JPS602186A - ラクターゼ調整物の精製方法 - Google Patents
ラクターゼ調整物の精製方法Info
- Publication number
- JPS602186A JPS602186A JP20070383A JP20070383A JPS602186A JP S602186 A JPS602186 A JP S602186A JP 20070383 A JP20070383 A JP 20070383A JP 20070383 A JP20070383 A JP 20070383A JP S602186 A JPS602186 A JP S602186A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- lactase
- cells
- ketone
- protease
- alcohol
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明はラクターゼ調製物の精製に関連している。ラク
ターゼ又はベーターガラクトシダーゼはラクトースをグ
ルコースとガラクトースに加水分解するのに効果的な酵
素である。したがってラクターゼは酪農工業において有
益である。例えばチーズ製造においてチーズ乳にラクタ
ーゼを添加すると、ラクトース加水分解の速度がばやま
り熟成時間が短縮さｔ、生成能が増加し、改良された生
成物が出来る。ラクターゼは又、ラクトースに対し生理
的に不耐性の人に投与するのに有益である。
ターゼ又はベーターガラクトシダーゼはラクトースをグ
ルコースとガラクトースに加水分解するのに効果的な酵
素である。したがってラクターゼは酪農工業において有
益である。例えばチーズ製造においてチーズ乳にラクタ
ーゼを添加すると、ラクトース加水分解の速度がばやま
り熟成時間が短縮さｔ、生成能が増加し、改良された生
成物が出来る。ラクターゼは又、ラクトースに対し生理
的に不耐性の人に投与するのに有益である。
ラクターゼば従来の醗酵法で容易に生産される数種の微
生物に赴ける細胞内成分である。これらの畝生物の例と
しては、タルイベロマイセス（ｊ（ｌ ｕ３）ｙ ｅ
ｒ ｏ−ｍｙ ｃ ｅｓ ） （従来からサツカロマイ
セスＣ３ａｃｃ）ｂａｒｏｍｙｃｅｓ）と考えられてい
たもの）属、おいてこのような微生物の細胞は、適当な
栄養培地中で培養し、収穫し乾燥した後全乾燥細胞を、
目的の適応物にラクターゼ活性を与えるために用いられ
た。この方法は、他の細胞成分もチーズ乳に加えられる
事になり、望ましくない味と香りを与えてしまうので良
い方法ではない。この問題点を克服するための従来の方
法は、細胞の内部からラクターゼを放出させる方法であ
り、特に細胞壁をホモジエナイズ、粉砕、又は化学的な
手段を用いて破壊していた。しかしながら、これらの方
法は一般に長時間を必要とし、高価であって、この方法
によりラクターゼばかりでなく他の細胞内酵素、タンパ
ク質及びそれらの分解生成物等も放出されるためラクタ
ーゼを分離せねばならない。この点に関して、微生物細
胞から分子内ラクターゼの放出においてフ：ロテアーゼ
も同時に放出され、このラクターゼ調製物中からプロテ
アーゼ活性を除去するのが困難であるという問題があっ
た。チーズ熟成を促進させるためにチーズ乳に加えたラ
クターゼ調製物中にプロテアーゼが混在シていれば、乳
タンパク質のタンパク分解によりペフチドが形成される
ために、不快な苦味で香りのないものが生成してしまう
。したがって、上述の見解において、微生物中からラク
ターゼを放出せしめる改良法が必要であり、さらに、こ
うして製したラクターゼ調製物の精製、特にラクターゼ
調製物中からプロテアーゼ活性を選択的に除去する方法
が必要である。
生物に赴ける細胞内成分である。これらの畝生物の例と
しては、タルイベロマイセス（ｊ（ｌ ｕ３）ｙ ｅ
ｒ ｏ−ｍｙ ｃ ｅｓ ） （従来からサツカロマイ
セスＣ３ａｃｃ）ｂａｒｏｍｙｃｅｓ）と考えられてい
たもの）属、おいてこのような微生物の細胞は、適当な
栄養培地中で培養し、収穫し乾燥した後全乾燥細胞を、
目的の適応物にラクターゼ活性を与えるために用いられ
た。この方法は、他の細胞成分もチーズ乳に加えられる
事になり、望ましくない味と香りを与えてしまうので良
い方法ではない。この問題点を克服するための従来の方
法は、細胞の内部からラクターゼを放出させる方法であ
り、特に細胞壁をホモジエナイズ、粉砕、又は化学的な
手段を用いて破壊していた。しかしながら、これらの方
法は一般に長時間を必要とし、高価であって、この方法
によりラクターゼばかりでなく他の細胞内酵素、タンパ
ク質及びそれらの分解生成物等も放出されるためラクタ
ーゼを分離せねばならない。この点に関して、微生物細
胞から分子内ラクターゼの放出においてフ：ロテアーゼ
も同時に放出され、このラクターゼ調製物中からプロテ
アーゼ活性を除去するのが困難であるという問題があっ
た。チーズ熟成を促進させるためにチーズ乳に加えたラ
クターゼ調製物中にプロテアーゼが混在シていれば、乳
タンパク質のタンパク分解によりペフチドが形成される
ために、不快な苦味で香りのないものが生成してしまう
。したがって、上述の見解において、微生物中からラク
ターゼを放出せしめる改良法が必要であり、さらに、こ
うして製したラクターゼ調製物の精製、特にラクターゼ
調製物中からプロテアーゼ活性を選択的に除去する方法
が必要である。
ラクターゼ、含有イースト細胞からラクターゼを、好収
率で、しかも比較的短時間で好純度で放出せしめる方法
は下記工程からなる。すなわち（ｃｚ）ラクターゼ含有
イースト細胞良を、約２０ル９５ル：が炭素数１−４の
ジアルキルクトン、より選んだ化合物（この場合、上述
の細胞とアルコール又はケトンの全重量に基ずく濃度で
ある。）と、約５〜３５℃、（２０〜３０℃が良好）で
接触せしめる。（ｂ）アルコール又はケトン処理細胞を
７）Ｈ約５、５〜８．０（約６．４−７．０が良好）を
有する水溶液と約５〜３５℃（約２０〜３０℃が良好）
で接触せしめる。工程（α）で用いる良好な化合物はメ
タノール、エタノール、インプロノ々ノール、又＋ｉそ
れらの混合物で、最も良好なものは、エタノールでおる
。アルコール又はケトンは全重量の約６０〜９０重量パ
ーセントの範囲で用いる。この方法に用いる良好なイー
スト細胞は、次の属のものである。すなわち、タルイベ
ロマイセスり弦すｖ暫る。
率で、しかも比較的短時間で好純度で放出せしめる方法
は下記工程からなる。すなわち（ｃｚ）ラクターゼ含有
イースト細胞良を、約２０ル９５ル：が炭素数１−４の
ジアルキルクトン、より選んだ化合物（この場合、上述
の細胞とアルコール又はケトンの全重量に基ずく濃度で
ある。）と、約５〜３５℃、（２０〜３０℃が良好）で
接触せしめる。（ｂ）アルコール又はケトン処理細胞を
７）Ｈ約５、５〜８．０（約６．４−７．０が良好）を
有する水溶液と約５〜３５℃（約２０〜３０℃が良好）
で接触せしめる。工程（α）で用いる良好な化合物はメ
タノール、エタノール、インプロノ々ノール、又＋ｉそ
れらの混合物で、最も良好なものは、エタノールでおる
。アルコール又はケトンは全重量の約６０〜９０重量パ
ーセントの範囲で用いる。この方法に用いる良好なイー
スト細胞は、次の属のものである。すなわち、タルイベ
ロマイセスり弦すｖ暫る。
本発明はラクターゼ調製物を含有する水溶液を約３０〜
９０重量パーセント（４０〜６０重量パーセントが良好
）のグリセロール（水−グリセロール溶液の全重量に基
づいた濃度）と約８５〜６０℃（４５〜５５℃が良好）
で、ｐＨ約５．５〜８、０ （ ６．４〜７．０が良好
°）で、プロテアーゼ活性が本質的に無くなるまで加熱
する事を特徴とするプロテアーゼ含有ラクターゼ調製物
中よりプロテアーゼ活性を選択的に無くす方法を供給す
る。もしも必要なら、水−グリセロール溶液にマンガン
イオンを１０−４〜１ ０−”濃度で加え、加熱工程中
のラクターゼの安定性を高める事が出来る。
９０重量パーセント（４０〜６０重量パーセントが良好
）のグリセロール（水−グリセロール溶液の全重量に基
づいた濃度）と約８５〜６０℃（４５〜５５℃が良好）
で、ｐＨ約５．５〜８、０ （ ６．４〜７．０が良好
°）で、プロテアーゼ活性が本質的に無くなるまで加熱
する事を特徴とするプロテアーゼ含有ラクターゼ調製物
中よりプロテアーゼ活性を選択的に無くす方法を供給す
る。もしも必要なら、水−グリセロール溶液にマンガン
イオンを１０−４〜１ ０−”濃度で加え、加熱工程中
のラクターゼの安定性を高める事が出来る。
本発明の方法は、この分野で良く知られたラクターゼ含
有イースト細胞から放出せしめたラクターゼを精製する
のに利用する事が出来る。適当なりーコレクションより
入手出来るような多くの菌ＡＴＣＣ８ ５ ８ ２、Ａ
ｒｃｃ： １ ２ ４ ２ ４、及びタルイベロマイセ
ス ラクテイスＣＫ１ｗｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓｌａｃｔ
ｉｓ ）である。ラクターゼを放出せしめる事ア州のカ
リフォルニア大学デービス校から一般に入手出来る培養
番号ＵＣＤ５５−３１の株菌であである。これら既知で
、一般に入手出来るものの変異株で、従来のＸ’ｆａ照
射、ＵＶ光照射、ナイトロージエンマスタード処理して
得るような変異株を用いるのも良好である事を理解され
たい。
有イースト細胞から放出せしめたラクターゼを精製する
のに利用する事が出来る。適当なりーコレクションより
入手出来るような多くの菌ＡＴＣＣ８ ５ ８ ２、Ａ
ｒｃｃ： １ ２ ４ ２ ４、及びタルイベロマイセ
ス ラクテイスＣＫ１ｗｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓｌａｃｔ
ｉｓ ）である。ラクターゼを放出せしめる事ア州のカ
リフォルニア大学デービス校から一般に入手出来る培養
番号ＵＣＤ５５−３１の株菌であである。これら既知で
、一般に入手出来るものの変異株で、従来のＸ’ｆａ照
射、ＵＶ光照射、ナイトロージエンマスタード処理して
得るような変異株を用いるのも良好である事を理解され
たい。
ラクターゼ含有イースト細胞は一般に、適当な栄養培地
、例えば、ラクトーズ含有の水性培地で、リン酸アンモ
ニウム、リン酸カリウム、等のリン及び窒素源と共に乳
しようを含んだ培地である。
、例えば、ラクトーズ含有の水性培地で、リン酸アンモ
ニウム、リン酸カリウム、等のリン及び窒素源と共に乳
しようを含んだ培地である。
このような栄養培地はこの分野に精通する者にとっては
よく知られた培地である。
よく知られた培地である。
この分野で既知の従来からの醗酵法を用い、イースト細
胞を、十分な濃度の細胞が９の栄養培地中で得られるま
で培養する。例えば、栄養培地中、約２０〜３５℃（２
５℃〜８５℃が良好）で約４８〜１０．０時間培養する
。次に細胞を、濾過又は遠心分離等の方法で取る。
胞を、十分な濃度の細胞が９の栄養培地中で得られるま
で培養する。例えば、栄養培地中、約２０〜３５℃（２
５℃〜８５℃が良好）で約４８〜１０．０時間培養する
。次に細胞を、濾過又は遠心分離等の方法で取る。
分子内ラクターゼを放出せしめるために、初め、イース
ト細胞す炭素数１−４のアルキルアルコール、炭素数１
−４のアルキル基を持つジアルキルケトンと、５℃〜３
５℃（２０℃〜３０℃が良好）で接触せしめる。アルコ
ール又はケトンは、細胞とアルコール又はケトンの全重
量に基づき、２０〜９０ 重ｔバーセント（６０〜９０
重量パーセントが良好）濃度用いる。細胞はアルコール
、又はケトンと２分〜２０時間（３０分〜２時間）接触
せしめる。次にアルコール又はケトンを細胞から、細胞
の濾過、溶媒留去、凍結乾燥等により分離する。しかし
アルコール、ケトンを約７５〜８０重量パーセント以下
用いた場合、アルコール又はケトンの除去は本質的でな
く、この細胞を次の工程で、アルコール又はケトンの存
在のまま、ｐＨ約５．５〜８．０の水ｉ＠液と処理する
事が出来る。
ト細胞す炭素数１−４のアルキルアルコール、炭素数１
−４のアルキル基を持つジアルキルケトンと、５℃〜３
５℃（２０℃〜３０℃が良好）で接触せしめる。アルコ
ール又はケトンは、細胞とアルコール又はケトンの全重
量に基づき、２０〜９０ 重ｔバーセント（６０〜９０
重量パーセントが良好）濃度用いる。細胞はアルコール
、又はケトンと２分〜２０時間（３０分〜２時間）接触
せしめる。次にアルコール又はケトンを細胞から、細胞
の濾過、溶媒留去、凍結乾燥等により分離する。しかし
アルコール、ケトンを約７５〜８０重量パーセント以下
用いた場合、アルコール又はケトンの除去は本質的でな
く、この細胞を次の工程で、アルコール又はケトンの存
在のまま、ｐＨ約５．５〜８．０の水ｉ＠液と処理する
事が出来る。
上記方法において、細胞をアルキルアルコール、又はジ
アルキルケトンと処理する場合、これはアルコール又は
ケトンにより分子内ラクターゼｌａ媒抽出するのではな
い事ン認められたい。本方法の条件下では、ラクターゼ
は、はとんど、アルコールやケトンにより細胞中から抽
出されない。本方法の機構を理論と結びつけるつもりは
ないがアルコール又はケトンは、細胞壁の透過性をより
良くし、以後に述べろ如＜ｐＨ約５．５〜８．０の水溶
液中に細胞を懸濁させた場合に分子内ラクターゼを放出
せしめるように作用するものと考えられろ。
アルキルケトンと処理する場合、これはアルコール又は
ケトンにより分子内ラクターゼｌａ媒抽出するのではな
い事ン認められたい。本方法の条件下では、ラクターゼ
は、はとんど、アルコールやケトンにより細胞中から抽
出されない。本方法の機構を理論と結びつけるつもりは
ないがアルコール又はケトンは、細胞壁の透過性をより
良くし、以後に述べろ如＜ｐＨ約５．５〜８．０の水溶
液中に細胞を懸濁させた場合に分子内ラクターゼを放出
せしめるように作用するものと考えられろ。
上述の如くアルコール又はケトンと処理した後アルコー
ル−又は、ケトン−処理細胞をｐＨ約５．５〜８．０の
水溶液（約６．４・〜７．０が良好であり６．６が最も
良い）中に懸濁せしめる。この場合、例えば、０．１Ｍ
リン酸ナトリウム又はカリウム水溶液又は０．１Ｍクエ
グ酸−リン酸水溶液等の適当な緩衝液を用いる方が良い
。溶液は撹拌、振とう、等によりラクターゼの放出を促
進させるのが良好である。この溶液は約５℃〜３５℃（
２０℃〜３０℃）Ｋ保つ。水溶液中の細胞の濃度は限定
されないが１リツトル中、約１０〜８０グラム（約３０
〜５０グラム／リツトルが良好）の範囲が良い。細胞は
水溶液中に懸濁させるが０．１Ａ／１，１ン酸ナトリウ
ム、カリウム等の緩衝液が良く、約１〜２０時間、特に
約１０〜２０時間で放出によるラクターゼの収量が最大
になる。これが約２０時間以上になると酵素による微生
物分解が起きるためラクターゼの収量が悪くなる。この
ようなラクターゼ損失は無閑条件下又は防腐剤の使用で
最少にする事が出来る。ラクターゼは細胞から他の細胞
内酵素又はタンパク質（例えばプロテアーゼ）と共に水
溶中に放出されるが、これら、望ましくない細胞構成体
の抽出量は細胞壁を機械的に破壊するためのホモグナイ
ズ、細胞の機械的粉砕等による従来のラクターゼ放出法
より本質的に少い。
ル−又は、ケトン−処理細胞をｐＨ約５．５〜８．０の
水溶液（約６．４・〜７．０が良好であり６．６が最も
良い）中に懸濁せしめる。この場合、例えば、０．１Ｍ
リン酸ナトリウム又はカリウム水溶液又は０．１Ｍクエ
グ酸−リン酸水溶液等の適当な緩衝液を用いる方が良い
。溶液は撹拌、振とう、等によりラクターゼの放出を促
進させるのが良好である。この溶液は約５℃〜３５℃（
２０℃〜３０℃）Ｋ保つ。水溶液中の細胞の濃度は限定
されないが１リツトル中、約１０〜８０グラム（約３０
〜５０グラム／リツトルが良好）の範囲が良い。細胞は
水溶液中に懸濁させるが０．１Ａ／１，１ン酸ナトリウ
ム、カリウム等の緩衝液が良く、約１〜２０時間、特に
約１０〜２０時間で放出によるラクターゼの収量が最大
になる。これが約２０時間以上になると酵素による微生
物分解が起きるためラクターゼの収量が悪くなる。この
ようなラクターゼ損失は無閑条件下又は防腐剤の使用で
最少にする事が出来る。ラクターゼは細胞から他の細胞
内酵素又はタンパク質（例えばプロテアーゼ）と共に水
溶中に放出されるが、これら、望ましくない細胞構成体
の抽出量は細胞壁を機械的に破壊するためのホモグナイ
ズ、細胞の機械的粉砕等による従来のラクターゼ放出法
より本質的に少い。
細胞中から放出されるラクターゼの量は従来から用いら
れている如くラクターゼ単位で測定される。Ｏ−ニトロ
フェニル−ベーターＤ−ｉラクトピラノシド（ＯＮＰＧ
）のＯ−ニトロフェニル（ＯＮＰ）及びＤ−ガラクトピ
ラノシドへの分解速度でラクターゼ単位を決定する。例
えばウエンドルフ（Ｗｅｎｄｏｒｆ ）等のＪ、 Ｍｉ
ｌｋ ＦｏｏｔＬ Ｔｅｃｈ、８４．４５１（１９７１
）を参照の事。さらに特異的に言えば、本発明の目的の
ために、０．１％牛血清アルブミンを含む帆ＩＭリン酸
カリウム緩衝液７ｍｌ。
れている如くラクターゼ単位で測定される。Ｏ−ニトロ
フェニル−ベーターＤ−ｉラクトピラノシド（ＯＮＰＧ
）のＯ−ニトロフェニル（ＯＮＰ）及びＤ−ガラクトピ
ラノシドへの分解速度でラクターゼ単位を決定する。例
えばウエンドルフ（Ｗｅｎｄｏｒｆ ）等のＪ、 Ｍｉ
ｌｋ ＦｏｏｔＬ Ｔｅｃｈ、８４．４５１（１９７１
）を参照の事。さらに特異的に言えば、本発明の目的の
ために、０．１％牛血清アルブミンを含む帆ＩＭリン酸
カリウム緩衝液７ｍｌ。
１０−３Ｍ硫酸マンガン１水和物の水溶液１ｍｌ、０．
０２Ｍ（ＤＯＮＰＧ溶液２１ａ、検定用（Ｄ ラクター
ゼ含有水液、を混合して製した溶液中で４２０？１．ｍ
での吸収を分光光度計で、０ＮＰＧの分解速＝ｙ決定す
る。検定は３７℃で２０分間行い、反応は２Ｘ １０
”Ｍ ＥＤＴＡ ジナトリウム、を含む２Ｍ水酸化アン
モニウム水１ｍｌ’Ｑ加えて止める。ラクターゼ単位は
４２０ｎ’ｍでの吸収における変化により決定する。１
ラクタ一ゼ単位は１分間に生成するＯＮＦの１マイクロ
モルに等しい。溶液中のプロテアーゼの量は、同様に、
本発明の目的のために、染色コラーゲンポリマーである
アゾコールの分解速度として測定したプロテアーゼ単位
として表わされる。例えばヘイム（Ｈｅｙｍ）によるＡ
ｒｃｈ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、 Ｂｉｏｐｈｙｓ 、 １
２７．８９（１９６２）の報告を参照せよ。さらに特異
的に言えば、アゾコールの分解速度は分光光度計を用（
ｚ）５２０ｎｍの吸収変化ｔ、（８ｍｌの０，１Ｍリン
酸ナトリウム緩衝液、１０ｍ１のアゾコール、ＩＴＬｌ
のプロテアーゼ含有検定溶液の混合により製した溶液中
で測定して決定する。この溶液を８７℃で３０分間振と
うしてインキユベートシ、残りのアゾコール’ａ＝濾過
して反応を止める。次に１分間当りの５２０ｎｍＶＣお
けろ吸光度の変化からプロテアーゼ単位を決定する。
０２Ｍ（ＤＯＮＰＧ溶液２１ａ、検定用（Ｄ ラクター
ゼ含有水液、を混合して製した溶液中で４２０？１．ｍ
での吸収を分光光度計で、０ＮＰＧの分解速＝ｙ決定す
る。検定は３７℃で２０分間行い、反応は２Ｘ １０
”Ｍ ＥＤＴＡ ジナトリウム、を含む２Ｍ水酸化アン
モニウム水１ｍｌ’Ｑ加えて止める。ラクターゼ単位は
４２０ｎ’ｍでの吸収における変化により決定する。１
ラクタ一ゼ単位は１分間に生成するＯＮＦの１マイクロ
モルに等しい。溶液中のプロテアーゼの量は、同様に、
本発明の目的のために、染色コラーゲンポリマーである
アゾコールの分解速度として測定したプロテアーゼ単位
として表わされる。例えばヘイム（Ｈｅｙｍ）によるＡ
ｒｃｈ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、 Ｂｉｏｐｈｙｓ 、 １
２７．８９（１９６２）の報告を参照せよ。さらに特異
的に言えば、アゾコールの分解速度は分光光度計を用（
ｚ）５２０ｎｍの吸収変化ｔ、（８ｍｌの０，１Ｍリン
酸ナトリウム緩衝液、１０ｍ１のアゾコール、ＩＴＬｌ
のプロテアーゼ含有検定溶液の混合により製した溶液中
で測定して決定する。この溶液を８７℃で３０分間振と
うしてインキユベートシ、残りのアゾコール’ａ＝濾過
して反応を止める。次に１分間当りの５２０ｎｍＶＣお
けろ吸光度の変化からプロテアーゼ単位を決定する。
イースト細胞中から抽出水溶液中にラクターゼ及び少量
のプロテアーゼ及び他のタンパク質が放出さｎた後、残
りの固形細胞物質を濾過して除きラクターゼと少量のプ
ロテアーゼ不純物を含む溶液を得る。必要ならラクター
ゼは従来の、凍結乾燥、アセトンの如き非溶媒を加えて
ラクターゼを沈澱させるか蔗糖を加えてスプレー乾燥等
の方法で単離する事が出来る。しかしこれらの方法で単
離したラクターゼばプロテアーゼ不純物を含んでおり、
これをチーズ製造に用いると望ましくない香と味になる
事は明らかである。したがって、イースト細胞から本発
明の方法で得たラクターゼは上述の如くプロテアーゼ活
性を除かねばならない。
のプロテアーゼ及び他のタンパク質が放出さｎた後、残
りの固形細胞物質を濾過して除きラクターゼと少量のプ
ロテアーゼ不純物を含む溶液を得る。必要ならラクター
ゼは従来の、凍結乾燥、アセトンの如き非溶媒を加えて
ラクターゼを沈澱させるか蔗糖を加えてスプレー乾燥等
の方法で単離する事が出来る。しかしこれらの方法で単
離したラクターゼばプロテアーゼ不純物を含んでおり、
これをチーズ製造に用いると望ましくない香と味になる
事は明らかである。したがって、イースト細胞から本発
明の方法で得たラクターゼは上述の如くプロテアーゼ活
性を除かねばならない。
本発明によれば、これらプロテアーゼ活性はプロテアー
ゼ不純物を言むラクターゼ調製物の水溶液を約８０〜９
０重量パーセントのグリセロール（この場合水−グリセ
ロール溶液の全重量にもとずく濃度）と約３５〜６０℃
でｐＩｉ約５．５〜８．０で加熱して除く事が出来る。
ゼ不純物を言むラクターゼ調製物の水溶液を約８０〜９
０重量パーセントのグリセロール（この場合水−グリセ
ロール溶液の全重量にもとずく濃度）と約３５〜６０℃
でｐＩｉ約５．５〜８．０で加熱して除く事が出来る。
それ故、アルコール−又はケトン−処理イースト細胞か
ら上述の方法に従って得たラクターゼ及びプロテアーゼ
不純物を含む水溶液はグリセロールを加え、加熱する事
によって、水溶液中からラクターゼ含有水せずに直接精
製する事が出来る。精製工程における水−グリセロール
溶液中のラクターゼの濃度は限定されないが一般的には
ＩＴＬｌ当り約１，０００〜２５．０００ラクタ一ゼ単
位（約２，０００〜２５．０００単位／ ｍｌが良好）
の範囲である。それ故、前述のアルコール−又はケトン
−処理細胞の抽出工程で得た、ラクターゼ含有水溶液は
グリセロール７加える前に、濃縮して適当な濃度にする
のが良い。
ら上述の方法に従って得たラクターゼ及びプロテアーゼ
不純物を含む水溶液はグリセロールを加え、加熱する事
によって、水溶液中からラクターゼ含有水せずに直接精
製する事が出来る。精製工程における水−グリセロール
溶液中のラクターゼの濃度は限定されないが一般的には
ＩＴＬｌ当り約１，０００〜２５．０００ラクタ一ゼ単
位（約２，０００〜２５．０００単位／ ｍｌが良好）
の範囲である。それ故、前述のアルコール−又はケトン
−処理細胞の抽出工程で得た、ラクターゼ含有水溶液は
グリセロール７加える前に、濃縮して適当な濃度にする
のが良い。
精製工程は約４５〜５５℃でｐＨ６，４〜７．０（約６
．６が最も良好である。）にて行うのか良く、この条件
下ではラクターゼは安定である。精製工程でのラクター
ゼの安定性は、もし必要なら、例えば塩化マンガン、硝
酸マンガン、硫酸マンガン等可溶性二価マンガン塩を、
１０−４〜１０−２Ｍマンガンイオン濃度にするのに十
分な量加えると、これが促進される。
．６が最も良好である。）にて行うのか良く、この条件
下ではラクターゼは安定である。精製工程でのラクター
ゼの安定性は、もし必要なら、例えば塩化マンガン、硝
酸マンガン、硫酸マンガン等可溶性二価マンガン塩を、
１０−４〜１０−２Ｍマンガンイオン濃度にするのに十
分な量加えると、これが促進される。
ラクターゼ含有水−グリセロール浴液はプロテアーゼ活
性が本質的に減少するまで加熱する。これに必要な時間
は反応温度に依存するが、一般には、６０℃で約３時間
〜３５℃で約ｌＯ日間であり、５０℃で約６〜１２時間
が最適である。この条件下でプロテアーゼ不純物は急速
に不活性化され、プロテアーゼ活性は初期の１０％以下
になる。
性が本質的に減少するまで加熱する。これに必要な時間
は反応温度に依存するが、一般には、６０℃で約３時間
〜３５℃で約ｌＯ日間であり、５０℃で約６〜１２時間
が最適である。この条件下でプロテアーゼ不純物は急速
に不活性化され、プロテアーゼ活性は初期の１０％以下
になる。
これに比してラクターゼはグリセロールで選択的に安定
化され、マンガンイオンを加えると、初期のラクターゼ
活性の９−０％以上が保持される。加熱中に、不活性化
されたプロテアーゼを含む不活性化されたタンパク質の
沈澱が出来、これを例えば沖過して除き目的のラクター
ゼ精製溶液を得る。
化され、マンガンイオンを加えると、初期のラクターゼ
活性の９−０％以上が保持される。加熱中に、不活性化
されたプロテアーゼを含む不活性化されたタンパク質の
沈澱が出来、これを例えば沖過して除き目的のラクター
ゼ精製溶液を得る。
グリセロールの存在下で加熱する事によりプロテアーゼ
活性を選択的に減少せしめる、上体の精製工程は、アル
コール又はケトンでイースト細胞を処理し、次の本発明
に従ってｐ、Ｈ５，５〜８．０で水解液中に抽出せしめ
て得たラクターゼの精製には特に適当である事は明白で
あるし力Ｓしプロテアーゼ活性を選択的に減少せしめる
この方法は、上述以外の方法、例えば従来の機械的破壊
又はホモゲナイズ等により得たラクターゼ調製物中のプ
ロテアーゼ活性を減するのに用いる事が出来る。
活性を選択的に減少せしめる、上体の精製工程は、アル
コール又はケトンでイースト細胞を処理し、次の本発明
に従ってｐ、Ｈ５，５〜８．０で水解液中に抽出せしめ
て得たラクターゼの精製には特に適当である事は明白で
あるし力Ｓしプロテアーゼ活性を選択的に減少せしめる
この方法は、上述以外の方法、例えば従来の機械的破壊
又はホモゲナイズ等により得たラクターゼ調製物中のプ
ロテアーゼ活性を減するのに用いる事が出来る。
本発明は次の実施例で例示するが、本発明はこれらの実
施例の特異的詳細に限定するものでない事馨理解された
い。
施例の特異的詳細に限定するものでない事馨理解された
い。
米国カリフォルニア州、カリフォルニア大学デービス校
、から得た培養番ｐｖｃＤ５５−３１の１リツトル中に
接種し１２時間２８℃で培養する。
、から得た培養番ｐｖｃＤ５５−３１の１リツトル中に
接種し１２時間２８℃で培養する。
乳しよう ４０．０グ／ｌ
（＃＆） ２ ＳＯ＋ ５ 、 Ｏ〃
ＫＪＰＯ４５，ｏ ｎ
トウモロコシ侵出液 １．０〃
ｉ”ＶＩｇｓｏ、・７Ｈ２００，５ｔｔ硫酸でｐＨ４，
５に調節しオートクレーブ中１１０℃で４５分間滅菌す
る。
５に調節しオートクレーブ中１１０℃で４５分間滅菌す
る。
１４リットルファーメンタ−甲［８リツトルの次の組成
の培地を入れる。
の培地を入れる。
Ｋ＆Ｐ Ｏ４１−８ｔ ’／ １３
ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４１，Ｏｔｔ
（ＮＨ４）２ＨＰＯ４１，Ｏ１１
ＭｇＳＯ４・ｌＨ２Ｏ０，ｒ ｓ
Ｆｅ Ｓ Ｏ４・７ Ｈ２Ｏ５，、Ｏ’ｌ１ｌｉｉｌ’
／ ｌｌＭｎＳＯ４・７Ｈ２０５，Ｏｍｇ／ｌ これを１２１℃、３０分間滅菌し上述の前培養菌を入れ
る。（１０％ｖ／ｖ） 組成： ラクト−ズ ８６３グ／ｌ イースト抽出物 ６．Ｏｆｆ／１ トウモロコシ浸出液 ８．０ｉ／１ ニコチン酸 ６．０ｍ９／（１ を有する培地（２，６”Ｊットル）を１１０℃で４５分
間滅菌し、これを６０時間以上連続的Ｑて加えて培養す
る。溶存酸素は培番中空気乞送り込み帆５容量／ｙ量／
分から０．７５容量／容量／分に増加させ、撹拌７３１
０ＲＰＭから３８ ＯＲＰＭに増加させる事により約１
０％に保つ。培養温度は３０℃でｐＨは４．５に保つ。
／ ｌｌＭｎＳＯ４・７Ｈ２０５，Ｏｍｇ／ｌ これを１２１℃、３０分間滅菌し上述の前培養菌を入れ
る。（１０％ｖ／ｖ） 組成： ラクト−ズ ８６３グ／ｌ イースト抽出物 ６．Ｏｆｆ／１ トウモロコシ浸出液 ８．０ｉ／１ ニコチン酸 ６．０ｍ９／（１ を有する培地（２，６”Ｊットル）を１１０℃で４５分
間滅菌し、これを６０時間以上連続的Ｑて加えて培養す
る。溶存酸素は培番中空気乞送り込み帆５容量／ｙ量／
分から０．７５容量／容量／分に増加させ、撹拌７３１
０ＲＰＭから３８ ＯＲＰＭに増加させる事により約１
０％に保つ。培養温度は３０℃でｐＨは４．５に保つ。
６０時間後＝、細胞濃度は１８ ？／ｌ、細胞中のラク
ターゼ含量は４２００単位／グラムである。
ターゼ含量は４２００単位／グラムである。
ラクターゼの多くなった細胞を濾過して取る。
上述の培養から得た１、８グラムの細胞を含むイースト
細胞ペース） ’Ｌ ６．８グラムのエタノールで処理
する。９０分抜工タノールを濾過して除き、細胞を帆Ｉ
Ｍリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ６，６、中に再び懸濁せ
しめる。この緩衝液中の細胞濃度は４０グ／ｌに調節す
る。エタノール処理潮胞を抽出緩衝液中で１５分間撹拌
してラクターゼを放出せしめる。次に、抽出した細胞を
ラクターゼに富む緩衝液中から濾過して除き、約６ ｍ
９７ ｍｌタンパク質と６５単位／ゴのラクターゼ活性
を有する酵素溶液を最終的に得る。収率は培養して得た
細胞の分子内ラクターゼ含有量に、もとすき４５％であ
る。
細胞ペース） ’Ｌ ６．８グラムのエタノールで処理
する。９０分抜工タノールを濾過して除き、細胞を帆Ｉ
Ｍリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ６，６、中に再び懸濁せ
しめる。この緩衝液中の細胞濃度は４０グ／ｌに調節す
る。エタノール処理潮胞を抽出緩衝液中で１５分間撹拌
してラクターゼを放出せしめる。次に、抽出した細胞を
ラクターゼに富む緩衝液中から濾過して除き、約６ ｍ
９７ ｍｌタンパク質と６５単位／ゴのラクターゼ活性
を有する酵素溶液を最終的に得る。収率は培養して得た
細胞の分子内ラクターゼ含有量に、もとすき４５％であ
る。
参考例２゜
参考例１で用いたエタノールによる細胞処理の代りに、
他のアルコール類又はケトン類を用い、実施例１で得た
他の細胞群で、参考例１の方法をくり返し次の結果を得
た。
他のアルコール類又はケトン類を用い、実施例１で得た
他の細胞群で、参考例１の方法をくり返し次の結果を得
た。
メタノール ４５ ６６
イソプロパノール ８７ ５２
ブタノール １１・５
ｔ−ブタノール ４５ ６６
アセトン １０ １３
メチルエチルケトン １０ １３
メチルイソブチルケトン ７．５ １０参考例ａ
参考例１で述べた方法に従い、細胞をエタノールで処理
し０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液で抽出する事による
ラクターゼ放出を菌株クルイベロマ血支７ フラギリス
（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｆｒａｇｉ−−リ］）
を用いて行う。２リツトルフラスコ中、参考例１の接種
培地１リツトル中で３０℃、２４時間培養し、細胞を濾
過して取る。細胞１．５グラムを参考例１の方法に従い
エタノール処理し、次に０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液
で抽出して放出せしめたラクターゼの量は次のとおりで
ある。
し０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液で抽出する事による
ラクターゼ放出を菌株クルイベロマ血支７ フラギリス
（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｆｒａｇｉ−−リ］）
を用いて行う。２リツトルフラスコ中、参考例１の接種
培地１リツトル中で３０℃、２４時間培養し、細胞を濾
過して取る。細胞１．５グラムを参考例１の方法に従い
エタノール処理し、次に０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液
で抽出して放出せしめたラクターゼの量は次のとおりで
ある。
Ｋ、フラギリ、ｘ、（ｆｒａｇｉｌｉｓ）ＡＴＣＣ８６
０８５，ＯＫ、フラギリスＣｆｒａｇｉｌｉｓ）ＡＴＣ
Ｃ８５８２１−５に、フラギリス（ｆγαｇｉｌｉｓ）
ＡＴＣＣ１００２２” １．５に、フラギリス（ｆγα
ｇｉｌｉｓ ）ＡＴＣＣ１２４２４２，０実施例１ ３０００単位／ゴのラクターゼ、０．２４プロテア一ゼ
単位／ｍｌ及び硫酸マンガンとして加えた１０−３Ｍマ
ンガンイオンを含む８リツトルの１：１グリセロール：
０．ＬＡ／リン酸カジカリウム溶液０℃で６時間加熱す
る。加熱中に不活性化したタンパク質の白色沈澱が出来
、これヲ濾過して除く。溶液中に残存するプロテアーゼ
活性は０．０３単位／ ｍｌであり初期のプロテアーゼ
活性の９０％が除去された事欠示す。これに比べ、溶液
中のラクターゼ活性は、２，７６０単位／’＞ｎｌであ
り、初期のラクターゼ活性の９０％以上が保持されてい
る事を表わしている。
０８５，ＯＫ、フラギリスＣｆｒａｇｉｌｉｓ）ＡＴＣ
Ｃ８５８２１−５に、フラギリス（ｆγαｇｉｌｉｓ）
ＡＴＣＣ１００２２” １．５に、フラギリス（ｆγα
ｇｉｌｉｓ ）ＡＴＣＣ１２４２４２，０実施例１ ３０００単位／ゴのラクターゼ、０．２４プロテア一ゼ
単位／ｍｌ及び硫酸マンガンとして加えた１０−３Ｍマ
ンガンイオンを含む８リツトルの１：１グリセロール：
０．ＬＡ／リン酸カジカリウム溶液０℃で６時間加熱す
る。加熱中に不活性化したタンパク質の白色沈澱が出来
、これヲ濾過して除く。溶液中に残存するプロテアーゼ
活性は０．０３単位／ ｍｌであり初期のプロテアーゼ
活性の９０％が除去された事欠示す。これに比べ、溶液
中のラクターゼ活性は、２，７６０単位／’＞ｎｌであ
り、初期のラクターゼ活性の９０％以上が保持されてい
る事を表わしている。
実施例１の方法を用い温度を５０℃の代りに３７℃で行
う。９日間加熱後、初期のプロテアーゼ活性の９０％が
除去され、初期のラクターゼ活性の９５％（２，８５０
単位／ ７Ｊ ）が保持される。
う。９日間加熱後、初期のプロテアーゼ活性の９０％が
除去され、初期のラクターゼ活性の９５％（２，８５０
単位／ ７Ｊ ）が保持される。
特許出願人 ファイザー・インコーホレーテッド（外２
名）
名）
Claims (3)
- （１）グロテアーゼ含有うクターゼ調裳物及びクリセロ
ール約３０〜９０重量パーセント（溶液の全重量に基づ
く）を含有する水浴液を約り５℃〜約６０℃で７）ＩＩ
約５．５〜８にてグロテアーゼ活性が充分に低下するま
で加熱することを特徴とするグロテアーゼ含有ラクター
ゼ調製物中からグロテアーゼ活性を選択的に低下せしめ
る方法。 - （２）温度が約４５〜約５５℃であり上記溶液中のグリ
セロール濃度が約４０−６０重量パーセントで、７）Ｉ
−１が約６．４〜７．０である特許請求の範囲第（１）
項の方法。 - （３）上記溶液がマンガンイオンｖｉｏ−’〜１０−２
モルの濃度で含有する特許請求の範囲第（１）項の方法
。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP20070383A JPS6019994B2 (ja) | 1983-10-26 | 1983-10-26 | ラクターゼ調整物の精製方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP20070383A JPS6019994B2 (ja) | 1983-10-26 | 1983-10-26 | ラクターゼ調整物の精製方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS602186A true JPS602186A (ja) | 1985-01-08 |
| JPS6019994B2 JPS6019994B2 (ja) | 1985-05-18 |
Family
ID=16428825
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP20070383A Expired JPS6019994B2 (ja) | 1983-10-26 | 1983-10-26 | ラクターゼ調整物の精製方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6019994B2 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS60224288A (ja) * | 1984-04-20 | 1985-11-08 | Fujitsu Ltd | 半導体発光装置の製造方法 |
| KR200487818Y1 (ko) | 2018-01-10 | 2018-11-08 | 주식회사 대신자동화 | 체인 |
-
1983
- 1983-10-26 JP JP20070383A patent/JPS6019994B2/ja not_active Expired
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS60224288A (ja) * | 1984-04-20 | 1985-11-08 | Fujitsu Ltd | 半導体発光装置の製造方法 |
| KR200487818Y1 (ko) | 2018-01-10 | 2018-11-08 | 주식회사 대신자동화 | 체인 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS6019994B2 (ja) | 1985-05-18 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US4218481A (en) | Yeast autolysis process | |
| US4144129A (en) | Cholesteroloxidase and method for its production from microorganisms | |
| US3810820A (en) | Urate oxidase and process for the production thereof | |
| EP0036737B1 (en) | Lactase preparation | |
| US4725540A (en) | Process for the preparation of amine-oxidase containing material, so produced amine-oxidase containing material | |
| US4064010A (en) | Purification of uricase | |
| JP2508001B2 (ja) | 耐塩性カタラ−ゼおよび過酸化水素の分解法 | |
| JPS602186A (ja) | ラクターゼ調整物の精製方法 | |
| US4062731A (en) | Production of uricase from micrococcus luteus | |
| Marranzini et al. | Effect of threonine and glycine concentrations on threonine aldolase activity of yogurt microorganisms during growth in a modified milk prepared by ultrafiltration | |
| US4737461A (en) | Novel bacteriolytic enzyme and process for preparing the same | |
| CA2089193C (en) | Diacetyl production | |
| US3661594A (en) | Production of bacterial rennet for making cheese | |
| US20020110880A1 (en) | Method of manufacturing polyamine composition | |
| US3592739A (en) | Purification of lactase | |
| JPS6279777A (ja) | ス−パ−オキシドデイスムタ−ゼの製造方法 | |
| RU2819908C1 (ru) | Ферментативный способ получения лактулозосодержащего продукта-постбиотика | |
| JPS6018394B2 (ja) | 微生物によるラクタ−ゼの製造法 | |
| US3558432A (en) | Waxolytic enzyme preparation | |
| JP2002159290A (ja) | 新規リパーゼおよびその製造方法 | |
| SU1082812A1 (ru) | Способ получени @ - @ -галактозидазы | |
| JP3871371B2 (ja) | ３’ガラクトオリゴ糖含有糖組成物の製造方法 | |
| JPS58198291A (ja) | β−ガラクトシダ−ゼおよびその製造法 | |
| JPS6152253A (ja) | 食品中のビフイズス菌の安定化方法 | |
| JPS63216475A (ja) | 乳酸桿菌属細菌の自己溶解活性誘導法 |