DE2828073A1

DE2828073A1 - Verfahren zum kultivieren von viren

Info

Publication number: DE2828073A1
Application number: DE19782828073
Authority: DE
Inventors: Marc Bugand; Philippe Comte; Pierre Precausta; Georges Zwingelstein
Original assignee: Institut Merieux SA
Current assignee: Institut Merieux SA
Priority date: 1977-06-30
Filing date: 1978-06-27
Publication date: 1979-01-11
Also published as: IT7825037A0; FR2396083A1; IE47060B1; NL7806899A; US4169761A; IT1097352B; LU79891A1; GB1604003A; DK289378A; DK147889B; AR216331A1; FR2396083B1; BE868573A; DK147889C; DE2828073C2; IE781315L

Description

Patentanwälte Dipl. Ing. Hans-Jürgen Müller Dr. rer. i:at Thomas Borendt

Dr.-Ing. Hans Leyh

Lucile-Grahn-SfraBs 38 D 8 München 80

INSTITUT MERIEUX
17, rue Bourgelat
LYON, Frankreich

-938/48-Dr.Be/fi

Verfahren zum Kultivieren von Viren

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-Z- Institut Merieux

H - 938/48 -

Beschreibung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Kultivieren von Viren, das insbesondere aber nicht ausschließlich zur großtechnischen Kultur insbesondere von Tollwutviren brauchbar ist, mit dem Ziel, Virussuspensionen zu erhalten, die zur Fabrikation von Vaccinen brauchbar sind.

In der Praxis wird die Kultur von Tollwutviren ganz allgemein durch Kultivieren des Virus auf Monozellularschichten in KuItürflaschen durchgeführt. Diese bekannte Technik hat den Nachteil, daß man für eine einigermaßen kommerzielle Produktionsmenge eine große Menge Flaschen benötigt, was zahlreiche Manipulationen bedingt und zu hohen Herstellungskosten führt.

Andererseits werden andere Viren, die nicht Tollwutviren sind, auf Zellen in monozellulären Schichten mit den gleichen Unbequemlichkeiten gezüchtet.

Es wurde bereits vorgeschlagen, diese Schwierigkeiten dadurch zu vermeiden, daß man Tollwutviren auf Zellen kultiviert, die in einen Gärbottich (Fermenteur) eingebracht sind, d.h. in einen großen Behälter, der in einem geeigneten flüssigen Nährmedium eine Suspension besagter Zellen enthält. Indessen hat sich als richtig herausgestellt, daß sich diese Zellen unter den Bedingungen dieser Art schlecht kultivieren lassen und daß es nicht möglich ist, eine großtechnische Virusproduktion nach diesem Verfahren zu erzielen.

Die Erfindung schlägt vor, diese Nachteile zu beseitigen und ein Verfahren zum Kultivieren von Viren zur Verfügung zu stellen, das eine großtechnische Kultur in Gärbottichen erlaubt, insbe-

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sondere in dem Fall, in dem Zellen verwendet werden, die sich normalerweise nicht zweckentsprechend in einem Gärbottich verhalten. Zweck der Erfindung ist es gleichermaßen, eine vernünftige Herstellungskostensenkung durch Verbesserung der Bedingungen der großtechnischen Kultur zu erzielen, wodurch die genannten Ziele erreicht werden können.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zum Kultivieren von Viren in einem Gärbottich (Fermenteur), das dadurch gekennzeichnet ist, daß man die Kultur des Virus in einem Gärbottich durchführt, der in einem üblichen geeigneten Nährmedium eine Suspension der Zellen sowie von Kollagenfasern enthält.

unter Kollagenfasern im Sinne der vorliegenden Erfindung werden Fasern des Kollagens verstanden, die einen hohen Reinheitsgrad aufweisen und sich in einer Form darstellen, die es gestattet, die Fasern gut zu verteilen und eine Suspension zu erhalten. Ein Herstellungsverfahren dieser Fasern aus Stützgewebe von Tieren, insbesondere der Haut, ist z.B. in der FR-PS 1 568 829 beschrieben.

Gemäß einer allgemeinen Verfahrensweise wird bevorzugt, die Kollagenfasern aus Häuten von jungen Rindern zu extrahieren, zu reinigen und zu dehydratisieren, wobei diese Fasern natürlich sterilisiert werden, z.B. durch trockene Wärme.

Die in den Gärbottich eingebrachte Fasermenge liegt zwischen 1 und 20 g/l, vorzugsweise zwischen 2 bis 8 g/l.

Die Kultur wird vorzugsweise unter Rühren bei einer Temperatur bewirkt, die bis zu 4O°C steigen kann. Am Ende der Kultivierung wird das Rühren eingestellt, damit die Fasern sich vom Inhalt trennen und am Boden des Gärbottichs ablagern.

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Vorzugsweise, Insbesondere bei der Herstellung von Tollwutviren, wird eine erste Kultur durchgeführt, z.B. während einer Zeitdauer von 2 bis 6 Tagen, die überstehende Flüssigkeit eliminiert und unter Verwendung eines neuen Nährmediums eine zweite Kultur durchgeführt, nach deren Beendigung die überstehende Flüssigkeit gesammelt wird.

Die isolierte überstehende Flüssigkeit wird anschließend filtriert, gegebenenfalls nacheinarLyse der Zellen, und üblichen Behandlungen unterzogen, die mit der Verarbeitung der Zellen zusammenhängen, z.B. der Verarbeitung zu einer Vaccine.

Die für die Viruskultur benötigten Zellen sind vorzugsweise solche Zellen, die üblicherweise auf monozellulären Schichten in Flaschen verwendet v/erden. Vorzugsweise können diese Zellen unter Bildung einer Suspension aus solchen Nährböden hergestellt sein, die durch Einwirkung eines proteolytischen Enzyms gebildet sind, wie durch Trypsin oder durch Pronase oder durch Zellkulturen, die in einem Gärbottich vermehrt worden sind, mit oder ohne Kollagenfaserverwendung.

Für das erfindungsgemäße Verfahren sind besonders geeignete und zweckmäßige Zellen solche, die unter der Bezeichnung

von
NIL2, einer bestimmten Abstammungslinie von Hamstern aus deren Embryonen stammen,oder Zellen IFFA3, PK15, WI38 und MRC5.

Vorzugsweise wird die Konzentration der Zellen im Gärbottich so eingestellt, daß sie zwischen 50 000 und 500 000 Zellen je cm beträgt.

Zu den Virusstämmen, die vorteilhaft nach dem erfindungsgemäßen Verfahren kultiviert werden können, gehören die Tollwut-

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viren, insbesondere die Tollwutviren von fixierten Stämmen der Typen Pasteur CVS, Pitman Moore, oder Modifikationen der Typen Flury HEP, Flury LEP, SAD.

Andere Viren können auch erfindungsgemäß kultiviert werden, gegebenenfalls nachdem sie Adaptionspassagen auf Zelltypen unterworfen wurden, die für stationäre Zellbetten in Aussicht genommen worden sind oder auf Kollagenfasern, die in Suspension gehalten wurden.

Das flüssige Nährmedium besteht aus üblichen, für die Viruskultur verwendeten Medien, die nicht näher erläutert zu werden brauchen. Es handelt sich im allgemeinen um eine Kochsalzlösung, die Aminosäuren, Vitamine, Glucoside, Peptone und gegebenenfalls Serum, z.B. von Kälbern oder jungen Pferden stammend, enthält, wie z.B. das Milieu Eagle oder Stoker-MacPherson.

Die Kultur wird in an sich bekannter klassischer Weise durchgeführt, wobei vorzugsweise ein pH-Wert zwischen 6 und 8 verwendet wird, belüftet und gegebenenfalls eine ausreichende Menge Kohlensäuregas zugegeben wird.

Andere Vorteile und Eigenschaften der Erfindung ergeben sich aus der folgenden Beschreibung, die die Erfindung anhand einiger Beispiele erläutert, diese aber nicht beschränken soll.

Beispiel 1

Mittels eines Betts von Zellen NIL2 in einer Glasflasche wird eine Zellsuspension hergestellt durch schonende Einwirkung von Trypsin. Die Zellen in der Suspension werden gewonnen und es wird eine Suspension vorbereitet und in einer

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Menge in einen Gärbottich eingefüllt, die einer Endkonzentration von 150 000 bis 300 000 Zellen je cm³ entspricht.

In einem anderen Ansatz wird eine Menge Kollagenfasern sterilisiert, die ausreicht, um eine Menge von 2 bis 8 g Fasern je Liter Suspension, die angewendet werden soll, zu erhalten. Diese Menge wird mit einem aliquoten Teil Nährmedium in Suspension gebracht. In den Gärbottich werden steril und in nicht festgelegter Reihenfolge das Nährmedium, die Zellsuspension, die Suspension der Kollagenfasern und eine Virussuspension zum Beimpfen in notwendiger und ausreichender Menge eingebracht, um das gewünschte Volumen in dem unteren Teil des Gärbottichs zu erhalten.

Anschließend wird gerührt und die Oberfläche mit filtrierter Luft durch eine sterilisierte Membran belüftet und bei einer Temperatur von z.B. 37°C inkubiert.

Die Vermehrung der Zellen wird durch Zählen von aliquoten Teilen kontrolliert.

Nach 2 bis 6 Tagen wird das Rühren eingestellt und die Kollagenfasern setzen sich unten im Gärbottich ab. Die überstehende Flüssigkeit wird hiervon abgetrennt.

Anschließend wird neues Nährmedium steril in den Gärbottich eingeführt und das Rühren sowie die Belüftung wird erneut vorgenommen. Sowie eine ausreichende Viruskonzentration in der Flüssigkeit erhalten wird, wird erneut das Rühren und die Belüftung eingestellt und es wird eine neue Ernte der überstehenden Flüssigkeit unter den genannten Bedingungen durchgeführt.

Die Suspension wird filtriert oder zentrifugiert, um die ZeIl-

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reste und eventuelle Faserreste zu eliminieren, die anwesend sein können. Die Virussuspension, die in dieser Weise erhalten wurde, wird anschließend inaktiviert, z.B. durch Einwirkung von fb -Propiolacton und nach einer ausreichenden Ablagerung, wonach das Präparat anschließend gefriergetrocknet oder in eine reine flüssige Form durch Konditionieren gebracht werden kann oder mit einem Adjuvant oder anderen Vaccinen gemischt werden kann.

Es wird eine geeignete Tollwutvaccine erhalten.

Beispiel 2

Es wird eine Suspension von Zellen IFFA3 durch Einwirkung
von Trypsin auf die Suspension hergestellt, und zu der Suspension steriles Kollagen sowie Virus vom Typ Pasteur zugesetzt.

Das Nährmedium ist ebenfalls Stocker-Medium.

Es wird unter Rühren mit 20 bis 100 Umdrehungen je Minute
und unter Belüftung der Oberfläche, wie vorher, eine Kultur durchgeführt. Nachdem die erforderliche Zellkonzentration
erhalten worden ist, wird das Rühren und die Belüftung eingestellt und die überstehende Flüssigkeit abgelassen, nachdem die Fasern sich am Boden des Gärbottichs abgesetzt haben.

Es wird von Serum befreites, neues Nährmedium erneut steril in den Gärbottich eingegeben und das Rühren wird wiederholt, sowie auch die Belüftung.

Nach Erreichen einer zufriedenstellenden Virus-Antigenkonzentraion wird das Rühren und das Belüften erneut eingestellt und die

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Virussuspension wird isoliert.

Diese Suspension wird durch eine sterile Membran filtriert und z.B. durch Einwirkung von {i-Propiolacton inaktiviert. Nach Kontrolle des Präparats kann dieses in bestimmten Mengenverhältnissen mit einem sterilen Aluminiumgel in Suspension gemischt und in Flaschen für Einzeldosxerungen oder Mehrfachdosierungen abgefüllt werden.

Beispiel 3

Es wird eine Zellsuspension von Embryonen der Abstammung WI38 durch Einwirkung von Trypsin hergestellt. In einem anderen Ansatz wird eine bestimmte Menge Kollagenfasern sterilisiert. Es werden Impfungsviren des modifizierten Stamms HEP in einem ausreichenden Volumen hergestellt.

Jeder Bestandteil wird sterilisiert in den Gärbottich eingefüllt und hierzu wird das Nährmedium nach Stocker zugegeben, bis das gewünschte Volumen erhalten wird. Die Faserkonzentration beträgt 2 bis 8 g/l und die Konzentration der Zellen liegt in der Größenordnung von 100 000 bis 200 000 Zellen je cm .

Das Rühren wird mit 20 bis 100 Umdrehungen je Minute durchgeführt und es wird eine Belüftung der Oberfläche mittels Luft durchgeführt, die durch eine sterile Membran filtriert wird.

Nach ausreichender Vermehrung der Zellen wird das Rühren und die Belüftung eingestellt, wobei sich die Kollagenfasern am Boden des Gefäßes absetzen, und die überstehende Flüssigkeit wird isoliert. Es wird neues Nährmedium zugesetzt, mit Ausnahme des Serums, in steriler Form in den Gärbottich und es wird erneut gerührt und belüftet. Nachdem die Vermehrung des

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Virus-Antigens einen zufriedenstellenden Grad erreicht hat, wird das Rühren und die Belüftung eingestellt und die Virussuspension wird durch Dekantieren von den Fasern geerntet.

Diese Suspension wird durch eine sterile Membran filtriert und auf Flaschen von z.B. 10 1 Inhalt verteilt. Nach der Kontrolle wird das Präparat gegebenenfalls mit einem Substrat auf Basis von Lactose gemischt und auf Flaschen verteilt, die Einzeldosen enthalten, und anschließend gefriergetrocknet.

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Claims

:28073 Institut Merieux - 933/4S - Patentansprüche

1. Verfahren zum Kultivieren von Viren, dadurch gekennzeichnet , daß man die Viruskultur in einem Gärbottich (Fermenteur) durchführt, der in einem an sich üblichen geeigneten Währmedium eine Zellsuspension sowie Kollagenfasern enthält.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß man eine Menge von Kollagenfasern im Gärbottich verwendet, die zwischen 1 und 20 g/l beträgt.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet , daß man eine Menge Kollagenfasern verwendet, die 2 bis 8 g/l beträgt.

4. Verfahren nach jedem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet , daß man die Kultur unter Rühren durchführt, daß man gegen das Ende der Kultur das Rühren einstellt,·«! d=n Fasern abdekantiert und die überstehende Flüssigkeit sammelt und aufarbeitet.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man nach der ersten Kultur die überstehende Flüssigkeit eliminiert, ein frisches Nährmedium einbringt, eine neue Kultur durchführt und schließlich die überstehende Flüssigkeit gewinnt.

6. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet , daß man Zellen verwendet, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus den Zellen NIL2, IFFA3, WI38, PK15 und PRC5.

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7. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet , daß man eine Zellkonzentration anwendet, die zwischen 50 000 und 500 000 Zellen je cm beträgt.

8. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet , daß man einen Stamm des Tollwutvirus kultiviert.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Tollwutvirusstamm verwendet, der ausgewählt ist aus Stämmen von adaptierten fixierten Viren der Typen PASTEUR, CVS, Pitman Moore oder ein modifizierter Stamm Typ Flury HEP, Flury LEP, SAD.

10. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet , daß man vor der Beimpfung des Gärbottichs mehrere Adaptionspassagen des Virus auf dem Zelltypus durchführt, der als Kulturzelle unter Verwendung der Kollagenfasern in Suspension vorgesehen ist.

11. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet , daß man vor dem Beimpfen im Gärbottich mehrere Adaptionspassagen des Virus auf dem Zelltypus durchführt, der für ein stationäres Kulturbett in Aussicht genommen ist.

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