LU79891A1 - Procede de culture de virus - Google Patents

Description

La présente invention a trait ä un procédé de culture de virus utilisable notamment mais non exclusivement à la culture industrielle de virus de la rage dans le but d'obtenir des suspensions virales susceptibles d'être utilisées pour la fabrica-5 tion de vaccins.

La culture actuelle du virus de la rage s'effectue d'une façon générale par culture du virus sur des couches mono-cellulaires en flacons. Cette technique connue présente l'inconvénient de nécessiter, pour une production quantitative notable, 10 une grande quantité de flacons, ce qui entraîne d'importantes manipulations et conduit à un prix de revient élevé.

Dans d'autres cas également des virus autres que le virus rabique sont cultivés sur des cellules en couches monocellu- » laires avec les mêmes inconvénients.

15 On a déjà essayé d'éviter cette sujétion en effectuant une culture du virus rabique sur des cellules placées dans un fermenteur, c'est-à-dire dans un grand réservoir contenant, dans le milieu nutritif liquide approprié, une suspension desdites cellules. Il s'est cependant avéré que ces cellules se comportent 20 mal dans de telles conditions et qu'il n'est pas possible d'obtenir une production industrielle de virus.

La présente invention se propose de remédier à ces inconvénients et de fournir un procédé de culture de virus permettant la culture industrielle dans des fermenteurs, même dans 25 le cas oü l'on utilise des cellules qui normalement ne se comportent pas convenablement dans un fermenteur. L'invention a également pour but d'obtenir ainsi une diminution sensible du prix de revient en raison des conditions industrielles de culture qui peuvent ainsi être réalisées.

30 L'invention a pour objet un procédé de culture de virus dans un fermenteur caractérisé par le fait que l'on effectue la ‘ culture du virus dans un fermenteur contenant, dans le milieu nutritif convenable habituel, une suspension de cellules et de fibres de collagène.

35 Par fibres de collagène au sens de la présente inven- " tion on entend des fibres de collagène ayant un haut degré de pureté et se présentant sous une forme permettant la dissémination des fibres et l'obtention d'une suspension. Un procédé de préparation de telles fibres â partir de tissus de soutien d'ani-40 maux et notamment de peaux se trouve par exemple décrit dans le DT/S.48 brevet français 1.568.829 dépose par le Centre Technique du

Cuir.

2 D'une façon générale, on préfère des fibres de collagène extraites du derme de jeunes bovins, purifiées et déshydra-5 tées, ces fibres étant bien entendu stérilisées, par exemple par la chaleur sèche.

La quantité de fibres dans le fermenteur est comprise * entre 1 et 20 g et de préférence entre 2 à 8 g/1.

La culture s'effectue de préférence sous agitation et 10 à température pouvant aller à 40°C. A la fin de la culture il suffit de supprimer l'agitation pour que les fibres décantent et se déposent au fond du fermenteur.

De préférence, notamment pour la rage, on réalise une * première culture, par exemple pendant 2 à 6 jours, on élimine le 15 surnageant puis on effectue avec un milieu nutritif neuf une deuxième culture après quoi le surnageant est recueilli.

Ce surnageant recueilli est ensuite filtré, éventuellement après lyse des cellules, puis soumis aux traitements habituels pour son utilisation, par exemple à titre de vaccin.

20 Les cellules utilisées pour la culture du virus sont de préférence des cellules utilisées habituellement en monocouches sur flacons. De façon avantageuse, ces cellules peuvent être préparées sous forme de suspension à partir des couches par action ménagée d'un enzyme protéolytique tel que 25 la trypsine ou la pronase, ou à partir de cultures cellulaires multipliées en fermenteur, avec ou sans fibres de collagène.

Des cellules particulièrement convenables pour le procédé selon l'invention sont des cellules telles que NIL2, lignée issue d'embryons de hamsters, ou IFFA3, PK15, WI38 et 30 MRC5.

De préférence, la concentration en cellules dans le fermenteur est ajustée pour être comprise entre environ 50.000 et 500.000 cellules par millilitre.

» Parmi les souches de virus susceptibles d'être avanta- 35 geusement cultivées par le procédé selon l'invention figurent le virus rabique et notamment les souches rabiques fixes type Pasteur CVS, Pitman Moore, ou modifiées de type Flury HEP, Flury LEP, SAD.

D'autres virus peuvent être cultivés selon l'invention, 40 éventuellement après avoir subi des passages d'adaptation sur DT/S.48 3 le type cellulaire considérée entretenu en couche stationnaire ou sur fibres de collagène maintenus en suspension.

Le milieu nutritif liquide est constitué par le milieu habituel utilisé dans la culture du virus et n'a donc pas à être 5 défini de façon plus précise. Il s'agit d'une solution saline contenant des acides aminés, des vitamines, des glucides, des peptones et éventuellement du sérum par exemple de veau ou de poulain, comme par exemple les milieux Eagle ou Stoker MacPherson.

La culture s'effectue d'une façon en soi classique en 10 adaptant de préférence le pH à une valeur comprise entre 6 et 8, en aérant et en ajoutant éventuellement une quantité suffisante de gaz carbonique.

D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront à la lecture de la description suivante, faite à 15 titre d'exemple non limitatif.

Exemple I

A partir de couches de cellules NIL2 établies en flacons de verre, on prépare une suspension cellulaire par action ménagée de trypsine. On récupère ainsi les cellules en suspension 20 et l'on en prépare une quantité telle que dans le fermenteur la concentration finale soit de 150.000 à 300.000 cellules par millilitre.

Par ailleurs, on stérilise une quantité suffisante de fibres de collagène pour avoir un poids de 2 à 8 g de fibres par 25 litre de suspension prête à l'emploi. Cette quantité est mise en suspension dans une aliquote de milieu nutritif. Dans le fermenteur sont introduits stérilement et dans un ordre non défini le milieu nutritif, la suspension de cellules, la suspension de collagène et la suspension virale de semence en quantité nécessaire et 30 suffisante pour obtenir le volume désiré compte-tenu de la taille du fermenteur.

* On effectue ensuite une agitation et on réalise une aération en surface avec de l'air filtré sur membrane stérili-* santé, l'incubation étant effectuée à la température de 37°C par 35 exemple.

’ La multiplication cellulaire est contrôlée par numéra tion quotidienne.

Après deux à six jours,on arrête l'agitation et les fibres de collagène se déposent au fond du fermenteur. On élimine 40 alors le surnageant.

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On ajoute ensuite du milieu nutritif neuf introduit stérilement dans le fermenteur et l'on remet l'agitation en route ainsi que l'aération. Lorsque la concentration de l'antigel viral obtenue est suffisante, on arrête à nouveau l'agitation et l'aéra-5 tion et on effectue une'nouvelle récolte du surnageant dans les conditions précédentes.

La suspension est filtrée ou centrifugée pour éliminer les débris cellulaires et les quelques débris fibreux qui peuvent être présents. La suspension virale ainsi obtenue est ensuite 10 inactivée par exemple par action de la bêtapropiolactone pendant un délai suffisant et la préparation peut être soit lyophilisée soit conditionnée sous forme liquide pure ou mélangée avec un adjuvant ou d'autres vaccins.

On obtient ainsi un vaccin antirabique convenable.

15 Exemple II

On réalise une suspension de cellules IFFA 3 par action de la trypsine et cette suspension est additionnée de collagène stérile et de virus de type Pasteur.

Le milieu nutritif est celui de Stocker.

20 On réalise la culture sous agitation entre 20 et 100 tours par minute avec aération réalisée en surface comme précédemment. Lorsque la concentration cellulaire requise est obtenue on arrête l'agitation et l'aération et après que les fibres se soient déposées sur le fond on rejette le surnageant.

25 Du milieu nutritif neuf exempt de sérum est ensuite introduit stérilement dans le fermenteur et l'agitation est remise en route ainsi que l'aération.

Lorsque la concentration en antigène viral est jugée satisfaisante, l'agitation et l'aération sont à nouveau arrêtées 30 et la suspension virale est récoltée.

Cette suspension est filtrée sur membrane stérilisante, inactivée par exemple par action de bêtapropiolactone. Après contrôle la préparation peut être mélangée en proportions déterminées avec une suspension de gel d'alumine stérile puis distri-35 buée en flacons unidose ou multidoses.

Exemple III

On réalise une suspension de cellules de lignée WI 38 par action de la trypsine. Par ailleurs, un poids déterminé de fibres de collagène est stérilisé. Le virus de semence souche 40 modifiée HEP est préparé sous un volume suffisant.

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Chaque constituant est introduit stérilement dans le fermenteur et le milieu nutritif de Stocker est ajouté pour obtenir le volume final désiré. La concentration en fibres est alors de 2 à 8g/l, la concentration en cellules étant de l'ordre 5 de 100.000 à 200.000 cellules par ml.

L'agitation est mise en route à raison de 20 à 100 tours par minute et l'on réalise une aération en surface à l'aide d'air filtré sur membrane stérilisante.

Lorsque la multiplication cellulaire est suffisante, on 10 arrête l'agitation et l'aération, les fibres de collagène se déposent sur le fond et le surnageant est rejeté. On ajoute du milieu nutritif neuf exempt de sérum stérilement dans le fermenteur et l'on remet l'agitation et l'aération en route. Lorsque la multiplication de l'antigène viral est jugée satisfaisante, 15 l'agitation et l'aération sont arrêtées et la suspension virale est récoltée après décantation des fibres.

Cette suspension est filtrée sur membrane stérilisante puis distribuée en flacons de 10 litres par exemple. Après contrôle, la préparation peut être mélangée avec un substrat à base 20 de lactose et distribuée en flacons unidose qui sont ensuite traités par lyophilisation.

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Claims (11)

1. Procédé de culture de virus caractérisé par le fait que l'on effectue la culture du virus dans un fermenteur contenant, dans le milieu nutritif convenable habituel, une suspension 5 de cellules et de fibres de collagène.

2. Procédé selon la revendication 1 caractérisé par le fait que la quantité de fibres dans le fermenteur est comprise entre 1 et 20 g.

3. Procédé selon la revendication 2 caractérisé par le 10 fait que la quantité de fibres est comprise entre 2 et 8 g/1.

4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 caractérisé par le fait que l'on effectue la culture sous agitation, que l'on supprime l'agitation vers la fin de la culture pour décanter les fibres et que l'on récolte le surnageant.

5. Procédé selon la revendication 4 caractérisé par le fait qu'après une première culture, on élimine le surnageant puis on apporte un milieu nutritif neuf, on effectue une nouvelle culture et on récupère enfin le surnageant.

6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 20 à 5, caractérisé par le fait que l'on utilise les cellules appartenant au groupe formé par les cellules NIL2, IFFA3, WI38, PK15 et PRC5.

7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé par le fait que la concentration en cellules est 25 comprise entre 50.000 et 500.000 cellules par ml.

8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé par le fait que l'on cultive une souche de virus de la rage.

9. Procédé selon la revendication 7, caractérisé par le 30 fait que la souche de virus rabique est choisie parmi les souches adaptées fixes type PASTEUR, CVS, Pitman Moore ou modifiées, type „ Flury HEP, Flury LEP, SAD. »

10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 _ à 6, caractérisé par le fait qu'avant l'ensemencement dans le 35 fermenteur on effectue plusieurs passages d'adaptation du virus ’ sur le type cellulaire considérée entretenu sur fibres de colla gène en suspension.

11. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé par le fait qu'avant l'ensemencement dans le fermenteur on effectue plusieurs passages d'adaptation du virus 40 sur le type cellulaire considéré entretenu en couche stationnaire. DT/S.48