. 120.
2. 2.Научное и технологическое агентство Японии Inage, Chiba, City, Япони , 8 но бр  1971.
3. 3.«Справочник по микробиологии, Токио, 1957, с. 376-377.