CN107494520A - 一种犬用精液冷冻稀释剂及冷冻方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种犬用精液冷冻稀释剂及冷冻方法，属于精液冷冻技术领域。该犬用精液冷冻稀释剂组成成分为：Tris 0.1~1.2g,葡萄糖0.1~2.9g，柠檬酸0.1~1.36g,卵黄0~20mL，LDL 1~8g，PCS 0~0.1g，N,N‑二甲基酰胺0~1.0g，前列腺素0~0.1mg，VE 0.1~1.5g，复合VB 0.1~1.5g，甘油0~6mL，青霉素0~0.05g，链霉素0~0.025g，加双蒸水至100mL。本发明可以使得精子的前向性、直线速率、鞭打频率等指标显著提高，犬精液的精子活率、精子膜完整性和精子DNA完整性也得到提升。

Description

一种犬用精液冷冻稀释剂及冷冻方法

技术领域

本发明属于精液冷冻技术领域，尤其涉及一种犬用精液冷冻稀释剂及冷冻方法。

背景技术

我国犬种资源丰富，品种繁多，其中北京犬、西施犬、沙皮犬、藏獒等品种列为世界名犬，还有通过各种途径从国外引进的优良品种如贵宾犬、博美犬等。珍惜这些犬种资源对我国犬业健康发展至关重要。但近年来在经济利益的驱使下，许多名贵犬种被大量无序繁殖，但都“重量不重质”，小群体近亲繁育等现象导致这些犬品种混杂，良莠不齐，优良纯种个体严重缺乏，严重影响了犬的性能，繁殖力降低，群体性能差异大。 利用人工授精技术结合开放式核心群育种以及现代分子育种技术等方法可以做好这些优良犬种的血统保纯工作，促进我国犬业的健康持续发展。

牛羊猪等家畜的人工授精技术早已普及应用，而犬的冷冻精液技术在国内仍然处于研究阶段，犬的冷冻精液稀释剂、冷冻技术不成熟导致犬的冻精解冻后精子活力低、授精后受孕率低，例如常规的冷冻稀释剂常常加入的卵黄、甘油成分，会抑制精子呼吸，降低精子活率。远远落后于国外的人工授精技术。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术中存在的缺点与不足，提供一种犬用精液冷冻稀释剂及冷冻方法。

本发明所采用的技术方案是：

一种犬用精液冷冻稀释剂，其组成成分为：Tris 0.1~1.2 g, 葡萄糖 0.1~2.9 g，柠檬酸 0.1~1.36 g, 卵黄0-20 mL，LDL 1~8 g，PCS 0~0.1 g，N, N-二甲基酰胺0~1.0 g，前列腺素0~0.1 mg，VE 0.1~1.5 g，复合VB 0.1~1.5 g，甘油0~6 mL，青霉素0~0.05 g，链霉素 0~0.025 g，加双蒸水至100mL。

根据上述冷冻稀释剂进行精液冷冻的方法，步骤如下：

(a)采用手握按摩法采取雄犬的精液，采集后迅速检测精液品质，精液冷冻前精液活率大于90%，密度大于1.0*108个/mL，畸形率小于5%，精子膜完整性大于85%，精子DNA完整性大于90%；

(b)先将不含有甘油的冷冻稀释剂按1:1比例稀释精液，采用水浴降温的方法由室温经过2h缓慢降温到4℃，加入甘油，平衡2h ，然后分装到0.25ml细管，将细管放入-70℃ 冰箱冻存15min，再将细管铺平在距离液氮面2cm处熏蒸6min，放入液氮罐中保存。

(c)精液冷冻一周后将细管投入40℃的温水中10秒后取出，检测精液品质。

优选的，所述的一种犬用精液冷冻稀释剂，其组成成分为：Tris 1.2 g，葡萄糖2.9 g，柠檬酸 1.36 g，卵黄 0 mL，LDL 8 g，PCS 0.1 g，N, N-二甲基酰胺 1 g，前列腺素0.1 mg，VE 1.5 g，复合VB 1.5 g，甘油5 mL ，青霉素 0.05 g，链霉素 0.025 g，加双蒸水至100 mL。

上述所述的TRIS(Solarbio)为细管冻精封口粉，采购于日本东京，PCS为胆固醇硫酸脂钾盐，采购于扬州科能，前列腺素采购于扬州科能生物有限公司），VE采购于扬州科能生物有限公司， LDL为低密度脂蛋白，依据 Mo ussa 等所介绍的方法自制备用。

所述的LDL中含有的磷脂可以在精子膜表面形成一层保护膜，替代精子膜上的一些磷脂，降低精子膜相位转变温度，起到保护精子的作用 。

所述的PCS 能防止精子中的胆固醇外流，起到膜稳定作用，使精子质膜能够进一步抵御冷冻低温的打击，同时也能使精子细胞抵抗精子在冷冻过程中出现冰晶化的状态，从而提高精子在冷冻过程的质量。

所述的VE能通过抑制自由基的形成，阻止诱发的膜脂质发生过氧化，降低精子畸形率和提高完整率；防止精子冷休克，提高冷冻精液解冻后的精子活力及受胎率

所述的复合VB、前列腺素可以提高冷冻精子的受胎率。

所述的N, N-二甲基酰胺作为抗冻保护剂对精子的损害比较小，可以提高精子冷冻后的存活率。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：本发明的一种犬用精液冷冻稀释剂，在降低甘油含量的基础上，添加LDL和PCS、N, N-二甲基酰胺(DMA)，增加VE、复合VB及前列腺素等成分，使得精子的前向性、直线速率、鞭打频率等指标显著提高，犬精液的精子活率、精子膜完整性和精子DNA完整性也得到提升。

附图说明

图1 不同犬用精液冷冻稀释剂对精液品质的影响；

图2 不同犬用精液冷冻稀释剂对精子运动参数的影响。

具体实施方式

实施例1

一种犬用精液冷冻稀释剂，其组成成分为：Tris 1.2 g, 葡萄糖 2.9 g，柠檬酸1.36g, 卵黄20mL，甘油6mL，青霉素 0.05 g，链霉素 0.025 g，加双蒸水至100 mL；

根据上述冷冻稀释剂进行精液冷冻的方法，步骤如下：

(a)采用手握按摩法采取雄犬的精液，采集后迅速检测精液品质，精液冷冻前精液活率大于90%，密度大于1.0*108个/mL，畸形率小于5%，精子膜完整性大于85%，精子DNA完整性大于90%；

(b)先将不含有甘油的冷冻稀释剂按1:1比例稀释精液，采用水浴降温的方法由室温经过2h缓慢降温到4℃，加入甘油，平衡2h ，然后分装到0.25ml细管，将细管放入-70℃ 冰箱冻存15min，再将细管铺平在距离液氮面2cm处熏蒸6min，放入液氮罐中保存。

(c)精液冷冻一周后将细管投入40℃的温水中10秒后取出，检测精液品质。

实施例2

一种犬用精液冷冻稀释剂，其组成成分为：Tris 1.2 g, 葡萄糖 2.9 g，柠檬酸 1.36g, 卵黄20mL ，PCS 0.1 g，N, N-二甲基酰胺1.0 g，前列腺素0.1 mg，VE 1.5 g，复合VB1.5 g，甘油5 mL ，青霉素 0.05 g，链霉素 0.025 g，加双蒸水至100 mL。其余步骤同实施例1。

实施例3

一种犬用精液冷冻稀释剂，其组成成分为：Tris 1.2 g, 葡萄糖 2.9 g，柠檬酸1.36g, 卵黄 0 mL， LDL 8 g，甘油6mL，前列腺素0.1 mg，VE 1.0 g，复合VB 1.5 g，青霉素0.05 g，链霉素 0.025 g，加双蒸水至100 mL；其余步骤同实施例1。

实施例4

一种犬用精液冷冻稀释剂，其组成成分为：Tris 1.2 g, 葡萄糖 2.9 g，柠檬酸 1.36g, 卵黄 0 mL，LDL 8 g，PCS 0.1 g，N, N-二甲基酰胺 1 g，前列腺素0.1 mg，VE 1.5 g，复合VB 1.5 g，甘油5 mL ，青霉素 0.05 g，链霉素 0.025 g，加双蒸水至100 mL。其余步骤同实施例1。

实施例5

一种犬用精液冷冻稀释剂，其组成成分为：Tris 0.1g, 葡萄糖 0.1 g，柠檬酸 0.1 g,卵黄 0 mL，LDL 1 g，PCS 0 g，N, N-二甲基酰胺 0 g，前列腺素0 mg，VE 0.1g，复合VB 0.1g，甘油0 mL ，青霉素 0 g，链霉素 0 g，加双蒸水至100 mL。其余步骤同实施例1。

实施例6

一种犬用精液冷冻稀释剂，其组成成分为：Tris 0.06g, 葡萄糖1.5g，柠檬酸 0.68 g,卵黄 10 mL，LDL 4g，PCS 0.05 g，N, N-二甲基酰胺 0.5 g，前列腺素0.05 mg，VE 0.8g，复合VB 0.7 g，甘油2mL ，青霉素 0 .025g，链霉素 0 .0125g，加双蒸水至100 mL。其余步骤同实施例1。

精液品质检测

1 材料与方法

1.1 实验动物与处理

在江苏农牧学院犬舍选择5只健康玩具贵宾犬公犬，年龄2~4岁，饲喂某品牌全价犬粮，自由饮水，散养，用手握按摩法采精雄犬精液，采精频率控制在每周一次。

1.2 试验方法

采用全自动精子分析仪检测精子活率、密度、精子畸形率及精子运动参数（前向性、直线性、曲线速率、直线速度、侧摆幅度、鞭打频率、摆动性、路径速度、移动角度等），精子活体检测试剂盒（低渗膨胀法）的方法检测精子膜的完整性，精子形态学快速染色液检测精子畸形率，精子DNA染色试剂盒检测精子DNA的完整性及受精能力。

1.3 结果

图1结果显示实施例2、实施例3、实施例4冷冻后犬精液的精子活率、精子膜完整性和精子DNA完整性都显著高于实施例1组（实施例1是对照组），精子畸形率低于实施例1组，其中实施例4的冷冻效果最好。图2是不同犬用精液冷冻稀释剂对精子运动参数的观察结果，显示实施例4的冷冻效果最好，精子前向性、直线速率、鞭打频率等指标均显著高于其他组别，说明在降低甘油含量的基础上，添加LDL和PCS、N, N-二甲基酰胺，增加VE、复合VB及前列腺素等成分，可以显著提高冷冻精液的冷冻效果。

犬用精液冷冻稀释剂及冷冻方法的应用

1 材料与方法

1.1 实验动物与处理

在江苏省宠物（藏獒）繁育中心选择体质健康，年龄为2～4岁，体重相近的贵宾犬母犬3只，饲养和管理方法一致，于2017年3～5月份采用试情法、阴道黏液涂片法等对3只母犬进行发情鉴定，在最佳配种时间点给母犬进行冷冻精液输精。

1.2 实验材料

棉签、生理盐水、载玻片、盖玻片、光学显微镜、瑞士染液、输精枪，移液枪等。

1.3 实验方法

采取健康玩具贵宾犬雄犬的精液，采用前述实施例4的冷冻稀释剂分两次法稀释精液，并采用前述冷冻步骤对精液进行冷冻，精液解冻后检查精液品质，给发情母犬进行子宫内输精。

2.结果

母犬输精后进行B超检查，3只母犬全部妊娠，后来三只母犬分别产下3只、3只和5只健康的仔犬。结果表明，采用本发明实施例4的冷冻稀释剂和方法对精液进行冷冻后，精液品质好，可以成功的使发情母犬受孕，受孕率达到100%。

Claims (4)

1.一种犬用精液冷冻稀释剂，其特征在于，其组成成分为：Tris 0.1~1.2 g, 葡萄糖0.1~2.9 g，柠檬酸 0.1~1.36 g, 卵黄0~20 mL，LDL 1~8 g，PCS 0~0.1 g，N, N-二甲基酰胺0~1.0 g，前列腺素0~0.1 mg，VE 0.1~1.5 g，复合VB 0.1~1.5 g，甘油0~6mL，青霉素0~0.05 g，链霉素 0~0.025 g，加双蒸水至100mL。

2.根据权利要求1所述的一种犬用精液冷冻稀释剂，其特征在于，其组成成分为：Tris1.2 g，葡萄糖 2.9 g，柠檬酸 1.36 g，卵黄 0 mL，LDL 8 g，PCS 0.1 g，N, N-二甲基酰胺1 g，前列腺素0.1 mg，VE 1.5 g，复合VB 1.5 g，甘油5 mL ，青霉素 0.05 g，链霉素 0.025g，加双蒸水至100 mL。

3.根据权利要求1或2所述的一种犬用精液冷冻稀释剂，其特征在于，pH为6.5。

4.利用权利要求1所述的一种犬用精液冷冻稀释剂进行精液冷冻的方法，步骤如下：

(a)采用手握按摩法采取雄犬的精液，采集后迅速检测精液品质，精液冷冻前精液活率大于90%，密度大于1.0*108个/mL，畸形率小于5%，精子膜完整性大于85%，精子DNA完整性大于90%；

(b)先将不含有甘油的冷冻稀释剂按1:1比例稀释精液，采用水浴降温的方法由室温经过2h缓慢降温到4℃，加入甘油，平衡2h ，然后分装到0.25ml细管，将细管放入-70℃ 冰箱冻存15min，再将细管铺平在距离液氮面2cm处熏蒸6min，放入液氮罐中保存；

(c)精液冷冻一周后将细管投入40℃的温水中10秒后取出，检测精液品质。