DK147889B - Fremgangsmaade til dyrkning af virus - Google Patents

Description

147889

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til dyrkning af virus i en fermenteringsbeholder, der i et sædvanligt, egnet næringsmedium indeholder en suspension af celler.

Fremgangsmåden er især anvendelig til industriel dyrkning af rabiesvirus med det formål at fremstille virussuspensioner, der kan anvendes til fremstilling af vacciner.

Den nuværende dyrkning af rabiesvirus foregår sædvanligvis ved dyrkning på monocellulære lag i kolber. Denne kendte metode har den ulempe, at det til en produktion med et kvantitativt væsentligt omfang er nødvendigt at anvende et stort antal kolber, hvilket medfører et stort antal manipulationer og en høj fremstillingspris.

I andre tilfælde, hvor der dyrkes virus, der er forskellige fra rabiesvirus, foregår dyrkningen ligeledes på celler i monocellu- 2 147889 lære lag med de samme ulemper.

Det er allerede forsøgt at undgå denne afhængighed ved at gennemføre en dyrkning af rabiesvirus på celler, der er anbragt i en fermenteringsbeholder, dvs. en stor beholder, der i et egnet, flydende næringsmedium indeholder en suspension af de nævnte celler. Det har imidlertid vist sig, at cellerne opfører sig dårligt under disse betingelser, og at det ikke er muligt at opnå en industriel produktion af virus.

Ifølge den foreliggende opfindelse undgås disse ulemper, og der tilvejebringes en fremgangsmåde til dyrkning af virus, der tillader industriel dyrkning i fermenteringsbeholdere, selv i de tilfælde, hvor der anvendes celler, der normalt opfører sig uhensigtsmæssigt i en fermenteringsbeholder. Opfindelsen har ligeledes det formål at tilvejebringe en betydelig nedsættelse af fremstillingsprisen som følge af de industrielle dyrkningsbetingelser, der på denne måde kan realiseres.

Opfindelsen angår en fremgangsmåde af den i indledningen nævnte art til dyrkning af virus, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at dyrkningsmediet desuden indeholder collagenfibre, der har en høj renhedsgrad og er i stand til at danne en suspension, som underlag for cellerne.

Ved kollagenfibre skal der her forstås kollagenfibre med høj renhedsgrad, der har en form, der tillader spredning af fibrene og fremstilling af en suspension. En fremgangsmåde til fremstilling af sådanne fibre ud fra animalsk bindevæv og især hud er f.eks. beskrevet i fransk patentskrift nr. 1.568.829.

Sædvanligvis foretrækkes kollagenfibre, der er udvundet af huder af ungkvæg og derefter er renset og dehydratiseret, idet disse fibre naturligvis steriliseres, f.eks. med tør varme.

Mængden af fibre i fermenteringsbeholderen er mellem 1 og 20 g/liter, fortrinsvis mellem 2 og 8 g/liter.

Dyrkningen gennemføres fortrinsvis under omrøring og ved en temperatur på indtil 40°C. Ved dyrkningens slutning er det tilstrækkeligt at afbryde omrøringen for at udskille fibrene, idet de afsætter sig på fermenteringsbeholderens bund.

Fortrinsvis, især ved fremstilling af rabiesvirus, gennemføres der en første dyrkning i f.eks. 2-6 døgn, hvorefter den ovenstående væske fjernes og bortkastes, og derefter gennemføres der med et nyt næringsmedium endnu en dyrkning, hvorefter den ovenstående væske opsamles.

Denne opsamlede, ovenstående væske filtreres derpå, eventuelt efter lyse af cellerne, og underkastes derefter sædvanlige behandlinger 3 147889 med henblik på den senere anvendelse, f.eks. som vaccine.

Cellerne, der anvendes til dyrkningen af virus, er fortrinsvis de celler, der sædvanligvis anvendes i monolag i kolber. Disse celler kan fordelagtigt fremstilles i form af en suspension ud fra de nævnte lag ved indvirkning af e.t proteolytisk enzym, såsom trypsin eller pronase, eller ud fra cellekulturer, der er opformeret i en fermenteringsbeholder med eller uden kollagenfibre.

Celler, der er særlig egnede til fremgangsmåden ifølge opfindelsen, er celler, såsom NIL2 eller IFFA3, der stammer fra hamsterfostre, PK15, der stammer fra pattegris-nyre, og WI38 og MRC5, der stammer fra menneskefosterlunge.

Fortrinsvis indstilles koncentrationen af celler i fermenteringsbeholderen til mellem ca. 50.000 og ca. 500.000 celler/ml.

Blandt de virusstammer, der fordelagtigt kan dyrkes ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, kan der nævnes rabiesvirus og især de umodificerede stammer af typen Pasteur, CVS og Pitman Moore eller de modificerede stammer af typen Flury HEP, Flury LEP eller SAD.

Andre virusarter kan også dyrkes ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen,eventuelt efter at være blevet tilpasset den anvendte celletype, der dyrkes i stationært lag eller på kollagenfibre, der holdes i suspension.

Det flydende næringsmedium består af et sædvanligt anvendt medium til dyrkning af virus og- behøver derfor ikke at defineres nærmere. Der er tale om en saltopløsning, der indeholder aminosyrer, vitaminer, kulhydrater, peptoner og eventuelt serum, f.eks. fra kalve eller føl, såsom et Eagle-medium (beskrevet af H. Eagle, Arch, of Biochem. Biophys. 61, side 356-366 (1959)) eller et Stoker-medium (beskrevet af H. Stoker og Mac Pherson, Virology 14, side 359-370 (1961)).

Dyrkningen gennemføres på i og for sig kendt måde, fortrinsvis under opretholdelse af en pH-værdi mellem 6 og 8, under beluftning og eventuelt under tilførsel af en tilstrækkelig mængde carbondioxidgas .

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen illustreres ved de følgende eksempler.

Eksempel 1

Ud fra NIL2-cellelag, der er tilvejebragt i glaskolber, fremstilles en cellesuspension ved indvirkning af trypsin. Efter suspenderingen kan cellerne fraskilles, og der tilvejebringes en sådan mængde, at slutkoncentrationen i fermenteringsbeholderen er 150.000-300.000 celler/ml.

4 147889

Endvidere steriliseres en tilstrækkelig mængde kollagenfibre til, at der fås en fibermængde på 2-8 g pr. liter anvendelsesklar suspension. Denne mængde bringes i suspension i en aliquot af næringsmediet. I fermenteringsbeholderen indføres sterilt og i vilkårlig rækkefølge næringsmediet, cellesuspensionen, suspensionen af kollagen og podesuspensionen af rabiesvirus (stamme Pitmann Moore) i nødvendig og tils trækkelig mængde til opnåelse af det ønskede volumen under hensyntagen til fermenteringsbeholderens kapacitet.

Derefter underkastes mediet en omrøring og overfladebeluft-ning med sterilfiltreret luft, og inkuberingen gennemføres ved f.eks. en temperatur på 37°C.

Celleformeringen kontrolleres ved daglig tælling.

Efter 2-6 døgn standses omrøringen, og kollagenfibrene afsætter sig på fermenteringsbeholderens bund. Derefter fjernes den ovenstående væske og bortkastes.

Der tilsættes derefter nyt næringsmedium, der indføres sterilt i fermenteringsbeholderen, og omrøringen og beluftningen startes igen. Når den opnåede viruskoncentration er tilstrækkelig, standses omrøringen og beluftningen på ny, og den ovenstående væske opsamles under de ovenfor beskrevne betingelser.

Den opsamlede ovenstående væske filtreres eller centrifugeres til fjernelse af cellemateriale og eventuelt tilstedeværende fibermateriale. Den herved fremkomne virussuspension inaktiveres derefter ved f.eks.. indvirkning af β-propiolacton i et tilstrækkeligt tidsrum, og præparatet kan enten lyofiliseres eller fordeles i beholdere i ren eller blandet, flydende form med et hjælpestof eller andre vacciner.

Der fås på denne måde en egnet rabiesvaccine.

Eksempel 2

Der fremstilles en suspension af IFFA 3-celler ved indvirkning af trypsin, og til denne suspension sættes sterilt kollagen og virus af Pasteur-typen.

Næringsmediet er et Stoker-medium.

Dyrkningen gennemføres under omrøring ved 20-100 omdr./min. og overfladebeluftning som ovenfor beskrevet. Når den nødvendige cellekoncentration er opnået, standses omrøringen og beluftningen, og efter at fibrene har afsat sig på bunden, bortkastes den ovenstående væske.

Det nye næringsmedium uden serum sættes derefter sterilt til fermenteringsbeholderen, og omrøringen og beluftningen startes igen.

Når koncentrationen af virus er tilfredsstillende, standses omrøringen og beluftningen på ny, og virussuspensionen fraskilles.

5 147889

Denne suspension sterilfiltreres og inaktiveres ved f.eks. indvirkning af β-propiolacton. Efter kontrol kan præparatet blandes i bestemte andele med en steril suspension af aluminiumoxidgel og fordeles i beholdere til enkeltdoser eller flere doser.

Eksempel 3

Der fremstilles en suspension af WI 38-celler ved indvirkning af trypsin. Endvidere steriliseres en bestemt vægtmængde kollagen-fibre, og der fremstilles et tilstrækkeligt volumen af podevirus af den modificerede stamme HEP.

Hver bestanddel sættes sterilt til fermenteringsbeholderen, og der tilsættes Stoker-næringsmedium til det ønskede slutvolumen. Koncentrationen af fibre er da 2 til 8 g/liter, og koncentrationen af celler er af størrelsesordenen 100.000-200.000 celler/ml.

Der omrøres med 20-100 omdr./min. og gennemføres en overflade-beluftning med sterilfiltreret luft.

Når cellerne har formeret sig tilstrækkeligt, standses omrøringen og beluftningen, hvorved kollagenfibrene afsætter sig på bunden, og den ovenstående væske bortkastes. Nyt næringsmedium uden serum sættes sterilt til fermenteringsbeholderen, og omrøringen og beluftningen startes igen. Når koncentrationen af virus er tilfredsstillende, standses omrøringen og beluftningen, og virussuspensionen fraskilles efter bundfældning af fibrene.

Denne suspension sterilfiltreres og fordeles derefter i kolber på f.eks. 10 liter. Efter' kontrol kan præparatet blandes med et substrat på basis af lactose og fordeles i beholdere til enkeltdoser, derefter underkastes en lyofilisering.

Eksempel 4

Der fremstilles en suspension af NIL2-celler ved indvirkning af trypsin på et fastsiddende lag af disse celler. Denne suspension tilvejebringes i et Stoker-medium, således at slutkoncentrationen af celler er mellem 50.000 og 200.000 celler/ml.

Til denne suspension sættes en tilstrækkelig mængde fibre af sterilt kollagen til, at der fås en vægtmængde på 2-8 g fibre pr. liter af den anvendelsesklare suspension.

Inkuberingen startes med omrøringen indstilles til mellem 20 og 100 o/m, og der udføres en overfladebeluftning med luft filtreret gennem en sterilfiltrerende membran.

c 147889

Celleformeringen kontrolleres ved daglig udtagning af prøver. Når formeringen er tilfredsstillende, standses beluftningen og omrøringen.

Fibrene af kollagen afsætter sig på fermenteringsbeholderens bund, den ovenstående væske bortkastes, og nyt sterilt medium, der er podet med en passende mængde reovirus type 1, indføres i fermenteringsbeholderen. Omrøringen og beluftningen startes igen på samme måde som ovenfor.

Når formeringen af virus bedømmes som tilfredsstillende, standses beluftningen og omrøringen, og den ovenstående virussuspension opsamles efter fradekantering af fibrene.

Denne suspension filtreres gennem en sterilfiltrerende membran og inaktiveres derpå ved indvirkning af beta-propiolacton.

Efter kontrol kan denne inaktiverede virussuspension indgå i en vaccine anvendt til forebyggelse af visse åndedrætssygdomme hos ungkvæg.

Eksempel 5

Der fremstilles en suspension af BHK21-celler ved indvirkning af trypsin på et fastsiddende lag af disse celler. Denne suspension tilvejebringes i et Stoker-medium, således at der fås en cellekoncentration på ca. 150.000 celler/ml.

Til denne suspension sættes en tilstrækkelig mængde sterile kollagenfibre til, at der fås en vægtmængde på 2-8 g fibre pr. liter cellesuspension.

Suspensionen sættes til en fermenteringsbeholder, og inkube-ringen startes. Omrøringen indstilles til mellem 20 og 100 o/m, og der udføres en overfladebeluftning med luft filtreret gennem en sterilfiltrerende membran.

Formeringen af cellerne kontrolleres ved daglig udtagning af prøver. Når formeringen er tilfredsstillende, standses beluftningen og omrøringen.

Kollagenfibrene afsætter sig på fermenteringsbeholderens bund, den ovenstående væske bortkastes, og nyt medium podet med mund- og klovsygevirus sættes til fermenteringsbeholderen. Inkube-ringen gennemføres som ovenfor beskrevet.

7 147839 Når formeringen af det antigene virus er tilfredsstillende, standses inkuberingen. Kollagenfibrene afsætter sig på bunden, og den ovenstående virussuspension opsamles.

Efter filtrering inaktiveres denne suspension ved indvirkning af formol eller glycidaldehyd og kan efter kontrol indgå i en vaccine anvendt til forebyggelse af mund- og klovsyge hos drøvtyggere og svin.

Eksempel 6.

Der fremstilles en suspension af PKl5-celler ved indvirkning af trypsin på et fastsiddende lag. Denne suspension tilvejebringes i et Eagle-medium indeholdende en opløsning af lactal-buminhydrolysat, således at der fås 50.000-300.000 celler/ml.

Til denne suspension sættes en tilstrækkelig mængde sterile kollagenfibre til, at der fås en vægtmængde på 2-8 g fibre pr. liter cellesuspension.

Denne suspension podes med en modificeret stamme af det virus, der fremkalder den klassiske svinepest, og indføres i en fermenteringsbeholder. Inkuberingen gennemføres som beskrevet i de foregående eksempler.

Celleformeringen kontrolleres dagligt. Når den er tilfredsstillende, standses omrøringen og beluftningen. Kollagenfibrene afsætter sig på bunden, og den ovenstående væske bortkastes.

Nyt medium, fremstillet ud fra Parker 199-medium, indføres under de ovenfor anførte betingelser.

Når formeringen af det antigene virus bedømmes som tilfredsstillende, standses imkuberingen. Fibrene afsætter sig på bunden, og den ovenstående virussuspension opsamles, fordeles i beholdere og opbevares i fryseskab. Efter kontrol filtreres denne suspension og kan indgå i en vaccine med modificeret levende virus, der foreligger i lyofiliseret form.