DE3041744A1 - Glucose-6-phosphat-dehydrogenase und verfahren zu deren herstellung - Google Patents
Glucose-6-phosphat-dehydrogenase und verfahren zu deren herstellungInfo
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Description
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UNITIKA LTP., AMagasaki / Japan
Glucose-G-phosphat-dehydrogenase und Verfahren zu deren
Herstellung · ■
Die Erfindung betrifft eine neue und nützliche Glucose-6~ phosphat-dehydrogenase und ein Verfahren zu deren Herstellung.
Sie betrifft insbesondere eine Glucose-6-phosphatdehydrogenase,
die zur Bestimmung von Glucose, Glucose-6-phosphat, Hexokinase und Hexose-6-phosphat-isomerase bei
klinischen Versuchen auf medizinischem Gebiet verwendet
werden kann und auch zur' Bestimmung von Fructose und Glucose in der Nahrungsmittelindustrie. Die Erfindung betrifft
auch ein Verfahren zur Herstellung einer solchen Dehydrogenase.
In jüngerer Zeit hat man Enzyme wegen ihrer hohen Spezifität bei der Art ihrer Reaktionen, des Substrates (d.h.
des Materials auf dem sie aktiv sind) und der optischen Eigenschaften als Katalysatoren für medizinische und Nahrungsmittelanalysen
verwendet. Es ist bekannt, dass die
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Bestimmung von Glucose- und Hexokinasemengen in Körper-
flüssigkeiten in klinischen Versuchen wichtige Parameter
sind. Die Analyse von Glucose- und Fructosemengen in der
Nahrung ist auch ein wichtiges Parameter bei der Herstellung von Invertzucker. Zur Zeit wird Glucose-6-phosphat-dehydrogenase
aufgrund ihrer sehr hohen Reaktionsspezifizität, ihrer Substrat- und optischen Eigenschaften für die Bestimmung dieser
Parameter in grossem Umfang eingesetzt, und sie stellt deshalb ein immer wertvoller werdendes Enzym dar.
Mikroanalysen unter Anwendung von Enzymen haben zwar die vorerwähnten
Vorteile, jedoch sind sie sehr labil und sie verlieren ihre katalytisch^ Aktivität in verhältnismässig kurzer
Zeit, die"von einigen Tagen bis zu mehreren Wochen liegen
kann, auch dann, wenn man sie unterhalb Raumtemperatur aufbewahrt. Die Labilität von Enzymen ist deshalb ein erhebliches
Problem bei der Verwendung von Enzymen für Mikroanalysen. Die bisher bekannten Zubereitungen von Glucose-6-phosphat-dehydrogenase
sind gleichfalls labil und aus Hefe stammende Glucose-6-phosphat-dehydrogenase, wie sie im Journal of Biological
Chemistry, Band 236, S 1225 (1961) beschrieben wird, verliert im allgemeinen den grössten Teil der Aktivität in wässriger
Lösung bei Raumtemperatur innerhalb von 1 bis 3 Wochen.
Die hohen Kosten sind ein anderer Grund, warum man Glucose-6-phosphat-dehydrogenase
bisher kaum für Mikroanalysen auf dem medizinischen Gebiet und für Nahrungsmittelanalysen
eingesetzt hat. Die Umsetzung von Glucose-6-phosphat-dehydrogenase
erfordert immer ein Coenzym und die meisten der .üblichen Analysen unter Verwendung von Glucose-6-phosphat-dehydrogenase
benötigen als Coenzym Nicotinamid-adenindinucleotidphosphat (nachfolgend als NADP bezeichnet). NADP ist bekanntlich
sehr teuer. Zahlreiche Glucose-6-phosphat-dehydrogenase-Zubereitungen
sind bekannt, 'z.B. aus Advantage in
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Enzymology, herausgegeben von Alton Meister, Band 48,
Seiten 97-191, und in den meisten Fällen benötigt man NADP als Coenzym bei der Enzymreaktion mit Ausnahme von solchen,
die von Leuconostoc mesenteroides und Pseudomonas W 6 stammen, die kompatibel bei der Anwendung mit Nicotinamidadenindinucleotid
( nachfolgend mit NAD bezeichnet) sind, das zur ein Zehntel oder weniger so viel kostet wie NADP.
Die aus Leuconostoc mesenteroides und Pseudomonas W 6 hergestellte Glucose-6-phosphat-dehydrogenase ist jedoch
nicht wärmestabil und hält sich nicht lange, d.h. dass die Inaktivierung des Enzyms beim Stehenlassen während ein
bis zwei Wochen bei Raumtemperatur festgestellt wird. Um die Vorteile der Analyse unter Verwendung von Glucose-6-phosphat-dehydrogenase
maximal ausnutzen zu können, hat man Untersuchungen durchgeführt, um eine Glucose-6-phosphatdehydrogenase
zu finden, die stabil ist und die mit billigen Coenzymen (d.h. anderen als dem teuren NADP) kompatibel
ist.
Aufgabe der Erfindung ist es, eine Glucose-6~phosphat-dehydrogenase
zu zeigen, die wärmestabil· ist, und die ihre Aktivität während einer längeren Zeit nicht verliert, und
die ausserdem kompatibel mit billigen. Coenzymen (d.h. anderen als dem teueren NADP) ist.
Aufgrund von zahlreichen Untersuchungen haben die Erfinder gefunden, dass ein Mikroorganismus vom Genus Bacillus
eine Glucose-6-phosphat-dehydrogenase erzeugt, welche die vorerwähnten Eigenschaften aufweist.
Die Erfindung betrifft deshalb eine Glucose-6-phosphatdehydrogenase,
die bei etwa 15-minütigem Inkubieren in einer Pufferlösung von etwa 500C wenigstens 80 % ihrer
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Ausgangsaktivität beibehält. Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung einer solchen Glucose-6-phosphat-dehydrogenase,
indem man einen Mikroorganismus vom Genus Bacillus kultiviert und aus der Kultur eine
Glucose-6-phosphat-dehydrogenase gewinnt, die beim Inkubieren während etwa 15 Minuten in einer Pufferlösung von
etwa 50 0C wenigstens 80 % ihrer Ausgangsaktivität beibehält.
Die erfindungsgemässe Glucose-6-phosphat-dehydrogenase ist
sehr wärmestabil, so dass man sie nach dem Isolieren während längerer Zeiträume länger aufbewahren kann als die übliche
Glucose-6-phosphat-dehydrogenase. Das Enzym ist ausserordentlich
brauchbar für biochemische Forschungen, in der Nahrungsmittelindustrie und für klinische Versuche. Ausserdem
ist das Enzym mit NAD kombatibel und da dies viel weniger kostet als NADP kann man es mit Vorteil als ein preiswertes
Reagens einsetzen.
Fig. 1 ist eine grafische Darstellung und zeigt die Restaktivität von Glucose-6-phosphat-dehydrogenase
gemäss der Erfindung (Kurve A) und von einer von Hefe abstammenden Glucose-6-phosphat-dehydrogenase
(Kurve B) nach Erhitzen auf verschiedene Temperaturen
während 15 Minuten.
Fig. 2 ist eine grafische Darstellung und zeigt die Restaktivität der erfindungsgemassen Glucose-6-phosphatdehydrogenase
(Kurve C) und von einer von Hefe stammenden Glucose-6-phosphat-dehydrogenase (Kurve D)
nach Lagerung bei 300C.
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Die erfindungsgemässe Glucose-6-phosphat-dehydrogenase
behält nach etwa 15-minütigem Inkubieren in einer Pufferlösung
von etwa 500C wenigstens etwa 80 % und vorzugsweise wenigstens etwa 90 % und insbesondere etwa 100 % der Anfangsaktivität bei. Insbesondere behält die erfindungsgemässe Dehydrogenase
wenigstens 80 % ihrer Anfangsaktivität bei, wenn man sie etwa 15 Minuten in einer Pufferlösung von etwa 57°C
behandelt. Die Konzentration und der pH der Pufferlösung 4ind nicht auf spezielle Werte beschränkt, aber im allgemeinen
liegt die Konzentration im Bereich von 5 bis 500 mMol/1
(nachfolgend mit mM bezeichnet) und der pH im Bereich von 7 bis 10,5. Für die Zwecke der Erfindung wird eine 100 mM
tris-HCL-Pufferlösung (pH etwa 9,0) mit einem Gehalt von
100 mM Kaliumchlorid mit Vorteil verwendet.
Die Physikochemisehen Eigenschaften der Glucose-6-phosphatdehydrogenase
gemäss der Erfindung werden nachfolgend angegeben:
1. Funktion des Enzyms
Die Glucose-e-phosphat-dehydrogenase der Erfindung katalysiert
folgende Reaktion:
Hexose-6-phosphat + Coenzym (oxidierte Form) Hexosealdonsäure-6-phosphat + Coenzym (reduzierte Form)
Hexose-6-phosphat ist der allgemeine Ausdruck'für Glucose-6-phosphat,
Mannose-6-phosphat und Galactose-6-phosphat und Hexosealdonsäure-6-phosphat ist der allgemeine Ausdruck
für Gluconsäure6-phosphat, Mannonsäure-6-phosphat und Galactonsäure-6-phosphat.
Das Coenzym kann entweder NADP oder NAD sein.
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2. Substratspezifität
Die Micheliskonstante (Km-Wert) des Enzyms für Glucose-6-phosphat
ist etwa 0,16 inM. Die Reaktionsgeschwindigkeit für Mannose-6-phosphat und Galactose-6-phosphat bei einer
gegebenen Substratkonzentration sind etwa 40 % bzw. 20 % im Vergleich zu Glucose-6-phosphat. Die Km-Werte für NADP
und NAD sind 0,016 bzw. 1,64 mM.
3. Optimaler pH : etwa 9,0 (bei 3O0C)
4. Stabiler pH-Bereich
Es findet eine geringe Deaktivierung des Enzyms beim Inkubieren mit einem pH von 7,0 bis 10,5 bei 40C während 24 h statt.
5. Optimaler Funktionstemperaturbereich
Der optimale Funktionstemperaturbereich für Umsetzungen liegt bei etwa 25 bis 75 °C. Die Aktivität erhöht sich bei einem pH
von 8,9 mit dem Steigen der Temperatur von 250C auf 750C.
6. Wärmebeständigkeit
Das Enzym ist gegen Erwärmen auf 57°C während v/enigstens 15 Minuten
stabil.
7♦ Molekulargewicht
Gelfiltrationschromatografie auf Sephacryl S-200 (Produkt
der Pharmacia Fine Chemical) zeigte, dass das Enzym ein Molekulargewicht von etwa 230.000 hat. Hefe- und Leuconostoc
mesenteroides-abgeleitete Glucose-6-phosphat-dehydrogenase
haben ein Molekulargewicht von etwa 100.000, gemessen bei
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der GeIfiltrationschromatografie mit Sephacryl S-200.
8." Bestimmung und Definition der Aktivität
Ein Gemisch von 2mM Glucose-6-phosphat, 0,5 mM NADP und
5 mM Magnesiumchlorid in 50 mM tris-HCL-Puffer mit einem pH von 8,9 wird hergestellt. Eine geeignete Menge an Glucose-6-phosphat-dehydrogenase
wird zu dem Gemisch zugegeben und dann wird die Erhöhung der Absorption an reduzierter Form
von NADP (NADP H) bei 340 nm während einer gegebenen Zeit gemessen. Nimmt man an, dass die enzymatische Aktivität,
bei welcher die Absorption von 1 Mikromol NADP H bei 340 nm pro Minute ansteigt, eine Einheit ist, so hat das gereinigte
Enzym eine Potenz von etwa 100 Einheiten /mg bei 300C.
9. Reinheit
Bei einer 7,5 %igen Acrylamid-Scheibenelektrophorese bei einem pH von 9,4 wandert eine gereinigte Probe des Enzyms zu einer
positiven Elektrode und gibt ein einzelnes Band. Bei der SDS-Elektrophorese wandert die Probe gleichfalls zur positiven
Elektrode und gibt ein einzelnes Band.
10. Zusammensetzungsanalyse
Der Anteil an Aminosäuren in dem Enzym wird nachfolgend in
Mol% angegeben:
1,05 % Asparginsäure, 5,42 % Threonin, 4,56 % Serin, 11,86 % Glutamsäure, 3,66 % Prolin, 6,67 % Glycin, 7,92 % Alanin,
0,62 % Cystein, 6,09 % Valin, 1,97 % Methionin, 5,59 % Isoleucin, 8,04 % Leucin, 3,72 % Tyrosin, 4,88 % Phenylalanin,
5,28 % Lysin, 3,40 % Histidin, 6,56 % Arginin und 2,72 % Tryptophan.. .
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11. Kristallstruktur
Die Kristallstruktur des Enzyms muss noch untersucht werden, weil man das Produkt bisher nicht kristallisiert hat.
Die Glucose-6-phosphat-dehydrogenase gemäss der Erfindung
kann hergestellt werden, indem man sie aus einer Kultur von Mikroorganismen vom Genus Bacillus gewinnt. Die bei der
Herstellung der erfindungsgemässen Glucose-6-phosphatdehydrogenase
verwendeten Mikroorganismen sind alle solchen Mikroorganismen,die zum Genus Bacillus gehören und die in
der Lage sind, diese Dehydrogenase zu bilden. Bevorzugte Mirkoorganismen vom Genus Bacillus sind Bacillus stearothermophilus,
z.B. die mit der Hinterlegungsnummer ATCC 7953, 7954,
8005, 10149, 12980 und NCA 1503.
Für die Kultivierung eines Mikroorganismus vom Genus Bacillus kann man verschiedene Nährmittel verwenden. Als Kohlenstoffquellen
können Saccharide, wie Glucose, Saccharose, Fructose, Stärkehydrolysate, Melasse und Sulfitablauge sowie organische
Säuren, wie Essigsäure und Milchsäure, oder Alkohole, die von den Mikroorganismen verwendet werden können, wie
Ethylalkohol und Butylalkohol, Fette und öle, aliphatische Säuren von Glycerin verwendet werden. Geeignete Stickstoffquellen
sind anorganische und organische Verbindungen, wie Amrnoniumsulfat,
Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniak, Aminosäuren, Pepton, Fleischextrakt und Hefeextrakt. Anorganische
Salze schliessen Kalium-, Natrium-, Phosphorsäure-, Zink-, Eisen-, Magnesium-, Mangan—, Kupfer-, Calcium- und
Cobaltsalze ein. Gewünschtenfalls können die Nährmittel Salze
von Spurenmetallen, Maismaische, Vitamine und Nucleinsäuren enthalten. Man kann die allgemein bekannten Nährmedien für
die Kultivierung von Mikroorganismen verwenden.
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Ein Mikroorganismus vom Genus Bacillus wird aerob in einem der vorerwähnten Medien während etwa 2 bis 6 h bei einer
Temperatur zwischen etwa 20 bis 800C und vorzugsweise etwa
40 bis 700C und insbesondere bei etwa 600C kultiviert.
Für eine industrielle Arbeitsweise wird bevorzugt, die Kultivierung unter Einstellung des Verdünnungsgrades vorzunehmen,
der mehr als 90 % der maximalen spezifischen Wachstumsgeschwindigkeit eines Mikroorganismus der unter kontinuierlichen
Kultivierbedingungen (μπ^χ) kultiviert wird, ausgedrückt als
Verdünnungsgrad in l/h des verwendeten Mikroorganismus beträgt. Die kontinuierliche Kultivierung bei einem auf mehr
als 90 % des umax des Mikroorganismus eingestellten Verdünnungsgrad bildet mehr Zellen als bei einer absatzweisen Arbeitsweise,
und die Zellen enthalten mehr Glucose-6-phosphatdehydrogenase als das bei einer absatzweisen Verfahrensweise
pro Zelleneinheit erzielte Maximum. Insbesondere wird bei kontinuierlicher Kultivierung bei einem Verdünnungsgrad,der
in der Nähe von umax gehalten wird, etwa 1,3-mal soviel
Glucose-6-phosphat-dehydrogenase gebildet wie in einem absatzweisen
Verfahren. Wird die kontinuierliche Kultivierung bei einem Verdünnungsgrad von weniger als 0,9 μπ^χ durchgeführt,
dann neigt das Glucose-6-phosphat-dehydrogenase-Niveau dazu, niedriger zu sein als bei einem absatzweisen Verfahren.
Der Verdünnungsgrad (nachfolgend mit D bezeichnet),wie er hier
angewendet wird, wird durch folgende Gleichung (I) ausgedrückt :
D =
worin D den Verdünnungsgrad (1/h)
F die Menge (l/h), mit welcher die Fermentationsflüssigkeit zu dem Fermentator geführt und abgezogen
wird,
• V das Volumen (1) der Fermentationsflüssigkeit in dem
Fermentator bedeuten.
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Das Symbol "μπ^χ", wie es hier verwendet wird, bedeutet den
maximalen spezifischen Wachstumsgrad (1/h) eines unter kontinuierlichen
Kultivierbedingungen kultivierten Mikroorganismus und ist ein spezifischer Wachstumsgrad, den man zur "Auswasch"-Zeit
feststellt, d.h. der Zeit, wenn der Mikroorganismus in einem Chemostat (siehe Herbert, Elsworth und Telling, Journal of
General Microbiology, Band 14, Nr. 8, Seiten 601-622, 1956) aufgrund des Ansteigens in D nicht mehr eine stationäre Zellkonzentration
beibehält, μπ^χ von thermophilen Mikroorganismen, wie sie
erfindungsgemäss verwendet werden, kann wie folgt bestimmt werden:
1,5 bis 20 1 eines Nährmediums in einem 2- bis 30-1-Feritientator
werden mit dem Mikroorganismus für eine absatzweise Kultivierung bei 400C bis 75°C und vorzugsweise bei 480C bis 610C und bei
einem pH von 4,5 bis 9,0 und vorzugsweise zwischen 6,0 und 8,0 inokuliert; wenn das Wachstum des Mikroorganismus den Gehalt
der Kohlenstoffquelle in der Brühe auf weniger als 0,01 Gew.-%
vermindert, wird ein Nährmedium der gleichen Zusammensetzung wie zuerst dem Fermentator zugegeben worden war, zu dem Fermentator
gegeben, um eine kontinuierliche Kultivierung zu starten, bei welcher der einzige Begrenzungsfaktor die Kohlenstoffquelle
ist. Auf diese Weise wird ein Chemostat erreicht. Wenn die kontinuierliche Kultivierung eine stationäre Phase erreicht hat,
wird D stufenweise durch Messen der Zellkonzentration in der Fermentationsflüssigkeit und der restlichen Kohlenstoffquelle
in der Fermentationsflüssigkeit innerhalb gegebener Zeitabstände
erhöht, und wenn D den spezifischen Wachstumsgrad des Mikroorganismus übersteigt, beginnt die stabile Zellkonzentration
abzunehmen, während der Gehalt an Kohlenstoffquelle zuzunehmen
beginnt.
Das Phänomen, bei dem eine Erhöhung von D die kontinuierliche Kultivierung veranlasst,aus der stationären Phase herauszukommen,
wird als "Auswaschen" bezeichnet und die spezifische Wachstumsgeschwindigkeit zur Auswaschzeit ist μΐΐ^χ. μπίαχ variiert
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für einen gegebenen Organismus in Abhängigkeit von der Art des Nährmediums und der Kultivierbedingungen, aber für eine gegebene
Kombination von Mikroorganismus, Nährmedium und Kultivierbedingungen ist μίτ^χ konstant und stellt deshalb eine verlässliche
Zahl für den Betrieb über längere Zeiten dar, sobald er einmal gemessen ist.
Gemäss der Erfindung wird D bei einer kontinuierlichen Kultivierung,
die nach Erreichen einer gewünschten Zellkonzentration bei einer üblichen Vorkultivierung und ansatzweisen Kultivierung
durchgeführt wird, auf einen vorbestimmten Wert limitiert. Der Übergang zu einer kontinuierlichen Kultivierung kann zu jeder
Zeit der absatzweisen Kultivierung erfolgen, jedoch wird vorzugsweise die Kultivierung in der letzten Stufe der logarithmischen
Wachstumsphase einer absatzweisen Kultivierung in eine kontinuierliche Kultivierung überführt und D sollte auf einen
vorbestimmten Wert sobald wie möglich festgelegt werden.
Eine nachfolgend beschriebene Ausführungsform der Erfindung besteht
in der Kultivieruncj von Bacillus sterothermophilus NCA 150
in einem Nährmedium mit Glucose als Kohlenstoffquelle. Wenn eine
chemostate kontinuierliche Kultivierung in einem 30-1-Fermentator (der mit 20 1 des Mediums gefüllt ist) bei einer Optimaltemperatur
von etwa 570C und einem Optimal-pH von etwa 6,8 durchgeführt
wird, beträgt μπ^χ des Mikroorganismus 1,1 (1/h). Um daher
eine kontinuierliche Kultivierung bei D gleich umax durchzuführen,
wird ein frisches Nährmedium der gleichen Zusammensetzung wie in der absatzweisen Kultivierung kontinuierlich
zu dem Fermentator gegeben und von diesem abgeführt in einer
Menge, die 1,1mal pro Stunde so gross ist wie das anfangs dem Fermentator zugeführte Volumen, oder in einer Menge von 22 l/h,
berechnet aus Formel (I). Die Zufuhr und das Abziehen können mittels einer Dosierpump2 erfolgen.
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Die Glucose-6-phosphat-dehydrogenase gemass der Erfindung kann
aus der Kultur gewonnen werden. Das Enzym -:ann man als abgetrennte
Lebendzellen, behandelte Lebendzellen, als Rohenzym oder als gereinigtes Enzym gewinnen. Für die Reinigung können
übliche Verfahren der Enzymreinigung angewendet werden; nach dem Zentrifugieren oder anderen geeigneten Massnahmen werden
die Zellen mit einem Homogenisator (Typ Manton Gaulin oder Dynomill),
durch eine französische Presse (French press) oder durch Überschallwellen homogenisiert, und die Zellmembrane werden durch
Zentrifugieren entfernt, wobei man ein Zellextrakt erhält, das dann mit Sulfat-Streptomycin oder Sulfat-Protamin behandelt
wird, worauf sich gegebenenfalls ein Ausfällen mit Ammoniumsulfat,
Aceton oder einer Wärmebehandlung anschliesst. Sofern eine weitere Reinigung erforderlich ist, kann man diese Reinigung
mit einer Ionenaustausch-Chromatografie über einer DEAE-Cellulose-Säule,
Adsorptionschromatografie über Hydroxyapatit oder durch Gelpermeations-Chromatografie über Sephadex kombinieren.
Auf diese Weise kann man die erfincLungsgemässe Glucose-6-phosphat-dehydrogenase
aus dem Kulturmedium abtrennen und reinigen.
Die erfindungsgemässe Glucose-6-phosphat-dehydrogenase ist sehr
wärmestabil, so dass sie nach der Isolierung über längere Zeiträume gelagert werden kann als dies mit den bekannten Glucose-6-phosphat-dehydrogenase-Zubereitungen
möglich Ist. Deshalb wird die erfindungsgemässe Dehydrogenase mit besonderem Vorteil
für biochemische Forschungen, in der Nahrungsmittelindustrie und für klinische Versuche verwendet. Beispielsweise kann das
Glucoseniveau in Nahrungsmitteln oder in Körperflüssigkeit mit einer hohen Genauigkeit unter Verwendu ig einer Reaktionsflüssigkeit aus Glucose-6-phosphat-dehydrojenase gemäss der
Erfindung, Hexochinase, NAD, ATP und Magnesiumchlorid bestimmt werden. Die Glucosemenge in Nahrungsmitteln ist ein wichtiges
1 3 0 0 2 1 / Γ : 1 1
Parameter bei der Herstellung von Invertzucker und die Glucosemenge
in der Körperflüssigkeit wird bei der Diagnose von Diabetes
verwendet. Bei einer anderen Anwendung kann man die Aktivität von Phosphoglucose-isomerase bestimmen, indem man das Glucose-6-phosphat-Niveau
in der Körperflüssigkeit mit einer Reaktionsflüssigkeit misst, die aus Glucose-6-phosphat-dehydrogenase gemäss
der Erfindung, NAD und Magnesiumchlorid besteht. Die Aktivität wird als Parameter für die Untersuchung auf Krebs,
z.B. Krebsmetastasen der Brust, angewendet.
Die erfindungsgemässe Glucose-6-phosphat-dehydrogenase reagiert
als Coenzym mit NAD, welches ein sehr viel billigeres Coenzym ist als NADP, so dass die Coenzyme mit Vorteil als billige
Reagentien verwendet v/erden können.
Die Erfindung wird in den nachfolgenden Beispielen, Vergleichsbeispielen und Änv/endunasbeispielen erläutert.
Beispiel 1 und Verglexchsbeispiel 1
Ein Medium (250 1) mit einem Gehalt an 0,5 g/dl (Deciliter) Polypepton, 9,5 g/dl Hefeextrakt, 1,0 g/dl Saccharose, 0,18 g/dl
Kaliumsulfat, 0,644 g/dl Dinatriumphosphat, 0,027 g/dl Magnesiumsulfat,
0,032 g/dl Zitronensäure, 0,0007 g/dl Ferrosulfat und 0,015 g/dl Mangansulfat wurde auf pH 7,0 eingestellt und 10 Minuten
bei 115°C hitzesterilisiert. Anschliessend wurde das Medium
mit einem Stamm von Bacillus stearothermophilus NCAS 1503 inokuliert und eine belüftete Kultivierung wurde bei 600C während
3 h mit einem Innendruck von 0,5 kg/m2 (Überdruck) vorgenommen.
Unmittelbar nach der Kultivierung wurden 700 g der Zellen mittels einer De Laval-Zentrifuge unter Wasserkühlung gewonnen. Die Zellen
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wurden gefroren und 300 g der gefrorenen Probe wurden in 600 g von 0,1 M Phosphatpuffer (pH: 7,5) suspendiert und anschliessend
mit einer französischen Presse homogenisiert und die Zellmembrane wurden durch Zentrifugieren entfernt, wobei man
ein Rohextrakt mit einem Gehalt an Glucose-6-phosphat-dehydrogenase
erhielt. Zu 600 ml des Rohextraktes wurden 300 ml einer 1 %igen wässrigen Lösung von Sulfatprotamin gegeben, und das
Gemisch wurde gründlich gerührt. Der entstandene Niederschlag Würde durch Zentrifugieren abgetrennt und das überstehende
Protamin wurde gewonnen. Zu der überstehenden Lösung wurde nach und nach festes Ammoniumsulfat gegeben bis bei 40C eine
50 %ige Sättigung vorlag. Der gebildete Niederschlag wurde durch Zentrifugieren gewonnen und in 0,1 M Phosphatpuffer
(pH: 7,5), gelöst. Die Lösung wurde durch Dialyse gegen eine 20-fache 0,1 M Phosphatpufferlösung (pH:7,5) entsalzt.
Das so erhaltene flüssige Rohenzym wurde durch eine DEAE-Cellulosesäule
geschickt, die mit 20 mMol Phosphatpuffer (pH:7,5)
enthaltend 2 mMol Mercaptoethanol und 2 mMol Natriumethylendiamintetraacetat,
äquilibriert worden war. Nach dem Eluieren mit einer Lösung aus Kaliumchlorid in Phosphatpuffer der gleichen
Zusammensetzung wie oben, wurde die gewünschte Glucose-6-phosphat-dehydrogenase bei einer KCl-Konzentration in der
Nähe von 0,15 M erhalten. Die aktiven Fraktionen wurden gesammelt,
konzentriert, entsalzen und durch eine Hydroxyapatitkolonne geleitet, die mit 5 mM Phosphatpuffer (pH:7,5)
äquilibriert worden war, und dann mit einem Lineargradienten, beginnend von 5 mMol Phosphatpuffer und endend mit 250 mMol
Phosphatpuffer, eluiert. Die gewünschte Glucose-6-phosphatdehydrogenase
erhielt man bei einer Pufferkonzentration in der Nähe von 75 mMol. Die aktiven Fraktionen wurden vereint,
konzentriert, entsalzt und einer Ultragel-ACA 34-Chromatografie
uterworfen, unter Verwendung eine's Eluierungsmittels aus
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05 mM tris-HCl-Puffer, enthaltend 0,1 M Kaliumchlorid. Die
erhaltenen aktiven Fraktionen wurden durch eine DEAE-Sephadex A-50-Säule,
die mit 30 mMol Phosphatpuffer (pH: 7,7), enthaltend 2 mMol
Mercaptoethanol und 2 mMol Natriumethylendiamintetraessigsäure,
äquilibriert worden war, geleitet und dann mit einem Lineargradienten von 0,1 bis 0,4 M Kaliumchlorid in einem Puffer der
gleichen Zusammensetzung wie oben eluiert. Man erhielt auf diese Weise gereinigte Glucose-6-phosphat-dehydrogenase bei einer
Kaliumchloridkonzentration in der Nähe von 0,2 M.
Die so erhaltene Glucose-6-phosphat-dehydrogenase wanderte zu
einer positiven Elektrode bei einer Scheibenelektrophorese bei pH 9,4 unter Verwendung von 7,5 % Acrylamid und ergab ein
einzelnes Band. Sie zeigte auch ein einzelnes Peak für ein Molekulargewicht von 250.000 bei einer Sephadex G-200-Chromatografie.
Die Ausbeute an Enzym betrug etwa 10 mg und die Stärke war etwa
100 Einheiten /mg. Der Reinigungsgrad des Enzyms war etwa 1.500 im Vergleich zu dem Rohextrakt,dessen Reinheit mit 1 bewertet
wurde.
Die erfindungsgemässe Glucose-6-phosphat-dehydrogenase wurde
hinsichtlich der Stabilität mit einer von Hefe abgeleiteten Glucose-6-phosphat-dehydrogenase, wie sie in Vergleichsbeispiel
1 erhalten wurde, verglichen. Die Ergebnisse sind in den Fig. 1 und 2 angegeben. Fig. 1 zeigt die Restaktivitäten
der beiden Enzyme räch 15-minütigem Erhitzen auf verschiedene Temperaturen in 100 mMol tris-Puffer (pH:9,0) mit einem Gehalt
von 100 mMol Kaliumchlorid. In der Fig. ist Kurve A die erfindungsgemässe
Glucose-G-phosphat-dehydrogenase und Kurve B die von Hefe abgeleitete Glucose-6-phosphat-dehydrogenase. Fig. 2
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zeigt die zeitabhängige Veränderung der Restaktivität der beiden Enzyme nach einer Lagerung bei 300C in 100 mMol tris-Puffer
(pH: 9,0). In dieser Kurve ist die Kurve C die erfindungsgemässe Glucose-e-phosphat-dehydrogenase und die Kurve D
die von Hefe abgeleitete Glucose-6-phosphat-dehydrogenase. Aus diesen beiden Fig. geht hervor, dass nahezu die gesamte
Aktivität der von Hefe abgeleiteten Glucose-6-phosphat-dehydrogenase
irreversibel bei einer 15-minütigen Wärmehandlung
bei 500C verloren geht, während die erfindungsgemässe Glucose-6-phosphat-dehydrogenase
bei der Behandlung bei 500C ihre Aktivität nicht verlor. Bei einer Behandlung bei 3O0C verlor
die von Hefe abgeleitete Glucose-6-phosphat-dehydorgenase ihre Aktivität in 10 bis 10 Tagen, während die erfindungsgemässe
Glucose-6-phosphat-dehydrogenase keinen Abfall der Aktivität auch nach einer 50-tägigen Lagerung zeigte. D.h., dass
die erfindungsgemässe Glucose-6-phosphat-dehydrogenase überraschend
stabil gegen Wärme ist und dass dies eine lange Haltbarkeit anzeigt. Diese Eigenschaft fehlt bei den bekannten
Glucose-6-phosphat-dehydrogenase-Zubereitungen.
Verwendeter Mikroorganismus: Bacillus stearothermophilis NCA 1503.
Formulierung des Nährmediums: Medium der nachfolgenden Formulierung,
bei dem Glucose, die als Kohlenstoffquelle verwendet wurde,
in 1 1 Leitungswasser gelöst wurde:
1,3 g Glucose, 1,0g Hefeextrakt, 0,5 g Pepton, 0,5 g KH2PO4,
0,5 g Na2HPO4-12H2O, 0,1 g MgSO4'7H2O, 0,01 g ZnSO4-VH2O, 0,01 g
MnSO4-7H2O, 0,01 g CuSO4-SH2O, 0,01 g
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Keimstadium: 20 ml des obigen Nährmediums wurden in einen
100 ml-Erlenmeier-Kolben geben und 100 ml des gleichen Nährmediums
wurden in einen 500 ml-Erlenmeier-Kolben gegeben und
nach dem Verschliessen der Kolben mit einem Baumwollpfropfen wurden die Medien mit überhitztem Wasserdampf 10 Minuten bei
1210C und 1 bar sterilisiert. Nach dem Abkühlen wurde das Medium
in dem 100 ml-Kolben aseptisch mit etwa 5 g einer gefriergetrockneten
Probe von Bacillus stearothermophilus NCA 1503, erhalten von der American Type Culture Collection, inokuliert.
Das Medium wurde dann einer Schüttel-Kultivierung (160 UpM) während 24 h bei 55°C auf einem Kreisschüttler unterworfen,
wobei der Mikroorganismus wuchs und das Grad der Trübung in einem solchen Maße zunahm, dass die Absorption bei 600 nm (gemessen
mit einem Spektrofotometer Model 101 der Hitachi Ltd.
und nachfolgend als ODfi,0 nm bezeichnet) 0,8 bis 1,0 betrug.
Etwa 5 ml des gekeimten Mikroorganismus (Inoculum) wurden auf das Medium in dem 500 ml-Kolben übetragen und der Kolben
wurde dann einer Schüttel-Kultivierung während einiger Stunden unter den gleichen Bedingungen wie oben angegeben unterworfen.
Wenn die OD660 nm etwa 1,0 erreichte, wurde die Kultivierung
abgebrochen.
Fermentationsstufe: In einen 30 1-Fermentator wurden 20 1
des Nährmediums der gleichen Zusammensetzung wie in der Keimstufe vorgelegt und die Sterilisierung wurde während 15 Minuten
bei 1210C und 1 Bar vorgenommen. Zu dem Medium wurde etwa 1
des Inoculums gegeben und dann wurde eine absatzweise Kultivierung
bei 55 _+ 1°C, pH 6,5 bis 7,0 (eingestellt mit 4 N NaOH) und
bei einer Luftzufuhr von 20 l/Minute bei 900 UpM durchgeführt.
Da während der Kultivierung eine Schäumung auftrat, wurde eine geringe Menge eines Entschäumungsmittels (KM-70 der Shinetsu
Chemical Industry Co., Ltd.) zugegeben. Etwa 2,5 h nach Beginn
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der Kultivierung erreichte die ODg60 nm 1,2 (0,56 g Trockenzellen
pro 1) und das Glucoseniveau in der Fermentationsflüssigkeit nahm auf weniger als 0,01 Gew.-% ab, worauf die kontinuierliche
Fermentierung dann sofort begonnen wurde. Da μπ^χ von
Bacillus stearothermophilus NCA 1503 1,4 (l/h) beträgt, wurde ein sterilisiertes Nährmedium der gleichen Zusammensetzung wie
bei der Keimstufe dem Fermentator in einer Menge von 28,0 l/h zugegeben, und die Fermentationsflüssigkeit wurde in der gleichen
Geschwindigkeit aus dem Fermentator abgezogen. Auf diese Weise wurde der μπ^χ bei 1,00 (in Beispiel 2) gehalten und eine kontinuierliche
Kultivierung wurde durchgeführt unter Verwendung einer 5-fachen Volumenmenge Nährmedium zum auf das Volumen der
Fermentationsflüssigkeit in dem Fermentator.
Die kontinuierliche Kultivierung wurde in gleicher Weise wie vorher angegeben vorgenommen mit der Ausnahme, dass D auf
0,9 μΐηαχ verändert wurde (das zugeführte Medium und die abgezogene
Fermentationsflüssigkeit betrugen 25,2 1) in Beispiel 3 und 0,75 μπ^χ (zugeführte Menge und abgezogene Menge: 21,0 l/h) in
Beispiel 4.
Die Mengen an Glucose-6-phosphat-dehydrgenase in den in den Beispielen
2, 3 und 4 erhaltenen Zellen wurden gemessen und werden in Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1 gibt auch die Menge an Glucose-6-phosphat-dehydrogenase
in den Zellen an, die man bei einer absatawciscn Verfahrensweise (Beispiel 5), die durchgeführt wurde,
bevor man zu einer kontinuierlichen Kultivierung überging, erhielt.
130021/081 1
Glucose-6-phosphat-Ansatz
dehydrogenase-Menge Nr. (U/g an Trockenzellen)
Ausbeute an Zellen Ausbeute an Glucose-(g
Trockene Zellen/ phosphat-dehydrogenase
l/h (U/l/h)
Beisp. 2
Beisp. 3
Beisp. 4
Beisp. 5
98 71 65 69
0,65
0,59
0,54
0,23
0,59
0,54
0,23
63,7 41,9 35,1 15,9
Aus der Tabelle wird ersichtlich, dass die durch kontinuierliche Kultivierung erhaltenen Zellen,bei der D bei Höher als 0,9 pmax
gehalten wurde, ein höheres Glucose-6-phosphat-dehydrogenaseniveau
ergaben als bei einer absatzweisen Verfahrensweise.
In einen 30 1-Ferinentator wurden 10 1 eines Mediums gegeben,
das hergestellt worden war durch Auflösen in 1 1 Leitungswasser eines Gemisches aus 1,3 g Glucose, 1,0 g Aramoniumsulfat, 0,5 g
Hefeextrakt, 0,5 g Monoka1iumphosphat, 0,5 g Dinatriumphosphat
und 0,1 g Magnesiumsulfat. Das Medium wurde mit überhitztem Wasserdampf bei 121° C und 1 bar während 15 Minuten sterilisiert.
1 1 eines flüssigen Inoculums von Bacillus stearothermophilus ATCC 12980, das auf einem Nährmedium der gleichen Zusammensetzung
wie vorher angegeben gekeimt worden war, und bei dem die Absorption bei 660 nm etwa 1,0 erreichte, wurde auf das
sterilisierte Medium übertragen und die Kultivierung wurde bei 57°C und bei einem pH zwischen 6,5 und 7,0 (eingestellt
mit 4 N NaOH) unter Zugabe von Luft in einer Menge von 20 l/Min.
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bei 900 UpM durchgeführt. Nachdem bei einer absatzweisen Kultivierung
während etwa 2,5 h die Absorption bei 660 nm 1,0 erreichte, wurde ein sterilisiertes Nährmedium der gleichen Zusammensetzung
wie vorher angegeben, kontinuierlich mit einer Dosierpumpe in einer Menge von 24,0 l/h zugeführt und die Fermentationsflüssigkeit
wurde in der gleichen Menge und mit der gleichen Vorrichtung aus dem Fermentator abgezogen. Insgesamt wurden 100
Nährmedium bei der kontinuierlichen Kultivierung verwendet. Unmittelbar nach der Fermentierung wurde zentrifugiert (De Laval-Zentjrifuge)
, wobei man 500 g der Zellen gewann.
Die Zellen wurden in der 1,5-fachen 0,1 M Phosphatpufferlösung
suspendiert und mit einem Homogenisator (Dyno-mill) homogenisiert.
Nach dem Abtrennen der unlöslischen Stoffe mit einer Zentrifuge erhielt man ein Rohextrakt mit einem Gehalt an Glucose-6-phosphatdehydrogenase.
Zu 400 ml des Extraktes wurden 200 ml einer 10%igen wässrigen Streptomycinsulfatlösung gegeben, und der erhaltene
Niederschlag wurde auf einer Zentrifuge entfernt, wobei das Streptomycin in der überstehenden Flüssigkeit war. Die überstehende
Flüssigkeit wurde mit Ammoniumsulfat behandelt und dabei Fraktionen von einer 25%igen Sättigung (4°C) bis zur
50 %igen Sättigung (40C) gewonnen. Diese Fraktionen wurden in
50 mMol tris-HCl-Puffer (pH:8,0) gelöst und die Lösung wurde
über eine DEAE-Sephadex-Säuler die mit einem Puffer der gleichen
Formulierung wie vorher angegeben, äquilibriert worden war, geschickt und dann mit einem Puffer der gleichen Formulierung
wie oben, mit der Ausnahme, dass er Natriumchlorid enthielt, eluiert. Die gewünschte Glucose-6-phosphat-dehydrogenase wurde
bei einer NaCl-Konzentration in der Nähe von 0,2 M gewonnen. Die aktive Fraktion wurde einer Säulenchromatografie über
Hydroxyapatit unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 1 angegeben unterworfen. Die dabei erhaltene aktive Fraktion
wurde durch eine Sephacryl S-200-Säule geleitet und mit 300 mMol tric-HCl-Puffer (pH 8,0) enthaltend 0 ,'1 M Natriumchlorid eluiert.
Man erhielt eine Glucose-6-phosphat-dehydrogenase, die
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ein einzelnes Band bei einer Scheibenelektrophorese mit Acrylamid wie-in Beispiel 1 ergab. Das Enzym zeigte ein einzelnes
Peak bei einer Sephadex G-200-Chromatografie wie in Beispiel 1,
entsprechend einem durchschnittlichen Molekulargewicht von etwa 230.000.
Die Ausbeute an Enzym betrug etwa 20 mg und die Stärke etwa 100 Einheiten/mg. Der Reinigungsgrad des Enzyms war etwa
1100 im Vergleich zu dem Rohextrakt, das mit 1 bewertet wurde.
Anwendungsbeispiele 1,
2
und 3
Die in Beispiel 1 hergestellte Glucose-6-phosphat-dehydrogenase
wurde zur Bestimmung der Glucosemenge in Standard-Sera mit einem bereits bekannten Gehalt von 76 mg/dl (Anwendungsbeispiel 1),
155 mg/dl (Anwendungsbeispiel 2) und 43 mg/dl (Anwendungsbeispiels 3) an Glucose verwendet.
Verfahren:
Eine Reaktionsflüssigkeit wurde hergestellt durch Auflösen
von 1 Einheit/ml Glucose-6-phosphat-dehydrogenase, 2 Einheiten/
ml Hexokinase, 2 MMoI NAD, 2 mMol ATP und 2 mMol MgCl2 in
1 ml einer 100 mMol Phosphatpufferlösung (pH: 8,5). Nach 5-minütigem
Stehen bei 300C wurde die Reaktionsflüssigkeit mit 20 μΐ
des jeweiligen Standard-Serums vermischt. Nach 5-minütiger Umsetzung bei 300C wurde die Absorption bei 340 nm mit einem
Spektrofotometer gemessen. Zur Kontrolle wurden 20 μΐ reines
Wasser zu einer Reaktionsflüssigkeit der gleichen Formulierung
wie vorher angegeben gegeben und nach 5 Minuten bei 300C die
Adsorption bei 34 nm bestimmt. Die Adsorption des Kontrollversuches wurde von der Adsorption der jeweiligen Standard-Seren
abgezogen, um auf diese Weise die Erhöhung der Adsorption zu bestimmen. Die Glucosemenge (mg) in 1 dl eines jeden Standard-Serums1
.-wurde nach folgender Gleichung-berechnet:
13 0 0 21/0811
145,8 χ (Erhöhung der Adsorption) =
Glucosemenge (mg) in 1 dl Probe.
Die Ergebnisse werden in Tabelle 2 gezeigt.
Anwendungsbeispiel 1 79 mg/dl Anwendungsbeispiel 2 151 mg/dl Anwendungsbeispiel 3 .43 mg/dl
Aus den Ergebnissen in Tabelle 2 geht hervor, dass die bekannten Glucosekonzentrationen in Proben sehr gut übereinstimmten
mit den gemessenen Glucosekonzentrationen, und dass man somit Glucosekonzentrationen nach dem vorerwähnten Verfahren
messen kann.
130021 /0811
Leerseite
Claims (16)
1. Glucose-G-phosphat-dehydrogenase-enzym, erhaltend aus
einem Mikroorganismus vom Genus Bacillus, das nach einer etwa 15-minütigen Inkubation in einer Pufferlösung bei
einer Temperatur von etwa 5O0C einen Aktivitätswert von
wenigstens etwa 80 % der ursprünglichen Aktivität beibehält.
2. Enzym gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
dass der Aktivitatswert grosser als etwa 90 % ist.
3. Enzym gemäss Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet,
dass der Aktivitätswert etwa 100 % ist.
130021/081 1
4. Enzym gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
dass die Pufferlösung eine Temperatur von etwa 57°C hat.
5. Enzym gemäss Ansprüchen 1 oder 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Glucose-6-phosphat-dehydrogenase
auf Nikotinamid-adenindinucleotid, das als Vorenzym verwendet wird, einwirkt.
6. Verfahren zur Herstellung einer Glucose-6-phosphat-dehydrogenase,
bei dem ein Mikroorganismus vom Genus Bacillus kultiviert wird, dadurch gekennzeichnet ,
dass man aus der Kultur eine Glucose-6-phosphat-dehydrogenase
gewinnt, die nach einem etwa 15-minütigen Inkubieren
in einer Pufferlösung mit einer Temperatur von etwa 5O0C
wenigstens 80 % der Anfangsaktivität beibehält.
7. Verfahren gemäss Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet,
dass eine kontinuierliche Kultivierung unter solchen Bedingungen durchgeführt wird, dass der Verdünnungsgrad
D wenigstens 0,9 ^max ist, wobei μίτ^χ der maximale spezifische
Wachstumsgrad des Mikroorganismus der unter kontinuierlichen Kultivierungsbedingungen kultiviert wird, ist.
8. Verfahren gemäss Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet,
dass der verwendete Mikroorganismus vom Genus Bacillus Bacillus stearothermophilus ist.
9. Coenzymzusammensetzung, bestehend im wesentlichen aus einer
Glucose-6-phosphat-dehydrogenase, die nach 15-minütigem
Inkubieren in einer Pufferlösung mit einer Temperatur von etwa 5O0C einen Aktivitätswert von wenigstens etwa 80% der Ursprungsaktivität
beibehält und aus Nikotinamid-adeninnucleotidphoBphat.
130021/0811
10. Coenzymzusammensetzung gemäss Anspruch 9, dadurch g e kennzei
chnet , dass der Aktivitätswert wenigstens etwa 90 % ist.
11. Verfahren gemäss Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet , dass das Bacillus stearothermophilus
ausgewählt ist aus ATCC 7953, 7954, 8005, 10149, 12980 und 1503.
12. Verfahren gemäss Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet , dass der Mikroorganismus NCA 1503 ist
und dass die Pufferlösung eine Temperatur von etwa 57°C und einen pH von etwa 6,8 hat.
13. Enzym gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet ,
dass der Mikroorganismus vom Genus Bacillus Bacillus stearothermophilus ist.
14. Enzym gemäss Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet,
dass der Mikroorganismus ausgewählt ist aus der Gruppe ATCC 7953, 7954, 8005, 10149, 12980 und NCA 1503.
15. Glucose-6-phosphat-dehydrogenase, dadurch gekennzeichnet , dass sie bei 15-minütiger Inkubierung
in einer Pufferlösung einer Temperatur von etwa 500C einen
Aktivitätswert von wenigstens 80 % der Anfangsaktivität beibehält.
16. Coenzymzusammensetzung, dadurch gekennzeichnet ,
dass sie im wesentlichen aus Glucose-6-phosphat-dehydrogenase
die von einem Mikroorganismus vom Genus Bacillus erhalten wurde und die bei etwa 15-minütigem Inkubieren in
13 0 0 2 1/0811
-A-
einer.Pufferlösung mit einer Temperatur von etwa 500C einen
Aktivitätswert von wenigstens etwa 80 % beibehält»und
aus Nikotinamid-adenindinucleotid besteht.
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Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP14485879A JPS5668391A (en) | 1979-11-07 | 1979-11-07 | Glucose-6-phosphate dehydrogenase and its preparation |
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| Publication Number | Publication Date |
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| DE3041744C2 DE3041744C2 (de) | 1990-07-12 |
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Family Applications (1)
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| US5137821A (en) * | 1988-12-29 | 1992-08-11 | Toyo Jozo Company, Ltd. | Gene and process of making glucose-6-phosphate dehydrogenase |
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Citations (1)
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| Chemical Abstracts, 80, 79 469 t, 1974 * |
| Chemical Abstracts, 81, 117 004 t, 1974 * |
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