BRPI0615784A2 - transferência nuclear de célula - Google Patents

Abstract

TRANSFERêNCIA NUCLEAR DE CéLULA. A presente invenção refere-se a métodos para transferência nuclear de célula que compreendem, por exemplo, modificar a zona pelúcida de um oácito e/ou seccionar os oócitos em várias partes. A presente invenção também descreve métodos para produzir um mamífero não-humano geneticamente modificado. Os mamíferos não-humanos geneticamente modificados obteníveis pelos métodos descritos estão, também, dentro do escopo da presente invenção. Ainda descritos estão métodos para crioconservação de células.

Description

"TRANSFERÊNCIA NUCLEAR DE CÉLULA"

Campo da Invenção

A presente invenção refere-se a um método detransferência nuclear de celular em mamíferos, e aos mamífe-ros geneticamente modificados obtidos ou aos animais geneti-camente modificados que podem ser obtidos pelo método. Alémdisso, a presente invenção refere-se a um método para vitri-ficar oócitos, zigotos, embriões, incluindo blastocistos.

Antecedentes da Invenção

A capacidade de modificar geneticamente célulasdoadoras e usá-las para transferência nuclear proporcionauma ferramenta para a produção de animais geneticamente mo-dificados que podem ser usados, por exemplo, como modelos dedoença para o estudo de doenças humanas sérias e teste defármacos.

Técnicas de transferência nuclear de célula, tra-dicionais, envolvem duas etapas de micromanipulação. Umaprimeira etapa envolve a enucleação de um oócito maduro, euma segunda etapa engloba a transferência de um núcleo doa-dor. Contudo, a micromanipulação provou ter várias desvanta-gens, por exemplo, a necessidade de equipamento caro, a ne-cessidade de pessoal altamente habilitado e um trabalho queconsome muito tempo.

Um método aperfeiçoado de transferência nuclearempregando células somáticas, como células doadoras, foi de-senvolvido recentemente, um método conhecido como ClonagemFeita Manualmente (HMC) , que envolve o uso de oócitos semzona pelúcida. O método é simplificado em comparação com atransferência nuclear tradicional já que a micromanipulaçãonão é mais necessária. 0 método tem sido usando em gado(Vajta et al. 2001 Cloning 3, 89-95; Vajta et al. 2003 Biol.Reprod. 68, 571-578. Vatja et al. 2005 Reprod. Fértil.

Dev.ll, 1-16; Tecirlioglu, et al., 2004) . Também o uso detransferência nuclear sem zona com uma etapa de micromanipu-lação foi descrito para gado (Booth et al. 2001 Cloning StemCells 3, 139-150; Oback et al. Cloning Stem Cells 5, 3-12) eporco (Booth et al. Cloning Stem Cells 3, 191-197). 0 fatoque esse método é tecnicamente menos exigente e menos consu-midor de tempo levou os pesquisadores a aplicar a técnicaHMC a outras espécies. Contudo, vários problemas técnicostornaram a aplicação de HMC em porco mais exigente que ori-ginalmente se supunha. Um dos problemas encontrados refere-se às baixas densidades flutuantes de oócitos porcinos, tan-to em oócitos porcinos de Zona intacta (ZI) como especial-mente os sem zona (ZF) . Conseqüentemente, oócitos porcinosnão sedimentam no fundo da placa. Além disso, a superfíciedos oócitos é pegajosa e é difícil evitar que uns se liguemaos outros quando a zona é removida. Além disso, oócitosporcinos com ZF são muito frágeis e são difíceis de serembissectados do modo descrito para oócitos bovinos.

Recentemente, porém com baixa eficácia, a técnicaHMC foi aplicada à transferência nuclear porcina, usando cé-lulas somáticas geneticamente modificadas, fibroblastos, co-mo células doadoras resultando na produção de blastocistosclonados, geneticamente modificados (Kragh et al. 2004 Re-production, Fertility and Development 16, 315-318).A presente invenção aperfeiçoa a técnica paratransferência nuclear de célula somática, através de HMC,resultando em uma taxa aumentada de reconstrução de embriõese, conseqüentemente a chance de se obter animais genetica-mente modificados é aumentada significantemente.

Um obstáculo para produzir animais geneticamentemodificados por métodos de transferência nuclear em largaescala é a incapacidade de se crioconservar oócitos e embri-ões de porco usando métodos aplicados a outras espécies. Is-so é devido ao teor de lipidio dos oócitos porcinos e embri-ões. A crioconservação de embriões porcinos clonados podemaperfeiçoar consideravelmente a produção da clonagem de cé-lulas somáticas ao minorar problemas logísticos. Contudo,recentemente, um procedimento não invasivo foi publicado pa-ra deslipidização de embriões porcinos com centrifugação,mas sem micromanipulação subseqüente (Esaki et al. Biol Re-prod. 71, 432-6).

Sumário da Invenção

A presente invenção refere-se em um aspecto a ummétodo de transferência nuclear de célula compreendendo asetapas de a) estabelecer pelo menos um oócito tendo pelo me-nos uma parte de zona pelúcida modificada, b) separar o oó-cito em pelo menos duas partes obtendo pelo menos um cito-plasto, c) estabelecer uma célula doadora ou núcleo de célu-Ia tendo propriedades genéticas desejadas, d) fundir pelomenos um citoplasto com a célula doadora ou núcleo de célulacircundado por membrana, e) obter um embrião reconstruído.

Um segundo aspecto da invenção refere-se a um mé-todo de transferência nuclear de célula que compreende asetapas de a) estabelecer pelo menos um oócito, b) separar ooócito em pelo menos três partes obtendo pelo menos dois ci-toplastos, c) estabelecer uma célula doadora ou núcleo decélula tendo as propriedades genéticas desejadas, d) fundirpelo menos um citoplasto com a célula doadora ou núcleo decélula circundado por membrana, e) obter um embrião recons-truído.

Um terceiro aspecto da invenção diz respeito a ummétodo para produzir um mamífero não-humano geneticamentemodificado ou transgênico, que compreende as etapas de a)estabelecer pelo menos um oócito tendo pelo menos uma partede uma zona pelúcida modificada, b) separar o oócito em pelomenos duas partes obtendo um oócito tendo um núcleo e pelomenos um citoplasto, c) estabelecer uma célula doadora ounúcleo de célula com as propriedades genéticas desejadas, d)fundir pelo menos um citoplasto com a célula doadora ou nú-cleo de célula circundado por membrana, e) obter um embriãoreconstruído, f) ativar o embrião reconstruído para formarum embrião, g) cultivar o dito embrião, e h) transferir odito embrião cultivado para um mamífero hospedeiro de modoque o embrião se desenvolve em um feto geneticamente modificado.

Um quarto aspecto da invenção refere-se a um méto-do para produzir um mamífero não-humano geneticamente enge-nheirado ou transgênico, que compreende as etapas de a) es-tabelecer pelo menos um oócito, b) separar o oócito em pelomenos três partes obtendo pelo menos um citoplasto, c) esta-belecer uma célula doadora ou núcleo de célula tendo as pro-priedades genéticas desejadas, d) fundir pelo menos um cito-plasto com a célula doadora ou núcleo de célula circundadopor membrana, e) obter um embrião reconstruído, f) ativar oembrião reconstruído para formar um embrião, g) cultivar odito embrião, e h) transferir o dito embrião cultivado paraum mamífero hospedeiro de modo que o embrião se desenvolveem um feto geneticamente modificado.

Em um quinto aspecto, a presente invenção se refe-re a um método para crioconservação de um embrião de porco,que compreende as etapas de a) estabelecer pelo menos um oó-cito de porco, g) deslipidizar o oócito, c) ativar o embriãoreconstruído para formar um embrião, d) cultivar o dito em-brião, e) vitrificar o embrião.

Em um sexto aspecto, a invenção refere-se a um mé-todo para clonar um mamífero não-humano que compreende asetapas de a) estabelecer um embrião conforme obtido pelosprocedimentos de acordo com a presente invenção, opcional-mente descongelando um embrião, b) transferir o dito embriãocultivado para um mamífero hospedeiro de modo que o embriãose desenvolve em um feto geneticamente modificado.

Em um sétimo aspecto, a invenção refere-se a ummamífero não-humano geneticamente modificado pelo métodoconforme definido aqui.

Em ainda um outro aspecto, a invenção refere-se aum embrião não-humano geneticamente modificado obtenível pe-lo método conforme definido aqui.

Em ainda um outro aspecto, a invenção refere-se aum embrião não-humano geneticamente modificado obtenivel pe-lo método conforme definido aqui, tendo em suas células te-ciduais mitocôndrias de pelo menos três fontes maternas di-ferentes .

Em um aspecto final, a invenção refere-se a um mé-todo para cultivar um embrião reconstruído (embrião), quecompreende as etapas de a) estabelecer pelo menos um oócitotendo pelo menos uma parte de zona pelúcida, b) separar ooócito em pelo menos duas partes obtendo um oócito tendo umnúcleo e pelo menos um citoplasto, c) estabelecer uma céluladoadora ou núcleo de célula tendo as propriedades genéticasdesejadas, d) fundir pelo menos um citoplasto com a céluladoadora ou núcleo de célula circundado por membrana, e) ob-ter o embrião reconstruído, f) ativar o embrião reconstruídopara formar um embrião, e e) cultivar o dito embrião.

Descrição dos desenhos

Figura 1. (s) Trissecção; (b) cupletos de fragmen-to de fibroblasto-oócito para a primeira fusão; (c) embriõesreconstruídos com tripletos (note alongamento sob correnteCA); (d) fusão de tripletos. Barra da escala: 50 m.

Figura 2. (a) Oócitos amadurecidos in vitro depoisda digestão parcial da zona. (b) Oócitos deslipidizados apósa centrifugação. (c) Bissecção de oócitos deslipidizados.(c) Cupletos de fragmento de fibroblasto-oócito para a pri-meira fusão, (e) Embriões reconstruídos em estágio de quatrocélulas desenvolvidos de oócitos deslipidizados. (f) Embri-ões reconstruídos em estágio de quatro células desenvolvidosde oócitos intactos, (g) Blastocistos re-expandidos de em-briões deslipidizados depois de aquecimento, (h) coloraçãocom Hoechst e iluminação UV de blastocistos re-expandidos deembriões deslipidizados depois de aquecimento. A barra re-presenta 100 μm.

Figura 3. Bissecção em enucleação quimicamente as-sistida Observar o cone de extrusão ou corpo polar conectadoà parte menor (carioplasto putativo). Fotografia estereomi-croscópica. A barra representa 50 μπι.

Figura 4. Coloração com Hoechst e iluminação UV daausência e presença de cromatina. Luz UV, fotografia micros-cópica fluorescente invertida. A barra representa 50 μπι. (a)A ausência de cromatina em citoplastos putativos (b). A pre-sença de cromatina em carioplastos putativos.

Figura 5. Fotografia estereomicroscópica de blas-tocistos do Dia 7 com enucleação manual quimicamente assis-tida (CAHE) . A barra representa 50 μπι.

Figura 6. Coloração com Hoechst e iluminação UV deblastócito desenvolvido depois da enucleação manual quimica-mente assistida (CAHE) . A barra representa 50 μπι.

Descrição detalhada da invenção

A presente invenção proporciona procedimentos a-perfeiçoados para clonar mamíferos por transferência nucle-ar, que se refere a introduzir um complemento inteiro de DNAnuclear de uma célula para uma célula enucleada.

Transferência nuclear de célula somática

Na clonagem, a transferência do núcleo de uma cé-lula (corpo) somática ou célula somática para uma célula deovo (oócito), que tenha tido seu próprio núcleo removido(desnucleado ou enucleado) , é chamada de transferência nu-clear de célula somática. 0 novo indivíduo se desenvolverádesse embrião reconstruído e será geneticamente idêntico aodoador da célula somática. Na presente invenção, o método detransferência nuclear de célula somática é um método detransferência nuclear de célula somática que compreende asetapas de a) estabelecer pelo menos um oócito tendo pelo me-nos uma parte de uma zona pelúcida modificada, b) separar ooócito em pelo menos duas partes obtendo pelo menos um cito-plasto, c) estabelecer uma célula doadora ou núcleo de célu-la tendo as propriedades genéticas desejadas, d) fundir pelomenos um citoplasto com a célula doadora ou núcleo de célulacircundado por membrana, e) obter um embrião reconstruído.Contudo, a presente invenção também se refere a um método detransferência nuclear de célula, que compreende as etapas dea) estabelecer pelo menos um oócito, b) separar o oócito empelo menos três partes obtendo pelo menos dois citoplastos,c) estabelecer uma célula doadora ou núcleo de célula tendoas propriedades genéticas desejadas, d) fundir pelo menos umcitoplasto com a célula doadora ou núcleo de célula circun-dado por membrana, e) obter um embrião reconstruído.

Os parâmetros para as etapas listadas podem servariados de modo a obter a mais eficaz transferência nuclearpara uma dada espécie animal. Os vários parâmetros estãodescritos em detalhes abaixo.

Oócito

O termo ^oócito', de acordo com a presente inven-ção, significa uma célula reprodutiva fêmea imatura, uma quenão tenha completado o processo de amadurecimento da célulapara formar um óvulo (gameta). Na presente invenção um oóci-to enucleado é a célula recipiente na processo de transfe-rência nuclear.

Os oócitos de acordo com a presente invenção sãoisolados de oviductos e/ou ovários de um mamífero. Normal-mente, os oócitos são recuperados de animais mortos, emboraeles possam ser isolados também ou de oviductos e/ou de ová-rios de animais vivos. Em uma modalidade, os oócitos são i-solados por procedimentos de recuperação oviductais ou méto-dos de recuperação transvaginais. Em uma modalidade preferi-da, os oócitos são isolados por aspiração. Os oócitos sãotipicamente amadurecidos em uma variedade de meios conhecidade uma pessoa versada na técnica antes da enucleação. Os oó-citos podem ser também isolados dos ovários de um animal re-centemente sacrificado ou quando o ovário foi congelado e/oudescongelado. Preferivelmente, os oócitos são recém-isoladosdos oviductos.

Os oócitos ou citoplastos podem ser também crio-conservados antes do uso. Embora seja apreciado por aquelesversados na técnica que oócitos recém-isolados e amadureci-dos sejam preferidos, será também apreciado que é possívelcrioconservar os oócitos depois da colheita ou depois do a-madurecimento. Se oócitos crioconservados são utilizados,então esses devem ser inicialmente descongelados antes de secolocar os oócitos em um meio de amadurecimento. Os métodosde descongelamento de materiais crioconservados, de modo queeles fiquem ativos depois do processo de descongelamento,são bem conhecidos daqueles com conhecimento ordinário datécnica. Contudo, em geral, a crioconservação de oócitos ecitoplastos é um procedimento muito exigente, e é especial-mente difícil em porcos, por causa da fragilidade geral men-cionada acima de oócitos e citoplastos de porco, e devido aoseu alto teor de lipídio que os torna bastante sensíveis adano por friagem (i.e. dano que ocorre entre +15 e +5 duran-te o procedimento de refrigeração e aquecimento).

Em uma outra modalidade, oócitos maduros (metáfaseII) que foram amadurecidos in vivo podem ser colhidos e usa-dos nos métodos de transferência nuclear aqui descritos.Es-sencialmente, os oócitos maduros de fase II são colhidos ci-rurgicamente ou dos mamíferos não super-ovulados ou super-ovulados 35 a 48 horas depois do início do estro ou depoisda injeção de gonadotropina coriônica humana (hCG) ou hormô-nio similar.

Se os oócitos foram cultivados in vitro, célulasde cúmulo circundando os oócitos in vivo podem ter se acumu-lado podendo ser removidas para proporcionar oócitos que es-tão em um estágio mais adequado de amadurecimento para enu-cleação. Células de cúmulo podem ser removidas por pipetagemou turbilhonamento, por exemplo, em presença de na faixa de0,1 a 5% de hialuronidase, tal como na faixa de 0,2 a 5% dehialuronidase, por exemplo, na faixa de 0,5 a 5% de hialuro-nidase, tal como na faixa de 0,2 a 3% de hialuronidase, porexemplo na faixa de 0,5 a 3% de hialuronidase, tal como nafaixa de 0,5 a 2% de hialuronidase, por exemplo, na faixa de0,5 a 1% de hialuronidase, tal como 0,5% de hialuronidase.A primeira etapa, nos métodos preferidos, envolveisolamento de um oócito recipiente de um animal adequado. Aesse respeito, o oócito pode ser obtido de qualquer fonteanimal e em qualquer estágio do amadurecimento.

0 estágio de amadurecimento do oócito na enuclea-ção e transferência nuclear foram reportados como sendo designificância para o sucesso de métodos de transferência nu-clear. Oócitos imaturos (prófase I) de ovários mamíferos sãofreqüentemente colhidos por aspiração. De modo a empregartécnicas, tais como de engenharia genética, transferêncianuclear e clonagem, tais oócitos colhidos são, preferivel-mente, amadurecidos in vitro antes que as células de oócitospossam ser usadas como células recipientes para transferên-cia nuclear.

Preferivelmente, clonagem de embrião mamífero, bemsucedida, usa o oócito do estágio de metáfase II como o oó-cito recipiente porque se acredita que neste estágio de ama-durecimento o oócito pode ser ou está suficientemente ativa-do para tratar o núcleo introduzido como se ele fosse um es-perma fertilizador. Contudo, a presente invenção refere-se aqualquer estágio de amadurecimento do oócito que esteja ade-quado para efetuar transferência nuclear de célula somática,embriões, blastocistos, e/ou animais obteníveis pelo métodode transferência nuclear de célula somática da presente in-venção.

O amadurecimento in vitro de oócitos ocorre usual-mente em um meio de amadurecimento até que o oócito tenhaatingido o estágio de metáfase II ou tenha extrudado o pri-meiro corpo polar. 0 tempo que leva para um oócito imaturoalcançar o amadurecimento é chamado de período de amadureci-mento .

Em uma modalidade preferida da presente invenção,o oócito é de porca ou porca nova, preferivelmente de umaporca.

Animais

O doador (célula somática ou núcleo de célula so-mática) e o recipiente (citoplasto) envolvidos no método detransferência nuclear de célula de acordo com a presente in-venção é um mamífero não-humano. Igualmente, o animal, noqual os embriões reconstruídos podem ser implantados de a-cordo com a presente invenção, é um mamífero não-humano. Omamífero pode ser um ungulado selecionado do grupo que con-siste em representantes domésticos ou selvagens de bovídeos,ovídeos, cervídeos, suídeos, eqüídeos, e camelídeos. Em umamodalidade particular, o mamífero é uma vaca ou touro, bi-são, búfalo, carneiro-chifre grande, cavalo, pônei, burro,mula, cervo, alce, caribu, bode, búfalo d'água, camelo, Iha-ma, alpaca ou porco. Em uma modalidade especial de presenteinvenção, o mamífero é um porco. Em uma modalidade, o porcoé um porco selvagem. Em uma outra modalidade, o porco é oporco doméstico Sus scrofa, ou S. domesticus. Em ainda umaoutra modalidade, a invenção refere-se ao miniporco, mastambém a porcos endógamos.

Em uma modalidade específica, o porco pode ser se-lecionado do grupo que consiste em Landrace, Yorkshire,Hampshire, Duroc, Chinese Meishan e Piêtrain. Em ainda umaoutra modalidade, a presente invenção refere-se ao grupo queconsiste em Landrace, Yorkshire, Hampshire e Duroc. Contudo,a presente invenção refere-se também ao grupo que consisteem Landrace, Duroc e Chinese Meishan. Similarmente, o grupoconsistindo em Berkshire, Piêtrain, Landrace e Chinese Mei-shan pode ser objeto da presente invenção. Mas também o gru-po que consiste em Landrace e Chinese Meishan é objeto dapresente invenção.

Em uma modalidade particular, o porco é um porcoLandrace, ou um porco Yorkshire. Em uma modalidade particu-lar, a invenção refere-se porcos da raça Hampshire, mas tam-bém Duroc. Em ainda uma outra modalidade, o porco é da raçaChinese Meishan. Contudo, a Berkshire é também coberta pelainvenção, e, em uma modalidade especial, a Piêtrain está co-berta pela presente invenção.

Uma outra modalidade da presente invenção, refere-se aos miniporcos selecionados do grupo que consiste em Go-ettingen, Yucatan, Bama Xiang Zhu, Wuzhishan, Xi Shuang Ban-na.

Em outras modalidades, a invenção refere-se aogrupo que consiste em Bama Xiang Zhu, Wuzhishan, Xi ShuangBanna. Em particular, a invenção refere-se a Goettingen. Mastambém Yucatan é relevante para a invenção. Similarmente,Bama Xiang Zhu é coberto pela invenção, também Wuzhishan, e,em particular, Xi Shuang Banna.

Os mamíferos doadores, de acordo com a presenteinvenção, podem ser fêmeas ou machos. A idade do mamíferopode ser qualquer idade tal como um adulto, ou, por exemplo,um feto.

Embrião

De acordo com a presente invenção, um embrião re-construído (i.e. embrião de célula simples) contém o materi-al genético da célula doadora. Subseqüentemente, o embriãoreconstruído se divide progressivamente em um embrião multi-celular após o início da mitose. In vitro, o início da mito-se é tipicamente induzido por ativação conforme descrição aqui.

Na presente invenção, o termo ^embrião' refere-setambém a embriões reconstruídos, os quais são embriões for-mados depois do processo de transferência nuclear após o i-nício da mitose, por ativação. Os embriões reconstruídos sãocultivados in vitro.

Quando o embrião contém cerca de 12 a 16 células,ele é chamado de "mórula". Subseqüentemente, o embrião sedivide ainda mais e muitas células são formadas, e uma cavi-dade cística preenchida com fluido dentro de seu centro, acavidade blastocele. Nesse estágio, o embrião é denominado"blastocisto". O estágio de desenvolvimento do oócito "fer-tilizado" na ocasião que está pronto para implante; formadoa partir da mórula e consiste em uma massa celular interna,uma cavidade interna, e uma outra camada de células denomi-nadas células trofectodérmicas.

O blastocisto de acordo com a presente invençãopode ser implantado no útero de um mamífero hospedeiro econtinua a crescer até um feto e então até um animal. Nosmétodos proporcionados aqui para produzir mamífero não-humano geneticamente modificado ou transgênico, para clonarum mamífero não-humano, para cultivar um embrião reconstruí-do, e/ou para crioconservação de um embrião de porco, o em-brião pode ser cultivado in vitro. 0 embrião pode ser, por5 exemplo, cultivado em cultura seqüencial. Será apreciado queo embrião pode ser um embrião normal, ou um embrião recons-truído como definido em algum lugar aqui.

Citoplasto

Um oócito ou parte de um oócito do qual o núcleofoi removido

Célula Doadora

O termo 'célula doadora' da presente invenção sig-nifica uma célula somática e/ou células derivadas da germe-linha.

O termo 'célula somática' da presente invençãosignifica qualquer célula (corpo) de um animal em qualquerestágio de desenvolvimento. Por exemplo, células somáticaspodem se originar de tecido fetal ou adulto. Células somáti-cas especialmente preferidas são aquelas de origem fetal.

Contudo, células de uma germe-linha podem ser usadas também.De acordo com a presente invenção, uma célula doadora é umacélula somática. Em uma outra modalidade da presente inven-ção, a célula doadora é uma célula derivada de uma linhagemde célula de germe.

Em uma modalidade preferida da presente invenção,a célula doadora contém as propriedades genéticas desejadas.Contudo, a célula doadora pode conter as propriedades gené-ticas desejadas que tenham sido ganhas pela manipulação ge-nética conforme descrito aqui em outro lugar.

As células somáticas são selecionadas do grupo queconsiste em células epiteliais, células neurais, células e-pidérmicas, ceratinócitos, células hematopoiéticas , melanó-citos, condrócitos, linfócitos (linfócitos BeT), eritróci-tos, macrófagos, monócitos, células mononucleares, fibro-blastos, células musculares cardíacas, e outras células mus-culares .

Essas podem ser obtidas de diferentes órgãos, porexemplo, pele, pulmão, pâncreas, fígado, estômago, intesti-no, órgãos reprodutivos, bexiga, rim, uretra e outros órgãosurinários.

Os animais, dos quais as células somáticas podemser derivadas, estão descritos em algum lugar aqui. Uma mo-dalidade preferida da invenção é o uso de células somáticasque se originam das mesmas espécies que o oócito recipiente(citoplasto).

Preferivelmente, as células somáticas são célulasde fibroblastos já que elas podem ser obtidas de ambos osfetos em desenvolvimento e os animais adultos, em grandesquantidades. Além disso, fibroblastos podem ser facilmentepropagados in vitro. Mais preferivelmente, as células somá-ticas são fibroblastos de origem fetal cultivados in vitro

Em uma modalidade preferida, as células somáticassão geneticamente modificadas. Em ainda uma outra modalidadepreferida da presente invenção, as células somáticas são cé-lulas de porco, e preferivelmente de origem fetal, ou, porexemplo, de adultos.Enucleação

0 método de enucleação de um oócito pode ser sele-cionado do grupo de métodos consistindo em aspiração, remo-ção física, uso de fluorcromos específicos para DNA, exposi-ção à luz ultravioleta e/ou enucleação quimicamente assisti-da. Em uma modalidade, a presente invenção refere-se ao usode fluorcromos específicos para DNA. Contudo, enucleação po-de ser realizada por exposição à luz ultravioleta. Em umamodalidade particular, a enucleação é quimicamente assistidaantes da remoção física do núcleo. Enucleação quimicamenteassistida usando, por exemplo, agentes antineoplásicos, talcomo demecolcina (N-desacetil-N-metil 1 colchicina), e/ou,por exemplo, etoposídeo ou agentes relacionados, pode serconduzida antes da modificação enzimática da zona pelúcida.

A enucleação quimicamente assistida compreende cultivar COCsem meio de amadurecimento, conforme descrito em algum lugaraqui, suplementado com demecolcina, por um particular perío-do de tempo. Na faixa de 0,1 μg/mL a 10 μg/mL de demecolci-na, tal como 0,2 μg/mL a 10 μg/mL , por exemplo 0,3 μg/mLa 10 μg/mL, tal como 0,25 μg/mL a 5 μg/mL, por exemplo, 0,3μg/mL a 1 μg/mL, tal como 0,25 μg/mL a 0,5 μg/mL, por exem-plo, 0,4 μg/mL de demecolcina pode ser suplementado ao meiode amadurecimento. Similarmente, o meio de amadurecimentopode ser suplementado com etoposídeo, por exemplo, na faixade 0,1 μg/mL a 10 μg/mL de etoposídeo, tal como 0,2 μg/mL a10 μg/mL, por exemplo, 0,3 μg/mL a 10 μg/mL, tal como 0,25μg/mL a 5 μς/πΛ, por exemplo, 0,3 μg/mL a 1 μg/mL, tal como0,25 μg/mL a 0,5 μg/mL, por exemplo, 0,4 μg/mL de etoposídeopode ser suplementado ao meio de amadurecimento. 0 tempo pa-ra cultivar os COCs em presença de agentes antineoplásicosvaria de 10 minutos a 5 horas, tal como 30 minutos a 5 ho-ras, por exemplo, 10 minutos a 2 horas, tal como 30 minutosa 2 horas, por exemplo, 10 minutos a 1,5 hora, tal como 20minutos a 3 horas, por exemplo, 10 minutos a 3 horas, talcomo 30 minutos a 1,5 hora,, por exemplo, 45 minutos. Em umamodalidade particular, a enucleação quimicamente assistida érealizada usando 0,45 μς/ιηΐ, de demecolcina e/ou etoposideoadicionado ao meio de amadurecimento por 45 minutos.

Em uma modalidade particular, é preferido que aenucleação seja por remoção física do núcleo. A remoção fí-sica pode ser por separação, por exemplo, por bissecção dooócito em duas metades (duas partes), uma que contém o nú-cleo e a metade do oócito enucleado, conhecido como o cito-plasto, remoção da metade nucleada do oócito e seleção docitoplasto resultante para subseqüentes procedimentos da in-venção. Alternativamente, a separação é por trissecção, re-sultando em três partes das quais duas partes são citoplas-tos. Em uma outra modalidade, o oócito pode ser separado emquatro partes, resultando na produção de três citoplastos. Ooócito pode ser ainda separado em cinco partes por remoçãofísica, resultando em quatro citoplastos. Similarmente, ooócito pode ser separado em seis partes, por exemplo, setepartes, tal como oito partes, por exemplo, nove partes, talcomo dez ou mais partes.

A separação física do oócito e subseqüente remoçãoda parte contendo o núcleo do oócito podem ser obtidas pelouso de uma lâmina micro-cirúrgica. Os oócitos podem ser se-lecionados para identificar quais oócitos foram enucleadoscom sucesso. As partes do oócito que contêm o DNA nuclearpodem ser identificadas por coloração com fluorocromo de Ho-echst, cujo procedimento de coloração é conhecido de umapessoa versada na técnica. Partes do oócito contendo o DNAnuclear são descartadas e os oócitos enucleados (citoplas-tos) são selecionados para procedimentos posteriores.

Zona pelúcida

Zona pelúcida é uma espessa e transparente camadanão celular ou envelope de espessura uniforme que circundaum oócito.

Geralmente, uma zona pelúcida intacta é considera-da como importante na transferência nuclear de célula devidoa vários parâmetros. Um parâmetro é manter o corpo polarpróximo à placa de metáfase do oócito de modo a indicar ositio apropriado para enucleação. Um outro parâmetro refere-se à manutenção da célula doadora próxima ao citoplasto dooócito, antes e durante a fusão. Acredita-se também que azona confira proteção à célula doadora e ao citoplasto du-rante a fusão. Finalmente, acredita-se que o desenvolvimentodo embrião depois da reconstituição e ativação seja suporta-do pela zona pelúcida.

A modificação de pelo menos uma parte da zona pe-lúcida pode ser realizada por vários métodos. Por exemplo,manipulação física pode ser usada para modificar a zona. Mastambém o tratamento químico com agentes, tais como, soluçõesácidas (ácido Tyrode), pode ser empregado. Um exemplo de a-gentes químicos que podem ser empregados na presente inven-ção compreende soluções ácidas, por exemplo, Tyrode. Em umamodalidade particular da invenção, a zona pelúcida é modifi-cada por digestão enzimática. Tal digestão enzimática podeser realizada por enzimas compreendendo, por exemplo, atripsina. Alternativamente, uma protease específica pode serusada, tal como pronase.

Em uma modalidade preferida, a digestão enzimáticaresulta em pelo menos uma digestão parcial de uma parte dazona pelúcida, que, em uma modalidade preferida da presenteinvenção, significa que pelo menos uma parte da zona pelúci-da está sendo removida, ou que a zona pelúcida está parcial-mente removida. No presente contexto, a zona pelúcida não écompletamente removida.

De acordo com uma modalidade especialmente prefe-rida da presente invenção, a parte parcialmente digerida dazona pelúcida é caracterizada pela zona pelúcida que estáainda visível e pelo fato de que o oócito não se tornou de-formado .

A digestão parcial pode ser obtida por exposição auma protease. Em uma outra modalidade da presente invenção,a digestão parcial pode ser obtida pelo uso de uma pronase.Em ainda uma outra modalidade, a digestão parcial pode serobtida pela combinação de uma protease e pronase.

Em uma modalidade preferida, a concentração depronase está na faixa de 0,1 mg/mL a 10 mg/mL, tal como 0,5mg/mL a 10 mg/mL, por exemplo, 1 mg/mL a 10 mg/mL, tal como1,5 mg/mL a 10 mg/mL, por exemplo, 2 mg/mL a 10 mg/mL, talcomo 2,5 mg/mL a 10 mg/mL, por exemplo, 2,75 mg/mL a 10mg/mL, tal como 3 mg/mL a 10 mg/mL, por exemplo, 3,25 mg/mLa 10 mg/mL, tal como 3,3 mg/mL a 10 mg/mL, por exemplo, 3,5mg/mL a 10 mg/mL.

Uma modalidade preferida é uma concentração depronase na faixa de 2 mg/mL a 5 mg/mL, tal como 2,25 mg/mL a5 mg/mL, por exemplo, 2,5 mg/mL a 5 mg/mL, tal como 2,75mg/mL a 5 mg/mL, por exemplo, 2,8 mg/mL a 5 mg/mL, tal como2,9 mg/mL a 5 mg/mL, por exemplo, 3 mg/mL a 5 mg/mL, tal co-mo 3,1 mg/mL a 5 mg/mL, por exemplo, 3,2 mg/mL a 5 mg/mL,tal como 3,3 mg/mL a 5 mg/mL.

Uma modalidade particular da presente invenção éuma concentração de pronase na faixa de 1 mg/mL a 4 mg/mL,por exemplo, 1 mg/mL a 3,9 mg/mL, tal como 1 mg/mL a 3,8mg/mL, por exemplo, 1 mg/mL a 3,7 mg/mL, tal como 1 mg/mL a3,6 mg/mL, por exemplo, 1 mg/mL a 3,5 mg/mL, tal como 1mg/mL a 3,4 mg/mL, por exemplo, 1 mg/mL a 3,3 mg/mL.

Em uma modalidade preferida,. a concentração depronase está na faixa de 2,5 mg/mL a 3,5 mg/mL, tal como2,7 5 mg/mL a 3,5 mg/mL, por exemplo, 3 mg/mL a 3,5 mg/mL. Emuma modalidade especial, a concentração de pronase é 3,3mg/mL.

Está claro para aquele versado na técnica que apronase deve ser dissolvida em um meio apropriado, um meiopreferido de acordo com a presente invenção é T33 (meio TCM199 tamponado com Hepes contendo soro 33% de soro de gado)(como descrito anteriormente - Vajta et al. , 2003).

O tempo de incubação do oócito na solução de pro-nase está na faixa de 1 segundo a 30 segundos, tal como 2segundos a 30 segundos, por exemplo, 3 segundos a 30 segun-dos, tal como 4 segundos a 30 segundos, tal como 5 segundosa 30 segundos.

Em uma outra modalidade da presente invenção, otempo de incubação está na faixa de 2 segundos a 15 segun-dos, tal como 2 segundos a 14 segundos, por exemplo, 2 se-gundos a 13 segundos, tal como 2 segundos a 12 segundos, porexemplo, 2 segundos a 11 segundos, tal como 2 segundos a 10segundos, por exemplo, 2 segundos a 9 segundos, tal como 2segundos a 8 segundos, por exemplo, 2 segundos a 7 segundos,tal como 2 segundos a 6 segundos, por exemplo, 2 segundos asegundos.

Em uma modalidade particular da presente invenção,o tempo de incubação está na faixa de 3 segundos a 10 segun-dos, tal como 3 segundos a 9 segundos, por exemplo, 4 segun-dos a 10 segundos, tal como 3 segundos a 8 segundos, por e-xemplo, 4 segundos a 9 segundos, tal como 3 segundos a 7 se-gundos, por exemplo, 4 segundos a 8 segundos, tal como 3 se-gundos a 6 segundos, por exemplo, 4 segundos a 7 segundos,tal como 3 segundos a 5 segundos, por exemplo, 4 segundos a

6segundos, tal como 4 segundos a 5 segundos. Um tempo deincubação especialmente preferido é de 5 segundos.

Em uma modalidade preferida da presente invenção,o oócito é tratado por 5 segundos em uma solução de pronasede 3,3 mg/mL, a 39°C..

Embrião reconstruído

O termo 'embrião reconstruído' significa a célulaque é formada por inserção da célula doadora ou núcleo dacélula doadora no oócito enucleado, que corresponde a um zi-goto (durante fertilização normal). Contudo, o termo ^embri-ão reconstruído' é também referido como a 'célula reconsti-tuída'. Na presente invenção, a célula doadora é uma célulasomática. Contudo, a célula doadora pode ser também derivadade uma célula de germe-linha.

Fusão

A transferência de uma célula doadora ou um núcleocircundado por membrana de uma célula doadora para pelo me-nos citoplasto é, de acordo com a presente invenção, reali-zada por fusão. Nos cenários descritos abaixo, o termo 'cé-lula doadora' refere-se também a um núcleo circundado pormembrana de uma célula doadora. A fusão pode ser obtida porvários métodos.

A fusão pode ser entre uma célula doadora e pelomenos um citoplasto, tal como, entre uma célula doadora epelo menos dois citoplastos, por exemplo, entre uma céluladoadora e pelo menos dois citoplastos, tal como entre umacélula doadora e pelo menos três citoplastos, tal como entreuma célula doadora e pelo menos quatro citoplastos, por e-xemplo, entre uma célula doadora e pelo menos cinco cito-plasto, tal como entre uma célula doadora e pelo menos seiscitoplastos, por exemplo, entre uma célula doadora e pelomenos sete citoplastos, tal como entre uma célula doadora epelo menos oito citoplastos.

A fusão pode ser realizada de acordo com as combi-nações listadas acima, simultaneamente ou seqüencialmente.Em uma modalidade da presente invenção, a fusão é realizadasimultaneamente. Em uma outra modalidade, a fusão do pelomenos um citoplasto e uma célula doadora é realizada seqüen-cialmente .

Por exemplo, a fusão pode ser obtida por fusãoquímica, em que uma célula doadora e o pelo menos um cito-plasto são expostos a agentes de promoção de fusão, tal co-mo, por exemplo, proteínas, glicoproteínas, ou carboidratos,ou uma combinação destas. Uma variedade de agentes promoto-res de fusão é conhecida, por exemplo, polietileno glicol(PEG), tripsina, sulfóxido de dimetila (DMSO), lectinas, a-glutinina, vírus, e vírus Sendai. Preferivelmente, fitoema-glutinina (PHA) é usada. Contudo, manitol e/ou poli(álcoolvinílico) podem ser usados.

Alternativamente, a fusão pode ser obtida por in-dução com corrente contínua (CC) através do plano de fusão.Freqüentemente, corrente alternada (CA) é empregada para a-linhar a célula doadora e recipiente. Eletrofusão produz umpulso de eletricidade suficientemente alto que é transitori-amente capaz de romper as membranas de o citoplasto e a cé-lula doadora e reformar as membranas subseqüentemente. Comoresultado, pequenos canais se abrirão entre a célula doadorae a célula recipiente. Em casos onde as membranas de a célu-la doadora e a célula recipiente se conectam, os pequenoscanais aumentarão gradualmente e, eventualmente, as duas cé-lulas se fundirão uma a outra.

0 alinhamento do pelo menos um citoplasto e a cé-lula doadora pode ser realizado usando-se corrente alternadana faixa de 0,06 a 0,5 kV/cm, tal como 0,1 a 0,4 kV/cm, porexemplo, 0,15 a 0,3 kV/cm. Em uma modalidade preferidà, oalinhamento de o pelo menos um citoplasto e a célula doadorapoder ser realizado usando-se corrente alternada a 0,2kV/cm.

A fusão pode ser induzida pela aplicação de cor-rente continua através do plano de fusão de o pelo menos umcitoplasto e a célula doadora. Corrente continua na faixa de0,5 a 5 kV/cm, tal como 0,75 a 5 kV/cm, por exemplo, 1 a 5kV/cm, tal como 1,5 a 5 kV/cm, por exemplo, 2 a 5 kV/cm. Umaoutra modalidade preferida da presente invenção é a aplica-ção de corrente continua na faixa de 0,5 a 2 kV/cm. Em umaoutra modalidade, a corrente continua pode ser de 2 kV/cm.

A corrente continua pode ser, preferivelmente, a-plicada durante a faixa de 1 5 a microssegundos, tal como 5a 15 microssegundos, por exemplo, 5 a 10 microssegundos. Umamodalidade particular pode ser de 9 microssegundos.

Em uma modalidade especialmente preferida, a fusãocom corrente continua pode estar usando uma corrente contí-nua de 2 kV/cm, por 9 microssegundos.

A eletrofusão e fusão química podem, contudo, sertambém combinadas.

Tipicamente, a eletrofusão é realizada em câmarasde fusão conforme conhecidas por aquele versado na técnica.

A fusão pode ser realizada em pelo menos uma eta-pa, tal como em duas etapas, por exemplo, três etapas, talcomo em quatro etapas, por exemplo, em cinco etapas, tal co-mo seis etapas, por exemplo, sete etapas, tal como oito eta-pas.

A fusão pode ser realizada em, por exemplo, umaprimeira etapa em que o pelo menos um citoplasto é fundido àcélula doadora. Uma segunda etapa de fusão pode compreenderfusão do par fundido (citoplasto-célula doadora, embrião re-construído) com pelo menos um citoplasto, tal como pelo me-nos dois citoplastos, por exemplo, três citoplastos, tal co-mo quatro citoplastos, por exemplo, cinco citoplastos, talcomo seis citoplastos, por exemplo, sete citoplastos, talcomo oito citoplastos. A segunda etapa de fusão com fusão depelo menos um citoplasto e o par fundido pode ser realizadaseqüencial ou simultaneamente. Em uma modalidade, os pelomenos dois citoplastos são fundidos ao par fundido simulta-neamente. Em uma outra modalidade, os pelo menos dois cito-plastos são fundidos ao par fundido, seqüencialmente.

Em uma modalidade da invenção, a segunda etapa defusão pode ser também uma etapa de ativação, em que o embri-ão reconstruído, é ativado para entrar na mitose. Conformedescrito em outro lugar aqui.

Ativação

Em uma modalidade preferida, o embrião reconstruí-do pode ser deixado ficar em repouso antes da ativação porum período de tempo de modo a permitir que a célula doadorarestabeleça seu genoma e ganhe potência total no novo ambi-ente do citoplasto enucleado. O embrião reconstruído pode,por exemplo, ficar em repouso por uma hora antes da ativa-ção .

Preferivelmente, o embrião reconstruído pode serativado de modo a induzir a mitose. Os métodos de ativaçãopodem ser, preferivelmente, selecionados do grupo que con-siste em pulso elétrico, choque quimicamente induzido, au-mentar níveis intracelulares de cátions divalentes ou redu-zir a fosforilação. Uma combinação desses métodos pode serpreferida para ativação.

Em uma modalidade particular da invenção, a ativa-ção e a segunda etapa de fusão podem ser realizadas simulta-neamente. Contudo, a ativação do embrião reconstituído e apelo menos uma etapa adicional de fusão entre o embrião re-construído e o pelo menos um citoplasto podem ser realizadasseqüencialmente.

Redução da fosforilação de proteínas celulares noembrião reconstruído por métodos conhecidos, tal como, porexemplo, pela adição de inibidores de quinase pode ativar oembrião reconstituído. Uma modalidade preferida pode envol-ver o uso de agentes que inibem a síntese protéica, por e-xemplo, cicloeximida. Uma outra modalidade preferida podeser o uso de agentes que inibem a formação do corpo de fuso.

Em uma modalidade da invenção, os níveis intrace-lulares de cátions divalentes podem ser aumentados. Os cá-tions divalentes, tal como, por exemplo, cálcio, podem estarcompreendidos no meio de ativação. Preferivelmente, os cá-tions podem entrar no embrião reconstruído, particularmentesubmetendo o embrião reconstruído a um pulso elétrico. Emuma modalidade preferida, o pulso elétrico pode provocar aentrada de cálcio no embrião reconstruído.

A aplicação de um pulso elétrico usando correntecontinua pode ser uma etapa de ativação. Contudo, em uma mo-dalidade preferida, o pulso elétrico aplicado para ativaçãopode servir também como uma etapa de fusão adicional.

Antes da aplicação do pulso elétrico usando cor-rente continua, o pelo menos um citoplasto e o pelo menos umembrião reconstruído podem ser alinhados pela aplicação decorrente alternada. A corrente alternada pode estar na faixade 0,06 a 0,5 kV/cm, tal como 0,1 a 0,4 kV/cm, por exemplo,0,15 a 0,3 kV/cm. Em uma modalidade preferida, o alinhamentodo pelo menos um citoplasto e a célula doadora pode ser efe-tuado usando corrente alternada a 0,2 kV/cm.

A ativação pode ser induzida pela aplicação decorrente continua através do plano de fusão do pelo menos umcitoplasto e a célula doadora. A corrente contínua na faixade 0,2 a 5 kV/cm, tal como 0,4 a 5 kV/cm, por exemplo, 0,5 a5 kV/cm. Uma outra modalidade preferida da presente invençãoé a aplicação da corrente contínua na faixa de 0,5 a 2kV/cm. Em uma outra modalidade, a corrente contínua pode ser0,7 kV/cm.

A corrente contínua pode ser, preferivelmente, a-plicada por na faixa de 10 a 200 microssegundos, tal como 25a 150 microssegundos, por exemplo, 50 a 100 microssegundos.Uma modalidade particular pode ser 80 microssegundos.

Em uma modalidade especialmente preferida, a cor-rente contínua pode ser o uso de uma corrente contínua de0,7 kV/cm por 80 microssegundos.

Uma especialmente preferida modalidade de ativa-ção, de acordo com a presente invenção, pode ser usar umpulso elétrico em combinação com a submissão do embrião re-construído a agentes que inibem a síntese protéica, formaçãodo corpo de fuso, e cátions divalentes.

A ativação pode ser realizada por qualquer combi-nação dos métodos descritos acima.

Tipo de modificação genética

As células doadoras podem ser geneticamente modi-ficadas por qualquer método padrão conhecido na técnica. Amodificação genética poder ser uma modificação do DNA genô-mico por deleção, inserção, duplicação, e/ou outras formasde mutação, incluindo mutação de ponto. A modificação podeser feita em seqüências de codificação e/ou seqüências denão-codificação. As construções de DNA para inserção podemconter um gene de interesse e/ou seqüências reguladoras taiscomo promotores, isolantes, intensificadores, repressores ousítios de entrada ribossômica. Em algumas modalidades, so-mente uma modificação genética é introduzida no genoma. Con-tudo, em outras modalidades, o genoma pode ser modificado emmais que um sítio. Técnicas adequadas para modificação gené-tica de células mamíferas, tais como fibroblastos, incluemtécnicas tais como adição de gene por recombinação não homó-loga, reposição de gene por recombinação homóloga, e ediçãode gene. Isso pode incluir o uso de inserção retroviral,transferência de transposon e/ou técnicas de cromossomos ar-tificiais. A recombinação de DNA não homólogo pode ser efe-tuada, por exemplo, conforme descrição de Kragh et al.

(2004) Reprod. Fert'. Dev. 16:290 ou Kragh et al. (2004) Re-prod. Fert. Dev. 16:315. Transferência de gene com base emtransposon pode ser efetuada conforme descrição de Izsvak etal. (1997) Cell 91:501. A reposição de gene por recombinaçãohomóloga pode, por exemplo, envolver as técnicas descritaspor Urnow et al. (2005) Nature 435:646. As técnicas para e-dição de gene foram descritas por Andersen et al. (2002) J.Mol. Med. 80:770, Liu et al (2002) Gene Ther. 9:118 e Soren-sen et al. (2005) J. Mol. Med. 33:39.

Cultura in vitro de embriões

Um aspecto da invenção refere-se a um método decultivo de embriões in vitro, por meio de que a taxa deblastocistos aumentou para 25,3%. Assim, um método de culti-var um embrião reconstruído está dentro do escopo da presen-te invenção, compreendendo as etapas de a) estabelecer pelomenos um oócito tendo pelo menos parte da zona pelúcida, b)separar o oócito em pelo menos duas partes obtendo um oócitotendo um núcleo e pelo menos um citoplasto, c) estabeleceruma célula doadora ou núcleo de célula tendo as propriedadesgenéticas desejadas, d) fundir pelo menos um citoplasto coma célula doadora ou núcleo de célula circundado por membra-na, e) obter o embrião reconstruído, f) ativar o embrião re-construído para formar um embrião, e e) cultivar o dito em-brião .

Um aspecto da invenção refere-se a um método detransferência nuclear de célula, no qual uma etapa de culti-var o embrião está incluída.

Em uma modalidade preferida em relação aos métodosdescritos aqui, os embriões são cultivados em um arranjo se-qüencial de meios. Preferivelmente, os blastocistos sãocrescidos em meio tradicional, tal como, por exemplo,NCSU37, ou meio equivalente conforme conhecido daquele ver-sado na técnica, em que a glicose é removida e substituídapor outros agentes. Um agente pode ser piruvato. Um outroagente pode ser lactato. Os agentes podem ser também combi-nados e repor a glicose no meio tradicional.

Os embriões podem ser cultivados nos meios substi-tuídos conforme descrição acima do Dia 0 ao Dia 3, tal comodo Dia 0 ao Dia 2.

A concentração de piruvato pode variar de 0,05 a1mM, tal como 0,1 a 1mM, por exemplo, 0,125 a 1mM, tal como0,15 a 1mM. Contudo a concentração de piruvato de sódio podetambém variar de 0,05mM a 0,9mM, tal como 0,05 a 0,8mM, porexemplo, 0,05 a 0,7mM, tal como 0,05 a 0,6mM, por exemplo,0,05 a 0,5mM, tal como 0,05 a 0,4mM, 0,05 a 0,3mM, tal como0,05 a 0,2mM. Preferivelmente, a concentração varia entre0,05 a 0,17mM, Uma concentração preferida de piruvato de só-dio é 0,17mM.

A concentração de lactato pode variar de 0,5 a10mM, tal como 0,75 a 10mM, por exemplo, 1 a 10mM, tal como1,5 a 10mM, tal como 1,75 a 10mM, por exemplo, 2 a 10mM, talcomo 2,5 a 10mM. Contudo, a concentração de lactato de sódiopode variar também de 0,5mM a 9mM, tal como 0,6 a 8mM, porexemplo, 05 a 7mM, tal como 0,5 a 6mM, por exemplo, 05 a5mM, tal como 0,5 a 4mM, por exemplo, 0,5 a 3mM. Preferivel-mente, a concentração varia entre 1 e 5mM, tal como 2 e 4mM,por exemplo, 2 e 3mM. Uma concentração preferida de lactatode sódio é 2,73 mM.Depois do meio de incubação inicial isento de gli-cose, a glicose está novamente substituindo o piruvato elactato. Os embriões podem ser cultivados no meio contendoglicose do Dia 4 ao Dia 3, preferivelmente do Dia 3 ao Dia7. A concentração de glicose pode variar de 1 a IOmM, talcomo 2 a IOmM, por exemplo, 3 a IOmM, tal como 4 a IOmM, porexemplo, 5 a IOMm. Contudo, a concentração de glicose podevariar também de 1 a 9mM, tal como 2 a 8mM, por exemplo, 3 a7mM, tal como 4-6mM. Uma concentração preferida de glicosede acordo com a presente invenção é 5,5mM de glicose.

Em ainda uma outra modalidade preferida, o embriãoé um embrião de porco.

Animais geneticamente modificados

De acordo com uma modalidade da presente invenção,animais geneticamente modificados ou transgênicos são pro-porcionados tendo os genótipos desejados.

Será apreciado que a invenção não compreende pro-cessos para modificar a identidade genética de animais, quesejam prováveis de provocar neles qualquer sofrimento semqualquer beneficio médico substancial ao homem ou ao animal,ou aos animais resultantes de tais processos.

A presente invenção refere-se a métodos para pro-duzir um mamífero não-humano geneticamente modificado outransgênico que compreende a) estabelecer pelo menos um oó-cito tendo pelo menos uma parte de uma zona pelúcida modifi-cada, b) separar o oócito em pelo menos duas partes obtendoum oócito tendo um núcleo e pelo menos um citoplasto, c) es-tabelecer uma célula doadora ou núcleo de célula com as pro-priedades genéticas desejadas, d) fundir pelo menos um cito-plasto com a célula doadora ou núcleo de célula circundadopor membrana, e) obter um embrião reconstruído, f) ativar oembrião reconstruído para formar um embrião, g) cultivar odito embrião; e h) transferir o dito embrião cultivado paraum mamífero hospedeiro de modo que o embrião se desenvolveem um feto geneticamente modificado.

Contudo, mamíferos não-humanos geneticamente enge-nheirados ou transgênicos podem ser também produzidos por ummétodo que compreende: a) estabelecer pelo menos um oócito,b) separar o oócito em pelo menos três partes obtendo um oó-cito tendo um núcleo e pelo menos um citoplasto, c) estabe-lecer uma célula doadora ou núcleo de célula com as proprie-dades genéticas desejadas, d) fundir pelo menos um citoplas-to com a célula doadora ou núcleo de célula circundado pormembrana, e) obter um embrião reconstruído, f) ativar o em-brião reconstruído para formar um embrião, g) cultivar o di-to embrião; e h) transferir o dito embrião cultivado para ummamífero hospedeiro de modo que o embrião se desenvolve emum feto geneticamente modificado.

Doação de órgãos ou de tecidos

Em uma modalidade, os animais da invenção podemser usados como fonte de doação de órgãos ou tecidos parahumanos ou outros animais, ou animais da mesma espécie, ouanimal de outras espécies. A transferência entre espécies éusualmente denominada xenotransplante. Órgãos inteiros quepodem ser transplantados incluem coração, rim, fígado, pân-creas ou pulmão. Alternativamente, partes de órgãos, taiscomo tecidos de órgãos específicos podem ser transplantadosou transferidos para humanos e outros animais. Em ainda umaoutra modalidade, uma célula individual ou uma população decélulas individuais de um animal da invenção pode ser trans-ferida para um ser humano ou um outro animal para fins tera-pêuticos .

Modelos de doenças

A presente invenção refere-se também a um métodopara clonar um mamífero não-humano de acordo com os métodosda presente invenção. Assim, um aspecto da invenção refere-se a um método para clonar um mamífero não-humano que com-preende: a) estabelecer um blastocisto conforme descrito a-qui, opcionalmente descongelar um embrião, b) transferir odito embrião cultivado para um mamífero hospedeiro de modoque o embrião se desenvolve em um feto geneticamente modifi-cado. 0 feto geneticamente modificado pode se desenvolver emum mamífero não-humano.

A presente invenção também engloba animais geneti-camente modificados como modelos de doença obteníveis pelosmétodos descritos aqui. Portanto, um segundo aspecto de in-venção é um mamífero não-humano geneticamente modificado ob-tenível pelos métodos descritos aqui. Um outro aspecto refe-re-se a um embrião não-humano geneticamente modificado, ob-tenível pelos métodos descritos aqui.

Os métodos descritos aqui não compreendem uma eta-pa cirúrgica efetuada no corpo não-humano.

0 método para transferência nuclear da presenteinvenção proporciona uma ferramenta para a produção de ani-mais de modelo para qualquer doença relevante que se poderiadesejar desenhar de modo a estudar o desenvolvimento da do-ença, regimes de tratamento potencial, teste de fármacos eprevenção. A doença de escolha não está limitada a nenhumgrupo particular de doenças. Exemplos de uso da presente in-venção para desenvolver modelos de doenças de animais gene-ticamente modificados são mostrados abaixo. Contudo, a in-venção não está limitada aos exemplos listados abaixo.

As modificações genéticas são introduzidas na cé-lula somática antes de SCNT pela técnica HMC. Contudo, a mo-dificação genética pode, em uma outra modalidade, ser intro-duzida durante a clonagem manual (HMC), por exemplo, por a-dição de transgenes em diferentes etapas do procedimento HMCque então encontrarão seu caminho para o genoma do embrião.

As modificações genéticas compreendem integraçãoaleatória de um gene causador de doença, gene mutado, ao ge-noma da célula somática. Poderia ser integração aleatória deum gene não mutado, normal, que causará uma doença quandoexpresso em um tecido especifico ou em um nivel de expressãoespecifico.

O gene introduzido ou transgene pode se originarde qualquer espécie, incluindo bactérias, porco, humano, ca-mundongo, rato, levedura, invertebrados, ou plantas. Seqüên-cias reguladoras do transgene podem acionar a expressão ubí-qua ou induzivel ou especifica de tecido e/ou tempo e podetambém se originar de qualquer espécie incluindo porco, hu-mano, camundongo, rato, levedura, invertebrados, ou plantas.

Importantemente, a modificação genética na célulasomática pode ser marcada para uma região especifica no ge-noma porcino por recombinação homóloga de uma construção demarcação ou por procedimentos de edição de genes. Isso pode-ria ser inativação (por exemplo, nocaute) de genes específi-cos que causariam uma doença ou fenótipo, ou poderia ser in-tegração (knock-in) de mutações especificas para genes espe-cíficos que então causarão a doença. Também, os transgenescausadores de doença podem ser integrados nas regiões regu-ladoras específicas do genoma porcino por métodos de recom-binação homóloga.

As modificações genéticas introduzidas no genomaporcino antes ou durante o procedimento de HMC poderiam tam-bém ser modificações epigenéticas (por exemplo, metilação deDNA ou metilação ou acetilação/desacetilação de histonas)por incubação de células somáticas, oócitos ou embriões deHMC reconstruídos com componentes químicos tal como Tricos-tatina ou compostos com efeito similar.

A invenção refere-se a animais geneticamente modi-ficados como modelos de doença, por exemplo, para doençasdegenerativas, distúrbios de dobradura de proteína relacio-nados à mitocôndria, mal de Alzheimer, mal de Parkinson, Co-réia de Huntington, ou esclerose. Contudo, também, um modelode mal de Alzheimer hereditário é uma modalidade da presenteinvenção.

Em ainda uma outra modalidade, os modelos de doen-ça podem incluir todos os tipos de doenças de câncer, porexemplo, câncer da mama. Mas todas as doenças cancerosas po-deriam ser estudadas, tal como câncer do cólon, ou câncer dopulmão.

Outras modalidades referem-se a modelos com siste-mas sensores genéticos para a análise de penetração na pelede moléculas terapeuticamente ativas, ou lipossomas flexí-veis. Ainda, uma outra modalidade refere-se a modelos de do-ença para cura de ferimento, ou tratamento de úlcera. Alémdisso, os modelos de doença para o tratamento de malforma-ções, por exemplo, por cirurgia reconstrutora está dentro doescopo da presente invenção. Também, modelos de doença rela-cionados à engenharia de tecido, tais como transplante decélula, transplante de tecido, transplante de órgão, estãodentro do escopo da presente invenção.

Ainda, outros modelos de doença são modelos de do-ença da psoriase, e/ou modelos de doença para distúrbios e-pidermoliticos, tal como Epidermólise Bolhosa Simples.

Também, modelos para o tratamento e prevenção dedoenças causadas por aterosclerose, doença cardíaca isquêmi-ca, são modalidades da presente invenção.

Os modelos incluem também modelos para distúrbiosmetabólicos para uma gama de doenças comuns, por exemplo,diabetes ou obesidade. Mas também aterosclerose e doençacardiovascular podem ser inicialmente causadas por distúr-bios metabólicos. Insuficiência renal é um outro exemplo deuma doença que pode ser causada por disfunção metabólica.Igualmente, pressão sangüínea alta (hipertensão) pode sertambém devida inicialmente à disfunção metabólica e podemser estudada em modelos de animais geneticamente modificadospara distúrbios metabólicos. Também doença causada por pro-teínas mitocondriais, por exemplo, deficiências de acyl-coAdesidrogenase de cadeia curta, fraqueza neuromuscular, dege-neração por expressão de variante deletada de OrnitinaTranscarbamilase.

Vitrificação

O termo crioconservação é usado para as diferentestécnicas de congelamento de célula envolvidas no congelamen-to, armazenagem e processo de descongelamento de células vi-vas. Vitrificação é uma forma de crioconservação onde as cé-lulas vivas são rapidamente refrigeradas de modo que o flui-do da célula não se transforme em gelo. Assim, a vitrifica-ção refere-se ao processo de refrigeração onde as células outecidos inteiros são conservados por refrigeração para bai-xas temperaturas subzero, tal como -80°C (tipicamente) ou -196°C (o ponto de ebulição do nitrogênio liquido). Nessastemperaturas baixas, qualquer atividade biológica, incluindoreações bioquímicas que levariam à morte celular, é eficaz-mente interrompida. Contudo, a vitrificação refere-se a umaabordagem especial, onde não é permitida a formação de gelono meio e nas células conservadas ou nos tecidos. Essa re-frigeração isenta de gelo pode ser obtida por aplicação dealtas concentrações de soluções crioprotetoras e taxas derefrigeração extremamente altas. Aquecimento deve ser reali-zado com aumento rápido de temperatura.

Um aspecto da presente invenção refere-se à capa-cidade de vitrificar (crioconservação) um oócito, citoplas-to, células, embriões, ou blastocistos. Assim, a presenteinvenção refere-se a um método para a crioconservação de umembrião de porco, que compreende: a) estabelecer pelo menosum oócito de porco, d) deslipidizar o oócito, c) ativar oembrião reconstruído para formar um embrião, d) cultivar odito embrião, e) vitrificar o embrião. Além disso, o oócitodeslipidizado pode ser separado, em pelo menos duas partesconforme descrição em outro lugar aqui, obtendo um oócitoque tem um núcleo e pelo menos um citoplasto.

Em particular, a invenção refere-se à vitrificaçãode um oócito; contudo, a invenção refere-se também à vitri-ficação de embriões, preferivelmente embriões no estágio deblastocisto. Em uma modalidade, o embrião é cultivado para oestágio de blastocisto antes da vitrificação. Especialmente,embriões de porco estão cobertos pela presente invenção.Também, citoplastos vitrificados são cobertos pela presenteinvenção, bem como as células.

Ainda, um outro aspecto da invenção refere-se àcrioconservação de um embrião de porco derivado de um métodopara transferência nuclear de célula, conforme descrito a-qui, que compreende a etapa de vitrificar um embrião de por-co. Um outro aspecto da invenção refere-se a embriões deporco obtidos ou obteníveis pelos métodos proporcionados aqui.

O termo 'crioconservar', como usado aqui, pode sereferir à vitrificação de um oócito, citoplasto, uma embriãode célula, ou do animal de invenção. As temperaturas empre-gadas para a crioconservação são, preferivelmente, mais bai-xas que -80°C, e mais preferivelmente temperaturas menoresque -196°C. Oócitos, células e embriões da invenção podemser crioconservados por um período indefinido de tempo. Ésabido que materiais biológicos podem ser crioconservadospor mais que cinqüenta anos.

Está dentro do escopo da invenção que embriões po-dem ser crioconservados antes da transferência para o mamí-fero hospedeiro quando são empregados métodos para produzirum mamífero não-humano geneticamente engenheirado ou trans-gênico. Tal crioconservação antes da transferência pode serno estágio de blastocisto do desenvolvimento de embrião.

Um aspecto da invenção refere-se à deslipidizaçãonão invasiva dos oócitos por tratamento moderado com um a-gente enzimático, para exemplo, uma pronase. Em uma modali-dade, a concentração de pronase está preferivelmente na fai-xa de 0,5 a 5 mg/mL, tal como o, 5 mg/mL a 3 mg/mL, por exem-pio, 0,5 mg/mL a 2 mg/mL. Preferivelmente, a pronase tem umaconcentração de 1 mg/mL. Em uma outra modalidade da presenteinvenção, a deslipidizaçao não invasiva de oócitos é obtidapor tratamento com uma pronase na concentração de 3,3 mg/mL.

A deslipidização de oócitos é realizada em presen-ça de um meio adequado, por exemplo, um meio compreendendo50% de soro de gado.

0 processo de deslipidização é deixado prosseguirpor um período preferivelmente na faixa de 1 a 5 minutos, emparticular 3 minutos. Contudo, em casos onde a concentraçãode pronase está na faixa de 2,5 mg/mL a 5 mg/ml, o períodoao qual o processo de deslipidização é deixado prosseguirvaria de 5 segundos a 15 segundos, por exemplo, de 5 segun-dos a 10 segundos, tal como 10 a 15 segundos. Uma modalidadeda presente invenção é a deslipidização de oócitos usando3,3 mg/ml de pronase por 10 segundos.

Preferivelmente, os oócitos são subseqüentementelavados em um meio adequado, por exemplo, um meio TCM-99tamponado com Hepes, suplementado com soro de bezerro, porexemplo, soro de bezerro a 20%. Os oócitos digeridos compronase e lavados são preferivelmente submetidos à centrifu-gação na faixa de 8.000 a 15.000 χ g, por exemplo, 9.000 a14.000 χ g. Em uma modalidade especialmente preferida, osoócitos são centrifugados a 12.000 χ g. A centrifugação podeprosseguir por na faixa de 10 a 30 minutos, tal como por 20minutos.

Em uma modalidade especialmente preferida da pre-sente invenção, os oócitos são deslipidizados por pronase emuma concentração de 1 mg/mL por 3 minutos, depois do que osoócitos podem ser lavados e subseqüentemente submetidos àcentrifugação a 12.000 χ g por 20 minutos.

Em uma modalidade preferida da presente invenção,os oócitos deslipidizados podem ser vitrifiçados. De acordocom uma modalidade da invenção, os oócitos deslipidizadospodem ser vitrificados e subseqüentemente aquecidos para se-rem empregados nos procedimentos de acordo com a presenteinvenção. Em uma modalidade alternativa, os oócitos deslipi-dizados podem ser usados nos métodos conforme descritos aquipara produzir, por exemplo, embriões, em particular embriõesno estágio de blastocisto, que podem ser preferivelmente vi-trificados. Oócitos vitrificados, citoplastos, células, em-briões ou embriões no estado blastocisto podem ser assim vi-trificados. Os blastocistos vitrificados produzidos peloprocesso de vitrificação da presente invenção podem ser ar-mazenados e mediante aquecimento podem ser implantados em ummamífero não-humano adequado para produzir mamíferos geneti-camente modificados de acordo com os presentes métodos paratransferência nuclear de célula.

Mitocôndria

Células do tecido dos mamíferos não-humanos gene-ticamente modificados e/ou de embriões não-humanos obtení-veis pela presente invenção podem conter mitocôndrias de di-ferentes fontes maternas. Em uma modalidade preferida, osmamíferos não-humanos e/ou embriões não-humanos podem contermitocôndrias de somente uma fonte materna. Contudo, em umaoutra modalidade preferida, os mamíferos não-humanos e/ouembriões não-humanos podem conter mitocôndrias de pelo menosduas fontes maternas, tal como três fontes maternas, por e-xemplo, quatro fontes maternas, tal como cinco fontes mater-nas, por exemplo, seis fontes maternas, tal como sete fontesmaternas, por exemplo, oito fontes maternas, tal como novefontes maternas, por exemplo, dez fontes maternas. A proba-bilidade de se ter um número específico de fontes maternaspode ser calculada com base nos tipos de mitocôndrias obser-vados .

Exemplos

Exceto onde de outro modo descrito, todos os pro-dutos químicos foram obtidos da Sigma Chemical Co. (St.Louis, MO, E.U.A.).

Coleta de Oócitos e amadurecimento in vitro (IVM)Complexos de oócitos de cúmulo (COCs) foram aspi-rados em foliculos de 2 a 6 mm de ovários de porca e de por-ca nova derivados de um abatedouro. COCs foram amadurecidosem grupos de 50 em 400 μΐι de TCM-199 tamponado com bicarbo-nato (GIBCO BRL) suplementado com soro de gado (CS) a 10%(v/v), fluido folicular de porco a 10% (v/v), 10 UI/mL deeCG, 5 UI/mL de hCG (Sulgonan Vet; Skovtunde, Dinamarca) a38,5°C no "Submarine Incubation System" (SIS; Vajta, et al.1997) em CO2 a 5% em ar umidifiçado por 41-44 horas.

Fertilização in vitro (IVF)

Experimentos de IVF foram realizados com oócitosamadurecidos in vitro em 3 réplicas idênticas. Depois do a-madurecimento, COCs foram lavados duas vezes com mTBM con-tendo cafeína 2mM (mTBMfert) e transferidos em grupos de 50para 400 μL, de mTBMfert· Sêmen recém-e j aculado foi tratadocomo descrito anteriormente (Booth, et al. , para publica-ção). Depois de capacitação por duas horas a 38,5°C e em CO2a 5% em ar umidificado, o esperma foi adicionado aos oócitoscom a concentração final ajustada de 1 χ IO5 de esperma/mL.A fertilização foi realizada a 38,5°C e em CO2 a 5% em arumidificado no SIS por 3 horas. Depois da inseminação, oszigotos presumíveis foram turbilhonados em mTBMfert para re-mover células de cúmulo antes da lavagem em meio de IVC ecolocação em placas de cultura (vide Cultura de embrião eavaliação) .

Clonagem manual (HMC)"

O método HMC aplicado foi baseado em nosso traba-lho prévio em gado e em porco (Kragh et al. , 2004; Peura eVajtar 2003; Vajta et al., 2003), mas com modificações sig-nificantes. Em resumo, 41 horas depois do inicio do amadure-cimento, o investimento de cúmulo dos COCs foi removido porpipetagem repetida em 1 mg/mL de hialuronidase em TCM199tamponado com Hepes. Desse ponto (exceto onde de outro modoindicado), todas as manipulações foram realizadas em um es-tágio aquecido ajustado para 39°C, e todas as gotas usadaspara manusear os oócitos foram de 20 μΐϋ de volume cobertoscom óleo mineral. Os oócitos foram brevemente incubados em3,3 mg/mL de pronase dissolvidos em T33 (T para meio TCM 199tamponado com Hepes; o número significa a percentagem (v/v)de suplemento CS, aqui de 33%) por 5 segundos. Antes dos oó-citos começarem a se deformar na solução de pronase, elesforam retirados e lavados rapidamente em gotas de T2 e T20.

Oócitos com zona parcialmente digerida, mas ainda visível,foram dispostos em gotas de T2 suplementado com 3 mg/mL depoli(álcool vinílico) (TPVA) e 2,5 μg/mL de citocalasina B.Trissecção em vez de dissecção foi realizada manualmente sobcontrole estereomicroscópico com Lâminas de Divisão Ultra-Agudas (AB Technology, Pullman, WA, E.U.A.; Fig. Ia). Frag-mentos dos oócitos trisseccionados foram coletados e colori-dos com 5 μL/mL de fluorocromo Hoechst 33342 em gotas deTPVA por 5 minutos, então colocados em gotas de 1 μί do meioTPVA no fundo de uma placa de Petri Falcon de 60 mm cobertacom óleo (3-4 fragmentos por gota) . Usando um microscópioinvertido e luz UV, as posições de fragmentos sem coloraçãode cromatina (citoplastos) foram registradas, e mais tardecoletadas sob estereomicroscópio em gotas de TlO até o iní-cio da fusão.

Células de fibroblastos fetais foram preparadasconforme descrição prévia (Kragh et al. , para publicação) . Afusão foi realizada em duas etapas onde a segunda incluiutambém o inicio da ativação, Para a primeira etapa, um terçodos citoplastos selecionados (preferivelmente as partes me-nores) foi usado. Com uma pipeta de vidro finalmente puxadae polida em fogo, 10 citoplastos foram transferidos como umgrupo para 1 mg/mL de fitoemaglutinina (PHA; ICN Pharmaceu-ticals, Austrália) por 3 segundos, então rapidamente goteja-dos em uma das poucas células de fibroblastos, individual-mente, que foram sedimentadas em uma gota de T2. Depois deligados, 10 pares de citoplasto-fibroblasto foram equilibra-dos em um meio de fusão (manitol 0,3M e PVA a 0,01%) por 10segundos. Usando corrente alternada (CA) de 0,6 kV/cm e 700KHz, os pares de células foram alinhados para o fio de umacâmara de fusão (câmara de fusão com microlâmina de 0,5 mmBTX, modelo 450; BTX, San Diego, CA, E.U.A.) com as célulasdoadoras mais afastadas do fio (Figura lb) , então fundidoscom corrente continua (CC) de 2,0 kV/cm, por 9 με. Depois dopulso elétrico, os pares de células foram removidos cuidado-samente do fio, transferidos para gotas de TlO e incubadospara observar se a fusão havia ocorrido.

Aproximadamente 1 hora depois da primeira fusão,pares fundidos juntos com os dois terços de citoplastos re-manescentes foram equilibrados em gotas de meio de ativação(manitol 0,3M, MgSO4 0,lmM, CaCl2 0,lmM e poli(álcool viní-lico) a 0,01% (PVA)). Sob corrente alternada de 0,6 kV/cm,os tripletos citoplasto-par fundido-citoplasto foram alinha-dos seqüencialmente ao fio em grupos de 10, com pares fundi-dos localizados no meio (Figura lc). Um único pulso de cor-rente continua de 0,7 kV/cm por 80 μ3 foi usado para a se-gunda fusão e iniciação de ativação. 0 tripletos foram entãoremovidos do fio e transferidos cuidadosamente para gotas deTlO para checar a fusão (Figura ld). Os embriões reconstruí-dos foram incubados em meio de cultura (vide Cultura de em-brião e avaliação) suplementado com 5 μg/mL de citocalasinaB e 10 μg/mL de cicloeximida, por 4 h, a 38,5°C, em CO2 a5%, O2 a 5% e N2 a 90% com umidade máxima, então lavados 3vezes em meio de IVC antes da cultura.

Ativação partenogenética (PA)

Oócitos ativados partenogeneticamente foram produ-zidos ou separadamente ou em paralelo com HMC. Os oócitosforam desnudados do mesmo modo que acima, exceto que uma in-cubação em pronase mais longa foi usada para conseguir a zo-na pelúcida completamente removida. Os oócitos sem zona (ZF)foram então equilibrados por 10 segundos em meio de ativação(manitol 0,3M, MgSO4 0,lmM, CaCl2 0,lmM, e poli(álcool viní-lico) (PVA) a 0,01% e transferidos para a câmara de fusão(câmara de fusão com micro-lâmina de 0,5 mm BTX, modelo 450;BTX, San Diego, CA, E.U.A.). Um pulso único de corrente con-tinua de 0,85 kV/cm por 80 με foi gerado com máquina de fu-são celular BLS CF-150/B (BLS, Budapeste, Hungria) e aplica-do aos oócitos ZF. Para os oócitos da zona intacta (ZI), umpulso único de corrente continua de 1,25 kV/cm, por 80 με,foi usado (de acordo com nos experimentos preliminares nãopublicados, esses parâmetros resultaram na mais alta ativa-ção e subseqüente desenvolvimento in vitro para oócitos deZI e ZF, respectivamente). 0 procedimento depois do pulsoelétrico foi o mesmo que para os embriões reconstruídos por HMC.

Cultura de embrião e avaliação

Todos os embriões porcinos produzidos pelos trata-mentos acima foram cultivados em um meio NCSU37 modificado(Kikuchi et al., 2002) contendo 4 mg/mL de BSA a 38,5°C, emO2 a 5%, CO2 a 5% e N2 a 90% com o máximo de umidade. 0 meiode cultura foi fornecido com 0,17 mm de piruvato de sódio e2,73 mm de -Iactato de sódio do Dia 0 (o dia para fertiliza-ção e ativação) ao Dia 2, então lactato de sódio e piruvatode sódio foram repostos com 5,5 mm de glicose do Dia 2 aoDia 7. Todos os embriões de ZF foram cultivados em sistemaWOW (Vajta, et al., 2000) no mesmo meio de cultura e misturagasosa conforme usados acima, com cuidadosa alteração domeio no Dia 2 sem remover os embriões dos WOWs. A taxa deblastocistos foi registrada no Dia 7. Para determinar os nú-meros de células totais, os blastocistos foram fixados emontados em uma lâmina microscópica de vidro em glicerolcontendo 20 μg/μL de fluorocromo Hoechst 33342. Depois decoloração por 24 horas, os embriões foram observados sob ummicroscópio invertido Diaphot 200 com ligação epifluorescen-te e filtro UV-2a (Nikon, Tóquio, Japão).

Exemplo 1

Diferenças na competência de desenvolvimento entreos oócitos derivados de porca (2,5 anos, 170 kg de peso) eoócitos derivados de porca nova (5,5-6 meses, 75 kg de peso)foram investigadas através de ZF e ZI PA depois de 44 horasde amadurecimento in vitro. Quatro grupos combinados foraminvestigados em 3 réplicas idênticas: (1) oócitos de porcasZF (2) oócitos ZI de porcas (3) oócitos ZF de porcas novas(4) oócitos ZI de porcas novas. Para a ativação de ZF, umúnico pulso de corrente continua de 0,85 kV/cm, por 80 μΞ,foi aplicado, enquanto um pulso único de 1,25 kV foi usadopara ativar oócitos de ZI. Seguintes aos 7 dias de cultura,conforme descrição acima, a percentagem de blastocistos porembrião ativado foi determinado.

A competência de desenvolvimento de oócitos parte-nogeneticamente ativados derivados ou de porcas ou de porcasnovas foi investigada. Como mostrado na Tabela 1, as taxasde blastocistos de oócitos partenogeneticamente ativados deporcas foram significantemente maiores que aquelas das por-cas novas, tanto depois ZF como de ZI PA.

Tabela 1.

<table>table see original document page 49</column></row><table><table>table see original document page 50</column></row><table>

a,b Sobrescritos diferentes significam diferençassignificantes (p < 0,05).

c,d Sobrescritos diferentes significam diferençassignificantes (p < 0,05).

* Porcentagem (Média ± S.E.M) de embriões desen-volvidos para blastocistos.

A diferença na competência de desenvolvimento deoócitos entre porcas e porcas novas foi examinada na produ-ção in vitro (IVP) e transferência nuclear de célula somáti-ca (SCNT), separadamente, resultando em conclusão similaràquela da publicação anterior de outros grupos de pesquisa(Sherrer, et al. , 2004; Hyun, et al., 2003), i.e. que embri-ões de oócitos derivados de porca são superiores àqueles deoócitos derivados de porca nova no suporte a desenvolvimentode blastocistos. Embora as porcas novas usadas em nosso es-tudo estejam na fronteira do amadurecimento, a diferença en-tre as taxas de blastocistos no Dia 7 depois da PA foi sig-nificante, provando a competência de desenvolvimento superi-or dos oócitos de porca.

Exemplo 2

A exeqüibilidade de HMC de porcino modificada foiidentificada em 6 réplicas idênticas, com IVF e, em parale-lo, ZF PA como controles. Os oócitos de porca, mais compe-tentes, (de acordo com o Exemplo 1) foram usados no Exemplo2. Sete dias depois da reconstrução e/ou da ativação, o nú-mero de blastocistos por embrião reconstruído e números decélulas totais de blastocistos aleatoriamente selecionadosforam determinados.

Mais que 90% de fragmentos de oócitos derivados deoócitos morfologicamente intactos podiam ser recuperados pa-ra HMC depois da trissecção. Em média, 37 embriões puderamser reconstruídos de 100 oócitos amadurecidos. A competênciade desenvolvimento de todas as fontes de embriões porcinosestá mostrada na Tabela 2. No Dia 7, o desenvolvimento deembriões reconstruídos para o estágio de blastocisto foi de17+4% com número de células médio de 46±5, enquanto as taxasde blastocistos para IVF, e ZF PA foram de 30±6% e 47±4% (n= 243, 170, 97), respectivamente.

Tabela 2.

Desenvolvimento in vitro de embriões produzidos

<table>table see original document page 51</column></row><table>

a,b,c Sobrescritos diferentes significam diferençassignificantes (p < 0,05).

d,e Sobrescritos diferentes significam diferençassignificantes (p < 0,05).

Embora não se tenha chegado próximo à eficácia má-xima teórica, a integração da digestão parcial da zona e atrissecção de oócitos quase dobrou o número de embriões re-construídos em comparação com o nosso sistema anterior (Kra-gh et al., 2004 Reprod. Fértil. Dev 16, 315-318). O aumentoda eficácia de reconstrução pode ter benefícios especiais naclonagem de porcino, pois a recuperação de oócitos depois daaspiração é mais exigente e consome mais tempo que de gado.Um ponto ainda mais importante é o alto número de embriõesrequerido para estabelecer gravidezes depois da transferên-cia nuclear porcina. IVC em porcos é também considerada comoum procedimento exigente e ineficaz (Reed et al. , 1992 The-riogeneology 37, 95-109). Uma desvantagem dos sistemas de ZFé que os embriões têm que alcançar pelo menos a mórula ouestágio precoce de blastocistos in vitro para evitar a de-sintegração no oviducto sem a camada protetora da zona pelú-cida. Por outro lado, uma vez no estágio de blastocisto, osembriões sem zona podem ser transferidos, com sucesso, con-forme provados por bezerro nascidos de transferência embrio-nária ou nuclear de célula somática (Peura et al., 1998; Te-cirlioglu et al. , 2004; Oback et al., 2003; Vajta, et al.,2004) e também por porquinhos nascidos depois de IVP de oó-citos sem zona (Wu et al., 2004) . O meio NCSU37 tem sido omeios mais largamente usado e de sucesso para a cultura deembriões de porcos. Contudo, apesar de o desenvolvimento deembrião aperfeiçoado em comparação com outros meios, a via-bilidade de embriões de porcinos de IVP está comprometidadepois de IVC. Alguns relatos sugerem que a glicose não émetabolizada prontamente por embriões porcinos precoces an-tes do estágio de oito células, mas usada em mais altasquantidades em embriões entre a mórula compactada e estágiosde blastocistos (Flood et al., 1988) . A reposição de glicosecom piruvato e lactato em NCSU37 para a cultura dos doisprimeiros dias resultou em uma taxa de blastocistos de 25,3%para embriões porcinos de IVP no estudo de Kikuchi (KiKuchiet al., 2002), que foi ainda corroborado por nossos presen-tes estudos com uma taxa de blastocistos de IVP de 30%, namédia. Além disso, a primeira avaliação desse sistema decultura seqüencial em embriões de HMC de porcino e ZF PA re-sultou em taxas de blastocistos de 17% e 47%, respectivamen-te. Algumas vezes, a taxa de blastocistos de ZI PA poderiaainda atingir niveis tão altos quanto 90% (Du, não publica-do) .

Análise estatística

A análise ANOVA foi realizada usando SPSS 11.0.Uma probabilidade de P < 0,05 foi considerada como sendo es-tatisticamente significante.

Exemplo 3

Vitrificação de blastocistos de porcino clonadosmanualmente produzidos de oócitos deslipidizados, amadureci-dos in vitro.

Recentemente foi publicado um procedimento não in-vasivo para deslipidização de embriões porcinos com centri-fugação, mas sem micromanipulação subseqüente (Esaki et al.,2004 Biol. Reprod. 71, 432-6).

Crioconservação de embriões/blastocistos foi efe-tuada por vitrificação usando Cryotop (Kitazato Supply Co.,Fujinomiya, Japão) conforme descrito previamente (Kuwayanaet al., 2005a; 2005b). No momento da vitrificação, embri-ões/blastocistos foram transferidos para a solução de equi-líbrio (ES) consistindo em 7,5% (v/v) de etileno glicol (EG)e 7,5% de sulfóxido de dimetila (DMSO) em TCM199 suplementa-do com 20% de substituto de soro sintético (SSS) a 39°C, pora 15 minutos. Depois de um encolhimento inicial, os embri-ões recuperaram seu volume original. 4-6 embri-ões/blastocistos foram transferidos para 20 μΙ; de gota desolução de vitrificação (VS) consistindo em 15% (v/v) de EGe 15% de DMSO e sacarose 0,5M dissolvida em TCM199 suplemen-tado com 20% de SSS. Depois da incubação por 20 segundos, osembriões foram carregados em Cryotop e imersos em nitrogêniolíquido. 0 processo de exposição em VS à imersão foi comple-tado em 1 minuto.

Embriões/blastocistos foram descongelados por i-mersão de Cryotop na solução de descongelamento (TS) consis-tindo em sacarose 1,0M em TCM199 mais 20% de SSS por 1 minu-to, então transferidos para a solução de diluição (DS) con-sistindo em sacarose 0,5M em TCM199 mais 20% de SSS por 3minutos. Para remover o crioprotetor, embriões/blastocistosforam mantidos duas vezes em uma solução de lavagem (WS;TCM199 mais 20% de SSS), 5 minutos para cada tempo. A sobre-vivência de blastocistos vitrificados foi determinada de a-cordo com as taxas de reexpansão de 24 horas de recuperaçãoem meio de cultura suplementado com 10% de soro de bezerro(CS) .

0 método de deslipidização não invasivo foi apli-cado a oócitos porcinos amadurecidos in vitro e posteriordesenvolvimento de oócitos deslipidizados depois da ativaçãopartenogenética foram investigados em 4 réplicas idênticas.Os oócitos foram aleatoriamente separados em grupos de des-lipidização e de controle.

Para deslipidização, os oócitos foram digeridoscom 1 mg/mL de pronase em presença de 50% de soro de gado(CS), por 3 minutos, e lavados em meio TCM-199 tamponado comHepes e suplementado com 20% de CS, que resulta em digestãoparcial da zona pelúcida (Figura 2a). Subseqüentemente, 40-50 oócitos foram centrifugados (12.000 χ g, 20 min), à tem-peratura ambiente, em meio TCM-199 tamponado com Hepes e su-plementado com 2% de CS, 3 mg/mL de PVA e 7,5 μg/mL de cito-calasina B (CB) (Figura 2b) . As zonas pelúcidas de ambos osoócitos centrifugados e intactos foram completamente removi-dos com posterior digestão em 2 mg/mL de solução de pronase.

Para ativação, uma única corrente continua de 85kV/cm por 80 με foi aplicada a ambos os grupos, seguido portratamento de 4 horas com 5 μg/mL de CM e 10 μg/mL de ciclo-eximida (CHX). Todos os embriões foram então cultivados nomeio NCSU37 modificado. No Dia 7 os blastocistos foram vi-trificados e aquecidos usando-se a técnicas Cryotop (Kuwaya-má et ai., RBM Online, para publicação), a 38,5°C. A sobre-vivência de blastocistos vitrificados foi determinada de a-cordo com as taxas de reexpansão depois de 24 h de recupera-ção em meio de cultura suplementado com 10% de CS. Númerosde células de blastocistos de ambos os grupos foram determi-nados depois de coloração com Hoechst. Os resultados foramcomparados por análise ANOVA. Digestão parcial de zona e acentrifugação resultaram na deslipidização bem sucedida em173/192 (90%) de oócitos. O desenvolvimento para blastocis-tos não foi diferente entre oócitos deslipidizados e intac-tos (2 8+7 % versus 28±5%, respectivamente; P>0,5). Contudo,as taxas de sobrevivência dos blastocistos derivados de oó-citos deslipidizados foram significantemente maiores que a-quelas desenvolvidas de oócitos intactos (85+6% versus 32±7%respectivamente; P<0,01). Não houve diferença no número mé-dio de células de blastocistos re-expandidos derivados tantode oócitos deslipidizados como intactos (36+7 versus 38±9,respectivamente; P>0,05). Os resultados demonstram que asimples técnica de deslipidização não dificulta a competên-cia de desenvolvimento ín vítro de oócitos porcinos ativa-dos, e melhora a criossobrevivência dos blastocistos deriva-dos sem perda significante do número de células.

Depois da deslipidização, a zona pelúcida de oóci-tos de ambos os grupos foi completamente removida. Os mesmosparâmetros conforme descritos acima para ativação elétricaforam aplicados a ambos os grupos. Sete dias depois da ati-vação, as taxas de blastocistos e os números de células deblastocistos foram determinados.

A exeqüibilidade de aplicar uma técnica de desli-pidização não invasiva a oócitos porcinos amadurecidos invitro foi investigada. 90% (173/102) de oócitos podem serdeslipidizados com sucesso. Como mostrado na tabela 3, o de-senvolvimento para blastocistos não foi diferente entre oó-citos deslipidizados e intactos (28±7% versus 28±5%, respec-tivamente; P>0,05). Contudo, as taxas de sobrevivência deblastocistos derivados de oócitos deslipidizados foram sig-nificantemente maiores que aqueles desenvolvidos de oócitosintactos (85±6% versus 32±7%, respectivamente; P<0,01). Nãohá diferença no número médio de células de blastocistos re-expandidos derivados tanto de oócitos deslipidizados comointactos (36+7 versus 38±9, respectivamente; P>0,05).

Tabela 3. Competência de desenvolvimento e crios-sobrevivência de embriões vitrificados-descongelados de oó-citos ativados deslipidizados e intactos

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Clonagem Manual de oócitos deslipidizados

Oócitos deslipidizdos foram usados para HMC em 5réplicas. Quatro réplicas idênticas de oócitos não deslipi-dizados para HMC foram usadas como sistema de controle. Setedias depois da reconstrução, os blastocistos produzidos deambos os grupos foram vitrifiçados com Cryotop. Taxas de so-brevivência e os números de células de blastocistos re-expandidos foram determinados como descrito para os blasto-cistos produzidos por PA.Exceto onde indicado de outro modo, todas as mani-pulações foram realizadas em um estágio aquecido ajustadopara 39°C, e todas as gotas usadas para manusear os oócitostinham um volume de 20 μΐ, cobertos com óleo mineral. Paratransferência nuclear de célula somática, a clonagem manual(HMC) descrita em nosso trabalho anterior (Du, et al., 2005)foi aplicada com uma única modificação: para enucleação deambos os oócitos deslipidizados e de controle, bissecção emvez de trissecção foi aplicada.

Em resumo, depois da remoção de investimento decúmulo, oócitos de controle foram incubados em 3,3 mg/mL depronase dissolvidos em T33, por 10 segundos. Antes dos oóci-tos começarem a se tornarem deformados na solução de prona-se, eles foram retirados e lavados rapidamente em gotas deT2 e de T20. Oócitos deslipidizados depois da centrifugaçãoforam digeridos nos 3,3 mg/mL de solução de pronase, pormais 5 segundos.

Tanto os oócitos de controle como os deslipidiza-dos com zonas pelúcidas parcialmente digeridas, distendidase amolecidas foram colocadas em gotas de T2 suplementado com2,5 μg/mL de citocalasina B. Bissecção foi realizada manual-mente sob controle estereomicroscópico (Figura 2c) com Lâmi-nas de Divisão Ultra-Agudas (AB Tenchology, Pullman, WA,E.U.A). Metades foram colhidas e coloridas com 5 μg/mL defluorocrõmo Hoechst 33342 em gotas de T2, por 5 minutos, eentão colocadas em gotas de 1 μί de meio T2 no fundo de umaplaca de Petri Falcon de 60 mm com óleo (3-4 metades por go-ta) . Usando um microscópio invertido e luz UV, as posiçõesdas metades sem coloração com cromatina (citoplastos) foramregistradas. Os citoplastos foram mais tarde coletados sobum estereomicroscópio e armazenados em gotas de TIO.

Células de fibroblastos fetais porcinos foram pre-paradas com digestão em tripsina de monocamadas como descri-to previamente (Kragh, et al., 2005). A fusão foi realizadaem duas etapas onde a segunda incluiu também a iniciação daativação. Para a primeira etapa, 50% dos citoplastos dispo-níveis foram transferidos para 1 mg/mL de fitoemaglutinina(PHA; ICN Pharmaceuticals, Austrália) dissolvidos em TO por3 segundos, então rapidamente deixados sobre células simplesde fibroblastos. Depois da ligação, pares de citoplasto-célula de fibroblasto foram equilibrados em meio de fusão(manitol 0,3M e 0,01% de PVA) por 10 segundos e transferidospara a câmara de fusão. Usando corrente alternada (CA) de0,6 kV/cm e 700 KHz, os pares foram alinhados para o fio deuma câmara de fusão com as células somáticas mais longe dofio (Figura 2d), então fundidos com uma corrente contínua de2,0 kV/cm, por 9 μβ. Depois do pulso elétrico, os pares decélulas foram removidos cuidadosamente do fio, transferidospara gotas de TlO e incubados para observar se a fusão haviaocorrido.

Aproximadamente 1 hora depois da primeira fusão,cada par foi fundido com um outro citoplasto em meio de ati-vação. Corrente alternada (CA) e um pulso de CC de 0,7 kV/cmpor 80 με foram aplicados conforme descrição acima. A fusãofoi detectada em gotas de TIO, então embriões reconstruídosforam transferidos no meio IVCO-2 (vide Cultura de embrião eavaliação) suplementado com 5 ^g/mL de citocalasina B e 10μς/ηΛ de cicloeximida. Depois de 4 horas de incubação a38,5°C em CO2 a 5%, O2 a 5% e N2 a 90% com umidade máxima, osembriões foram lavados 3 vezes em meio IVC0-2 de cultura.

Tabela 4. Competência de desenvolvimento e crios-sobrevivência de embriões vitrificados-congelados de embri-ões porcinos de SCNT derivados de oócitos deslipidizados eintactos.

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Sobrescritos diferentes significam diferenças sig-nificantes (p < 0,05).

*: média+S.E.M.

Competência de desenvolvimento in vitro foi obser-vada em HMC com oócitos deslipidizados quando as taxas deblastocistos no Dia 7 foram comparadas com o grupo de con-trole de HMC (21±6% versus 23±6% respectivamente; P>0,05;Tabela 4). A taxa de criossobrevivência depois da vitrifica-ção dos blastocistos clonados derivados de oócitos deslipi-dizados foi significantemente maior que aquela desenvolvidade oócitos intactos (79+6% versus 32+8%, respectivamente;Ρ<0,01) .

Exemplo 4

Enucleação manual quimicamente assistida (CAHE) ecomparação com métodos existentes

Depois de 41-42 horas de amadurecimento in vitro,COCs foram ainda cultivados por 45 minutos na mesma soluçãosuplementada por 0,4 μς/ιη]1 de demecolcina. Células de cúmuloforam então removidas por pipetagem em 1 mg/mL de hialuroni-dase dissolvido em TCM-199 tamponado com Hepes. Desse ponto(exceto onde de outro modo indicado), todas as manipulaçõesforam realizadas em um estágio aquecido para 39°C. Todas asgotas usadas para manuseio de oócitos foram de 20 μΐ. em vo-lume, e foram cobertas com óleo mineral.

Etapas básicas do procedimento de HMC foram des-critas em outro lugar aqui. Em breve, oócitos sem células decúmulo foram incubadas em 3,3 mg/mL de pronase dissolvidosem T33 (T para meio TCM 199 tamponado com Hepes; o númerosignifica a percentagem [v/v] de suplemento de CS, aqui de33%), por 20 segundos. Quando lises parciais de zonas pelú-cidas e leve deformação de oócitos ocorreram, eles foram re-tirados e lavados rapidamente em gotas de T2 e de T20. Noveoócitos foram depositados em uma gota de T2 suplementada com2,5 μg/mL de citocalasina B (CB). Usando uma pipeta de vidrofino polido em fogo e finamente puxada, os oócitos foram gi-rados para encontrar um cone de extrusão com luz e/ou corpopolar fortemente ligado sobre a superfície, e a bissecçãoorientada foi realizada manualmente sob controle estereomi-croscópico com uma microlâmina (AB Technology, Pullman, WA,Ε.U.A.)· Menos da metade do citoplasma (próximo à extrusãoou PB) foi separada da parte remanescente (Figura 3). Depoisda bissecção de todos os 9 oócitos na gota, partes maiores epartes menores (com e extrusão e PB ligado) foram coletadase colocadas em gotas separadas de T2, respectivamente.

Enucleação manual orientada sem tratamento com de-mecolcina (OHE)

Todas as etapas foram similares ao procedimentodescrito anteriormente, mas pré-incubação de demecolcina nãofoi aplicada.

Bissecção manual aleatória para enucleação (RHE)

Pré-incubação de demecolcina foi também omitida dopré-tratamento deste grupo. Depois da remoção de células decúmulo, as zonas pelúcidas foram parcialmente digeridas porpronase como descrito acima. Bissecção manual igual aleató-ria foi aplicada em gotas de T2 suplementado com 2,5 μg/mLde CB. Todos os demi-oócitos foram selecionados e coloridoscom 10 μg/mL de Hoechst em gotas de T2 por 10 minutos, entãocolocados em gotas de 1 μΐ, de meio T2 cobertas com óleo mi-neral (três demi-oócitos em cada gota). Usando um microscó-pio invertido e luz UV, as posições de demi-oócitos isentosde cromatina, i.e. citoplastos, foram registrados. Esses ci-toplastos foram coletados mais tarde sob um estereomicroscó-pio e armazenados em gotas de T2 antes de posteriores mani-pulações.

Fusão e iniciação de ativação

Células de fibroblastos fetais porcinos foram pre-paradas conforme descrição prévia (Kragh et al., 2005, Du etal., 2005). A fusão foi realizada em duas etapas, onde a se-gunda incluiu também a iniciação da ativação. Para a primei-ra etapa, com uma pipeta de vidro fino polido em fogo e fi-namente puxada, aproximadamente 100 células somáticas foramcolocadas em uma gota de T2, e 20-30 citoplastos foram colo-cados em uma gota de TIO. Depois de um curto equilíbrio,grupos de 3 citoplastos foram transferidos para 1 mg/mL defitoemaglutinina (PHA) por 2 a 3 segundos, então cada um foirapidamente gotejado sobre uma células somática simples. De-pois da ligação, os pares de citoplasto-célula somática fo-ram novamente retirados e transferidos para um meio de fusão(manitol 0,3M suplementado com 0,01% [p/v] de PVA) . Usandouma corrente alternada (CA) de 0,6 kV/cm e 700 kHz, paresequilibrados foram alinhados em um fio de uma câmara de fu-são (câmara de fusão com micro-lâmina de 0,5 mm BTX, modelo450; BTX, San Diego, CA, E.U.A.) com as células somáticasmais afastadas do fio, então fundidos com um simples impulsode corrente contínua (CC) de 2,0 kV/cm por 9 μ3. Os paresforam então removidos cuidadosamente do fio para uma gota deTIO, e incubados subseqüentemente para observar se a fusãohavia ocorrido.

Aproximadamente 1 h depois da fusão, os pares fun-didos e os citoplastos remanescentes foram equilibrados se-paradamente em meio de ativação (manitol 0,3M, MgSO4 0,lmM,CaCl2 0,ImM, suplementado com 0,01% [p/v] de PVA). Usandocorrente alternada (CA) de 0,6 kV/cm, um par e um citoplastoforam alinhados em um fio da câmara de fusão, com os paresfundidos entrando em contato com o fio. Um pulso simples deCC de 0,86 kV/cm por 80 με foi usado para a segunda fusão ea iniciação da ativação. A fusão foi checada depois da incu-bação em gotas de TIO.

Clonagem Tradicional (TC)

A micromanipulação foi conduzida com um microscó-pio invertido Daiphot 200 (Nikon, Tóquio, Japão), conformedescrição acima (Chen et al., 1999; Zhang et al., 2005). Emresumo, depois de 42 a 44 horas de amadurecimento in vitro,as células de cúmulo foram removidas conforme descrição aci-ma. Uma gota de solução de micromanipulação simples de 50 μΐ;foi feita sobre a área central de uma tampa de placa de cul-tura de 60 mm e coberta com óleo mineral. Os grupos de 20-30oócitos e células de fibroblastos fetais foram colocados namesma gota. Depois de incubação por 15-30 minutos, o oócitoretido com uma pipeta retentora (diâmetro interno = 25-25 μπιe diâmetro externo = 80-100 μτη) . Depois de ser colocado naposição do relógio de 5-6 horas, o primeiro corpo polar e ocitoplasma adjacente (aproximadamente 10% do volume total dooócito) contendo presumivelmente a placa de metáfase foramaspirados e removidos com uma pipeta de injeção chanfrada(diâmetro interno = 20 μπι) . Uma célula de fibroblasto fetalfoi então injetada no espaço através do mesmo orifício. De-pois da transferência nuclear (NT), os cupletos reconstruí-dos foram transferidos para as gotas dos meios cobertos comóleo mineral para recuperação por 1 - 1,5 h até fusão, e aativação foi conduzida. 0 meio de recuperação foi NCSU-23suplementado com 4 mg/mL de BSA e 7,5 μg/mL de CB. Os cuple-tos reconstruídos foram incubados em meio de fusão por 4 mi-nutos. Os cupletos foram alinhados manualmente usando um ca-pilar de vidro finamente puxado e polido para fazer o conta-to plano paralelo aos eletrodos. Um simples pulso de corren-te continua, por 30 με, de 2,0 kV/cm foi então aplicado. De-pois da cultura em gotas de IVCO-2 (especificado em "Culturade embrião e avaliação") suplementado com 7,5 μg/mL de CBpor 30-60 minutos, os resultados de fusão foram examinadossob estereomicroscópio. Os cupletos fundidos foram submeti-dos a um segundo pulso em solução de ativação. Depois de 30minutos de incubação em TIO, eles foram transferidos paraIVC0-2 para avaliar o desenvolvimento in vitro.

Outras etapas de ativação

Depois do impulso de ativação, todos os embriõesreconstruídos foram incubados em IVCO-2 suplementado com 5μg/mL de CB e 10 μg/mL de cicloeximida, a 38,5°C em CO2 a5%, O2 a 5%, e N2 a 90%, com umidade máxima.

Cultura de embrião e avaliação

Quatro horas mais tarde, todos os embriões recons-truídos e ativados foram lavados e cultivados em placas dequatro poços Nunc em 400 μΐι de IVCO-2 cobertas com óleo mi-neral, a 38,5°C em CO2 a 5%, O2 a 5%, e N2 a 90%, com umidademáxima. IVCO-2 era um meio NCSU37 modificado (Kikuchi etal. , 1999), contendo 4 mg/mL de BSA, piruvato de sódio0,17mM, e 2,73mM de lactato de sódio do Dia 0 (o dia para aativação) ao Dia 2. Piruvato de sódio e lactato de sódio fo-ram repostos com glicose 5,5mM do Dia 2 ao Dia 7 (IVC2-7) .Todos os embriões sem zona foram cultivados no Poço do sis-tema de Poço (WOW) (Vajta et al., 2000) no mesmo meio decultura de mistura gasosa conforme usado acima, com cuidado-sa troca de meio no Dia 2 sem remover os embriões dos WOWs.0 embriões de TC foram cultivados em grupos de 15 a 30 empoços de placas de 4 poços usando a mesma quantidade de meioe composição. Taxas de clivagem e de blastocistos foram re-gistradas no Dia 2 e Dia 7, respectivamente. Para determinaros números de células totais, os blastocistos foram fixadose montados em uma lâmina de vidro de microscópio em uma pe-quena quantidade (<2 μί) de glicerol contendo 10 μg/mL deHoechst 33342. Depois da coloração por várias horas, à tem-peratura ambiente, os embriões foram observados sob um mi-croscópio invertido Diaphot 2000 com ligação epifluorescentee filtro de UV-2A (Nikon, Tóquio, Japão).

Comparação de eficácia de CAHE versus OHE

A eficácia e confiabilidade de CAHE foram testadasem 12 réplicas idênticas pelo uso de um total de 620 oóci-tos.

Depois de amadurecimento por 41-42 horas, os oócitosforam submetidos à incubação com demecolcina. A bissecçãoorientada foi realizada em oócitos, onde um cone de extrusãoe/ou um PB fortemente ligado foi(foram) detectado(s) depoisda digestão parcial com pronase. As percentagens de oócitosbisseccionados versus totais e oócitos sobreviventes versusbisseccionados foram registradas. Subseqüentemente, ambos oscitoplastos putativos e carioplastos foram coletados separa-damente e coloridos com Hoechst 33342 (10 μg/mL em T2 por 10minutos). A presença ou ausência de cromatina foi detectadasob microscópio fluorescente invertido (Figura 4).

A eficácia e a confiabilidade de OHE foram invés-tigadas em 9 réplicas idênticas usando um total de 414 oóci-tos. Depois de 42-43 horas de amadurecimento in vitro, bis-secção orientada foi realizada em oócitos amadurecidos ondeum cone de extrusão e/ou um PB foram detectados depois dedigestão parcial de pronase. Os resultados foram avaliadosconforme descrito no parágrafo anterior.

Os resultados são mostrados na Tabela 5.

Tabela 5: A eficácia de enucleação manual quimica-mente assistida (CAHE) e enucleaçâo manual orientada (OHE)

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*: média ± D.A. (desvios absolutos)

Subscritos diferentes significam diferença(P<0,05)

Não foram detectadas diferenças entre os gruposcom respeito aos cones de extrusão e/ou corpos polares Iiga-dos permitindo bissecção orientada ou nas taxas de lise, e aenucleação bem sucedida por razão de oócito bisseccionadoera também similar. Contudo, a eficácia total do procedimen-to medida pelo número de citoplastos por total de oócitosfoi maior no grupo CAHE que no grupo OHE.Comparação de desenvolvimento in vitro de embriõesproduzidos com CAHE, RHE e TC

Em 8 réplicas, um total de 468 oócitos amadureci-dos in vitro foi aleatoriamente distribuído e submetido atrês dos procedimentos de enucleação descritos acima. As ta-xas de fusão entre citoplasto e fibroblastos doadores foramregistradas. Os embriões reconstruídos foram ativados e cul-tivados como descrito anteriormente. Taxas de clivagem e deblastocistos foram determinadas no Dia 2 e no Dia 7, respec-tivamente. As características estereomicroscópicas dos blas-tocistos desenvolvidos foram comparadas entre grupos.

Tabela 6: Competência de desenvolvimento de embri-ões derivados de enucleação manual quimicamente assistida(CAHE), enucleação manual aleatória (RHE) e clonagem com ba-se em micro-manipulador tradicional (TC) ._

<table>table see original document page 68</column></row><table>

*: média ± DA (desvios absolutos)

Subscritos diferentes significam diferença(Ρ<0,05)

As taxas de fusão após enucleação foram similaresentre CAHE, RHE e TC, respectivamente. A segunda fusão e a-tivação resultaram em perdas desprezíveis (<1%) nos primei-ros três grupos. Embora TC tenha resultado em clivagem menorpor taxas de embriões reconstruídos que os outros três gru-pos, essa diferença não estava presente nas taxas de blasto-cistos por embriões reconstruídos.

As características estereomicroscópicas (tamanho;proporção estimada e perfis da massa celular interna) nãodiferiram entre os grupos. Os números de célula (57±6 versus49±7 versus 53±6) dos blastocistos produzidos de CAHE, RHE eTC estão mostrados na Tabela 6, Figura 5 e Figura 6.

Análise estatística

AVEDEV foi realizado pelo software Microsoft XPExcel e ANOVA foi realizado pelo sistema SAS. Uma probabili-dade de P<0,05 foi considerada como sendo estatisticamentesignificante.

Exemplo 5

Produção de porquinhos

Clonagem manual (HMC)

Quarenta e uma horas depois do início do amadure-cimento in vitro, o investimento de cúmulo dos COCs foi re-movido por pipetagem repetida em 1 mg/mL de hialuronidase emTCM199 tamponado com Hepes. A partir desse ponto (exceto on-de de outro modo indicado) , todas as manipulações foram rea-lizadas em um estágio aquecido ajustado para 39°C, e todasas gotas usadas para manuseio de oócitos foram de 20 μΐ, devolume cobertas com óleo mineral. Os oócitos foram brevemen-te incubados em 3,3 mg/mL de pronase dissolvidos em T33 (Tpara meio TCM 199 tamponado com Hepes); o número significa apercentagem (v/v) do suplemento de soro de bezerro (CS), a-qui de 33%) por 20 segundos e então rapidamente lavados emgotas de T2 e T20. Os oócitos com zona parcialmente diferi-da, mas ainda visível, foram dispostos em gotas de T2 suple-mentado com 2,5 μg/mL de citocalasina B (CB). Com uma pipetade vidro fino polido em fogo e finamente puxada, os oócitosforam girados para encontrar o corpo polar (PB) na superfí-cie, e bissecção orientada foi realizada manualmente sobcontrole estereomicroscópico com uma microlâmina (AB Techno-logy, Pullman, WA, E.U.A.). Assim, menos que metade do cito-plasma de oócito (próximo à extrusão ou PB) foi removida docitoplasto putativo remanescente. Os citoplastos foram lava-dos duas vezes em gotas de T2 e coletados em uma gota deTIO.

As células de fibroblastos fetais foram preparadasconforme descrição prévia (Kragh, P,M. et al., Theriogeno-logy 64, 1536-1545 (2005)).

A fusão foi realizada em duas etapas, onde a se-gunda também incluiu a iniciação da ativação. Para a primei-ra etapa, metades de citoplastos putativos foram usadas. Comuma pipeta de vidro fino polido em fogo e finamente puxada,10 citoplastos foram transferidos como um grupo para 1 mg/mLde fitoemaglutinina (PHA; ICN Pharmaceuticals, Austrália)por 3 segundos, então rápida e individualmente gotejados so-bre uma das poucas células de fibroblastos que foram sedi-mentadas em uma gota de T2 . Depois da ligação, 10 pares decitoplasto-células de fibroblasto foram equilibrados em meiode fusão (manitol 0,3M e PVA a 0,01%) por 10 segundos. Usan-do corrente alternada (CA) de 0,6 kV/cm e 700 kHz, os paresde células foram alinhados ao fio de uma câmara de fusão(câmara de fusão com microlâmina de 0,5 mm BTX, modelo 450;BTX, San Diego, CA, E.U.A.) com as células somáticas maisafastadas do fio, então fundidos com corrente continua (CC)de 2,0 kV/cm, por 9 μ3. Depois do pulso elétrico, os paresde células foram cuidadosamente removidos do fio, transferi-dos para gotas de TlO e incubados para observar se a fusãohavia ocorrido.

Aproximadamente 1 hora depois da primeira fusão,os pares fundidos juntos com os citoplastos remanescentesforam equilibrados em gotas de meio de ativação (manitol0, 3M, MgSO4 0,lmM, CaCl2 0,ImM e PVA a 0,01%). Sob correntealternada (AC) de 0,6 kV/cm, pares fundidos com citoplastosforam seqüencialmente alinhados ao fio em grupos de 10, compares fundidos longe do fio. Um pulso de corrente continua(CC) simples de 0,7 kV/cm por 80 μ3 foi usado para a segundafusão e iniciação da ativação. Os pares foram então removi-dos do fio e transferidos cuidadosamente para gotas de TlOpara checar a fusão. Os embriões reconstruídos foram incuba-dos em meio PZM-3 suplementado com 5 μg/mL de CB e 10 μg/mLde cicloeximida por 4 horas, a 38,5°C em CO2 a 5%, O2 a 5% eN2 a 90% com umidade máxima, então inteiramente lavados an-tes da cultura.

Clonagem tradicional (TC)Micromanipulação foi conduzida com um microscópioinvertido Diaphot 200 (Nikon, Tóquio, Japão). Células de cú-mulo foram removidas conforme descrição acima depois de 42 a44 horas de amadurecimento. Todas as manipulações foram rea-lizadas em um estágio aquecido ajustado para 39°C. Uma sim-ples gota de 50 μι de solução de micromanipulação (NCSU-23suplementado com 4 mg/mL de BSA e 7,5 μg/mL de CB) foi feitana área central sobre uma tampa de placa de cultura de 60 mme coberta com óleo mineral. Grupos de 20 a 30 oócitos e cé-lulas de fibroblastos fetais foram colocados na mesma gora.Depois de incubação por 15 a 30 minutos, um oócito foi obti-do com uma pipeta retentora (diâmetro interno = 25-35 μπι ediâmetro externo = 80-100 μπι) . Depois de serem colocados naposição do relógio de 5-6 horas, o primeiro corpo polar e ocitoplasma adjacente (aproximadamente 10% do volume total dooócito) contendo presumivelmente placa de metáfase foram as-pirados e removidos com uma pipeta de injeção chanfrada (di-âmetro interno = 20 μπι) . Uma célula de fibroblasto fetal foientão injetada no espaço através do mesmo orifício. Depoisda transferência nuclear (NT), os cupletos reconstruídos fo-ram transferidos para gotas de meios cobertos com óleo mine-ral para recuperação por 1 a 1,5 h até fusão, e a ativaçãofoi conduzida. Os cupletos reconstruídos foram incubados emmédio de fusão por 4 minutos. Os cupletos foram alinhadosmanualmente usando um capilar de vidro finamente puxado epolido para fazer o contato plano paralelo aos eletrodos. Umpulso simples, por 30 με, de corrente contínua de 2,0 kV/cmfoi então aplicado. Depois da cultura em gota de meio PZM-3suplementado com 7,5 μς/πΛ de CB, por 30 a 60 minutos, osresultados de fusão foram examinados sob um estereomicroscó-pio. Os cupletos fundidos foram submetidos a um segundo pul-so em solução de ativação. Depois de incubação por 30 minu-tos em TIO, eles foram transferidos para meio PZM-3 para a-valiar o desenvolvimento in vitro.

Cultura de embrião e Transferência

Os embriões reconstruídos foram cultivados em meioPZM-3 (Dobrinsky, J.T. et al., Biol Reprod 55, 1069-1074(1996) suplementado com 4 mg/mL de BSA. Embriões sem zonaproduzidos de HMC foram cultivados no sistema WOWs modifica-do (Feltrin, C. et al. , Reprod Fértil Dev 18, 126 (2006).Duas linhagens de células diferentes (LW1-2 para HMC, LW2para TC) foram usadas como células doadoras nucleares paraHMC e TC para possibilitar identificação da descendência dosdois procedimentos. LW1-2 e LW2 se originam de fetos de umcruzamento (com Duroc) e raça Landrace holandesa pura, res-pectivamente.

A taxa média de blastocistos por embrião recons-truído depois da cultura in vitro por 7 dias foi de50,1±2,8% (média±S.E.M.), que é significantemente maior(p<0,01) para HMC que aquela de TC realizada em paralelo emnosso laboratório (Tabela 7) e também a maior que foi atéagora reportada com respeito à clonagem de porco.

Tabela 7

Desenvolvimento in vitro de embriões produzidospor clonagem manual e por clonagem tradicional

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a,b Valores de sobrescritos diferentes dentro decolunas são significantemente diferentes (p < 0,05).*: média±S.E.M.

Blastocistos mistos produzidos de ambos HMC e TCforam transferidos cirurgicamente para 10 porcas naturalmen-te sincronizados no Dia 4 ou 5 de ciclo estrual. Em seis(55%) recipientes foi diagnosticada gravidez por ultra-sonografia, 2 abortaram e até o momento de se escrever aquidois tiveram ninhadas de 3 e 10 porquinhos respectivamente.Um tamanho de ninhada de 10 porquinhos clonados é, de acordocom o nosso conhecimento, o maior tamanho de ninhada até a-gora obtido em clonagem de porco. Todos eles são saudáveis ese comportam normalmente exceto por um que mostrou flexurada articulação distai de uma pata dianteira.

Os resultados preliminares sugerem que quando em-briões de estágios similares foram transferidos, os recipi-entes no Dia 4 do ciclo estrual suportou a fixação da gravi-dez melhor que os do Dia 5 (Tabela 8) .

<table>table see original document page 74</column></row><table><table>table see original document page 75</column></row><table>

Análise por Microssatélite

Análise parenteral usando 10 marcadores de micros-satélite, porcinos, diferentes, confirmou o genótipo idênti-co de porquinhos clonados e células doadoras usadas paratransferência nuclear. A identificação foi feita por análisede microssatélite de DNA genômico de cada um dos porquinhosrecém-nascidos, a porca substituta materna, e os fibroblas-tos de pele doadores LWl-I e LW2 se originando de dois fetosque representam a raça Landrace holandesa e Duroc, respecti-vãmente. Dez locais de microssatélites polimórficos (SW886,SW58, SW2116, SW1989, SW152, SW378, KS139, S0167M SW1987,SW957) localizados em diferentes cromossomos porcinos foramampliados por PCR 3-color multiplex e os produtos analisadosno Analisador Genético 3130X1 (Applied Biosystems) usando oprograma Gene Mapper 3.7.

Para o segundo recipiente, a taxa de filhotes porembrião (22%) foi a maior reportada até agora em clonagem deporco (Walker, S.C. et al., Cloning Stem Cells 7, 105-112(2005); Hoshino, Y. et al. Cloning Stem Cells 7, 17-26(2005)). Eficácias de nascimento vivo/embrião transferidoforam obtidas em HMC (17%) e TC (15%).

Análise Estatística

As diferenças entre os grupos experimentais foramavaliadas usando teste t de amostras independentes por SPZZ11,5. P<0,05 foi considerado significante.

Exemplo 6

Um exemplo de um transgene que poderia ser usadopara produzir um mamífero não-humano transgênico como modelode doença para epidermólise bolhosa simples é o gene de que-ratina 14, compreendendo uma mutação conforme mostrada emnegrito.

A seqüência do transgene integrado em fibroblastosfetais porcinos (célula doadora) compreende o promotor dequeratina humana 14 e o cDNA de queratina 14 incluindo có-dons iniciadores e de terminação (em negrito) e a mutaçãocausadora da doença (em negrito e sublinhado) como descritopor Sorensen et al. , J. Invest Dermatol. Fevereiro de1999; 112(2) :184-90) . 0 fragmento é clonado em pNl-EGFP(Clontech) contendo sinal de polyA para expressão de gene eum gene de seleção de Neomicina para seleção de clones decélulas com o transgene integrado,

aagcttatat tccatgctag ggttctggtg ttggtgcgtg gggttggggt gggactgcagaagtgccttt taagattatg tgattgactg atctgtcatt ggttccctgc catctttatcttttggattc ccctcggagg aggggaggaa ggagtttctt ttgggtttta ttgaatcaaatgaaagggaa agtagagglg ttcctatgga ggggaggaag gagtttcttt tgggttttattgaatcaaaí gaaagggaaa gtagaggtgt tcctatgtcc cgggctccgg agcttctattcctgggccct gcataagaag gagacatggt ggtggtggtg gtgggtgggg Qtggtggggcacagaggaag ccgatgctgg gctctgcacc ccattcccgc tcccagatcc ctctggatatagcaccccct ccagtgagca cagcctcccc ttgccccaca gccaacagca acatgcctcccaacaaagca íctgtccctc agccaaaacc cctgttgcct ctctctgggg aaattgtagggctgggccag ggtgggggga ccattctctg cagggagatt aggagtgtct gtcaggggcg

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Claims (43)

1. Método de transferência nuclear de célula,CARACTERIZADO pelo fato de que compreende as etapas dea. estabelecer pelo menos um oócito tendo pelo me-nos uma parte de zona pelúcida modificada,b. separar o oócito em pelo menos duas partes ob-tendo pelo menos um citoplasto,c. estabelecer uma célula doadora ou núcleo de cé-lula tendo propriedades genéticas desejadas,d. fundir pelo menos um citoplasto com a céluladoadora ou núcleo de célula circundado por membrana, ee. obter um embrião reconstruído.

2. Método de transferência nuclear de célula,CARACTERIZADO pelo fato de que compreende as etapas dea. estabelecer pelo menos um oócito,b. separar o oócito em pelo menos três partes ob-tendo pelo menos dois citoplastos,c. estabelecer uma célula doadora ou núcleo de cé-lula tendo propriedades genéticas desejadas,d. fundir pelo menos um citoplasto com a céluladoadora ou núcleo de célula circundado por membrana, ee. obter um embrião reconstruído.

3. Método, de acordo com qualquer uma das reivin-dicações precedentes, CARACTERIZADO pelo fato de que pelomenos uma parte da zona pelúcida é parcialmente removida.

4. Método, de acordo com qualquer uma das reivin-dicações precedentes, CARACTERIZADO pelo fato de que pelomenos uma parte da zona pelúcida é parcialmente removida en-zimaticamente.

5. Método, de acordo com qualquer uma das reivin-dicações precedentes, CARACTERIZADO pelo fato de que o oócito é se-parado em pelo menos três partes obtendo pelo menos dois ci-toplastos.

6. Método, de acordo com qualquer uma das reivin-dicações precedentes, CARACTERIZADO pelo fato de que as pro-priedades genéticas desejadas da célula doadora ou do núcleode célula foram obtidas por modificação do gene ou genes de-sejados por mutação, deleção e/ou inserção.

7. Método, de acordo com qualquer uma das reivin-dicações precedentes, CARACTERIZADO pelo fato de que o méto-do de fusão é selecionado de fusão química, eletrofusão ebiofusão.

8. Método, de acordo com qualquer uma das reivin-dicações precedentes, CARACTERIZADO pelo fato de que a fusãoé realizada em pelo menos uma etapa.

9. Método, de acordo com qualquer uma das reivin-dicações precedente, s, CARACTERIZADO pelo fato de que a fu-são é realizada em pelo menos duas etapas.

10. Método, de acordo com a reivindicação 7,CARACTERIZADO pelo fato de que a primeira etapa de fusão éentre pelo menos um citoplasto e a célula doadora ou núcleode célula circundado por membrana.

11. Método, de acordo com a reivindicação 7,CARACTERIZADO pelo fato de que a segunda etapa de fusão éentre o pelo menos um par fundido conforme definido na rei-vindicação 8 e pelo menos um citoplasto.

12. Método, de acordo com qualquer uma das reivin-dicações precedentes, CARACTERIZADO pelo fato de que a célu-la doadora é uma célula somática.

13. Método, de acordo com a reivindicação 12,CARACTERIZADO pelo fato de que a célula somática é selecio-nada do grupo que consiste em células epiteliais, célulasneurais, células epidérmicas, ceratinócitos, células hemato-poiéticas, melanócitos, condrócitos, linfócitos (linfócitosBeT), eritrócitos, macrófagos, monócitos, células mononu-cleares, fibroblastos, células musculares cardíacas, e ou-tras células musculares.

14. Método, de acordo com a reivindicação 12,CARACTERIZADO pelo fato de que as células somáticas são ob-tidas do grupo que consiste em células da pele, células dopulmão, células pancreáticas, células do fígado, células doestômago, células intestinais, células cardíacas, célulasdos órgãos reprodutivos, células da bexiga, células do rim,células uretrais e outras células do órgão urinário.

15. Método, de acordo com qualquer uma das reivin-dicações precedentes, CARACTERIZADO pelo fato de que a célu-la somática é uma célula de fibroblasto.

16. Método, de acordo com qualquer uma das reivin-dicações precedentes, CARACTERIZADO pelo fato de que a célu-la somática é uma célula de fibroblasto, originando-se de ummamífero.

17. Método, de acordo com a reivindicação 16,CARACTERIZADO pelo fato de que o mamífero é um porco.

18. Método, de acordo com a reivindicação 1 e/ou-2, CARACTERIZADO pelo fato de que a célula doadora se origi-na de um célula de germe-linha.

19. Método, de acordo com qualquer uma das reivin-dicações precedentes, CARACTERIZADO pelo fato de que o oóci-to se origina de um porco.

20. Método para produzir um mamífero não-humanogeneticamente modificado ou transgênico, CARACTERIZADO pelofato de que compreende:a. estabelecer pelo menos um oócito tendo pelo me-nos uma parte de uma zona pelúcida modificada,b. separar o oócito em pelo menos duas partes ob-tendo um oócito tendo um núcleo e pelo menos um citoplasto,c. estabelecer uma célula doadora ou núcleo de cé-lula com as propriedades genéticas desejadas,d. fundir pelo menos um citoplasto com a céluladoadora ou o núcleo de célula circundado por membrana,e. obter um embrião reconstruído,f. ativar o embrião reconstruído para formar umembrião,g. cultivar o dito embrião, eh. transferir o dito embrião cultivado para um ma-mífero hospedeiro de modo que o embrião se desenvolva em umfeto geneticamente modificado.

21. Método para produzir um mamífero não-humanogeneticamente engenheirado ou transgênico, CARACTERIZADO pe-lo fato de que compreende:a. estabelecer pelo menos um oócito,b. separar o oócito em pelo menos três partes ob-tendo pelo menos um citoplasto,c. estabelecer uma célula doadora ou núcleo de cé-lula tendo as propriedades genéticas desejadas,d. fundir pelo menos um citoplasto com a céluladoadora ou núcleo de célula circundado por membrana,e. obter um embrião reconstruído,f. ativar o embrião reconstruído para formar umembrião,g. cultivar o dito embrião, eh. transferir o dito embrião cultivado para um ma-mífero hospedeiro de modo que o embrião se desenvolva em umfeto geneticamente modificado.

22. Método, de acordo com a reivindicação 20 ou-21, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende uma ou maisdas características conforme definidas em qualquer uma dasreivindicações precedentes, em que o método para ativação doembrião reconstruído é selecionado do grupo de métodos queconsiste em pulso elétrico, choque quimicamente induzido,aumento dos níveis intracelulares de cátions divalentes eredução da fosforilação.

23. Método, de acordo com a reivindicação 20 ou-21, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende uma ou maisdas características conforme definidas em qualquer uma dasreivindicações precedentes, em que as etapas d) e f) são re-alizadas seqüencial ou simultaneamente.

24. Método, de acordo com a reivindicação 20 ou-21, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende uma ou maisdas características conforme definidas em qualquer uma dasreivindicações precedentes, em que o embrião é cultivado invitro.

25. Método, de acordo com a reivindicação 24,CARACTERIZADO pelo fato de que o embrião é cultivado em cul-tura seqüencial.

26. Método, de acordo com a reivindicação 20 ou-21, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende uma ou maisdas características conforme definidas nas reivindicaçõesprecedentes, em que o embrião é crioconservado antes datransferência para um mamífero hospedeiro.

27. Método, de acordo com a reivindicação 26,CARACTERIZADO pelo fato de que o embrião está em um estágiode blastocisto.

28. Método para crioconservação de um embrião deporco, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende:a) estabelecer pelo menos um oócito de porco,g) deslipidizar o oócito,c) ativar o embrião reconstruído para formar umembrião,d) cultivar o dito embrião, ee) vitrificar o embrião.

29. Método, de acordo com a reivindicação 28,CARACTERIZADO pelo fato de que o oócito deslipizado é sepa-rado em pelo menos duas partes obtendo um oócito tendo umnúcleo e pelo menos um citoplasto.

30. Método, de acordo com a reivindicação 28 ou-29, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende uma ou maisdas características conforme definidas em qualquer uma dasreivindicações precedentes, em que o dito embrião é cultiva-do para o estágio de blastocisto antes da vitrificação.

31. Método para clonagem de um mamífero não-humano, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende:a. estabelecer um embrião conforme obtido em qual-quer uma das reivindicações 1 a 30, opcionalmente desconge-lar um embrião, eb. transferir o dito embrião para um mamífero hos-pedeiro de modo que o embrião se desenvolve em um feto gene-ticamente modificado.

32. Mamífero não-humano geneticamente modificado,CARACTERIZADO pelo fato de ser obtenível pelo método confor-me definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 31.

33. Embrião não-humano geneticamente modificado,CARACTERIZADO pelo fato de ser obtenível pelo método confor-me definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 31.

34. Mamífero não-humano geneticamente modificado,CARACTERIZADO pelo fato de ser obtenível pelo método confor-me definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 31, tendoem suas células teciduais mitocôndrias de pelo menos trêsfontes maternas diferentes.

35. Mamífero não-humano geneticamente modificadoou embrião não-humano geneticamente modificado, de acordocom a reivindicação 32 ou 33, CARACTERIZADO pelo fato de terem suas células teciduais mitocôndrias de pelo menos trêsfontes maternas diferentes.

36. Mamífero não-humano geneticamente modificadoou embrião não-humano geneticamente modificado, de acordocom a reivindicação 32, 33, ou 34 CARACTERIZADO pelo fato deter em suas células teciduais mitocôndrias de pelo menosquatro fontes maternas diferentes.

37. Mamífero não-humano geneticamente modificadoou embrião não-humano geneticamente modificado, de acordocom a reivindicação 32 ou 33, CARACTERIZADO pelo fato de terem suas células teciduais mitocôndrias de somente uma fontematerna diferente.

38. Mamífero não-humano geneticamente modificadoou embrião não-humano geneticamente modificado, de acordocom a reivindicação 32 ou 33, CARACTERIZADO pelo fato de terem suas células teciduais mitocôndrias de pelo menos duasfontes maternas diferentes.

39. Mamífero não-humano geneticamente modificado,de acordo com a reivindicação 32, 33 ou 34, CARACTERIZADOpelo fato de que o mamífero é um porco.

40. Embrião não-humano geneticamente modificado,de acordo com a reivindicação 33 ou 34, CARACTERIZADO pelofato de que o embrião é de um porco.

41. Método para cultivar um embrião reconstruído(embrião), CARACTERIZADO pelo fato de que compreende:a. estabelecer pelo menos um oócito tendo pelo me-nos uma parte de uma zona pelúcida modificada,b. separar o oócito em pelo menos duas partes ob-tendo um oócito tendo um núcleo e pelo menos um citoplasto,c. estabelecer uma célula doadora ou núcleo de cé-lula tendo as propriedades genéticas desejadas,d. fundir pelo menos um citoplasto com a céluladoadora ou núcleo de célula circundada por membrana, e. ob-ter o embrião reconstruído,f. ativar o embrião reconstruído para formar umembrião, ee. cultivar o dito embrião.

42. Método, de acordo com a reivindicação 40,CARACTERIZADO pelo fato de que o embrião é cultivado em meioseqüencial.

43. Método, de acordo com qualquer uma das reivin-dicações 1 a 28, CARACTERIZADO pelo fato de que o método nãocompreende etapa cirúrgica realizada no corpo animal não-humano.