CN109735487A - 一种无透明带细胞的束缚方法 - Google Patents

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陈子江
李�城
吴克良
马金龙
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Abstract

本发明属于医疗领域，提供一种给无透明带细胞重造透明带束缚作用的方法，其要点包括：备用透明带的固定、备用透明带的开缝、备用透明带的牵拉开口、备用透明带内容物的吸出、无透明带卵子或受精卵的推入、透明带复原。本发明提供的透明带束缚方法，能够为无透明带细胞、如卵子或受精卵重造透明带束缚作用，从而增加了其后续的发育能力，有利于继续进行下一步的融合及囊胚发育，使得卵细胞能够得到更大程度的利用。

Description

一种无透明带细胞的束缚方法
技术领域
本发明属于医疗领域，涉及细胞的束缚。
背景技术
因雌性本身的ZP1(透明带蛋白1)基因突变，会导致其卵子外周没有透明带包裹，俗称“裸卵”，此类卵子因缺乏透明带的保护作用，通常无法正常受精，常被归为异常卵子而放弃。通过单精子胞浆注射技术，可使其与其它正常卵子一样获得正常受精的机会和能力。当其正常受精后，可以后续的正常分裂；随着分裂次数的增加，受精卵的卵裂球数目在不断增加，但由于其外周没有透明带的包裹，缺失了透明带的保护及束缚作用，当受精卵分裂到Day 2以后(或6-8细胞以后)，各卵裂球会四散开来，无法继续进行下一步的融合及囊胚发育，以致无法获得良好结局。
发明内容
针对上述现有技术的不足，为了使这类卵子或受精卵有更好的利用及发育，本发明提供一种给无透明带细胞重造透明带束缚作用的方法，其要点包括：备用透明带的固定、备用透明带的开缝、备用透明带的牵拉开口、备用透明带内容物的吸出、无透明带卵子或受精卵的推入、透明带复原；具体步骤如下：
(1)备用透明带的固定：取含有透明带的备用卵子或受精卵，作为备用透明带供体，用两根固定针将备用透明带固定住，固定位置位于所述卵子或受精卵的下半部分；
(2)备用透明带的开缝：使用激光或显微切割针在备用透明带上自下而上地开缝；优选地，所述缝的长度为1/5～1/3直径；更优选地，1/4直径；
(3)备用透明带的牵拉开口：将两根固定针水平向两侧轻轻牵拉，将备用透明带的开缝拉开得更大；
(4)备用透明带供体内容物的吸出：将活检针沿着步骤(3)的开缝穿过，将备用透明带供体的内容物完全吸出，制得空透明带；
(5)无透明带卵子或受精卵的推入：用活检针轻轻吸附住无透明带卵子或受精卵，将其由步骤(3)的开缝推进空透明带中；
(6)透明带复原：将两根固定针松开，让透明带慢慢恢复原来的形态。
本发明中所涉及的所有无透明带细胞、备用卵子或受精卵、无透明带卵子或受精卵均来自兔子、小鼠或大鼠。
本发明中涉及的无透明带细胞、备用卵子、备用受精卵均来自同一个体，备用卵子、备用受精卵均为无实际利用价值的卵子及受精卵。
优选地，步骤(1)、(2)、(4)中的固定针、显微切割针及活检针，为塑料、金属或玻璃材质，优选玻璃材质。
优选地，步骤(1)、(2)、(4)中的固定针、显微切割针及活检针，其前段与整体存在一定的角度，角度范围为0-90°，优选35°。
优选地，步骤(1)、(2)、(4)中的固定针、显微切割针及活检针的针尖部分可为平口或锐口，固定针及活检针优选平口，内部中空，可配合显微注射器做抽吸、吹打操作，显微切割针优选锐口。
优选地，所述的步骤(1)固定位置位于备用卵子或受精卵的下半部分，更优选地，位于备用卵子或受精卵赤道面与最低端中间的位置，优选位于备用卵子或受精卵纵向直径的由下往上1/4处。
优选地，所述的步骤(2)中的激光，可为各类波长及颜色的激光，优选1480nm的红外激光。
优选地，所述的步骤(2)中的开缝位于备用卵子或受精卵纵向直径的自下而上的1/4～1/2处。
优选地，所述的步骤(3)中，开缝的大小与准备往里推入的无透明带卵子或受精卵的尺寸大小近似。优选地，所述开缝的宽度为直径的1/4～3/4，更优选1/2直径。
优选地，所述的步骤(5)中的无透明带卵子或受精卵包括未成熟卵子(GV期、MI期)及成熟卵子(MII期)，受精卵包括原核期受精卵、卵裂期胚胎(2细胞至10细胞胚胎，大于10细胞胚胎)、融合期胚胎、桑葚期胚胎及囊胚期胚胎，优选成熟卵子(MII期)，卵裂期胚胎(4细胞)。
本发明提供的透明带束缚方法，能够为无透明带细胞、如卵子或受精卵重造透明带束缚作用，从而增加了其后续的发育能力，有利于继续进行下一步的融合及囊胚发育，使得卵细胞能够得到更大程度的利用。
附图说明
图1为本发明一种具体实施方式的示意图，表示用两根固定针固定备用卵子或受精卵；其中，1为两根固定针；
图2为本发明一种具体实施方式的示意图，表示在备用卵子或受精卵的透明带上开缝；其中，2为开缝；
图3为本发明一种具体实施方式的示意图，表示将两根固定针沿开缝两侧轻轻牵拉，使开缝变大；其中，3指示宽度拉大的开缝；
图4为本发明一种具体实施方式的示意图，表示将活检针从开缝处伸入，将卵子或受精卵的胞浆吸出，得到备用透明带；其中，4为活检针针尖；
图5为本发明一种具体实施方式的示意图，表示用活检针吸附住无透明带卵子或受精卵，将其由开缝处推进空透明带中；其中，5为卵裂球；
图6为本发明一种具体实施方式的示意图，表示将两根固定针松开，让透明带慢慢恢复原来的形态。
具体实施方式
下面将结合具体实施例和附图说明本发明，但本发明的内容不限于此。
以下实施例中，如果没有特殊说明，所使用的试剂和仪器都是本领域常规试剂和仪器，可以通过商购方式获得；所使用的基础操作都是本领域常规方法，本领域技术人员根据描述的内容可以实现所述操作并得到相应的结果。
以下实施例中使用的兔子、小鼠、大鼠的卵子和受精卵，无论是否有透明带，均来自于本实验室，任何商购的兔子、小鼠、大鼠的卵子或受精卵均可使用。
本申请中的说明书附图为示例性说明，现以实施例1做具体说明，其它实施例亦可参考附图过程。
实施例1：小鼠无透明带卵子(MII期)的透明带束缚方法
1.如图1所示，用两根固定针将备用的小鼠卵子的透明带固定住，固定位置位于备用卵子的下半部分，卵子纵向直径的由下往上1/4处。
2.如图2所示，使用显微切割针在透明带上自下而上开一个1/4直径左右的开缝。
3.如图3所示，将两根固定针水平向两侧轻轻牵拉，将透明带拉开一个比较大的开缝，开缝的宽度为1/2直径。
4.如图4所示，将活检针沿着步骤(3)的开缝穿过，将备用卵子透明带内容物完全吸出，得到空透明带。
5.如图5所示，用活检针轻轻吸附住小鼠无透明带卵子(MII期)，将其由步骤(3)的开缝处推进空透明带中。
6.如图6所示，将两根固定针松开，让透明带慢慢恢复原来的形态。
此次实验共固定小鼠无透明带卵子30枚，经培育和精子受精后，有28枚发育成正常胚胎。
实施例2：小鼠无透明带受精卵(4细胞期)的透明带束缚方法
1.用两根固定针将备用小鼠受精卵的透明带固定住，固定位置位于备用受精卵的下半部分，受精卵纵向直径的由下往上1/3处。
2.使用1480nm红外激光在透明带上自下而上开一个1/3直径左右的缝。
3.将两根固定针水平向两侧轻轻牵拉，将透明带拉开一个比较大的开缝，开缝宽度为1/3直径。
4.将活检针沿着步骤(3)开缝穿过，将备用受精卵的透明带内容物完全吸出，得到空透明带。
5.用活检针轻轻吸附住小鼠无透明带卵子(4细胞期)，将其由步骤(3)的开缝推进空透明带中。
6.将两根固定针松开，让透明带慢慢恢复原来的形态。
本次实验共固定小鼠无透明带受精卵20枚。经后期培育后，20枚受精卵均正常发育成胚胎。
实施例3：大鼠无透明带卵子(MII期)的透明带束缚方法
1.用两根固定针将备用大鼠卵子的透明带固定住，固定位置位于废弃及科研大鼠卵子的下半部分，卵子纵向直径的由下往上1/4处。
2.使用显微切割针在透明带上自下而上开一个1/4直径左右开缝。
3.将两根固定针水平向两侧轻轻牵拉，将透明带拉开一个比较大的开缝，开缝的宽度为1/3直径。
4.将活检针沿着步骤(3)的开缝穿过，将备用大鼠卵子的透明带内容物完全吸出，得到空透明带。
5.用活检针轻轻吸附住大鼠无透明带卵子(MII期)，将其由步骤(3)的开缝推进空透明带中。
6.将两根固定针松开，让透明带慢慢恢复原来的形态。
本次实验共固定大鼠无透明带卵子26枚，经后期受精和培养，有25枚发育成胚胎。
实施例4：大鼠无透明带受精卵(4细胞期)的透明带束缚方法
1.用两根固定针将备用大鼠卵子的透明带固定住，固定位置位于废弃及科研大鼠卵子的下半部分，卵子纵向直径的由下往上1/3处。
2.使用1480nm红外激光在透明带上自下而上开一个1/3直径左右的开缝。
3.将两根固定针水平向两侧轻轻牵拉，将透明带拉开一个比较大的开缝，开缝宽度为1/2直径。
4.将活检针沿着步骤(3)的开缝处穿过，将备用卵子的透明带内容物完全吸出，得到空透明带。
5.用活检针轻轻吸附住大鼠无透明带受精卵(4细胞期)，将其由步骤(3)的开缝推进空透明带中。
6.将两根固定针松开，让透明带慢慢恢复原来的形态。
本次实验共固定大鼠受精卵20枚，经培养，20枚全部发育成胚胎。
实施例5：兔无透明带卵子(MII期)的透明带束缚方法
1.用两根固定针将备用兔卵子的透明带固定住，固定位置位于备用你兔卵子的下半部分，卵子纵向直径的由下往上1/4处。
2.使用显微切割针在透明带上自下而上开一个1/4直径左右的开缝。
3.将两根固定针水平向两侧轻轻牵拉，将透明带拉开一个比较大的开缝，开缝宽度为1/3直径。
4.将活检针沿着步骤(3)的开缝穿过，将备用兔卵子的透明带内容物完全吸出，得到空透明带。
5.用活检针轻轻吸附住兔无透明带卵子(MII期)，将其由步骤(3)的开缝处推进空透明带中。
6.将两根固定针松开，让透明带慢慢恢复原来的形态。
本次实验共固定兔子无透明带卵子共20枚；后期经受精和培育，有19枚发育成胚胎。
实施例6：兔无透明带受精卵(4细胞期)的透明带束缚方法
1.用两根固定针将备用兔受精卵的透明带固定住，固定位置位于备用兔卵子的下半部分，受精卵纵向直径的由下往上1/4处。
2.使用1480nm红外激光在透明带上自下而上开一个1/4直径左右的开缝。
3.将两根固定针水平向两侧轻轻牵拉，将透明带拉开一个比较大的开缝，开缝宽度为1/2直径。
4.将活检针沿着步骤(3)的开缝穿过，将备用兔受精卵的透明带内容物完全吸出，得到空透明带。
5.用活检针轻轻吸附住兔无透明带卵子(4细胞期)，将其由步骤(3)的开缝推进空透明带中。
6.将两根固定针松开，让透明带慢慢恢复原来的形态。
本次实验共固定兔子无透明带受精卵共25枚；后期经培育，有24枚受精卵发育成胚胎，大大提高了无透明带受精卵的利用率。

Claims (10)

1.一种无透明带细胞的束缚方法，包括：
(1)备用透明带的固定：取含有透明带的备用卵子或受精卵，作为备用透明带供体，用两根固定针将备用透明带固定住，固定位置位于所述备用卵子或受精卵的下半部分；
(2)备用透明带的开缝：使用激光或显微切割针在备用透明带上自下地开缝；
(3)备用透明带的牵拉开口：将两根固定针水平向两侧轻轻牵拉，将备用透明带的开缝拉开得更大；
(4)备用透明带供体内容物的吸出：将活检针沿着步骤(3)的开缝穿过，将备用透明带供体的内容物完全吸出，制得空透明带；
(5)无透明带卵子或受精卵的推入：用活检针轻轻吸附住无透明带卵子或受精卵，将其由步骤(3)的开缝推进空透明带中；
(6)透明带复原：将两根固定针松开，让透明带慢慢恢复原来的形态；其中所述无透明带细胞、备用卵子或受精卵、无透明带卵子或受精卵均来自兔子、小鼠或大鼠。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(1)中固定的位置位于备用卵子或受精卵纵向直径的由下往上1/4处。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(2)中的开缝位于备用卵子或受精卵纵向直径的自下而上的1/4～1/2处。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(2)中，所述开缝的长度为1/5～1/3直径。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，步骤(2)中，所述开缝的长度为1/4直径。
6.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(3)中，所述开缝的宽度为直径的1/4～3/4。
7.根据权利要求6所述的方法，其中，步骤(3)中，所述开缝的宽度为1/2直径。
8.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(2)中的激光为1480nm的红外激光。
9.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(1)、(2)、(4)中的固定针、显微切割针及活检针的针尖部分为平口或锐口，其中，固定针及活检针内部中空。
10.根据权利要求9所述的方法，其中，所述固定针、显微切割针及活检针的前段与整体存在一定的角度，角度范围为0-90°，优选35°。
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