DE2929530C2

DE2929530C2 - Glycerin oxidierendes Enzym, Verfahren zu seiner Herstellung und seine Verwendung zur quantitativen Bestimmung von Glycerin

Info

Publication number: DE2929530C2
Application number: DE2929530A
Authority: DE
Inventors: Hiroko Yokohama Kanagawa Akita; Osamu Terada; Takayuki Machida Tokyo Uwajima
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1978-07-21
Filing date: 1979-07-20
Publication date: 1982-04-15
Also published as: US4255519A; JPS5515736A; GB2025979A; JPS6031471B2; DE2929530A1; GB2025979B

Description

dadurch gekennzeichnet,
folgende Eigenschaften besitzt:

daß es noch

(2) Substratspezifität: Spezifische Wirkung auf Glycerin und Dihydroxiaceton;

(3) pH-Optimum: 7,8 bis 8,6;

(4) pH-Stäbiiitätsbereich: 7,5 bis 10,0;

(5) Temperatur-Optimum der Wirkung: 37° C;

(6) Michaelis-Konstante gegen Glycerin (K_n,-Wert):8,0xl0-³m;

und erhältlich ist durch Züchten von Penicillium sp. NRRL 11 339 in einem Nährmedium, das zu Beginn der Züchtung einen pH-Wert von 6 bis 8 aufweist, wobei man die Züchtung bei 18 bis 30° C unter Bewegen 30 bis 72 Stunden durchführt und das Enzym aus der eshaltenen Kulturlösung gewinnt.

2. Verfahren zur Herstellung des Glycerin oxidierenden Enzyms gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Penicillium sp. NRRL 11 339 in einem Nährmedium züchtet, das zu Beginn der Züchtung einen pH-Wert von 6 bis 8 aufweist, die Züchtung bei 18 bis 3O⁰C unter Bewegen 30 bis 72 Stunden durchführt und das Enzym aus der erhaltenen Kulturflüssigkeit gewinnt.

3. Verwendung des Glycerin oxidierenden Enzyms gemäß Anspruch 1 zur quantitativen Bestimmung von Glycerin.

Fig. 1 zeigt die Menge der Sauerstoff auf nähme in einem Reaktionssystem, in dem Glycerinoxidase II mit Glycerin in Gegenwart von Sauerstoff umgesetzt wird. Dabei gibt die Kurve A die Menge der Sauerstoffaufnahnie in einem Reaktionssystem ohne Katalase und die Kurve B die Menge der Sauerstoffaufnahme in Gegenwart von Katalase wieder.

Fig.2 zeigt die relativen Aktivitäten nach lOminütiger Inkubation bei 37° C und verschiedenen pH-Werten, ίο Fig.3 zeigt die Restaktivitäten nach 15minütiger Behandlung bei 30° C und verschiedenen pH-Werten.

F i g. 4 zeigt die Beziehung zwischen der Reaktionszeit und der optischen Dichte bei 500 nm bei der Messung der Enzymaktivität

Fig.5 zeigt die Enzymaktivität nach lOminütiger Inkubation beim pH-Wert 8 und verschiedenen Temperaturen.

Fig.6 zeigt die Restaktivitäten nach 15minütiger Behandlung bei verschiedenen Temperaturen.
F i g. 7 ist eine graphische Darstellung der Werte von Tabelle IV.

Die Glycerinoxidase II weist folgende enzymologische und physikochemische Eigenschaften auf:

30

(a) Wirkung

Die erfindungsgemäße Glycerinoxidase oxidiert Glycerin unter Verbrauch von Sauerstoff und unter Bildung von Wasserstoffoxid und Glycerinaldehyd.

(b) Substratspezifität

Das erfindungsgemäße Enzym reagiert spezifisch mit Glycerin und Dihydroxyaceton.

35 7,8 bis 8,6.

7,5 bis 10,0.

(c) pH-Optimum

(d) pH-Stabilitätsbereich

(e) Temperaturoptimum der Wirkung

45

Aus der DE-OS 28 17 087 ist ein Glycerin oxidierendes Enzym (im folgenden als Glycerinoxidase I so bezeichnet) bekannt, das bei Züchtung eines Mikroorganismus der Gattungen Aspergillus oder Neurospora erhalten wird.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Glycerin oxidierendes Enzym, das nachstehend als »Glycerinoxidase II« bezeichnet wird, das sich zur quantitativen Bestimmung von Glycerin eignet, sowie ein Verfahren zur Herstellung dieses Enzyms zu schaffen. Diese Aufgabe wird gemäß den Patentansprüchen gelöst.

Es wurde festgestellt, daß die erfindungsgemäße Glycerinoxidase II die gleiche Wirkung wie die in der vorgenannten DE-OS beschriebene Glycerinoxidase I aufweist, aber in bezug auf Substratspezifität, pH-Optimum, pH-Stabilitätsbereich, Temperatur-Optimum der Wirkung und Substrataffinität (Michaelis-Konstante für Glycerin) Unterschiede zu der bekannten Glycerinoxidase aufweist.

37° C.

8,0 XlO-^

(f) Michaelis-Konstante
gegen Glycerin (K_n,-Wert)

(g) Bedingungen für die pH-Inaktivierung

Glycerinoxidase II wird durch 30minütige Behandlung bei pH-Werten über 10,5 oder unter 7,0 inaktiviert.

(h) Bedingungen für eine Inaktivierung
durch Temperatureinwirkung

Glycerinoxidase II wird durch eine 30minütige Behandlung bei 45°C zu etwa 15 Prozent und durch eine 30minütige Behandlung bei 50° C zu etwa 65 Prozent inaktiviert.

(i) Enzyminhibitoren

Die nach Zusatz von verschiedenen Inhibitoren in einer Konzentration von 1 millimolar erhaltenen Enzymaktivitäten sind in Tabelle I zusammengestellt, wobei die Enzymaktivität ohne Inhibitorzusatz als 100 definiert wird. Die Aktivität wird aufgrund der Geschwindigkeit der Sauerstoffaufnahme bei der Umsetzung, die mit einem Warburg-Manometer gemessen wird, berechnet.

Tabelle I

Inhibitor

Relative Geschwindigkeit, %

Ohne	100
AgNO,	O
HgCl₂	79,0
Pb(CH₃COO)₂	26,3
p-Chloromercuribenzoat	81,4
ZnCl,	84,3
FeSO₄	0
NH₃OH	0
o-Phenanthrolin	65,5
(Ζ,α'-Dipyridyl	75,7
EDTA	82,8
Neocuproin	80,3
Diäthyldithiocarbamat	0

(j) Stabilisierung des Enzyms

Die Wännebeständigkeit und Lagerbeständigkeit des Enzyms wird durch TES-Puffer nach Good (N-Tris-(hydroxymethyl)-methyl-2-amino-äthansuIfonsäure; Biochemistry, Bd. 5 (1966), S. 467 bis 477) verbessert

(k) Molekulargewicht

Das Molekulargewicht von Glycerinoxidase II beträgt 300 000 oder mehr, wie sich aus dem Elutionsverhalten bei der Gelfiltration unter Verwendung einer mit dreidimensional vernetztem Dextran (Sephadex G-200) gepackten Säule ergibt.

(1) Kristallstruktur und Elementaranalyse

Eine Kristallisation des Enzyms ist bisher nicht gelungen. Eine Bestimmung der Elementaranalyse wurde bisher nicht durchgeführt.

Der zur Herstellung des erfindungsgemäßen Enzyms verwendete Stamm Penicillium sp. NRRL 11 339 weist die nachstehend angegebenen morphologen Eigenschaften auf.

1. Züchtungseigenschaften auf verschiedenen Medien:

(a) Auf Czapek-Agar zeigen die Kolonien ein sehr geringes Wachstum und erreichen innerhalb 1 Woche einen Durchmesser von etwa 15 mm. Die Kolonien sind dünn und halbtransparent.

(b) Auf Malzextrakt-Agar ergibt sich ein Kolonienwachstum von etwa 32 mm Durchmesser. Die Kolonien sind flach und kompakt. Der Kolonienrand ist weiß und der Konidienbereich olivfarben (1 '/2 ni — 1 '/2 p]. Color Harmony Manual, Container Corp. of America). Es bildet sich kein Exsudat. Die Rückseite ist weiß.

2. Konidiophoren wachsen bis zu etwa 50 μηι Länge und 3 μίτι Durchmesser mit einer einfachen oder doppelten asymmetrischen (Asymmetrica) Verzweigung. Die Wände sind etwas granuliert.

3. Metulae stark divergierend (Divaricata), etwa 9 x 12 μπι auf 2,5 bis 3 μπα mit granulierten Wänden.

4. Sterigmata von etwa 8 bis 9 μΐη auf 2,5 bis 3 μίτι, die in Richtung zu den Spitzen Verengungen und Ausbuchtungen aufweisen und die Gestalt von Figuren beim Kegelspiel haben.

5. Konidien von etwa 3 μηι Durchmesser, klar seeigelartig, aber nicht auffallend.

6. Sclerotia und Perithecia: keine

7. Wachstumstemperatur

Auf Malzextrakt-Agar mäßiges Wachstum bei 25° C und reichliche Sporenbildung, bei 30° C Wachstum vollständig begrenzt ohne Sporenbildung.

8. Nährstoffbedarf

Auf Czapek-Agar bei 25° C sehr geringes Wachstum (1, (a)). Auf »steep«-Agar breiteres und dickeres Wachstum bei reichlicher Sporenbildung und auf Malzextrakt-Agar wesentlich besseres Wachstum.

9. Physiologische Bedingungen

(a) Optimale Wachstumsbedingungen

pH-Wert 4 bis 7, Temperatur: 20 bis 25° C.

(b) Wachstumsbereich

pH-Wert: 2 bis 9, Temperatur: 0 bis 30° C.

Gemäß »A Manual of the Penicilla«, K. B. Raper, C.

Thorn, D. I. Fenne], The Williams & Wilkins Company, Baltimore, ergibt sich, daß der Penicillium sp-Stamm mit den vorstehenden morphologischen Eigenschaften zu den Pilzen der Reihe Penicillium nigricans gehört Die genaue Einordnung dieses Pilzes wurde in der Literatur bisher noch nicht vorgenommen.

Es können beliebige synthetische und natürliche Medien verwendet werden, sofern sie entsprechende Kohlenstoffquellen, Sückstoffquellen, anorganische Salze und andere Nährstoffe enthalten.

Beispiele für Kohlenstoffquellen sind Kohlenhydrate, wie Glucose, Saccharose und Rohrzuckermelassen, und Zuckeralkohole, wie Glycerin, Sorbit und Mannit.

Als Stickstoffquellen kommen wäßriges Ammoniak, verschiedene anorganische und organische Ammoniumverbindungen, wie Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Ammoniumcarbonat und Ammoniumphosphat, Stickstoffverbindungen, wie Harnstoff, und stickstoffhaltige organische Materialien, wie Peplon, Hefeextrakt, Caseinhydrolysat, entfettete Sojabohnen oder Hydrolyseprodukte davon, in Frage.

Beispiele für anorganische Materialien sind Metallsalze, wie Natrium-, Kalium-, Mangan-, Magnesium-, Calcium-, Kobalt-, Nickel-, Zink- und Kupfersalze, sowie Salze von Chromsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Salpetersäure und Salzsäure.

Die Züchtung wird im allgemeinen bei Temperaturen von 18 bis 30° C und zweckmäßig von 20 bis 25° C durchgeführt, wobei beim Züchtungsbeginn der pH-Wert 6 bis 8 und zweckmäßig etwa 6,5 beträgt. Nach 30- bis 72stündiger Züchtung unter Schütteln oder unter Submersbedingungen unter Belüftung und Bewegung bildet sich in der Gärflüssigkeit eine beträchtliche Menge an Glycerinoxidase II.

Die auf diese Weise in der Gärflüssigkeit gebildete Glycerinoxidase II kann auf folgende Weise gewonnen werden:

Da Glycerinoxidase II im allgemeinen in den Mikroorganismenzellen entsteht, wird nachstehend ein Verfahren zur Gewinnung des Enzyms aus den Mikroorganismenzellen beschrieoen. Nach beendeter Züchtung werden die durch Filtration der Gärflüssigkeit erhaltenen Mikroorganismenzellen in ausreichendem Umfang mit Wasser oder Pufferlösung gewaschen. Anschließend werden die Zellen in einer entsprechenden Menge einer Pufferlösung suspendiert und aufgebrochen. Das Aufbrechen der Zellen erfolgt durch mechanische Zerkleinerung in bekannten Geräten.
Feste Bestandteile werden von der nach dem

Aufbrechen der Mikroorganismenzellen erhaltenen Lösung durch Filtration oder Zentrifugation entfernt. Anschließend wird aus der Lösung die Glycerinoxidase II nach einem üblichen Verfahren zur Isolierung von Enzymen gewonnen. Beispielsweise läßt sich ein Enzympulver durch (1) fraktionierende Fällung mit Ammoniumsulfat, (2) Säulenchromatographie an DEAE-Cellulose, (3) Fraktionierung mit einem Molekularsieb (Sephadex), (4) Säulenchromatographie an Hydroxylapatit und (5) Gefriertrocknung der aktiven Fraktionen erhalten. Die einzelnen Verfahrensstufen können selbstverständlich wiederholt angewendet werden. Ferner können auch andere herkömmliche Reinigungsverfahren gegebenenfalls in Kombination mit den vorstehend genannten Reinigungsschritten eingesetzt werden.

Nachstehend sind die enzymologischen und physikochemischen Eigenschaften von Glycerinoxidase II detaillierter angegeben, und zwar für das gereinigte Präparat von Beispiel 1.

1. Wirkung

Glycerinoxidase II oxidiert Glycerin unter Verbrauch von Sauerstoff und unter Bildung von Wasserstoffperoxid und Glycerinaldehyd.

(a) Bestätigung der
Bildung von Wasserstoffperoxid

Zusammensetzung des Reaktionssystems A
(ohne Katalase)

Reagentien

wäßrige 0,01 m Glycerinlösung 0,5 ml

0,1 m TES-Puff er (pH-Wert 8,0) 1,0 ml

wäßrige Lösung von Glycerinoxidase 0,2 ml')

6	0,5 ml	B
wäßrige 2,4 millimolare Lösung	0,5 ml	ι ü
von 4-Aminoantipyrin	0,2 ml 2)
wäßrige 42 millimolare Phenollösung	0,1ml	ί Ϊ
wäßrige Lösung von Peroxidase
Wasser	t

30

Glycerinoxidase II wird mit Glycerin in Gegenwart von Sauerstoff umgesetzt Anschließend wird das Enzymsystem mit Peroxidase, Phenol und 4-Aminoantipyrin versetzt wobei Chinonimin-Pigment im Reaktionssystem gebildet wird (Reaktion von Wasserstoffperoxid mit Peroxidase, Phenol und 4-Aminoantipyrin gemäß Clin. Chem„ Bd. 20 (1974), S. 20.

(a)-2

Glycerinoxidase wird mit Glycerin in Gegenwart von Sauerstoff unter Bildung von Wasserstoffperoxid umgesetzt Zur Zersetzung des gebildeten Wasserstoffperoxids wird Katalase zugegeben. Anschließend werden Peroxidase, Phenol und 4-Aminoantipyrin zugesetzt um die vorstehend genannte Umsetzung vorzunehmen. Im Reaktionssystem bildet sich aber kein Chinonimin-Pigment

(a)-3

Bei Anwesenheit von Katalase im durch Glycerinoxidase in Gegenwart von Sauerstoff katalysierten Glycerin-Oxidationssystem sinkt die Sauerstoffaufnahme auf die Hälfte. Dies wird durch folgende experimentelle Befunde gestützt:

²) Produkt mit einem Gehalt an 200 Einheiten der spezifischen Aktivität 1000.

(a)-3-2

Zusammensetzung des Reaktionssystems B
(mit Katalase)

Reagentien

wäßrige 0,01 rn Glycerinlösung 0,5 ml

0,1 m TES-Puffer (pH-Wert 8,0) 1,0 ml

wäßrige Lösung von Glycerinoxidase 0,2 ml')

wäßrige Lösung von Katalase 1,0 ml³)

Wasser 0,3 ml

¹J vgl. Reaktionssystem A.

³) Produkt mit einem Gehalt an 100 Katalaseeinheiten mit einer spezifischen Aktivität von 100.

(a)-3-3
Reaktionsdurchführung

Im Fall des Systems ohne Katalase werden die Reagentien des Reaktionssystems A vermischt Die Reaktion wird bei 37° C unter Rühren durchgeführt Die Menge der Sauerstoffaufnahme wird mit einem Warburg-Manometer gemessen. Die Ergebnisse sind in F i g. 1 zusammengestellt

Im Fall des Systems mit einem Gehalt an Katalase werden die Reagentien des Reaktionssystems B vermischt Die Reaktion wird bei 37° C durchgeführt Die Menge der Sauerstoffaufnahme wird auf die vorstehend beschriebene Weise gemessen. Die Ergebnisse sind ebenfalls in F i g. 1 zusammengestellt Wie sich aus F i g. 1 ergibt werden in Abwesenheit von Katalase (Kurve A von F i g. 1) bei 5,0 μΜοΙ Glycerin als Substrat 4,98 μΜοΙ Sauerstoff verbraucht In Gegenwart von Katalase (Kurve B von Fig. 1) werden 2,51 μΜοΙ Sauerstoff verbraucht was etwa der Hälfte des Sauerstoffverbrauchs von (A) entspricht

Die vorstehend unter (a)-l, (a)-2 und (a)-3 aufgeführten Befunde bestätigen, daß das erfindungsgemäße Enzym zur Bildung von Wasserstoffperoxid in der Lage ist

tine quantitative Bestimmung des gebildeten Wasserstoffperoxids wird durch eine quantitative colorimetrische Bestimmung des gebildeten Chinonimin-Pigments durchgeführt Dabei ergibt sich, daß im Reaktionssystem A gemäß dem nachstehend erläuterten Verfahren 4-AA 4,96 μΜοΙ Wasserstoffperoxid aus 5 μΜοΙ Glycerin gebildet werden.

(b) Bestätigung der Bildung von Glycerinaldehyd

65

') Mit einem Gehalt an 5 μΜοΙ Glycerinoxidase mit einer spezifischen Aktivität von 6.3, erhalten gemäß Beispiel L

Glycerinoxidase wird mit Glycerin in Gegenwart von Sauerstoff umgesetzt Ein Reaktionsprodukt wird als Glycerinaldehyd identifiziert

Verfahren zur Identifikation

(b)-i-i-O)

Reaktionslösung

5 Tropfen einer wäßrigen Lösung mit einem Gehalt an 50 mg/ml Glycerin, 5 Tropfen einer Lösung mit einem Gehalt an 10 U/ml Glycerinoxidase in 0,02 m TES-Puffer und 1 Tropfen Katalase mit 14 000 U/ml werden vereinigt. Die Umsetzung wird unter Schütteln 20 Stunden bei 30° C durchgeführt.

(b)-l-l-(2)
Identifikation

Bei der nachstehend erläuterten Dünnschichtchromatögraphie läßt sich als Produkt in der Reaktionsiösung

Glycerinaldehyd durch Vergleich mit einer authentischen Probe nachweisen.

Zur Dünnschichtchromatographie wird eine Merck-Kieselgel-Platte G-60 F-254 verwendet. Als Laufmittel dienen das Lösungsmittelsystem 1 (Butanol zu Essigsäure zu Wasser im Verhältnis 4:1:1 (Volumteile)) und das Lösungsmittelsystem 2 (Butanol zu Pyridin zu Wasser im Verhältnis 3 :2 :1,5 (Volumteile)).

Nach der Durchführung der Dünnschichtchromato-

lü graphie werden drei verschiedene Reaktionen auf der Platte durchgeführt, nämlich die p-Anisidin-Reaktion, die Perjodsäure-Benzidin-Reaktion und die 2,4-Dinitrophenylhydrazin-Reaktion. Dabei ergeben sich Rr-Werte und Färbungen der Flecken, die mit der authentischen Probe übereinstimmen. Die Ergebnisse sind in Tabelle II zusammengestellt.

Tabelle II

Identifikation der bei der Dünnschichtchromatographie erhaltenen Reaktionsprodukte (R_rWerte und Farbreaktionen)

Färbereagens

Probe/Laufmittel

Lösungsmittel	Lösungsmittel-
system 1	system 2
RrWert 0,67	0,76 (braun)
(braun)
R_rWert 0,69	0,78 (braun)
(braun)
R_rWert 0,66	0,76
ω*	ω*
R_rWert 0,68	0,78
ω*	ω*
RrWert 0,67	0,77
(orangefarben)	(orangefarben)
R_rWert 0,69	0,78
(orangefarben)	(orangefarben)

p-Anisidin-Chlorwasserstoffsäure-Reagens¹)

Perjodsäure-Benzidin-Reagens²)

2,4-Dinitrophenylhydrazin-Reagens³)

Glycerinaldehyd (authentische Probe) Reaktionsprodukt

ί Glycerinaldehyd (authentische Probe)

{ Reaktionsprodukt

Die in Klammern angegebenen Farbangaben beziehen sich auf die Färbung der Flecken.

(^* Beim Perjosäure-Benzidin-Reagens bedeutet einen weißen Flecken mit blauem Hintergrund.

Anmerkungen:

') p-Anisidin-Chlorwasserstoff-Reagens: Reduzierende Carbonylverbindungen, wie Zucker, reagieren mit p-Anisidin-Chlorwasserstoffsäure unter Bildung einer für die jeweilige Struktur charakteristischen Färbung.

²) Perjodsäure-Benzidin-Reagens: Polyalkohol und Verbindungen ählicher Struktur verbrauchen Perjodsäure, so daß eine Reaktion mit Benzidin verhindert wird. Somit lassen sich diese Verbindungen als weiße Flecken nachweisen.

³) 2,4-Dmitrophenylhydrazin-Reagens: Carbonylverbindungen reagieren mit 2,4-Dinitrophenylhydrazin unter Bildung von 2,4-Dinitrophenylhydrazonen, die sich als orangefarbene Flecken nachweisen lassen.

Aus der vorstehenden Tabelle ergibt sich, daß die erhaltenen Produkte und die authentische Probe von Glycerinaldehyd sich in bezug auf Rf-Werte und Anfärbung vollkommen gleich verhalten. Dies stellt eine Bestätigung dafür dar, daß es sich bei dem Produkt, das durch Umsetzung der Glycerinoxidase II mit Glycerin in Gegenwart von Sauerstoff erhalten worden ist, um Glycerinaldehyd handelt

(b)-2

Die Menge an Glycerinaldehyd, die bei der Umsetzung von Glycerinoxidase II mit Glycerin in Gegenwart von Sauerstoff gebildet wird, ist fast äquimolar zur verbrauchten Glycerinmenge. Dieser Befund wird durch Zusatz von 2,4-Dinitrophenylhydrazin zum Reaktionssystem bestätigt Dabei wird das entsprechende 2,4-DinitrophenyIhydrazon gebildet, das durch Colorimetrie quantitativ bestimmt wird.

(c) Bestätigung der Menge der Sauerstoffaufnahme

Der Sauerstoffverbrauch im System, in dem Glycerinoxidase II mit Glycerin umgesetzt wird, wird mit Hilfe einer Sauerstoffelektrode und einem Warburg-Manometer gemessen. Dabei wird bestätigt, daß die Menge der Sauerstoffaufnahme der Menge an gebildetem Glycerinaldehyd entspricht

(d) Die Ergebnisse der quantitativen Bestimmungen der Menge an Wasserstoffperoxid und Glycerinaldehyd und der Menge der Sauerstoffaufnahme, die gemäß den vorstehend erläuterten Verfahren (a), (b) und (c)

durchgeführt worden sind, stehen im Einklang mit der angenommenen Stöchiometrie.

Die vorstehenden qualitativen und quantitativen Untersuchungen bestätigen, daß das Glycerinoxidase II enthaltende System Glycerin unter Bildung von Wasserstoffperoxid und Glycerinaldehyd gemäß nachstehender Gleichung oxidiert.

CH₂OH
CHOH
CH₂OH

O,

CH₂OH CHOH + H₂O₂ CHO

II. Substratspezifität III. pH-Optimum und pH-Stabilitätsbereich

Das pH-Optimum liegt im Bereich von 7,8 bis 8,6. Die Aktivitäten werden nach lOminütiger Inkubation bei 37°C bei verschiedenen pH-Werten unter Verwendung von TES-Puffer gemessen. Die Ergebnisse sind in F i g. 2 zusammengestellt.

Der pH-Stabilitätsbereich beträgt 7,5 bis 10,0. Die restlichen Aktivitäten werden nach 15minütiger Behandlung bei 37°C bei verschiedenen pH-Werten unter Verwendung von TES-Puffer gemessen. Die Ergebnisse sind in F i g. 3 zusammengestellt.

IV. Verfahren zur
Bestimmung der enzymatischen Aktivität

Die enzymatische Aktivität wird in »Einheiten« ausgedrückt. Eine Enzymeinheit ist als die Enzymmenge definiert, die in 1 Minute in Gegenwart von Sauerstoff 1 μΜοΙ Glycerin bei 37° C zersetzt. Die Bestimmung der

Die relative Aktivität wird unter Verwendung von anderen Substraten gemessen. Diese Substrate werden

in äquimolaren Mengen zum Glycerin im Verfahren zur 20 Enzymaktivität wird folgendermaßen durchgeführt: Messung der Aktivität gemäß 4-AA verwendet. Glycerin wird unter Rühren mit Glycerinoxidase II

unter Bildung von Wasserstoffperoxid umgesetzt Das gebildete Wasserstoffperoxid wird in Gegenwart von Peroxidase mit 4-Aminoantipyrin und Phenol umgesetzt, wodurch ein Chinonimin-Pigment gebildet wird Die optische Dichte des erhaltenen Chinonimin-Pigments im sichtbaren Bereich, die ein Maß für das gebildete Wasserstoffperoxid darstellt, wird gemessen. Auf diese Weise wird die Enzymaktivitäl (nachstehend bezeichnet als »4-AA-Verfahren«) bestimmt.

Die spezifische Aktivität wird als Einheiten pro 1 mg Protein definiert Die Menge des Enzymproteins wird gemäß dem Lowry-Verfahren unter Verwendung eines Kupfer-Folin-Reagens gemessen; vgl. O. H. Lowry, N. J. Rosebrough, A. L. Farr und R. ]. Randall, J. Biol. Chem., Bd. 193 (1951), S. 265.

Die relativen Aktivitäten bezüglich der weiteren Substrate sind in Tabelle III zusammengestellt, wobei die Glycerinaktivität als 100 gesetzt wird.

Tabelle III
Substratspezifität

Substrat

Relative Aktivität

Glycerin 100

Glycerin-3-phosphorsäure 12

Dihydroxyaceton 293

1,2-Propandiol 11

1,3-Propandiol 23

1,3-Butandiol 11

2,3-Butandiol 16

1,4-Bulandiol 11

Äthanol 11

n-Propanol 11

Isopropanol 23

sek.-Butanol 9

Isobutan öl 14

n-Butanol 7

CH₂OH

(a) Prinzip

Die Bestimmung der Enzymaktivität wird durch Umsetzung des enzymatisch gebildeten Wasserstoffperoxids mit 4-Aminoantipyrin und Phenol in Gegenwart von Peroxidase unter Bildung eines Chinonimin-Pigments durchgeführt Das gebildete Chinonimin-Pigment wird quantitativ bestimmt Die vorstehenden Umsetzungen lassen sich durch die Reaktionsgleichungen (1) und

(2) darstellen:
CH₂OH

CHOH + O₂
CH₂OH

Glycerinoxidase II

CHOH + H₂O₂

OH

N O 2H₂O₂ + CH₃—Ny

CH₃ NH₂

4-Aminoantipyrin

CH₃—N

CH

+ 4H₂O (2)

Das Reaktionsprinzip der Gleichung (2) ergibt sich aus CC. Allain und Mitarb., Clin. Chem., Bd. 20 (1974), S. 470.

(b) Reagentien

(1)	Substrat: wäßrige 0,1 m	0,5 ml
	Giycerinlösung
(2)	Puffer: 0,1 mTES-Puffer vom	1,0 ml
	pH-Wert 8
(3)	4-Aminoantipyrin: wäßrige	0,5 ml
	2,4 millimolare Lösung
(4)	Phenol:42 millimolare wäßrige	0,5 ml
	Lösung
(5)	wäßrige Lösung von Peroxidase:
	Proteinmenge 2 mg/ml,	0.1 ml
	spezifische Aktivität 100	0,3 ml
(6)	Wasser	0,1ml
(7)	wäßrige Enzymlösung

pH-Werts von 7,0 bzw. oberhalb eines pH-Werts von 10,5 inaktiviert.

Inaktivierung durch Temperatureinflüsse
ι

Nach einer 15minütigen Erwärmung bei einem pH-Wert von 7,8 in 0,1 m TES-Pufferlösung werden die restlichen Aktivitäten gemessen. Wie sich den in F i g. 6 wiedergegebenen Ergebnissen entnehmen läßt, ist das in Enzym bis zu 4O⁰C lOOprozentig stabil und wird bei 45° C zu etwa 15 Prozent inaktiviert.

VII. Hemmung, Aktivierung und Stabilisierung

r> Diesbezüglich wird auf die vorstehenden Erläuterungen verwiesen.

VIII. Substrataffinität

(c) Versuchsdurchführung

Die Reagentien (1) bis (6) werden in einem Reagenzglas vermischt und sodann 5 Minuten bei 37° C geschüttelt. Sodann wird die Enzymlösung zugesetzt. Das erhaltene Gemisch wird mit TES-Puffer auf 3 ml aufgefüllt. Die Umsetzung wird 10 Minuten unter Schütteln bei 37° C durchgeführt. Zu Vergleichszwecken wird ein entsprechendes Verfahren unter Verwendung von Wasser anstelle der Testlösung durchgeführt. Die optische Dichte der Reaktionslösung bei 500 nm wird gemessen. Die Differenz zur Kontroilösung wird als Δ OD (optische Dichte) bestimmt.

(d) Berechnung der Enzymaktivität

Wie bereits erwähnt, ist 1 Einheit Glycerinoxidase II als die Enzymmenge definiert, die in 1 Minute bei 37°C 1 μΜοΙ Glycerin zersetzt.

Der Absorptionskoeffizient von 1 millimolar Chinonimin-Pigment beträgt 5,33 (vgl. Clin. Chem. Bd. 20 (1974), S. 470). Ergibt sich für die optische Dichte {AOD) bei 500 nm der gemäß dem vorstehenden Verfahren IV-(c) erhaltenen 3 ml Reaktionslösung ein Wert von a, so läßt sich die Enzymaktivität (A) pro 1 ml Enzymlösung nach folgender Formel berechnen:

a ■

5,33

3 ·

50

= a ■ 0,56 (Einheiten/ml).

Die OD-Werte bei 500 nm werden unter Veränderung der Reaktionszeit (bei der Messung der enzymatischen Aktivität) gemessen. Die Ergebnisse sind in F i g. 4 zusammengestellt Aus Fig.4 ergibt sich, daß die Oö-Werte bei 500 nm proportional zur Reaktionszeit sind-

V. Optimaler Temperaturbereich der Wirkung

Die Enzymaktivität nach lOminütiger Inkubation beim pH-Wert 8 und bei verschiedenen Temperaturen sind in Fig.5 zusammengestellt Das Temperaturoptimum beträgt etwa 37° C

VL Inaktivierung durch pH- und

Temperatureinfluß und dgL
Inaktivierung durch pH-Einflüsse ^6d

Wie vorstehend unter ITL (pH-Optimum und stabiler pH-Bereich) erläutert, wird das Enzym unterhalb eines Die Michaelis-Konstante (vgl. H. Lineweaver und D. Burk, J. Amer. Chem. Soc, Bd. 56 (1934), S. 658) (K_m-Wert) ^für das Substrat Glycerin beträgt bei der Glycerinoxidase Il 8,0xl0"³m. Die K_n,-Werte für Glycerinoxidase I: aus Aspergillus japonicus 1,85 χ 10"² m und aus Neurospora crassa 1,9Ox 10~² m. Somit ist der K_m-Werl von Glycerinoxidase II aus Penicillium sp. NRRL 11 339 etwa halb so groß wie bei Glycerinoxidase 1 aus den Mikroorganismen der Gattungen Aspergillus und Neurospora.

Somit weist die Glycerinoxidase II eine hohe Affinität gegen Glycerin auf. Dieses Enzym ist aufgrund seiner Wärmebeständigkeit und seines niedrigen K_m-Werts besonders zur quantitativen Glycerinbestimmung geeignet.

Entsprechende Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Glycerin sind nachstehend angegeben.

(a) Verfahren unter Umsetzung von Glycerinoxidase II mit Glycerin in Gegenwart von Sauerstoff, wobei das gebildete Wasserstoffperoxid quantitativ bestimmt wird.

(b) Verfahren, bei dem der gemäß (a) gebildete Glycerinaldehyd mit 2,4-Dinitrophenylhydrazin unter Bildung von 2,4-Dinitrophenylhydrazon umgesetzt wird. Eine quantitative colorimetrische Bestimmung des 2,4-Dinitrophenylhydrazons ermöglicht eine quantitative Bestimmung des Glycerins.

(c) Verfahren, bei dem Glycerinoxidase II mit Glycerin in Gegenwart von Sauerstoff umgesetzt wird und die Menge der Sauerstoffaufnahme im System gemessen wird.

Die Prinzipien und die Verfahren gemäß (a), (b) und (c) sind vorstehend unter Abschnitt I erläutert Nachstehend wird ein Beispiel für das Verfahren (a) für die quantitative Bestimmung von Glycerin unter Messung der Menge an gebildetem Wasserstoffperoxid erläutert

Die optische Dichte der Reaktionslösungen bei 500 nm wird gemäß den Ausführungen unter Abschnitt rV-(c) bestimmt, wobei Lösungen mit einem Gehalt an 0,1 mg Enzym mit einer spezifischen Aktivität von 2,4/ml verwendet werden. Die Konzentration der Substratlösung (Giycerinlösung) beträgt 0,i, 0,2, 0,5,1,0, 5,0 und 10,0 millimolar (vgl. Abschnitt IV-(c)). Die Ergebnisse sind in Tabelle IV zusammengestellt

Tabelle IV

Substratkonzentration
(millimolarj

O.D-Wert bei 500 nm

0,1 0,2 0,5 1,0 5,0 10,0

0,058 0,116 0,301 0,598 2,995 5,990

Es laßt sich eine lineare Beziehung zwischen der Substratkonzentration (Glycerinkonzentration) und der optischen Dichte der Reaktionslösung bei 500 nm feststellen. Auf dieser Basis läßt sich die Glycerinkonzentration einer unbekannten Lösung quantitativ bestimmen.

Somit kann die Glycerinkonzentration einer Lösung unter Verwendung von Glycerinoxidase II gemessen werden. Damit wird erfindungsgemäß ein neues Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Glycerin zur Verfügung gestellt

Insbesondere auf dem Gebiet der Biochemie besteht ein Bedarf nach Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Glycerin. Es sind verschiedene Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Triglyceriden bekannt, wobei die Triglyceride im Serum unter Bildung von Glycerin und Fettsäuren hydrolysiert werden und das Glycerin bestimmt wird.

Es sind verschiedene chemische Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Glycerin bekannt, z. B. das Chromotropsäure-Verfahren, das Acetylaceton-Verfahren, das Triazol-Verfahren, das Randrup-Verfahren und das Mendelsohn-Fluoreszenz-Verfahren. Jedoch haben alle diese Verfahren den Nachteil, daß sie nicht spezifisch für Glycerin sind. Zur enzymatischen Glycerinbestimmung kann beispielsweise Glycerokinase (E. C. 2.7.1.30) verwendet werden. Jedoch muß diese Reaktion zusammen mit Pyruvat-kinase (E. C. 2.7.1.40) und Lactat-dehydrogenase (E. C. 1.1.1.27) durchgeführt werden. Somit ist die Messung sehr zeitaufwendig und zu einer Bestimmung einer großen Anzahl von Proben ungeeignet

Es wurde festgestellt, daß das erfindungsgemäße Enzym Glycerinoxidase H Glycerin direkt unter stöchiometrischer Bildung von Wasserstoffperoxid oxidiert Das erhaltene Wasserstoffperoxid läßt sich leicht in ein gefärbtes System überführen. Somit steht ein quantitatives Verfahren zur Bestimmung von Glycerin und infolgedessen auch von Triglyceriden zur Verfügung, das sehr einfach und spezifisch aufgrund der genannten colorimetrischen Bestimmung durchgeführt werden kann.

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

300 ml eines Anzuchtmediums mit einem Gehalt an 30 g Glycerin/Liter, 6 g Maisquellwasser/Liter und 2 g Hefeextrakt/Liter (pH-Wert 6,5 vor der Sterilisation) werden in einen 2 Liter fassenden Erlenmeyer-Kolben mit Penicillium sp. KY 868 (NRRL 11 339) beimpft. Die Züchtung wird unter Schütteln 48 Stunden bei 25° C durchgeführt.

900 ml (Inhalt von 3 Kolben) der erhaltenen Anzuchtkultur werden auf 15 Liter Kulturmedium der gleichen Zusammensetzung wie das Anzuchtmedium, das sich in einem 30-Liter-Fermenter befindet, übertragen. Die Züchtung wird unter Belüftung (15 Liter/min) und Rühren (250 U/min) 40 Stunden bei 25° C durchgeführt. Anschließend wird die Gärflüssigkeit abgenutscht Der Filterkuchen wird mit Wasser gewaschen. Man erhält 73 g (Trockengewicht) Mikroorganismenzellen.

Diese Mikroorganismenzellen werden in 5 Liter 10 millimolarem TES-Puffer vom pH-Wert 7,8 suspendiert und anschließend mit einer Mühle aufgebrochen. Nach dem Aufbrechen der Zellen wird die Suspension unter Verwendung einer Kühlzentrifuge (20 Minuten bei 20 000 g) zentrifugiert Man erhält 4,5 Liter Überstand mit einem Proteingehalt von 23 g und einer spezifischen Aktivität von 0,01 Einheit/mg. Der Oberstand wird mit Ammoniumsulfat versetzt Die bei 30- bis 70prozentiger Sättigung mit Ammoniumsulfat ausgefällte Fraktion wird gewonnen und in 50 ml 10 millimolarem TES-Puffer vom pH-Wert 7,8 gelöst Die Lösung wird gegen 10 Liter 10 millimolaren TES-Puffer unter Verwendung eines Schlauches aus regenerierter Cellulose dialysiert Die Dialyse wird 48 Stunden mit einer Gesamtmenge von 40 Liter Dialyseflüssigkeit durchgeführt, wobei das Dialysebad in Abständen von 12 Stunden erneuert wird. Die dialysierte Enzymlösung wird über eine mit DEAE-Cellulose gepackte Säule der Abmessungen 5,5x40 cm, die vorher mit 10 millimolarem TES-Puffer vom pH-Wert 7,8 äquilibriert worden ist gegeben. Dabei wird das Enzym adsorbiert. Nichtadsorbierte Proteinverunreinigungen werden mit dem gleichen Puffer ausgewaschen. Anschließend wird die Glycerinoxidase eluiert wozu 2 Liter 0,01 m TES-Puffer vom pH-Wert 7,8 mit einem Gehalt an 0,1 m NaCl verwendet werden. 500 ml aktive Fraktionen mit einem Proteingehalt von 0,6 g und einer spezifischen Aktivität von 0,21 werden gesammelt Diese Lösung wird bis zu einer Sättigung von 70 Prozent mit Ammoniumsulfat versetzt wodurch das Enzym ausgefällt wird. ·

Anschließend werden die Niederschläge durch 20minütige Zentrifugation bei 20 000 g gewonnen und hierauf in 23 ml 10 millimolarem TES-Puffer vom pH-Wert 7,8 gelöst. Die Lösung wird über eine mit dreidimensional vernetzten! Dextran (Sephadex G-100) gepackte Säule der Abmessungen 5,5 χ 80 cm, die vorher mit 10 millimolarem TES-Puffer vom pH-Wert 7,8 äquilibriert worden ist, gegeben. Zur Elution werden 1 Liter 10 millimolarer TES-Puffer vom pH-Wert 7,8 über die Säule gegeben. Das Eluat wird in Fraktionen aufgefangen. Man erhält 300 ml einer Fraktion mit einer hohen spezifischen Aktivität (Proteingehalt 140 mg, spezifische Aktivität 0,61). Diese Lösung wird bis zu einer Sättigung von 70 Prozent mit Ammoniumsulfat versetzt. Das dadurch ausgefällte Enzym wird abzentrifugiert (20 Minuten bei 20 000 g) und sodann in 10 ml 10 millimolarem TES-Puffer vom pH-Wert 7,8 gelöst. Die erhaltene Lösung wird 24 Stunden gegen 5 Liter 10 millimolaren TES-Puffer vom pH-Wert 7,8 dialysiert, wobei als Dialysemembran ein Schlauch aus regenerierter Cellulose verwendet wird und das Dialysebad 2mal erneuert wird. Nach der Dialyse wird die erhaltene Enzymlösung über eine mit Hydroxylapatit gepackte Säule der Abmessungen 5,5 χ 20 cm, die vorher mit 10 millimolarem TES-Puffer vom pH-Wert 7,8 äquilibriert worden ist, gegeben. Weitere 250 ml des gleichen Puffers werden über die Säule gegeben. Das Eluat wird in Fraktionen aufgefangen. Die Fraktionen mit einer hohen spezifischen Aktivität werden vereinigt und gefriergetrocknet. Man erhält 4,9 mg gereinigtes, pulverförmiges Enzympräparat von Glycerinoxidase II

mit einer spezifischen Aktivität von 6,3. Die spezifische Aktivität des gereinigten Enzyms beträgt etwa das 630fache des Zellextrakts. Die Ausbeute in bezug auf die Aktivität beträgt 11,4 Prozent

(6) Wasser

(7) Enzym:
Proteingehalt 1,0 mg/ml,
spezifische Aktivität 2,4

0,3 ml

0,1ml

Beispiel?. Verwendete Reagentien

(1) Testlösung:

wäßrige Glycerinlösung

unbekannter Konzentration 0,5 ml

(2) Puffer:

0,1 mTES-Puffervom pH-Wert 8 1,0ml

(3) 4-Aminoantipyrin: wäßrige

2,4 millimolare Lösung 0,5 ml

(4) Phenol:

wäßrige 42 millimolare Lösung 0,5 ml

(5) Peroxidase:

wäßrige Lösung von Peroxidase mit einem Proteingehalt von 20 mg/ml und einer spezifischen Aktivität

von 1000 0,1 ml

(b) Verfahren

Die vorstehend genannten Reagentien (1) bis (6) werden in ein Reagenzglas gegeben und 5 Minuten bei 37° C mit ausreichender Intensität geschüttelt. Anschließend wird die Enzymlösung zugesetzt Das erhaltene Reaktionsgemisch wird mit TES-Puffer auf 3 ml aufgefüllt. Die Umsetzung wird 10 Minuten unter Schütteln bei 37° C durchgeführt. Das entsprechende Verfahren wird zu Vergleichszwecken wiederholt, wobei anstelle der Testlösung Wasser verwendet wird. Die OD-Wert bei 500 nm der Testlösung wird gemessen. Die Differenz AOD zur Vergleichslösung beträgt 0,322. Aus der Kurve von F i g. 7 läßt sich ein Glyceringehalt der Testlösung von 0,532 miliimqiar ermitteln.

Hierzu 4 Blatt Zeichnungen

230 215/547

Claims

Patentansprüche:

1. Glycerin oxidierendes Enzym mit der Eigenschaft:

(1) Wirkung: Oxidation von Glycerin in Gegenwart von Sauerstoff unter Bildung von Wasserstoffperoxid und Glycerinaldehyd;