CN1970731A - 利用黑曲霉制备高效生物铁载体的方法 - Google Patents

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孙红启
张为灿
赵越
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Abstract

本发明公开了一种利用黑曲霉制备高效生物铁载体的方法，由(1)菌种选择，(2)孢子悬液的制备，(3)液体发酵培养，(4)发酵液粗提，(5)铁载体精制等步骤组成。本发明所述方法简单，培养基原料廉价、易于制备，并且采用液体培养技术，利于放大和实现工业化生产，合成的铁载体活性高，性质稳定，具有良好的应用价值。

Description

利用黑曲霉制备高效生物铁载体的方法
技术领域
本发明涉及一种利用黑曲霉制备高效生物铁载体的方法，属微生物发酵工业领域。
背景技术
铁是几乎所有活细胞所必需的营养元素，在许多生物学过程中起着重要作用。Fe3+Fe2+的相互转化可以产生氧化还原电势，是某些关键代谢酶类活性所必需的金属元素。虽然铁是地壳中含量第二位的金属元素，但是大部分不能直接被生物利用。在中性pH下，环境中可供生物体利用的水化铁离子Fe3+的浓度不超过10-18molL[J.Biological Chem.270，45：26723-26726，1995]。铁载体(siderophore)是微生物为适应低铁条件下的生理代谢，而产生的一类低分子量(＜1KDa)铁离子螯合剂[Annu.Rev.Microbiol.48：743-772，1994]。它们对铁离子(Fe3+)具有特异性的高亲和力，能从低铁环境中摄取铁，转运到胞内，供微生物生理代谢所需。
铁载体在农业、医药、造纸印染工业、化肥工业等方面都有着广泛的用途。在农业方面，铁载体能富集铁元素，提高土壤难溶铁的溶解性和可利用率，从而促进植物生长，铁载体还能通过螯合铁，降低局部的游离铁的浓度，从而抑制植物病原菌的繁殖。在医学上，铁载体被广泛用于治疗铁离子沉积引起的血色病，治疗β-地中海贫血症等。在印染工业的退浆、煮练、漂白等工序中，铁载体通过螯合水中钙、镁、铁等金属离子，消除织物黄斑现象，提高产品质量。
铁载体应用中存在的主要问题是：目前应用的铁载体大多数是化学合成的铁载体，其生物相容性差，由于难于降解，大量使用后易造成环境污染。用生物技术合成铁载体能够很好地克服这些缺陷，生物铁载体主要有三种化学类型：儿茶酚盐型、氧肟酸盐型和多羟基羧酸盐类，此外还有一些不常见的结构。铁载体可与Fe3+结合形成六齿型结构。在细菌中儿茶酚盐型和氧肟酸盐型两种铁载体都有，而大多数真菌只有氧肟酸盐型铁载体。
目前国内外有许多微生物合成铁载体的报道[Annu.Rev.Microbiol.48：743-772，1994；  Infect.Immun.59：3997-4000，1991；Clin.Microbio.Rev.Vol.12，No.3，394-404，1999；微生物学报，2000年1期]，但是利用微生物进行铁载体的大量合成仍存在一定困难。这是由于微生物的大量生长需要足够的铁，而铁载体的合成却需要低铁条件的诱导，铁对铁载体合成的反馈抑制限制着生物铁载体的大量生产。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种利用黑曲霉制备高效生物铁载体的方法，该方法可大量合成高效铁载体。
本发明所述的利用黑曲霉制备高效生物铁载体的方法，由下述步骤组成：
(1)菌种选择：选用黑曲霉(Aspergillus niger)ATCC 6275，黑曲霉(Aspergillusniger)ATCC 10864，黑曲霉(Aspergillus niger)ATCC 20611，黑曲霉(Aspergillusniger)CGMCC 1067之一；
(2)孢子悬液的制备：将上述黑曲霉接种于麸皮汁固体培养基斜面上，于25℃-30℃温箱培养4-5天，待长出大量孢子后，用生理盐水洗下孢子并收集，将孢子滤液用生理盐水稀释，调节孢子浓度为107-108个/mL，置于无菌试管中，4℃保存备用；
其中：
所述麸皮汁固体培养基配制方法是：麸皮汁加2％琼脂，121℃灭菌20min，备用；麸皮汁配制方法是：称取100g麸皮加蒸馏水，煮沸半小时，纱布过滤，用蒸馏水稀释至1L；
(3)液体发酵培养：将上述黑曲霉孢子悬液以体积百分比为1％-2％的接种量，接种于麸皮汁液体培养基或马铃薯葡萄糖液体培养基中，25℃-30℃，170-200rpm振荡培养，6-8天后，用四层纱布过滤培养物，收集发酵液，弃去菌体，所获得的发酵液含高活性的铁载体；
其中：
所述麸皮汁液体培养基配制方法是：麸皮汁用自来水稀释5倍，121℃灭菌20min，备用；
所述马铃薯葡萄糖液体培养基配制方法是：马铃薯去皮，称取200g，切成小块，加入蒸馏水，煮沸半小时，纱布过滤，滤液中加入20g葡萄糖，用蒸馏水稀释至1L，121℃灭菌20min，备用；
(4)发酵液粗提：将上述发酵液用截流分子量为1KDa的超滤膜进行超滤，然后超滤液进行真空冷冻干燥，冻干后得到的干粉即为粗提的铁载体粗品；铁载体粗品非常稳定，可长期保存；
(5)铁载体精制：将上述铁载体干粉粗品用其体积量5-7倍的水稀释后，加入饱和醋酸铅溶液进行沉淀，至不再产生沉淀为止；然后过滤收集沉淀，再用饱和醋酸铅溶液洗涤沉淀；过滤收集沉淀，用超纯水悬浮沉淀；通入现制备的硫化氢，硫化氢与溶液中的铅形成硫化铅沉淀，过滤除去硫化铅沉淀，得除去铅的滤液；滤液用减压旋转蒸发进行浓缩，同时除去滤液中溶解的硫化氢；之后，浓缩液上CM-Sepharose fast flow阳离子交换层析柱，收集含活性组分的透过峰；活性组分再浓缩后上DEAE-Sepharose fastflow阴离子交换层析柱，用盐洗脱，收集活性组分分离峰；活性组分经真空冷冻干燥浓缩后，获得精制的铁载体干粉样品。
上述利用黑曲霉制备高效生物铁载体的方法中：步骤(2)或(3)所述培养温度优选是28℃。
上述利用黑曲霉制备高效生物铁载体的方法中：步骤(3)所述振荡条件优选是180-190rpm。
上述利用黑曲霉制备高效生物铁载体的方法中：步骤(3)所述培养时间优选是7-8天。
铁载体活力测定和计算方法：
CAS(chrome azurol sulfonate assay)[Methods Enzymol.235：329-344]因它的普遍适用性、高灵敏性以及方便性而得到广泛应用。CAS分析法是一种高灵敏度的化学方法，这种方法不依赖于铁载体的结构而是基于铁载体对Fe3+的亲和性。
取上含铁载体的溶液1.5mL加入1.5mL CAS检测液混匀，室温静置1小时以上，用723分光光度计测定630nm波长下的光吸收OD630，以水作为阴性对照。铁载体表达量计算公式如下：
其中Ar为630nm下以水作空白对照测得的光吸收值，As为样品测得的光吸收值。
当环境中铁(不溶性的Fe3+)的浓度达到10-20μmol/L时，微生物分泌铁载体的能力几乎被完全抑制，因此筛选对铁有一定耐受性的铁载体产生微生物是大量生产铁载体的关键。本发明在大量菌种筛选工作的基础上，发现黑曲霉(Aspergillus niger)，特别是黑曲霉(Aspergillus niger)ATCC 6275，黑曲霉(Aspergillus niger)ATCC 10864，黑曲霉(Aspergillus niger)ATCC 20611，黑曲霉(Aspergillus niger) CGMCC 1067是良好的铁载体高产菌株，其产生的铁载体活性明显超过其他铁载体产生菌，而且铁载体的合成几乎不受铁的反馈抑制。铁载体分泌试验证实，所述菌株铁载体的分泌受环境中铁浓度的影响小，在铁浓度达到500μmol/L时，仍然能进行铁载体的大量合成和分泌。这表明所述菌铁载体的合成机制不同于其它菌株，它不是低铁诱导表达的，很可能是组成型表达，低铁仅仅刺激了菌体铁载体合成量的增加。所述菌株对培养条件要求粗放，因此可用天然原料进行大规模生物培养制备铁载体。
有机溶剂萃取实验结果表明，黑曲霉产生的铁载体极性很强，不溶于极性低的溶剂，如三氯甲烷和苯甲醇，可以部分溶解于甲醇和丙酮。是一类不同于儿茶酚盐和氧肟酸盐类的新型铁载体。它极易溶于水，其水溶液的pH值约为3.5-4.5，分子量小于1KDa。黑曲霉铁载体具有极强的铁螯合能力，而且能将不溶性的Fe3+转化成可溶性的Fe2+，利于生物的吸收和利用。黑曲霉铁载体还具有很强的热稳定性，铁载体在水溶液100℃煮沸30分钟，CAS法检测铁载体活性不降低。该方法生物合成的铁载体在农业、医药、印染等方面有着潜在的应用价值。
本发明所述利用黑曲霉制备高效生物铁载体的方法的优点是：
提供的黑曲霉菌株生长旺盛，抗污染能力强，并可产生大量孢子，有利于接种和培养。
培养方法简单，培养基原料廉价、易于制备。采用液体培养技术，利于放大和实现工业化生产。
合成的铁载体活性高，性质稳定，具有良好的应用价值。
具体实施方式
实施例1：
将黑曲霉(Aspergillus niger)ATCC 6275接种于麸皮汁固体培养基斜面上，于28℃温箱培养5天，待长出大量孢子后，用适量生理盐水洗下孢子并收集，将孢子滤液用适量的生理盐水稀释，调节孢子浓度为107-108个/mL，置于无菌试管中，4℃保存备用。
其中：
所述麸皮汁固体培养基配制方法是：麸皮汁加2％琼脂，121℃灭菌20min，备用；麸皮汁配制方法是：称取100g麸皮加蒸馏水，煮沸半小时，纱布过滤，用蒸馏水稀释至1L；
菌株接种于含麸皮汁液体培养基的三角瓶中，接种量为2％(v/v)，28℃，170rpm振荡培养6天，铁载体活性可达95-100％，收集培养液。
其中：
所述麸皮汁液体培养基的配制方法是：麸皮汁用自来水稀释5倍，121℃灭菌20min，备用；
发酵液过滤，弃去菌体。用截流分子量1KDa的超滤膜超滤，收集滤出液。真空冷冻干燥，干粉粗品用水适量稀释后，先加入饱和醋酸铅溶液进行沉淀，至不再产生沉淀为止，过滤得沉淀，用饱和醋酸铅溶液洗涤并收集沉淀。用适量超纯水悬浮沉淀，通入现制备的硫化氢，硫化氢与溶液中的铅形成硫化铅沉淀，过滤除去硫化铅沉淀，得除去铅的滤液。滤液经减压旋转蒸发进行适当浓缩，同时可以除去滤液中溶解的硫化氢。浓缩液上CM-Sepharose fast flow阳离子交换层析柱，收集含活性组分的透过峰；活性组分再浓缩后上DEAE-Sepharose fast flow阴离子交换层析柱，用盐洗脱，收集活性组分分离峰；活性组分经真空冷冻干燥浓缩后，获得精制的铁载体干粉样品。
实施例2：
将黑曲霉(Aspergillus niger)ATCC 10864接种于麸皮汁固体培养基斜面上，于28℃温箱培养5天，待长出大量孢子后用用适量生理盐水洗下孢子并收集，将孢子滤液用适量的生理盐水稀释，调节孢子浓度为107-108个/mL，置于无菌试管中，4℃保存备用。
菌株接种于含马铃薯葡萄糖培养液的三角瓶中，接种量为1％(v/v)，28℃，200rpm振荡培养7天，铁载体活性90-95％，收集培养液。
发酵液过滤，弃去菌体。用截流分子量1KDa的超滤膜超滤，收集滤出液。将超滤液真空冷冻干燥，冻干后铁载体粗品干粉可长期储存。
实施例3：
将黑曲霉(Aspergillus niger)CGMCC 1067接种于麸皮汁固体培养基斜面上，于28℃温箱培养4天，待长出大量孢子后，用生理盐水洗下孢子并收集，将孢子滤液用生理盐水稀释，调节孢子浓度为107-108个/mL，置于无菌试管中，4℃保存备用；
其中：
所述麸皮汁固体培养基配制方法是：麸皮汁加2％琼脂，121℃灭菌20min，备用；麸皮汁配制方法是：称取100g麸皮加蒸馏水，煮沸半小时，纱布过滤，用蒸馏水稀释至1L；
将上述黑曲霉孢子悬液以体积百分比为2％的接种量，接种于马铃薯葡萄糖液体培养基中，28℃，180rpm振荡培养，8天后，用四层纱布过滤培养物，收集发酵液，弃去菌体，所获得的发酵液含高活性的铁载体；
其中：
所述马铃薯葡萄糖液体培养基配制方法是：马铃薯去皮，称取200g，切成小块，加入蒸馏水，煮沸半小时，纱布过滤，滤液中加入20g葡萄糖，用蒸馏水稀释至1L，121℃灭菌20min，备用；
将上述发酵液滤用截流分子量为1KDa的超滤膜进行超滤，然后超滤液进行真空冷冻干燥，冻干后得到的干粉即为粗提的铁载体粗品；铁载体粗品非常稳定，可长期保存；
将上述铁载体干粉粗品用其重量5倍的水稀释后，加入饱和醋酸铅溶液进行沉淀，至不再产生沉淀为止；然后过滤收集沉淀，并用饱和醋酸铅溶液洗涤沉淀；用超纯水悬浮沉淀，通入现制备的硫化氢，硫化氢与溶液中的铅形成硫化铅沉淀，过滤除去硫化铅沉淀，得除去铅的滤液；滤液用减压旋转蒸发进行浓缩，同时除去滤液中溶解的硫化氢。浓缩液上CM-Sepharose fast flow阳离子交换层析柱，收集含活性组分的透过峰；活性组分再浓缩后上DEAE-Sepharose fast flow阴离子交换层析柱，用盐洗脱，收集活性组分分离峰；活性组分经真空冷冻干燥浓缩后，获得精制的铁载体干粉样品。

Claims (4)

1.一种利用黑曲霉制备高效生物铁载体的方法，由下述步骤组成：
(1)菌种选择：选用黑曲霉(Aspergillus niger)ATCC 6275，黑曲霉(Aspergillusniger)ATCC 10864，黑曲霉(Aspergillus niger)ATCC 20611，黑曲霉(Aspergillusniger)CGMCC 1067之一；
(2)孢子悬液的制备：将上述黑曲霉接种于麸皮汁固体培养基斜面上，于25℃-30℃温箱培养4-5天，待长出大量孢子后，用生理盐水洗下孢子并收集，将孢子滤液用生理盐水稀释，调节孢子浓度为107-108个/mL，置于无菌试管中，4℃保存备用；
其中：
所述麸皮汁固体培养基配制方法是：麸皮汁加2％琼脂，121℃灭菌20min，备用；麸皮汁配制方法是：称取100g麸皮加蒸馏水，煮沸半小时，纱布过滤，用蒸馏水稀释至1L；
(3)液体发酵培养：将上述黑曲霉孢子悬液以体积百分比为1％-2％的接种量，接种于麸皮汁液体培养基或马铃薯葡萄糖液体培养基中，25℃-30℃，170-200rpm振荡培养，6-8天后，用四层纱布过滤培养物，收集发酵液，弃去菌体，所获得的发酵液含高活性的铁载体；
其中：
所述麸皮汁液体培养基配制方法是：麸皮汁用自来水稀释5倍，121℃灭菌20min，备用；
所述马铃薯葡萄糖液体培养基配制方法是：马铃薯去皮，称取200g，切成小块，加入蒸馏水，煮沸半小时，纱布过滤，滤液中加入20g葡萄糖，用蒸馏水稀释至1L，121℃灭菌20min，备用；
(4)发酵液粗提：将上述发酵液滤用截流分子量为1KDa的超滤膜进行超滤，然后超滤液进行真空冷冻干燥，冻干后得到的干粉即为粗提的铁载体粗品；铁载体粗品非常稳定，可长期保存；
(5)铁载体精制：将上述铁载体干粉粗品用其体积量5-7倍的水稀释后，加入饱和醋酸铅溶液进行沉淀，至不再产生沉淀为止；然后过滤收集沉淀，并用饱和醋酸铅溶液洗涤沉淀；用超纯水悬浮沉淀，通入现制备的硫化氢，硫化氢与溶液中的铅形成硫化铅沉淀，过滤除去硫化铅沉淀，得除去铅的滤液；滤液用减压旋转蒸发进行浓缩，同时除去滤液中溶解的硫化氢；之后，浓缩液上CM-Sepharose fast flow阳离子交换层析柱，收集含活性组分的透过峰；活性组分再浓缩后上DEAE-Sepharose fast flow阴离子交换层析柱，用盐洗脱，收集活性组分分离峰；活性组分经真空冷冻干燥浓缩后，获得精制的铁载体干粉样品。
2.如权利要求1所述的利用黑曲霉制备高效生物铁载体的方法，其特征是：步骤(2)或(3)所述培养温度是28℃。
3.如权利要求1所述的利用黑曲霉制备高效生物铁载体的方法，其特征是：步骤(3)所述振荡条件是180-190rpm。
4.如权利要求1所述的利用黑曲霉制备高效生物铁载体的方法，其特征是：步骤(3)所述培养时间是7-8天。
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