SE407065B - Cellveggupplosande kompext enzym isolerat ur odlingsmedium innhallande pellicularia saskii och/eller pellicularia filamentosa - Google Patents

Description

is 20 25 30 35 1216381-91, kvävekällor, för alstring och ansamliq;i'medlet, varefter dessa komplexa enzymer isoleras från medlet.

De cellväggsupplösande komplexa enzymerna enligt föreliggande uppfinning, vilka är av det slag som framgår av ingressen till det bifogade krav l, har kännetecken som framgår av något av de bifogade kraven avseende enzym. g _ Sättet för framställning av sådant enzym har kännetecken som framgår av bifogade patentkrav avseende sätt.

Enligt gällande klassifikationsprinciper hör släktet Pellicularia till familjen Corticiaceal i ordningen Aphyllophorales, som hör till underklassen Homolasidiae av klassen Basidomycetes. Som kända exempel på kända arter av släktet Pellicularia, som kan användas enligt föreliggande uppfinning för framställning av det cellväggs- upplösande enzymet, må nämnas de kända arterna Pellicularia sasakii, som är känd för att orsaka bladrost pá risplantor och den kända arten Pellicularia filamentosa, som ger upphov till svart skorv på potatisplanta. Varieteter av Pellicularia filamentosa är deponerade under ATCC nr 14701, 14702, 14703 och 20206 och en varietet av Pellicularia sasakii är deponerad under ATCC nr 13289, sid. 120 i "Catalogue of strains“ 9th Edition (1970) av The American Type Culture Collection. I Vi har isolerat en varietet av Pellicularia sasakii ur en sjuklig förändring av bladrostinfektionen på risplanta och deponerat denna organism under beteckningen F.R.I. No. 1170 i den japanska depositionsinstitutionen'"Fermentation Research Institutet" , Agency of Industrial Science & Technology of Japan, Inage, Chiba City, Japan, (1971-ll-08). Denna varitet deponerades i American Type éulture Collection, Rockville, Maryland, 1972-12-12 och har betecknats ATCC nr 20 365.Vidare har en varietet av Pellicularia filamentosa isolerats ur sjuklig förändring av svartskorvinfektion på potatis.

Denna variant är deponerad under beteckningen F.R.I. No. 1172 (samma dag).Denna varitet deponerades i ATCC 1972-12-12 under be- teckningen ATCC nr 20 366. Emellertid har det inte varit möjligt att särskilja varianterna F.R.I. No. 1170 och F.R.I. No. 1172 från de kända varianterna av Pellicularia sasakii respektive Pellicularia y filamentosa med hänsyn tagen till vad som sägs i den japanska publikationen "Microbiology Handbook, p. 376-377, Tokyo (publicerad 1957-12-25).

Morfologiska egenskaper som är gemensamma för de nämnda 10 15 20 2-5 30 35 H0 7216381-9 3 varianterna av Pellicularia sasakii och Pellicularia filamentosa kan kort beskrivas enligt följande: 1) Det vegetativa myceliet har fibrös form eller hattform och är ursprungligen färglöst, men ändrar vid åldring färg till gulaktigt brunt. . _ ' 2) Myceliet har vanligen en diameter av 8-12 pm. 3) Sklerotium är utbildat. Ä) Basidium har formen av en tunna eller obovoid och har H eller 8 grenar. 4) Färglösa sporer med jämn yta bildas. 6) Hymenlum är plant. 7) Fruktkroppen bildar ett pungformat membran.

Arterna Pellicularia sasakii och Pellicularia filamentosa kan skiljas från varandra på att Pellicularia sasakii orsacar blad- rostsjukan på risplanta och Pellicularia filamentosa svartskorv- sjukan på potatis samt "damping~off"-sjukan på äggplantan, samt också att P. sasakii bildar mörkbrunfärgade sklerotier på 5~13 mm, basidiestorlek 18 x 9 pm och sporstorlek 9 X 7 um. P. filamentosa bildar brunfärgade sklerotier på 1-3 mm, basidiestorlek 15 x 8 um och sporstorlek 9 x 7 um. Emellertid har några systematiker kon- staterat att Pellicularia sasakíi_blott är en naturlig variant av arten Pellícularia filamentosa.

Vilket som helst av de ovan nämnda varianterna av P. sasakii och P. filamentosa kan användas vid utförandet av sättet enligt föreliggande uppfinning för alstring av det cellväggupplösande komplexa enzymet. .

Vid utförandet av sättet enligt uppfinningen kan en varietet av släktet Pellicularia, särskilt Pellícularia sasakii eller Pellicularia filamentosa, odlas antingen 1 flytande odlingsmíljö eller i fast odlingsmiljö med användning av känd fermenteringsteknik.

Det är vanligen lämpligt att genomföra odlingen av Pellicularia- varieteten vid en inkubationstemperatur på 15-HOOC under H8-2MO h, ehuru odlingsförhållandena kan variera i beroende av det använda odlingssättet.

Den kultur i vilken Pelliculariavarieteten odlas vid sättet enligt uppfinningen skall innehâllaessimilerbara kol- och kväve- källor. Exempel på lämpliga kolkällor är kolhydrat, sådana som stärkelse, glukos, sukros, vetekli, rískli o.dyl. Exempel på lämpliga kvävekällor är ammoniumsalter, nitrat, pepton, köttextrakt, jäst- extrakt och avfettat sojabönmjöl etc. Det är gynnsamt att använda .....~.-w-.fl..~=s.a.-n.n.._.....-_~.-_. .

LMM...- . 10 15 20 25. 30 35 1216381-9 k lämplig mängd växtbefrämjande ämnen, exempelvis vitaminer, som be- ståndsdel i odlingsmíljön. Man kan också sätta till pulver av torkad jäst, Chlorella och/eller svamp etc. för att understöda enzympro- 'duktionen. Dessutom kan kulturen tillsättas oorganiska salter, såsom kaliumsalter, kalciumsalter, magnesiumsalter, järnsalter, fosfat etc, för tillförsel av olika spårelement, vilka är väsent- liga för tillväxten av Peilicuiariaarten.

Kultiveringen av Pellicularia kan försiggå tills tillräcklig mängd av önskat enzym bildats och samlats i kulturen. Det är lämpligt att genomföra odlingen av Pellicularian under aerobiska förhållanden.

Vid odling i vätska är det lämpligt att hålla 20-3500 under H8-120 h under aerobíska, vätta odlingsförhållanden. Vid fast kultivering är det lämpligt att odlingen genomförs vid 20-35°C under 3-10 dygn.

Det cellupplösande komplexa enzymet framställs och samlas i kulturmiljön under odlingen. Ett överskikt i det kulturspad som fås vid bortfiltrering eller bortcentrifugering av fast material, såsom mycelium och fast återstod i kulturen, kan användas som sådant för cellupplösning vid olika mikroorganismer. Ett sådant överskikt kan också frystorkas så att man får ett rått enzympreparat. Den erhållna fasta kulturen extraheras med vatten eller buffrat vatten med pu u,o-7,0, varvid man får ett vattennaitigt extrakt innehållande det komplexa enzymet, vilket kan användas på samma sätt som det först nämnda filtratet.

För att isolera det komplexa enzymet i form av ett renare enzympreparat, kan det enzymet innehållande odlingsmodlet befrias från fastsubstans, exempelvis genom filtrering eller centrifugering, eller kan extraheras med vatten eller buffrat vatten. Erhållen rå vattenlösning av enzymet kan sedan behandlas med ett känt avsalt- ningsmedel, exempelvis ammoniumsulfat, natriumkloríd etc., eller med ett med vatten blandbart organiskt lösningsmedel, exempelvis lägre alifatiska alkoholer, såsom metyl~ eller etylalkohol, eller aceton, för utfällning av enzymet ur den råa lösningen. För ytterligare rening kan enzymet lösas i lämplig bufferlösning, exempelvis 0,01 M acetatbuffrat vatten, varefter enzymlösningen kan underkastas en dialys-eller gelfïltreringsprocess. Den så erhållna renade enzym- lösningen kan därefter frystorkas, så att man får ett rent enzym- preparat, som väsentligen består av det önskade komplexa enzymet.

De av Pellicularia sasakii och Peiiicularia filamentosa ' enligt förfarandet enligt uppfinningen alstrad enzymen är lösliga i vatten, men olösliga i aceton och etanol och de 10 15 20 25 30 35 40 7216-381-9 5 har följande gemensamma egenskaper: a) De har verkan att upplösa levande och döda celler av bakterie, svamp, jäster, Basidiomycetes och Chlorella, f b) deras cellväggsupplösande verkan är stabil inom pH-området 3-9, varvid optimalt pH är i området 5-7, ' c) de är optimalt verksamma (cellväggsupplösningsaktivitet) inom temperaturområdet 30-HOOC, men den optimala-temperaturen variera» något i beroende av egenskaperna hos de mikroorganismer, vilkas celler skall upplöses, d) deras cellväggupplösande verkan är stabil vid låg tempe- ratur, men försvinner snabbt vid temperaturer över SOOC, e) deras cellväggupplösande verkan inhiberas i närvaro av Mffifl Ni” eller zn**, ' f) de har de enzymatiska verkningarna hos cellulas, glukanas, kitinas, protoas, hemi-cellulas och karboximetylcellulas samt g) de består väsentligen av delenzymer, som vardera har rmolekylvikt på minst SO OOO.

Det kan antas att de av Pellicularia sasakii och Pellicularia filamentosaalstrade cellväggsupplösande komplexa enzymerna bildar en blandning av cellulas, glukanas, kitinas, proteas, hemi-cellulas och karboximetylcellulas i form av ett komplex och visar sin höga aktivitet vid upplösning av cellerna hos olika mikroorganismer på grund av en synergistisk effekt av verkan hos de olika enzymkompo- nenterna, ehuru det förutsätts att dessa komplexa enzymer, som alstrats av de olika arterna av Pellicularia, har sammansättningar som skiljer sig mer eller mindre från varandra, i det att det visar sig att dessa komplexa enzymer har mer eller mindre olika egenskaper och styrkor för de speciella enzymatiska aktiviteterna. f,De cellväggupplösande verkningar, som anges under punkterna b) - e) i det bifogade huvudkravet bestäms enligt följande procedur: En mängd av ett framställt enzympreparat får reagera med 5 ml av en suspension av celler av Candldn utilis IFO-0396, som har en begynnelseturbiditet motsvarande en optisk täthet (U,D) på 1,0, mätt vid våglängden 660 mnm. Reaktionun får töršlggå vid 3500 under 60 minuter vid pH 5,0. Efter denna reaktion mäts den optiska tät- heten hos den cellsuspension som innehåller de upplösta cellerna och oupplösta celler vid våglängden 660 mnm. När den reagerade cell- suspensionen visar en minskning på 1 % i turbiditeten (eller 0.D.- .värdet) jämfört med den ursprungliga cellsuspensionen, anses denna mängd.enzympreparat ha styrkan 1 enhet med avseende på cellväggupp- 10 15 20 25 a 30 35 HO 7215381-9 6 lösande verkan. Dessutom mäts cellulasaktivíteten, ß-1,3-glukanas- aktiviteten och kitanasaktiviteten (tidigare omnämnda) på sätt som 'beskrivs senare i Exempel 13.

När lysen, dvs upplösningen av cellväggen hos en mikro» organism, genomförs med hjälp av enzym enligt uppfinningen, får enzymet reagera med mikroorganismcellerna suspenderade i vatten.

Reaktionen kan lämpligen genomföras inom temperaturomrâdet 20-6000 och företrädesvis mellan 30 och HOOC vid pH 2-10, företrädesvis 3,k - 8,0. Använd reaktionstemperatur och pH kan väljas till lämpliga värden under hänsynstagande till egenskaperna hos de mikroorganismer, vilkas celler skall upplösas under inverkan av enzymet. Mikroorga- nismcellerna kan vara antingen levande eller döda vid kontakten med enzymet. I vilket fall som helst kan väsentligen samtliga celler upplöses på grund av upplösningen av cellväggen och innehållet (intracellulära ämnen) hos cellerna frigöras i vattenfasen av cell- suspensionen under 20 timmar efter reaktionens början.

Vid utförandet av reaktionen mellan enzymet och mikroorganism- cellerna kan enzympreparatet tillsättes en cellsuspension i vatten, vilken har buffrats till ett pH som är optimalt för den enzymatíska form av ett fast pulver eller en vattenlös- reaktionen, antingen 1 ning av detta, eller också kan kulturlagen eller ett kulturextrakt tillsättes. Cellerna kanockså tillsättas en lösning av enzympreparat i vatten eller i en bufferlösning, som har ínställts till ett för den enzymatiska reaktionen optimalt pH. War reaktionen fullbordats, har cellerna helt lösts utan att lämna någon fast återstod i lös- ningen. I vissa fall kvarblir emellertid en viss mängd fast substans även efter det att reaktionen fullbordats. Genom bestämning av gändringen i cellsuspensionens turbiditet eller koncentrationen av en löslig komponent i cellprotoplasman eller genom mikroskopisk iakttagelse av tillståndet hos cellerna i suspension kan man bestämma om cellerna upplösts i önskad grad. Pâ detta sätt kan man få en cellösning i vatten, i vilken materialet i cellmembranen och cellerna: protoplasma lösts i vatten tillsammans med det använda komplexa enzymet. Om så önskas kan den så erhållna cellösningen filtreras för borttagning av möjligen förekommande fast återstod. Denna lösning kan också om så är erforderligt värmas för avaktíveríng av kvar- u ' varande enzym. Sa erhållen cellösning kan därefter behandlas genom. avvattning eller koncentrering 1 vakuum för att ge en torr produkt.

Cellösningen kan också behandlas med lämpliga medel, exempelvis extraktion eller kromatografi, för utvinning av användbara ämnen .7216381-9 7 därur.

Enzymet enligt föreliggande uppfinning kan lysera cellerna, eller riktigare cellväggon, hos många olika mikroorganismer, såsom bacteria, fungi, jäst, Basidiomycetes samt Chlorella, en alg, 5 Denna egenskap hos enzymet enligt uppfinningen medför avsevärda fördelar jämfört exempelvis med det kända enzym, som är isolerat från kultur av Corticium rolfsii enligt det sätt som beskrivits i den japanska patentskriften 11978/67. Det entym som isolerats ur kultur av Corticium rolfsii har sitt optimala område inom pH 2,0-2,5 10 och begränsad förmåga, i det att det blott kan upplösa cellväggen hos jäst och Chlorella. Mikroorganismerna av släktet Corticium kan _ skiljas från mikroorganismer av släktet Pellicularia genom att de förstnämnda alstrar ett kontinuerligt hymenium, i vilket basidier ligger sida vid sida på ett kontinuerligt sätt, medan de sistnämnda 15 alstrar ett diskontinuorligt hymenium, i vilket bnsidierna ligger på avstånd från varandra.

Medelst enzym enligt uppfinningen kan man sålunda upplösa mikroorganismceller, innefattande hacteriu, fungi, jâstcr, Basidiomycetes och Chlorella, varvid man behandlar cellerna suspen- 20 derade i vattenhaltigt medel, med enzym av känd varietet av _“"Pellicularia sasakii eller Pellicularia filnmentosau Ett enzym enligt uppfinningen kan användas för extraktion av användbara intracellulära substanser ur cellerna samt vid fram- ställning av ett koncentrerat extrakt av näringsmedel eller andra 1 25 cellprotoplasman hos olika mikroorganismer, såsom jäst, Chlorella, bacteria och fungi, förekommande användbara ämnen. För sådana ändamål behandlas cellerna med enzymet i vatten för upplösning av cellväggen och frigörande av protoplasman, varvid man får en cellösning, som därefter kan dehydreras partiellt eller fullständigt 30 så att_man får ett kgncentrat eller torrt pulver. Dessutom kan ett enzym enligt uppfinningen användas för att förhindra-förstörelse av födoämnen eller drycker genom att dessa tillsätts en verksam mängd av enzym, som får upplösa bakterie- eller svampceller, som möjligen förekommer eller kan inkomma i födan respektive drycken och som 35 vid frånvaro av enzymet kan åstadkomma förstörelse. Enzym enligt föreliggande uppfinning kan sålunda få vidsträckt användning på många områden, exempelvis i födoämnesindustrin, i den farmaceutiska industrin, foderindustrin och pesticidindustrin. 3 Uppfinningen framgår ytterligare av följande exempel: 10 15 20 25 30 35 _ organismer, inklusive bacteria, fungi, 7216381 -9 Exempel 1 I en konisk kolv på 300 ml infördes 19 g vetekli, 1 g torkad jäst och 18 ml vatten. Kolven värmdes därefter och innehållet skakades, så att man fick en jämn pastaartad blandning. Den så er- hållna kulturen behandlades med ånga vid 12000 under 20 minuter för sterilisering. En förrådskultur av Pellicularia sasakii (F.R.I.

No. 1170) inokulerades på den sterlla kulturen. Fast kultivering av Pellicularia-arten genomfördes under 120 h vid konstant temperatur, 28°C. Den erhållna kulturen blandades med 80 ml av en acetatbuffer- lösning, pH 4,0, och blandningen skakades vid rumstemperatur under 1 h, så att enzymerna extraherades i den flytande fasen. Blandningen filtrerades därefter under tryck och det erhållna filtratet centrifu- gerades, varvid man fick 70 ml av en klar lösning,innehållande det av Pellicularia sasakii bildade enzymet. Till denna klara lösning sattes 210 m1 aceton, så att enzymet utfaildes. 'sanningen utfiltre- rades och torkades, varvid man fick 700 mg enzympreparat i pulver- form. Detta enzympreparat visade sig vara aktivt för upplösning av cellväggen hos en mångfald mikroorganismer, inklusive bacteria, fungi, jäst, Basidiomycetes och Chlorella.

Exempel 2 I en- 300-ml-kolv ifylldes 10 g vetekli, 16 g riskli, 2 g pepton och 20 ml vatten. Kolven värmdes och innehållet skakades tills man fick en jämn pastaformig blandning. Den så erhållna kul- turen ångades vid 12006 under 20 minuter för sterilisering. En för- rådskultur av Pellicularia filamentosa (F.R.I. No, 1172) inokulerades på den sterila kulturen. Fast kultivering av Pellicularia-arten genomfördes vid 2800 under 170 h. Den så erhållna kulturen blandades därefter med 80 ml vatten och blandningen skakades vid omgivninge- temperatur, så att bildat enzym extraherades till vattenfasen. Bland-_ ningen filtrerades under tryck och det erhållna filtratet centrifu- gerades så att man fick en klar lösning innehållande det.av Pellicularia filamentosa bildade enzymet. Till den klara lösningen sattes ammoniumsulfat till 70 % mättning, varvid enzymet utfälldes.

Fällningen utfiltrerades och torkades, varvid man fick 1 g enzym- preparat i pulverform. Detta enzympreparat visade sig vara aktivt med avseende på upplösningen av cellväggen hos en mångfald mikro- jäster, Basidiomycetes och Chlorella.

I en konisk 1-1-kolv infördes 9 g sukros, 6 g riskli, 16 g 10 15 20 30 35 H0 7216381 '-9 9 pulver av torkad svamp (Cortinellus shiitake), 1,5 g ammoniumsulfat, ,S g monokaliumfosfat, 0,3 g kaliumklorid, 0,3 g magnesiumsulfat och 0,003 g järnsulfat. Därefter tillsattes 300 ml vatten för upp- lösning av lösligt material. Kulturen i form av vattenlösning ste- riliserades genom ångning vid 120°C under 20 minuter. En förråds- kultur av Pellicularia filamentosa (F.R.I. 1172) inokulerades i den sterila flytande kulturen. Skakningskultivering av Pellicularia- arten genomfördes vid 2300 under 120 h. Den så erhållna kulturlagen filtrerades för borttagning av förekommande fast material, och rhâllet klart filtrat innehållande enzym koncentrerades till en 4 I e 'tredjedel av sin ursprungliga volym genom dialysering genom ett eialysmembran. Till den koncentrerade lösningen sattes H00 ml 99% etanol, rest vatten, så att det komplexa enzymet utfälldes.

Fällningen filtrerades och torkades och gav då H50 mg enzympreparat i pulverform. Detta enzympreparat visade sig vara aktivt med av- seende på upplösning av cellväggen hos en mångfald mikroorganismer, inklusive bacteria, fungi, jäster, Basidiomycetes och Chlorella.

Exempel H ' I en konisk 300-ml-kolv infördes 5 g finfördelat vetekli, g ammoniumsulfat, 0,5 g monokaliumfosfat, 0,1 g kaliumklorid, , g magnesiumsulfat, 0,001 g järnsulfat och 100 ml vatten. Kolvens innehåll steriliserades genom ångning vid 120°C under 20 minuter.

En förrâdslösning av Pellicularia sasakii (F,R.I. 1170) inokulerades i den sterila vätskekulturen. Skakningsinkubation genomfördes vid 2300 under 2% h medelst en roterande skakapparat för framställning av en flytande ympkultur. Dessutom placerades 200 g vetekli, 5 g pulver av torkad svamp (Cortinellus shiitake) och 160 ml 5%-ig lösning av ammoniumsulfat i vatten i fem träskålar. I varje skål Ü: O ...x MH blandades.materialen med varandra så att man fick en homogen bland- ning,som därefter steriliserades genom ångning. 20 ml av den ovan nämnda ympkulturen inokulerades på kulturen i varje skål. Kultive- rfnv under stillastående genomfördes vid 28°C under 96 h. Kulturerna i saålarna blandades och den blandade kulturen extraherades med M 1 acetatbufferlösning i vatten med pH H,O. Extraktet filtrerades under tryck och filtratet centrifugerades samt gav 3,6 l klar lösning innehållande det av Pellicularia sasakii bildade enzymet. Till denna klara lösning sattes ammoniumsulfat till 70 % mättning, så att enzymet utfälldes. Fällningen uppsamlades och togs upp i 900 ml vatten. Enaymlösningen-lyofilliserades i vakuum och gav.32 g enzym- preparat i form av pulver. Detta enzympreparat visade sig vara aktivt 10 15 20 25- 30 35 40 7216381-9 10 för upplösning av cellväggarna i en mångfald mikroorganismer, inklusive bacteria, fungi, jäster, Basidiomycetes och Chlorella. 7 Exempel 5 ' I var och en av två koniska kolvar på 300 ml infördes 19 g vetekli, lg torkad jäst och l8 ml vatten och innehållet i varje kolv värmdefi och skakades så att man fick en jämn pastaartad bland- ning. De så bildade kulturerna steriliserades genom ångning vid l20°C under 20 minuter. Förrådskulturer av Péllicularia sasakii och Pellicularia filamentosa inokulerades. Fast kultivering genomfördes under l20 h vid 28°C. Efter kultiveringen blandades de erhållna kulturerna med 80-ml-portioner av en 0,1 N acetatbufferlösning pH 5,0 och blandningarna skakades vid omgivningstemperatur under 1 h, så att de av de olika arterna av Pellicularia bildade ' enzymerna extraherades till'respektive flytande faser. Blandningarna filtrerades under tryck och de erhållna filtraten centrifugerades och'gav 70-ml-portioner av två klara lösningar, innehållande respektive komplexa enzymer. 7 Dessutom framställdes cellsuspensioner av fungi, jäster, bacteria och Chlorella i vatten av kulturer av Aspergillus niger, Penicillium steckii, Saccharomyces cerevisiae IFO-0209, Candida utilis IFO-0396, Candida albicans, Candida lipolitica och Lentinus edodes, var och en inkuberad i maltmiljö, kulturer av Bacillus subtilis och Lactobacillus lactis, vardera inkuberade i buljong- miljö, och kultur av Chlorella pyrenoidosa, inkuberad i Nakamura- miljö. Var och en av dessa cellsuspensioner placerades i tre provrör. 20-ml-portioner av de ovan nämnda tre klara enzymlösningarna till- sattes sedan de tre provrören, som vardera innehöll de respektive cellsuspensionerna. Innehållet i varje provrör skakades försiktigt under 20 h i vattenbad vid konstant temperatur på 350C, så att enzymerna fick reagera med cellväggarna för upplösning av cellerna i suspensionen. Suspensionerna betraktades under mikroskop för be- stämning av den grad, i vilken cellerna hade upplösts under inverkan av de Pellicularia sasakii och Pellicularia filamentosa bildade enzymerna.

Graden av upplösning av cellväggarna bestämdes enligt föl- jande skala: _ Symbolen ++ anger att upplösning av samtliga celler kunde iakttas.

Symbolen + anger att upplösning av större delen av cellerna 'kunde konstateras. 7216381~9 ll Symbolen i anger att en mindre del av cellerna upplösts.

Symbolen - anger att ingen upplösning av cellerna kunde iakttas.

Erhållna provresultat framgår av följande Tabell 1. För jäm- förelse upprepades provningsförloppet med tillsats av 2 ml acetat- bufferlösning vid pH 5,0 i stället för de ovan nämnda klara enzym- lösningarna. Vid de jämförande proven kunde ingen upplösning av cellerna observeras.

TABELL 1 Cellugglösning Behandlade Tillsats Enzym av Enzym av celler av av enzym Pellicularia Pellicularia * sasakiiw filamentosa Aspergillus Tillsatt ++ ++ niger Icke tillsatt - - Penicillium Tillsatt ++ ++ Stedul clcke tillsatt _ _ Saccharomyces Tillsatt ++ ++ Cerevisiae Icke tillsatt - - Candida Tillsatt ++ ++ utllls Icke tillsatt - - Candida Tillsatt ++ ++ alblcans Icke tillsatt - - Candide Tillsatt ++ ++ limlitica Icke tillsatt _ _ Lentinus Tillsatt + + ed°des Icke tillsatt _ _ Bacillus Tillsatt 1 i Subtilis Icke tillsatt - - Lactobacillus Tillsatt + + lactls Icke tillsatt - - Chlorella Tillsatt + + Pyremidæa Icke tillsatt _ _ 10 15 20 25 30 35 7216381-9 12 Exempel 6 Cellsuspensioner i fysiologisk saltlösning framställdes av kulturer av Candida utilis IFO-0396, Saccharomyces cerevisiae IFO-0209 och Hansenula anomala IFO~O122, som samtliga erhållits genom skakningskultivering av mikroorganismcn i flytande odlings- ' medel innehållande 3 % giukøs, o,s % (NHg)2sog, 0,5 % Kngroh, 0,2 % Naci, 0,2 % Mgsog- 7H2o och 0,1 % jäsnextrakt (allt räknat i vikt) vid pH 5,2 under 20 h, varvid skakningen utfördes med en rotator vid 200 varv per minut. En droppe av varje på detta sätt framställd cellsuspension lades på en glasplât och en droppe avfiden klara lösningen av enzymet av Pellicularia sasakii enligt Exempel 1 ' tillsattes droppen cellsuspension på glasplattan. Vätskorna i dropparna blandades snabbt av varandra och täcktes därefter med ett täckglas. Glasplattan hölls vid konstant temperatur 30° och ändring- arna i cellerna i vätskan på glasplattan lakttogs under mikroskop.

Man kunde se att cellerna gradvis upplöstes allteftersom Liden fort- gskred. Graden av cellupplösning iakttogs och uppskattades enligt följande skalaz- Symbolen + anger att cellupplösning försiggick.

Symbolen ++ anger att cellupplösningen fortskred.

Symbolen +++ Symbolen - anger att ingen cellförändring kunde iakttas.

De erhållna provresultaten framgår av följande Tabell 2. Som jämförelse upprenades försöken med tillsats av en droppe acetat- buffešlösningen I i stället för enzymlösningsdroppen. Vid de jämförande prpven kunde ingen upplösning av cellerna iakttas. anger att upplösning av samtliga celler fullbordatz TABELL 2 Cellupplösningsgrad vid Mikroorganism Enzymtillsats tiden (minuter)_ _ N 1 3 5 10 15 30 _ 60 90 Candida Tillsatt + ++ ++ +++ utllls icke tillsatt _- _ _ _ _ _ , _ Saccharomyçese Tillsatt - - -v sv» °ereV1s*ae icke tillsatt _ _ _ _ _ _ _ _ Hansenula Tillsatt - - ~ - | ++ ++ +++ anomala Icke tillsatt 7216381-9 13 fišgmpel Z I en konisk gaoo-mi-koiv infördes zo g vetexii, 0,5 g torrt svamppulver (Corinellus shíítake) och 16 ml 5%-ig ammoníumsulfat- lösning i vatten, varefter kolvinnehållet värmdes och skakades så 'att man fick en jämn pastaartad blandning. Denna kulturmiljö steri- liserades med ånga vid 1200 under 20 minuter. En förrådskultur av Pellicularia filamentosa inokulerades och fast odling genomfördes _vid 25°C under 144 h. Den erhållna kulturen blandades med 8 ml av- 10 15 20 25 30 35 joniserat vatten och blandningen skakades vid omgivningstemperatur under 1 h för extrahering av det av Pellicularia filamentosa alstrade enzymet till vätskeskiktet. Blandningen filtrerades under tryck och filtratet.oentrifugerades, varvid man fick 65 ml klar lösning inne- hållande det komplexa enzymet. Till denna klara lösning sattes ammoniumsulfat till 70 % mättning,så att det komplexa enzymet ut- fälldes. Fällningen frånïiltrerades och torkades och gav därvid 1,7 g enzympreparat i form av ett pulver.

Detta enzympreparat löstes 1 en acetatbuffcrlösning, pH 5,0, så att man fick en enzymlösning innehållande 1 % enzympreparnt. 10 ml av denna cnzymlösning placerades i ett L-format rör, som dessutom tillsattes 1 g torkad Chlorella eller 1 g torkad jäst (vilken var en art av Candida, som inkuberats med användning av en kulturmiljö innehållande paraffínisk kolvätefraktion av petroleum- olja som kolkälla. Det L-formade röret skakades vid konstant tempe- ratur, ÄOOC, så att enzymen fick reagera med jäst- respektive Chlorellacellerna för upplösning av cellväggen. Efter 1 resp. 3 h tillsattes 3 ml natriumhydroxidlösning i vatten så att reaktions- blandningen i röret fick ett pH på omkring 7. Blandningen skakades därefter åter under 15 minuter och centrifugerades sedan för sepa- rering av fast material. Den erhållna klara lösningen analyserades med avseende på innehåll av socker och proteiner som lösts ut ur cellerna. Sockermängden bestämdes kolorimetriskt vid 530 mnm med användning av 3,5-dinitro-salicylsyra som färgutvecklande medel och angavs som mängd glukos. Proteinmängden beräknades genom bestämning av kväveinnehållet i proteinerna medelst den kända Kjeldahl- ninhydrinmetoden och multiplicering av det konstaterade kväveinne- hållet med 6,25. _ De erhållna provresultaten framgår av Tabell 3. Som jämförelse upprepadcs proven med tillsats av 10 ml acetatbufferlösning, pH 5,0, i stället för enzymlösning. i, , 10 15 20 25 7216381-9 1h TAEšLL_3 Mikrorga- Enzymtillsats Reaktions- Ur cellerna upplösa ämnen nism tid (h) Qmjï) " ___ Socker _ 2roteig§;_ _ Torkad Tillsatt 1 70{2 291,0 jäst 3 75,11» 368,2 Ej tillsatt 1 5 7 95_1 3 516 95,1 ro rkaal Tillsätt 1 30 , 3 162, 2 chlorella _ 3 3k,1 a198,9 Ej tillsatt 1 o,1+ 40,1 3 o,1+ ho,6 Ešçmpel 8 Avsikten_med detta exempel är att Visa att det komplexa enzy- met enligt föreliggande uppfinning kan användas för att förhindra förstöring av olika födoämnen och drycker, såsom tomatjos, potatis- jos och apelsinjos. 10-ml-portioner av tomatjos, potatisjos och apelsinjos hälldes i små skålar. Det enzympreparat, som framställts enligt Exempel 1, renades med hjälp av ett jonbytesharts. 0,1 mg, 1 mg respektive _10 mg av det erhållna renade enzympreparatet tillsattes respektive skålar. Några skålar innehållande matvara eller dryck, men utan tillsats av enzympreparat, användes som kontroll. Skålarna hölls i-f luft vid 28°C under viss tid och därefter bestämdes förstörelsegrad genom observation av missfärgning, utseende och lukt hos safterna.

Provresultaten framgår av följande Tabell k. I denna tabell anger symbolen + att saften blivit dålig och symbolen 3 anger att den inte förstörts. 10 mi 20- 25 30 7216381~9 1 5 Trißßngjt _ Tid (dvgn) Material Enzvmtillsats _1_ _g_ _&_ _1_ Tomatjos Ingen tillsats - '+ + + 0,1 mg/10 ml_ - - - + 1 mg/10 - ~ - - 10 mg/10 ml - - - - - Potatisjos Ingen tillsats + + 0,1 mg/10 ml - - 1 mg/10 ml e - - 10 mg/10 ml - ~ - f ' Apelsinjos Ingen tillsats ï - - + + 0,1 mg/10 ml ~ - - ~ 1 mg/10-ml ~ - - - 10 mg/10 ml - - - - Exemgel 2 Till 100 g av en torkad cellkaka av jästen Candide lipolitica sattes 1 1 av en O,5%-ig vattenlösning av det enligt Exempel 2 framställda enzympreparazet. Blandningcn hölls vid 3500 under 30 min. för att den enzymatiska reaktionen skulle få fortlöpa, varefter reaktionsblandningen tillsattes 1 1 0,2 N natriumhydroxidlösning.

Blandningen värmdes och hölls under 30 minuter vid SOOC, så att proteinet i jästcellerna extraherades till vattenfasen. Det er- hållna extraktet centrifugerades så att cellkakan frånskiljdes och den som överskikt erhållna lösningen inställdes till pH H,O genom tillsats av 6 N vätoklorid; så att proteinet utfälldes vid den isoelektriska punkten. Mängden utfällt protein-motsvarade 76 % av hela proteininnehâllot i jästcellerna. När provet Upprepades utan tillsats av cnzympreparatet utvanns blott 15 % av jästccllernas hela proteininnehåll.

Ex§m2§lllQ 10 g av en massa Lestående av torkade celler av Candide utilis tillsattes 100 mi vattenlösning (pH 6,0) innehållande 0,5 % enzympreparat framställz enligt Exempel 3, Blandningen hölls vid 10 15 20 25 30 'vattenlösning (pH #,O) innehållande 1 ' enzympreparatet. Den erhållna blandningen skakades försiktigt vid 7216381-9 16 3500 under 1 h, så att enzymerna reagerade med jästens cellväggar.

Reaktionsblandníngen frystorkades så att man fick ett pulver be- stående av den enzymbehandlade Candida-jästen. Proceduren upprepades utan enzympreparatet för framställning av ett pulver bestående av blott frystorkadCandida-jäst Den ursprungligen torkade Candida- jästen obehandlad, den enzymbehandlade Candida-jästen och den blott frystorkade jästen behandlades med pepsin för uppskattning av l digestibiliteten. Do erhållna resultaten framgår av följande Tabell 5. f TABELL Prov Digestibilitet vid pepsin Torkad Candida-jäst obehandlad 58,% % (jämförelse) Blott frystorkad Candida-jäst 60,2 % (jämförelse) Candida-jäst behandlad med _- 97,7 % enzym enligt föreliggande uppfinning Exempel 11 _ Till en mängd klar lösning innehållande det komplexa enzymet av Pellicularía sasakii, som erhållits enligt Exempel 5, sattes dubbla volymen aceton, så att det komplexa enzymet utfälldes. Fäll- 'ningen uppsamlades och torkades så att man fick ett enzvmpreparat i form av pulver. 20 g av en våt kaka (fastsubstansinnehâll H8 viktprocent) bstående av celler av Candida utilis sattes till 100 ml % av det nämnda pulverformiga 35°C under 1 h för enzymatisk reaktion. Därefter centrifugerades _reaktionsblandningen för frånskiljning av kvarvarande fast material.

Lösningen i överskiktet lyofïüüserades, varvid man fick 7,8 g torrt pulverformigt extrakt av de lösliga intracellulära ämnena i cellerna av Candida utilis. Vid analys visade sig detta torra extrakt inne- hålla 54,3 % råproteiner, 4,0 % råfetter, 1,7 % fibröst råmaterial, 6,H % aska och 33,6_% lösliga kväveföreningar._ När processen upprepadcs med tillsats av 100 ml acetatbuffer- lösning, pH H,O, i stället för enzymlösníngcn fick man blott 1,7 g torrt pulver efter lyofilliseringen av lösningen. 10 15 20 25 30 7216381 '-9 17 ELsm2el_l2 .

En inokulering av Candida albicans, en patogen jäst, på 100 ml potatisglukosmedium framställdes av en kultur av denna jäst samt inkuberades vid 30°C under 24 h, varefter detta medium ut- späddes med vatten till 10 gånger ursprungliga volymen. 1-ml- portioner av den så framställda inokuleringsmassan (innehållande 6 x 10% jästcellkolonier/ml) sattes till 10-mléportioner av ett potatisglukosmedium (pH 6,0) innehållande 0,5, 1, 2, N, 8, 16_ respektive 32 mg/ml av det enzympreparat av Pellicularia sasakii som framställts enligt Exempel 1. De ínokulerade media inkuberades stillastående vid 3500 under 2% h, varefter antalet oupplösta celler av Candida albicans räknades. De erhållna resultaten framgår av följande Tabell 6. ïAEEkå_É Enzympreparatinnehåll i Antal cellkolonier ínkuberat medlum (ma/ml) ger ml medium Inget 2 X 106 0,5 1 X 105 1 ' 7 x 10” 2 U x 10% % 2 X 102 8 O 16 0 32 O lJà§flQs_3 __ Enzymatisk verkan bestämdes för de~komp1exa enàymer som- framställts ur kulturer av Pellicularia sasakii och Pellicularia filamentosa med processerna enligt Exemplen 4 resp. 2. Bestämningen av enzymatisk aktivitet genomfördes pà följande sätt: l) Cellulasaktivitet: Sml enzymlösning (pH 5,0) infördes i ett L-format rör och tvâ filterpapperstycken_(lcm x lcm) dränktes i enzymlösningen i röret. Lösningen skakades vid 40°C, och tiden till filterpapperstyckena fullständigt sönderdelats bestämdes.

Cellulasaktivitetens styrka beräknades enligt följande formel: igg . 1000 (x) Styrka = ' (y) 10 15 20 7216381-ett 18 där (x) är tiden (i minuter) tills filterpappersstyckena sönder- delats fullständigt och (y) är volymen (i ml) av den använda enzym- lösningen. 2) 5-1,3-glukanasaktivitet: 0,5 ml lösning av 1% laminarin infördes i ett provrör, varefter 0,5 ml utspädd enzymlösning (pH 5,0) tillsattes och blandningen värmdes och hölls vid ÄOÛC under 30 minuter. Därefter bestämdes mängden glukos i reaktions- blandningen kolorimetriskt. 1 mg i reaktionsblandningen bildad glukos fick motsvara 1 enheter a-1,3-glukanasaktivitet per 0,5 ml av den utspädda enzymlösningen. 3) Kitinasaktivitet: Donna aktivitet mättes med användning av 1 ml 1%-ig suspension av pulverformig (maskvidd nr 100) poly-N- aoetylglukosamin, pH 5,0, med vilket 1 ml utspädd enzymlösning fick reagera vid 45°C under 2 h. Bildning av 1 mcg/ml N-acetylglukosamin i reaktionsblandningen togs som motsvarande 1 enhet kitinasaktivitet per ml enzymlösning.

Optimal temperatur och optimalt pH för respektive enzymakti- viteter mättes också för de av Pellicularia sasakii och Pellicularia filamentosa framställda enzympreparaten. Resultaten framgår av följande tabeller 7 och 8.Dessa enzymaktiviteter mättes på den enligt exempel 5 framställda enzymlösningen.

TABELL 7 Egenskaper hos av P. sasakii- framställt enzym Enzymatisk aktivitet Styrka- Optimal Optimalt pH (enhet/g) tgmperatur ( C Cellväggupplösande 210 ,, 30 - 40 5 - 7 aktivitet " Cellulasaktivitet 500 HO ~ 50 5,0 ß-1,3-glukanas- 17¿O HO - 50 5,0 aktivitet Kitinasaktivitet 12,5 35 4,0 - 5,5 7216381-9 19 TABELL 8 Egenskaper hos av P. filamentosa framställt enzym_ Enzymatisk aktivitet Styrka Optimal Optimalt pH - (enhet/ml tåmperatur ( C) Cellväggupplösande 220 30 - 40 ' 5 - 7 aktivitet _ Cellulasaktívitet 500 HO - 50 5 g-1,3-glukanas- 17,2t HO - 50 5,0 aktivitet Kítínasaktivítet 12,0 35 H,O - 5,5

Claims (11)

7216381-9 ' ,, Patentkrav

1. l. Cellväggupplösande komplext enzym, isolerat ur ett odlings- medium innehållande den kända arten Pellicularia sasakii och/eller den kända arten Pellicularia filamentosa, och vilket har föl~ jande kännetecken: (a) aktivitet med avseende på upplösning av levande och döda celler av åtminstone Aspergillus niger; Penicillium steokii, Saccharomyces cerevisiae, Candida utilis, Candida albicans, Candida lipolytica, Lentinus edodes, Bacillus subtilis, Lacto~ bacillus lactis och Chlorella; (b) den cellväggupplösande aktiviteten är stabil inom pH- området 3-9 med optimalt pH inom området 5-7; (c) den cellväggupplösande aktiviteten är optimal inom temperaturområdet 30 till 40°C med optimal temperatur varierande i beroende av slaget av mikroorganism, vars celler skall upplöses; (d) den cellväggupplösande aktiviteten är stabil vid låg _ temperatur men upphör snabbt vid temperatur över 50°C; ++ _ av Mn_ I Ni '(e) den cellväggupplösande aktiviteten inhiberas i närvaro ++ eller Zn++; ___ (f) det utövar de enavmatiska aktiviteterna hos cellulas _ och-5-1,3-glukanas vid en optimal temperatur om 40-SOOC och optimalt _ o pH-värde om 5,0 hos kitinas vid en optimal temperatur om ca 35 C och optimalt pH om 4-5,5, hos proteas, hemicellulas och amylas; samt (g) det består väsentligen av enzymkomponenter, som vardera har molekylvikter på minst 50 000.

2. Enzym enligt krav l producerat av Pellicularia sasakii, k ä n n e t e c k n a t därav, att det har en cellulasaktivitet Ü med optimalt temperaturområde 40-SOOQ oth optimalt pH på 5,0, en ß-1,3-glukanasaktivitet som har ett optimalt temperaturområde 4Ö-50°C och ett optimalt pH på 5,0, samt en kitinasaktivitet, som har optimal temperatur vid 35oC och optimalt pH-område på 4,0-5,5. *

3. Enzym enligt krav l, producerat av Pellicularia filamentosa, k ä n n e t e c k n a t därav, att det har en cellulasaktivitet med ett optimalt temperaturområde 40-50°C och optimalt pH på 5,0, en 6-1,3-glukanasaktivitet med_optimalt temperaturområde 40-5090 _ 7216381-9 407 065 21 och ett optimalt pH på 5,0 samt en kitinasaktivitet med optimal temperatur 35°C och optimalt pH-område på 4,0-5,5.

4. Enzym enligt krav l, producerat av Pellicularia sasakii, k ä n n e t e c k n a t därav, att det är i form av ett pulver.

5. Enzym enligt krav l, producerat av Pellicularia filamentosa, k ä n n e t e c^k n a t därav, att det är i form av ett pulver.

6. Sätt att framställa ett cellväggupplösande komplext enzym enligt något av föregående krav, k ä n n e t e c k n a t därav, att man odlar en känd stam av den kända arten Pellicularia sasakii och/eller den kända arten Pellicularia filamentosa i ett odlingsmedel innehållande assimilerbara kolkällor och assimiler- bara kvävekällor för framställning och ansamling av det komplexa enzymet i medlet, varefter det komplexa enzymet isoleras från medlet.

7. Sätt enligt krav 6, k ä n n e t e c k n a t därav, att man odlar en känd stam av Pellicularia sasakii eller Pellicularia ~filamentosa.

8. Sätt enligt krav 6 eller 7, k ä n n e t e c k n alt därav, att man i flytande medel odlar den kända Pellicularia-stammen vid en temperatur inom området 20-35°C under en tid av 48-120 h under aeroba förhållanden.

9. Sätt enligt krav 7, k ä n n e t e c k n a t därav, att odlingen av den kända Pellicularia-stammen genomförs i fast od- lingsmedel vid en temperatur inom området 20-35°C under 3 till 10 dygn.

10. l0. Sätt enligt krav 7, k ä n n e t e c k n a t därav, att den kända stammen av Pellicularia sasakii eller Pellicularia filamentosa genomförs i ett odlingsmedel innehållande kli som en assimilerbar kolkälla och assimilerbara kvävekällor för bildning och ansamling av det komplexa enzymet i medlet, att medlet extra- heras med vatten eller buffrat vatten för framställning av ett lösningsextrakt i vatten av enzymet, att enzymet fälls ur extrak- tet genom utsaltning med ammoniumsulfat eller genom tillsats av aceton eller etanol, varefter fällningen torkas. 7216381", 22

11. ll. Sätt enligt krav 7, k ä n n e t e c k n a t därav, att den kända stammen av Pellicularia sasakii eller Pellicularia filamen- tosa odlas i ett flytande odlingsmedel innehållande asšimiler- bara kolkällor och assimilerbara kvävekällor under aeroba för- hållanden för bildning och ansamling av enzymet i det flytande medlet, att den erhållna kulturen filtreras för frånskiljande av fast material, att det erhållna klara filtratet koncentreras dia- lytiskt medelst ett dialysmembran, att det komplexa enzymet fälls ur det koncentrerade filtratet genom utsaltning eller genom till- sats av aceton eller etanol, varefter fällningen torkas. ANFÖRDA PUBLIKATIONER: US 3 658 650 (195-62) Andra pubLikationer: World directory of coLLections of cultures of mícroorganísms. Compiled by S M Martin ... Ed. by S M Martin & V B D Skerman ... New York 1972, p. 314, 388, 402. Chemical abstracts. 71(1969), ref. 46787 f ; 77(1972), ref. 2581 d.