JPS5832876B2 - 組織培養基材 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は特定のコラーゲンを材料とする組織培養用基材
、特に単層培養用基材に係る。

生体外で分離された細胞組織又は微生物を人工的な条件
下にこれを培養する組織培養の１つとして単層培養法が
ある。

単層培養法は細胞の培養容器壁筒への付着性を利用する
方法であって、シート又は繊維を形成する細胞、例えば
繊維芽細胞、上皮細胞の如く変形（変質）しない限り、
それが成長するための固体の支持体を必要とする細胞の
培養に適している。

単層培養法によれば平面的に細胞集団が形成されるので
、いつでも細胞の状態を顕微鏡下に観察することができ
る。

従って、単層培養法は細胞の形態に依存した研究、例え
ば、ウィルス感染による細胞の変化、放射線や制癌剤に
よる細胞の変化又は分化の誘導などの研究に有効な手段
である。

ところで、単層培養における固体の支持体、例えば、培
養用容器やフィルム等の材料としては、（１）細胞に対
して無刺激性であること、（２）培養液によって膨潤、
溶解又は腐蝕されないこと、（３）消毒、滅菌操作が容
易であり且つ該操作によってほとんど又は全く変形、変
質しないことが必要である。

これらの観点から従来、金属、ガラス、陶器又は合成高
分子材料等が用いられてきた。

しかしながら、従来のそれら組織培養基材は特に初代培
養において組繊細胞との接着力（Ｃｅｌｌｃｏｎｔａｃ
ｔ ）が良好でなく、単層培養の基材としては不満足な
ものであった。

上記材料に代わる基材として生物由来のコラーゲンが提
案されている。

（文献： Ｒ，Ｌ、Ｅｈｒｍａｎｎｅｔ ａｌ、：Ｊ、
Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎ５ｔ、Ｖｏｌ１
６．Ｎｏ、６Ｐａｇｅ １３７５（１９５６年）） 培養基材としてのコラーゲンは細胞の培養状態を観察す
るために透明であることが好ましく、ラットの尾の鍵か
ら酸性溶媒で抽出した酸可溶性コラーゲンが用いられて
きた。

しかしながら、天然の可溶性コラーゲンは量的に僅少な
上、製造手順も繁雑故え、安価に且つ容易には入手でき
ず、小規模な実験研究用の基材と云える。

この為、血液凝固剤などに用いられている酵素処理可溶
化コラーゲンの転用が考えられる。

しかしながら、該酵素処理可溶化コラーゲンは該コラー
ゲン中に混入した蛋白分解酵素を完全に除去することが
困難であり、この為、組織培養用基材として不適当であ
る。

又、該酵素可溶化法は処理費又は実施費用が高い。

即ち、従来から単層培養用基材としてコラーゲンの利用
が提案されているが、それらの基材は量的、質的又はコ
スト的な制約により汎用の基材とはなり得ないものであ
る。

本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究の結果、
牛皮等のコラーゲン原料を精製してなる不溶性コラーゲ
ンを超音波で可溶化した特定のコラーゲンが単層培養用
基材として前記天然可溶性コラーゲン基材と性能的に遜
色ないことを見い出し、本発明の完成に到達した。

本発明はアミノ酸組成として下記主構成成分が１０００
残基あたり グリシン：３１２〜３４０残基 プロリン：１１９〜１３８残基 ハイドロキシプロリン：９４〜１００残基チロシン：２
．６〜５．５残基 であり且つ 変性温度：３１〜４０℃ 沈降速度定数（Ｓ） ： １．６２〜１．１２極限粘
度：１０．４〜１．８ｄｌ／グ を有するコラーゲン組織培養基材に係る。

上記本発明のコラーゲン培養基材は波長２５０〜２９０
ｎｍにおける紫外吸収を示さず且つ脂質分が０．５重
量％以下である精製コラーゲンをｐＨ２〜４の酸水溶液
に分散後、分散液に超音波を照射することにより製造し
得る。

該超音波処理法は豊富に入手し得るコラーゲン原料を第
三物質で汚染されることなくほとんど全て可溶化できる
という特徴を有する。

従って、従来量的に制約されていた天然の可溶性コラー
ゲンに代わる新しいコラーゲン培養用基材を容易且つ豊
富に供給し得るものである。

又、本発明のコラーゲン培養基材が、天然のコラーゲン
原料の個体差、例えば種、雌雄、年齢差に基ずく特性の
バラツキに対して上記超音波処理で再編成・均質化され
ていることは前記特性中、沈降速度定数又は極限粘度値
から明らかである。

因みに、前記天然の可溶性コラーゲンの粘度は１、２．
５ ｄｌ／ を程度を示し、本発明のコラーゲンのそれ
と比べかなり高い。

以下、本発明を詳述する。

本発明において使用されるコラーゲン原料としては、変
性を受けていない牛、脈線等の動物の結合組織、例えは
、皮、鍵、腸、骨などを挙げることができる。

動物の生皮、冷・温蔵皮もしくは乾燥炭はコラーゲン含
量が高いので好ましい。

本発明に係る精製コラーゲンとは、波長２．５０〜２．
９０ ｎｍにおける紫外吸収を示さず且つ脂質含量０５
重量％以下であるコラーゲンを云う。

該精製コラーゲンは前記コラーゲン原料を脱毛、脱石灰
の通常の前処理を施した粗コラーゲンからアルブミン、
グロブリン等のコラーゲン以外の蛋白質及び脂質等の不
純物を除去することによって得られる。

前記精製コラーゲンは粗コラーゲンから公知の抽出法に
よって製造し得る。

即ち、コラーゲン以外の蛋白質の除去は、食塩水に粗コ
ラーゲンを繰り返し浸漬することにより達成される。

脂質分は例えばアセトン−エタノール又はアセトンエタ
ノール−水系等の混合溶媒で抽出除去し得る。

中性塩可溶コラーゲン成分は、Ｎａ２ＨＰＯ４ＫＨ２Ｐ
Ｏ４のリン酸バッファ溶液等で、又酸可溶コラーゲンは
クエン酸−第一クエン酸カリウム（ＫＨ２Ｃ６Ｈ５０７
）のクエン酸バッファ溶液又はクエン酸−Ｎａ２ＨＰＯ
４のリン酸バッファ溶液等で除去すれば良い。

上記可溶コラーゲンの除去効果は、銅−フォリン法によ
って抽出液中の蛋白質が検出されなくなるまで行う。

なお、リン酸バッファ液のｐＨ又は溶液の濃度、配合割
合等は除去すべき成分により適宜変えることができる。

上記抽出の条件は特に限定されないが、通常５℃以下の
温度下で１〜数日間行う。

本発明に係る酸分散水溶液のｐＨは２〜４の範囲である
。

酸分散液のｐＨが２以下であると、一旦膨潤したコラー
ゲン繊維の析出現象が生じるので好ましくない。

また、ｐＨ４〜１０の条件下では、コラーゲン繊維の膨
潤が不充分なため均一な分散状態になく、静置すれば容
器の器底に沈降する状態となり好ましくない。

ｐＨ１０以上の条件下では、コラーゲン繊維の変質が生
じ不都合である。

分散液中のコラーゲン含有量は０．２〜１０重量％好ま
しくは０．２〜５重量％である。

１０重量％以上では分散液の粘度が高くて取り扱いが困
難である。

又、０．２重量以下では操作上、品質上で特に問題を生
じないが、目的物の分離・回収に労費がかかり好ましく
ない。

分散液に使用する酸は塩酸、燐酸、硫酸などの無機酸、
又は酢酸、酪酸、クエン酸、乳酸、コハク酸、酒石酸な
どの有機酸の１種もしくはそれらの混合物を例示し得る
。

本発明に係る超音波照射熱量は通常１０８Ｋｄ／ｌ〜２
．５ Ｘ １０３に７／ ｔである。

用いる超音波の周波数は一般に超音波と呼ばれる帯域に
あれば特に限定されないが好ましくは１７．５〜２４．
５ＫＨｚである。

前記超音波照射熱量は後述のＳ定数によって決める。

即ち、前記分散液中の精製コラーゲン原料は超音波照射
の進行とともに細片化又は可溶化し、最終的には分子状
にまで達する。

この間の状態の変化は、分析用超遠心機による沈降速度
の測定によって表わすことができる。

沈降速度測定におけるＳ定数は構成するコラーゲン基本
単位の状態に係る値であって、種々の物性に相関する重
要な因子である。

本発明に係るコラーゲン繊維のＳ定数は、１．６２〜１
．１２の範囲にある。

なお、本発明で云うＳ定数はＭＯＭ３１７０／ｂ型機（
ハンガリーＭＯＭ社製）を用い、２０℃の温度でコラー
ゲン繊維２η／ｌでの測定値である。

超音波処理時の温度はコラーゲンの熱変性が生じない温
度、即ち３０℃以下、好ましくは２０℃以下である。

上記条件下で超音波の照射を行なうと、最初極めて粘稠
で不透明であった分散液は、照射によるコラーゲンの可
溶化の進行とともに粘度低下がみられ透明となってくる
。

上記の如くして得られた超音波処理液は、中和、透析、
凍結乾燥等の公知の手段によって容易に本発明のコラー
ゲン組織培養用基材を製造し得る。

本発明のコラーゲン組成培養基材の物性は以下の通りで
ある。

即ち、（１）アミノ酸組織として下記主構成成分が１０
００残基あたり グリシン：３１２〜３４０残基 プロリン：１１９〜１３８残基 ハイドロキシプロリンゴ９４〜１００残基チロシン：２
．６〜５．５残基 であり且つ 変性温度：３１〜４０℃ 沈降速度定数（Ｓ）：１．６２〜１，１２極限粘度：１
０．４〜１．８ｄｌ／ｆ？ を有する。

なお、上記特性の中でアミノ酸組成は、アミノ酸分析装
置（ＪＬＣ−６ＡＨ日本電子製）で、方変性温度は、走
査型示差熱量計（ＤＳＣ−ＩＢＰｅｒｋｉｎ Ｅ１ｍｅ
ｒ社製）より求めた。

極限粘度は、２４．８℃の温度における濃度０．２６
Ｌ？／ １００ ｃｃの値である。

極限粘度測定における溶媒は０．１５Ｍクエン酸バッフ
ァー（ｐＨ３，７）を用いる。

本発明の組織培養基材は上記コラーゲンのフィルム状、
ゲル状又はそれらの凍結乾燥体の形態で用いられる。

該基材は組織培養用に使用されるシャーレ、ビン類、フ
ラスコ、試験管、プレート類、ビー力等に支障なく適用
でき得る。

上記容器類の材質はガラス、プラスチック等いずれでも
良く、特に限定されない。

上記形態を有する組織培養ベッドの製造の具体例を下記
に示す。

１・ Ｆｉ１ｍ状ベッド ３７１１（ｉ／ｌのコラーゲン溶液を培養シャーレに滴
下して表面を覆う。

風乾後アンモニア雰囲気に置いた後、滅菌水で充分に洗
浄し、乾燥する。

２、 Ｇｅｌ状ベッド （１）３■／ｌのコラーゲン溶液を培養シャーレに入へ
そのままの状態でアンモニア雰囲気に一晩放置する。

過剰なアンモニアを放散させた後、滅菌水で充分に洗浄
り、冷蔵する。

（１１）３■／ｌのコラーゲン溶液１ｏ容量部に１容量
部の０．１ＭＮａ ２ＨＰＯ４を含む２．０ Ｍ Ｎａ
Ｃｌ水溶液を加え、０．１ＭＮａＯＨでｐＨ７，４〜７
．６に調整し冷蔵する。

３、凍結乾燥状ベッド 上記ｇｅｌを凍結乾燥し、必要に応じて滅菌水又はメデ
ィウムを加え冷蔵下でｇｅｌ化させる。

なお、培養はできるだけ無菌操作を厳重にすることを第
一義とするが、予め予防的にペニシリン、ストレプトマ
イシン等の抗生物質を添加しておくことが好ましい。

更に、本発明の組織培養基材をマトリックス、例えば粒
状のプラスチックス、ガラス、金属等の表面に担持すれ
ば細胞等のサスペンション培養法にも適用できる。

本発明のコラーゲン組織培養基材を使用する組織培養ベ
ッドは生体外でシート状又は繊維状で成長するは乳類、
鳥類、両生類、魚類及び昆虫類を含む動物から誘導され
た細胞を培養するのに好適である。

このような細胞としては上皮組織、結合組織内組織、神
経組織又はリンパ組織から誘導されるものである。

特に、ヒトを含むは乳類から誘導された皮膚及び筋肉の
線維芽細胞を培養するのに適する。

また、ＨｅＬａ 、 ＫＢ 、 Ｄｅｔｒｏｉ ｔ
６等のヒト癌由来細胞株の培養、ヒト癌細胞の初代培養
に適する。

本発明の組織培養ベッドによる細胞等の培養法は、特に
限定されるものでなく公知の方法又は手段で実施し得る
。

以上、本発明は自然界に多量に存在しているにもかかわ
らず培養基材としてはその１部分しか利用されていない
コラーゲンから超音波処理と云う新しい処理法を導入す
ることにより、該コラーゲンの適用範囲を拡大せしめた
ものであり、その産＊業上への貢献は犬と云えるものと
思料する。

以下、実施例をもって本発明を説明する。

実施例 粗コラーゲンから生成した約５咽角に細断した精製コラ
ーゲン原料（北米産ステアハイド）５０ｙ′（乾燥重量
１２．５ｆ）をｐＨ２，５のＨＣ７水溶液５００７７２
１に一晩浸漬し酸膨潤させた。

酸膨潤したコラーゲン細片をジュースミキサーを用いて
ｐＨ３のＨＣ１水溶液２．５を中に分散、分散後濃塩酸
を用いて分散液をｐＨ３に調整後０．５重量％のコラー
ゲン濃度の分散液を得た。

得られた分散液を超音波処理した。

すなわち、超音波発生機（海上電機■製ＷＡ−６２８３
型、出力６００Ｗ、周波数１９、５ ＫＨｚ ）のノズ
ル先端に連続的に分散液を供給しつつ、容器を冷却し、
液温を１５℃に保ちながら超音波を照射した。

超音波照射量は１０００Ｋａｙｌ／ｌであった。

本発明のコラーゲン培養基材及び天然の酸抽出コラーゲ
ン基材を用い、細胞培養の生着率を比較した。

′３５１ｒｒｒｒＬ径のプラスチックス製細胞培養シャ
ーレ（Ｆａｌｃｏｎ社製）に１０％の胎児子牛血清を含
むＭＥＭメディウム１０ｍ１を入れ、３７℃で１時装置
いた後、ＨｅＬａ細胞をＩ Ｘ １０’個を含むＭＥＭ
メディウムを１ ｍｌ更に加えた後、３７℃で１２０分
間炭酸ガス培養した。

液中に浮遊する細胞数をコールタ−・カウンターで測定
することにより生着率を求めた。

その結果を第１表に示す。

この結果から、本発明の基材は天然の酸抽出可溶性コラ
ーゲンと同様に市販のプラスチックス製シャーレに比べ
細胞の生着率が著じるしく向上しでいることが明らかで
ある。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ アミノ酸組成として下記構成成分が１０００残基あ
   たり グリシン＝３１２〜３４０残基 プロリン：１１９〜１３８残基 ハイドロキシプロリン＝９４〜１００残基チロシン：２
   ．６〜５．５残基 であり且つ 変性温度＝３１〜４０℃ 沈降速度定数（Ｓ）：１．６２〜１．１２極限粘度：１
   ０．４〜１．８ｄｌｌ？ を有するコラーゲンを含む組織培養基材。 ２ 前記コラーゲンがフィルム状、ゲル状又はそれらの
   凍結乾燥処理した形状のいずれかの形態にあることを特
   徴とする特許請求の範囲第１項に記載のコラーゲンを含
   む組織培養基材。